Preparacin de Medios de cultivo - Mtodos de Siembra de Microorganismos Objetivos 1. Aprender la preparacin y manipulacin de los medios de cultivo.

Materiales: frasco con medio de cultivo deshidratado, medio lquido y slido, matraz o erlenmeyer de 500 mililitros , balanza, probeta, esptula, papel kraft, plancha de calentamiento, varilla de vidrio, agar nutritivo y cinta indicadora de pH. Procedimiento: Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Medios de Cultivo y los vdeos: Preparacin y medios de cultivo parte 1 y parte 2 . Preparacin de medio de cultivo Revