Medios de cultivo. Los nutrientes son necesarios para los microorganismos.

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes que crean las condiciones necesarias para que crezca un microorganismo. Son preparados artificiales que intentan imitar las condiciones ambientales presentes en la naturaleza y se presentan en forma de:

Desecados: en forma de polvo, tienen una mayor durabilidad Hidratados: preparados ya, listos para usar, la vida media de las placas es mas corta. Tienen 4 componentes: Agua Fuente de carbono y energa Fuente de Nitrgeno, Fsforo y Azufre Sales minerales. Tambin pueden llevar algunas otras sustancias como: Factores de crecimiento. Agentes tamponantes. Agentes gelificantes. Colorantes. Indicadores de pH. Indicadores Redox. Etc. La funcin de estos compuestos es porque cada microorganismo crece bajo determinadas condiciones. Principales componentes de los medios de cultivo. Agua Todos los medios de cultivo tienen agua, se utiliza agua destilada sin Cloro, Calcio o magnesio, estos cationes podran precipitar con el PO42- de las peptonas durante la esterilizacin, limitando la disponibilidad de estos elementos. Esta agua est a pH neutro. Productos orgnicos

Digeridos proteicos o pectonas. Entre los ms comunes estn las peptonas, ya que la mayora de los microorganismos no tienen proteasas, y son hidrolizados de protenas de distintas fuentes, pueden ser de la carne, de la leche (casena), o de las plantas. Se degradan mediante cidos o lcalis, o mediante la hidrlisis enzimtica. Dependiendo de la fuente de la protena, como del mecanismo de hidrlisis, incluso de un lote a otro, obtendremos distintas caractersticas:

Digeridos enzimticos de casena. Son aminocidos libres y pequeos pptidos, ricos en Triptfano, y pobres en Carbohidratos. Son tiles para la fermentacin de azcares. Los ms utilizados son Casitone, Trypticase peptone y Tryptone. Digeridos enzimticos de carne. Son aminocidos y pptidos similares a los digeridos de casena, aunque de proporciones ms variadas. Los mas utilizados son Bacto peptona, Proteosa peptona y Peptona bacteriolgica Digeridos enzimticos de plantas. Proceden de plantas como la soja, son ricos en carbohidratos, protenas y vitaminas. Los ms utilizados son Phytone, Soytone y Soya peptone Hidrolizados cidos de casena. Aminocidos libres son pobres en Triptfano y Cistena porque la hidrlisis cida destruye aminocidos y vitaminas. Se utilizan sobre todo Acidicase y Casamino acids. Hidrolizados mixtos. Se han desarrollado porque dan mejores resultados que las peptonas que usan una sola fuente.

Biosate: Extracto de levadura y digerido de casena. Polypeptone: Digeridos de casena y carne. Tryptone: Digeridos de distintas fuentes. Extractos e infusiones. Son concentrados de productos hidrosolubles de carne, rganos o tejidos de animales o vegetales, se obtienen mediante maceracin, ebullicin, y una posterior concentracin y desecacin hasta obtener una pasta o polvo. Extracto de carne. Sin carbohidratos fermentables, pero con cido gliclico y lctico y creatinina que pueden servir como fuentes de Carbono. Extracto de levadura. Se pueden obtener mediante autlisis de levadura de panadera, incubando las clulas a temperatura alta y tambin por hidrlisis cida o enzimtica. Es rico en aminocidos, pptidos, vitaminas hidrosolubles del complejo B y carbohidratos. Extracto de glbulos rojos. Aparte de otros nutrientes, suministra los factores X o hemina y los factores V (difosfo - piridn - adenn nucletido) encargado de la coagulacin de la sangre. Infusiones de hgado, corazn y cerebro. Ricos en aminocidos azufrados que reducen el potencial redox.

Extracto de suelo. Cultivo como la esporulacin como Azotobacter, Rizhobium,...

de

microorganismos

del

suelo

Carbohidratos. Son fuente de carbono y energa, estos compuestos suelen ser glcidos: Monosacridos: Glucosa. Disacridos: Lactosa. Polmeros: Almidn. Hidrolizados: Extracto de malta. A la hora de esterilizar los carbohidratos, tenemos que tener en cuenta la reaccin de Maillard. Esta reaccin tiene lugar por interaccin de los aminocidos y peptonas con los grupos hidroxilo de los azcares dando lugar a un marcado oscurecimiento de los medios, en este caso, los carbohidratos se esterilizan por filtracin, y una vez estriles, se adicionan en condiciones aspticas y no por temperatura.

Fluidos corporales. Se trata de sangre completa, desfibrinada, inmunizada, plasma o suero sanguneo. La sangre no puede ser esterilizada, debe ser obtenida en condiciones aspticas directamente del animal sano (conejo, rata, caballo, cordero,...). Hay dos tipos de medios de cultivo con sangre.

Agar-sangre: Se adiciona la sangre al medio estril en sobrefusin (45-50C). Es til para pruebas de hemlisis (pruebas de patgenos).

Agar-chocolate: Los glbulos rojos hemolizados, se adiciona la sangre desfibrinada al medio estril a 80C, a esta temperatura, se produce la hemlisis y se liberan los factores X y V, es til para el crecimiento de Neisseria y Haemphilus.

Otros suplementos. Otros compuestos utilizados para la elaboracin de medios de cultivo, en forma de suplementos son:

Leche descremada (bacterias lcticas). Zumo de frutas o tomate (bacterias aisladas de vegetales). Suplementos vitamnicos.

Compuestos inorgnicos. Aqu incluimos el NaCl, que regula la osmolaridad del medio (proporciona un equilibrio osmtico). Tambin encontramos K, Mg, Fe, Ca, etc. La fuente de Fsforo, a veces es incorporada como PO42-. La fuente de Azufre como SO42-. Nitrgeno como NO3-, o como NH4+. Agentes gelificantes. Se usan para preparar medios de cultivo slidos o semislidos, gracias a estos, los primeros microbilogos aislaron microorganismos en cultivo puro. Tenemos:

Agar-agar: Es el ms utilizado, es un polmero polisacardico, se obtiene de algas rojas del gnero Gelidium. Un 70% de agarosa, constituye el agente gelificante y un 30% de agaropectina. Es insoluble en agua fra pero se disuelve en agua hirviendo, durante el enfriamiento se mantiene lquido entre los 45-50C para solidificar a 38-40C. Cuando solidifica forma geles transparentes y pocos microorganismos pueden degradarlo. Como inconveniente es caro, pero es el ms utilizado. Se usa en alimentacin como E-406.

Carragenina: Se extrae de algas rojas marinas, polmero muy utilizado en alimentos como E407, es menos usado, solidifica a 50-60C y no es til para la adicin de compuestos en sobrefusin.

Gelatina: Fue el primer agente gelificante usado por R. Koch, procede del colgeno. Este se licua fcilmente por encima de los 28C, no se utiliza con frecuencia y tambin por la por la facilidad de degradacin por parte de muchos microorganismos, mediante la actividad proteoltica.

Gel de slice o silicogel: De origen inorgnico de silicato Na y K, se emplea al 10%, es raro su empleo por su dificultad de manejo y su elevado coste, su uso est restringido a la elaboracin de medios definidos para el cultivo de bacterias auttrofas estrictas anaerobias.

Agentes selectivos. Son compuestos que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero permiten el crecimiento de otros, pero solo a una concentracin determinada. Los ms utilizados son:

Colorantes (cristal violeta, azul de metileno, verde brillante...). Bilis o sales biliares. Laurilsulfato sdico. NaCl. Azida sdica, selenito, telurito potsico, cloruro de litio, ... Antibiticos. Antifngicos, que inhiben el crecimiento de los hongos y las levaduras. El medio de McConkey contiene cristal violeta para inhibir el crecimiento de bacterias Gram - y sales biliares para favorecer el crecimiento de las enterobacterias. Agentes reductores. Permiten crear condiciones anaerobias para favorecer el desarrollo de grmenes microaeroflicos o anaerobios, reducen el O2 y lo convierten en H2O. Tenemos agentes reductores como:

Cistena. Tioglicolato sdico. Sulfuro ferroso. Sulfuro sdico. Ditioteitrol. Citrato de Titanio (III). Sistemas de amortiguacin del pH. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro de unos rangos ptimos para el crecimiento de los microorganismos. Los microorganismos ms comunes son los neutrfilos (pH = 7), aqu se emplean sales como los fosfatos disdicos o bipotsicos/monopotsicos. Cuando se requieren pH cidos, sobre todo para hongos y levaduras, se emplean tampones a base de citrato, acetato o succinato. Indicadores de pH. Son colorantes sensibles al cambio de pH y cambian de color segn el pH, cada colorante tiene un rango de pH donde acta.

Indicadores redox. Son colorantes sensibles a los cambios de potencial redox del medio, nos informa sobre la capacidad de los microorganismos a aceptar o ceder electrones. El azul de metileno, cuando se oxida por completo, llega a 78 y es azul, mientras que si se reduce por completo, tiene un poder redox de -49 y es incoloro. 2.10 Sustancias cromognicas o fluorognicas. Son sustancias que emiten color o fluorescencia al ser hidrolizados y nos informan sobre la utilizacin del sustrato por parte de la bacteria. Clasificacin de los medios de cultivo. Segn su estado fsico:

Slidos: Contienen un solidificante (Agar) a una concentracin de 1,5-2%. El Agar nutritivo contiene tambin 10g de peptona. Semislidos: Tambin tienen solidificantes pero en una concentracin inferior al 0,5%. Lquidos: Son denominados caldos, no llevan agentes gelificantes como el agar; Ej.: agua de peptona. Segn su composicin qumica: Medios indefinidos Son naturales o complejos, son aquellos en los que se desconoce su composicin precisa, ya que estn preparados con peptonas, extractos de levadura, de carne, agar...; Ej.: Agar nutritivo.

Medios definido. Son sintticos, se conoce de forma exacta su composicin qumica tanto cualitativa como cuantitativamente. Ej.:

Agua Peptona: . Peptona: 10 g. . NaCl: 5g. . Agua destilada: 1000 ml. Segn su finalidad:

Medios ordinarios o generales: Tiene nutrientes que permiten el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Ej.: TSA. Medios de enriquecimiento: Son lquidos, ya que estos favorecen el crecimiento bacteriano sobre la base de una caracterizacin fsica o qumica de los mismos. Ej.: el Agua de peptona alcalina, con pH bsico, permite enriquecer al Vibrio Cholerae.

Medios diferenciales: En su composicin existen algunas sustancias que ponen de manifiesto una determinada actividad metablica de la bacteria. Ej.: Medio para favorecer la fermentacin de la lactosa. Medios selectivos: Son slidos, con un a sustancia (selector) que inhibe el crecimiento de algunos microorganismos pero el no el crecimiento de otro. Ej.: Medio de McConkey, intervienen sales biliares y selecciona el crecimiento de Enterobacterias a partir de una muestra heterognea. Preparacin de un medio de cultivo. Se pueden preparar de distintas maneras: Estos medios se suministran deshidratados y se hidratan con agua destilada, segn el fabricante, despus se esterilizan. frmula preestablecida. Ej.: Medio YM. A veces, algunos componentes no soportan la esterilizacin en autoclave, y hay que adicionarles al medio, una vez en sobrefusin, y se esterilizan por filtracin. Ejemplo prctico: Preparacin del medio Agar de Bard Parkes. 50 ml de yema de huevo 1:1 25 ml de yema de huevo 25 ml de suero salino 50C 3 ml de telurito potsico al 3,5%.

Conservacin Una vez estriles y fros, los medios se refrigeran a unas temperaturas de unos 48C para evitar la deshidratacin. Evitar la deshidratacin es crucial para que los componentes no lleguen a alcanzar unas concentraciones demasiado altas y el medio de cultivo quede inservible, para ello tambin las placas con el medio de cultivo se ponen boca abajo y en bolsas de plstico para evitar la contaminacin y evitar en todo lo posible la excesiva evaporacin.

Tema 2: Cultivo de microorganismos. Cultivo de microorganismos Introduccin. Una vez que ya tenemos los medios de cultivo preparados, hay que inocularlos, y para ello se necesita:

Medio de cultivo. Condiciones ptimas de incubacin como temperatura, pH, presin, condiciones atmosfricas (concentracin de O2). Estos medios de cultivo son slidos (cultivos en reposo), o lquidos (para cultivos en agitacin) Temperatura de incubacin. Segn a la temperatura en la que los microorganismos puedan desarrollarse de manera adecuada, tenemos 5 grupos de microorganismos en funcin de la temperatura.

Psicrfilos: Crecen bien a 0 C y tienen una temperatura ptima de 15C o menos, y la mxima temperatura es de 20C. Estos microorganismos viven en hbitats como en el rtico o el Antrtico. Psicrotolerantes: Tambin llamados Psicrtrofos, toleran bien el fro, crecen a 0C y su temperatura ptima es de 20-30C, con una mxima de 35C. Mesfilos: Viven en animales de sangre caliente y ambientes acuticos terrestres de latitudes tropicales, crecen a una temperatura ptima de 20-45C, siendo la temperatura mnima de 15-20C y la mxima de 45C. Termfilos: Viven en ambientes calientes, como las fuentes termales, etc., crecen a una temperatura de 55C o ms, siendo su temperatura mnima de 45C y un ptimo de entre 55-65C. Hipertemfilos: Crecen en ambientes muy calientes, tienen una temperatura ptima de 80-113C. pH Cada especie tiene un rango de pH definido para su crecimiento, y un pH ptimo para su crecimiento. Segn esto, podemos clasificar a los microorganismos en: - 5,5. - 8. - 11,5.

Presin. La mayora de los microorganismos crecen a presin atmosfrica, sin embargo existen microorganismos que viven en las profundidades, donde la presin aumenta 1 Atm. cada 10 metros, por tanto estos microorganismos que en el medios haya presin, estos microorganismos son los barfilos. Los barotolerantes crecen tanto a presin atmosfrica como a altas presiones. Condiciones atmosfricas. Aqu nos referimos a la concentracin de Oxgeno, existen microorganismos que viven en O2 y otros que no. En cuanto a sus requerimientos de Oxgeno tenemos: Aerobios estrictos: Exigen la presencia de Oxgenos para su crecimiento. Microaerfilos: Son aerobios, pero necesitan una proporcin menor de Oxgeno que en el aire (21%), aqu la concentracin de Oxgeno es del 2-10%. Esto se debe a que tienen una capacidad limitada de respiracin o bien a que tienen alguna molcula sensible al Oxgeno. Estos microorganismos viven en la superficie. Anaerobios facultativos: Viven tanto con Oxgeno como sin l, pero crecen mejor en presencia de oxgeno. Anaerobios aerotolerantes: No usan el Oxgeno cuando est presente, aunque viven tanto en presencia como en ausencia de ste. Estos microorganismos son fermentadores, la diferencia est en que los facultativos si usan el Oxgeno, pero los tolerantes no. Anaerobios estrictos: No viven en presencia de Oxgeno porque le es txico. Para poner de manifiesto los requerimientos de Oxgeno, se usa un caldo de tioglicolato sdico que permite tener condiciones de anoxia y tambin se aade un potencial redox. El cultivo en condiciones de anaerobiosis se consigue: Siembra en profundidad en placa, aqu se trasfiere 1ml de inculo a una placa de petri vaca y estril, a continuacin se aade un medio de cultivo con agar fundido y atemperado. Una vez slido, se le aade una 2 capa del medio de cultivo. Siembra en tubo con medio slido fundido. Se trasfiere 1ml de inculo a un tubo con medio fundido y atemperado que previamente a sido hervido para permitir la expulsin del Oxgeno presente en el medio (cuando se solidifica se le aade vaselina estril, pero es opcional). Los medios utilizados incluyen algn agente reductor como la cistena o el tioglicolato sdico. Siembra en tubo con medio lquido. Aqu el medio se hierve para expulsar el Oxgeno, una vez fro, se inocula con 1ml de cultivo y no se agita, se cubre con una capa de vaselina de 1cm. Esta capa impide la difusin del Oxgeno al medio. Jarras de anaerobiosis. Sembramos como aerobiosis, son recipientes hermticamente cerrados, donde se colocan los cultivos donde se permite crear en su interior unas condiciones adecuadas. El Oxgeno se transforma en agua, las condiciones de anaerobiosis se producen por procesos qumicos.

Se introduce un sobre comercial con borohidrato sdico y cido ctrico, con un catalizador de Paladio. El sobre se abre y se le aaden 10ml de agua destilada estril para generar la liberacin de CO2 y H2 mediante las siguientes reacciones: C6H6O7 + 2NaHCO2 Na (C6H5O7) + 3H2O + 3CO2 NaBH4 + 2H2O NaBO2 + 4H2. El Paladio cataliza la reaccin entre el H2 y el O2 presente en la jarra, esta reaccin produce agua que se condensa en las paredes de la jarra. Para los anaerobios estrictos, estos se cultivan e incuban en condiciones anaerbicas, por lo que se incuban en cmaras de anaerobiosis, que permiten el manejo de estos microorganismos en condiciones de anaerobiosis. Mantenimiento y conservacin. En cualquier laboratorio es fundamental el mantenimiento y conservacin de las colecciones de microorganismos para investigar, educar, uso industrial... El mantenimiento se hace para conservar los microorganismos durante cortos periodos de tiempo, generalmente das. La conservacin se usa para conservar estos microorganismos durante largos periodos de tiempo, aos. El principal objetivo de la conservacin de las cepas es mantenerlas viables, mantenerlas en cultivo puro y evitar que sus caracteres genticos y fenotpicos cambien, es decir, mantener la cepa lo ms prximo posible a su estado original.

Mtodos de mantenimiento a corto plazo. Subcultivo. Es el ms utilizado, consiste en una resiembra peridica del microorganismo cada cierto tiempo en un medio de cultivo adecuado. El intervalo de tiempo depende del tipo de microorganismo, como de las condiciones externas y del medio utilizado. La resiembra se realiza en un agar inclinado. Los medios utilizados usan agar inclinado, ya que se detectan mejor los contaminantes en medio slido que en lquido. Al hacerlo inclinado, tiene por objetivo evitar la desecacin rpida del medio, ya que se evapora menos. La composicin qumica tiene una composicin mnima, son los ms adecuados porque soportan una tasa metablica menor. Algunas bacterias requieren medios complejos para su correcto crecimiento y almacenamiento, por tanto los periodos de conservacin son cortos. El periodo de resiembra es vlido para cortos periodos de tiempo, generalmente 15- 20 das, ya que pierden la viabilidad al emitir toxinas producto de su actividad metablica residual, a la prdida de agua, o bien al aumento en la concentracin de solutos, ms de tres meses no se pueden tener as. La refrigeracin est entre los 4-8C porque la tasa metablica disminuye excepto en pscrofilos, adems, as tambin disminuye la evaporacin del agua, evitando el aumento en la concentracin de sales y otros componentes.

Bajo aceite de parafina. Es el mtodo ms antiguo aunque todava se utiliza hoy da, es til para microorganismos que no se pueden conservar por otros mtodos como los protozoos. Aqu el aceite se esteriliza a 130C durante 1 o 2 horas, se usa un cultivo en fase logartmica de crecimiento del microorganismo, y se le aade una capa de 10mm de aceite de parafina estril. El aceite impide la difusin del Oxgeno al medio de cultivo, por lo que se evitan las oxidaciones y reducciones de la tasa de crecimiento. Los tubos se conservan en fro para evitar la evaporacin de agua y que haya un acceso excesivo y una difusin de Oxgeno.

Mtodos a largo plazo. Entre estos mtodos est la desecacin, que es la eliminacin de agua mediante deshidratacin que permite reducir drsticamente el metabolismo. No todos los microorganismos sobreviven a estos procesos, salvo sus formas de resistencia, es decir las esporas. Desecacin sobre tierra. Es til para microorganismos productores de esporas. En cuanto a soportes, usamos una mezcla de arena y tierra, aqu se toma una muestra de tierra de jardn y se mezcla con arena. La mezcla se esteriliza a 130C durante 2-3 horas 3 veces con aire caliente, no en autoclave. Una vez estril, se le aade unas gotas de la suspensin de esporas y se deja secar a temperatura ambiente, a continuacin de conservan a 4C. Para la recuperacin del cultivo, tomamos una pequea cantidad de la fraccin de tierra y la suspendemos en un medio de cultivo adecuado. Se pueden usar otros materiales en vez de tierra como el silicogel, bolas de porcelana o incluso vidrio poroso. Desecacin sobre papel. Mtodo fcil y barato, consiste en usar discos o tiras de papel estriles y a continuacin se le aaden los microorganismos y se seca al vaco. Hay una variante que consiste en usar gelatina en ves de papel que protege los microorganismos de la desecacin. Aqu el cultivo se centrifuga, y el plet se mezcla con gelatina nutritiva fundida a 28-30C y despus se echan las gotas de la mezcla en el papel de filtro y se deja solidificar. Posteriormente se lleva a 1015C a un desecador. Congelacin. Es til porque deprime el metabolismo al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo se reduce el metabolismo drsticamente hasta casi anularlo con Nitrgeno lquido a -192C. Pero la congelacin acarrea una serie de problemas como la formacin de cristales de hielo, que pueden romper las clulas. Otro problema es que al eliminar el agua lquida y transformarse en hielo, existe una concentracin de sales que puede ser perjudicial para la clula.

Para solucionar estos problemas se usan agentes crioprotectores (anticongelantes) que son productos que protegen la clula impidiendo el dao celular durante los procesos de congelacin y descongelacin. Estas sustancias son muy solubles y poco txicas. Las sustancias que normalmente se usan son:

Penetrantes: entran en el interior celular, glicerol al 25% o dimetilsulfxido (DMSO) al 10%. No penetrantes: protegen desde fuera, albmina de suero, leche descremada al 20%, sacarosa al 12% o dextrano al 10%, adems de glucosa, lactosa, manitol, poliglicol, polivinilpirrolidona, ... En cuanto a la forma de congelar, hay una controversia, ya que algunos recomiendan una congelacin rpida y otros, gradual que consiste en bajar 1C/min. Hasta los -20C, para luego bajar rpido. Sin embargo la descongelacin debe ser rpida. Tambin se puede congelar a una temperatura de -30C en congeladores normales o bien a -70C con nieve carbnica, este el mtodo ms utilizado en los laboratorios para la conservacin de microorganismos. La ultracongelacin consiste en congelar con nitrgeno lquido a -196C, se usa para congelar bacterias, virus y lneas celulares. Liofilizacin. Es el mtodo ms empleado para el mantenimiento de colecciones de cultivo. Se ha usado para muchas bacterias y virus reteniendo la viabilidad hasta 50 aos. Consiste en una congelacin y posterior desecacin al vaco (el agua sublima a baja presin). Para evitar los daos del fro, se usan agentes crioprotectores como la leche o la albmina. Aqu el cultivo se centrifuga y el sedimento se resuspende en una solucin crioprotectora y se congela con nieve carbnica, a continuacin se hace sublimar el agua. Una vez desecado, la ampolla se cierra a la llama, manteniendo el vaco. Para evitar su oxidacin, se llana de nitrgeno y despus se guarda a 4C o a temperatura ambiente. Para recuperar los microorganismos, rompemos la ampolla, adicionamos medio fresco e incubamos los viales a una temperatura adecuada. Para comprobar si la cepa es pura, se siembra o disemina una muestra. Conservacin de los distintos microorganismos.

Algas y cianobacterias: Subcultivos a temperatura de 10-15C Algunas cianobacterias se pueden conservar bien desecadas ya que presentan akinetos. Las algas no aguantan bien la desecacin ni la liofilizacin. La congelacin es el mejor resultado con Nitrgeno lquido.

Bacterias. Se han usado todos los mtodos conocidos con malos y buenos resultados, el mejor mtodo es la liofilizacin debido a su facilidad de transporte. Virus. Se recomienda para su conservacin en mucho tiempo el Nitrgeno lquido. Hongos. La mayora se conservan por desecacin en suelo ya que tienen formas de resistencia.

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- disponibilidad de nutrientes adecuados un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos

microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que preveer el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.

7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)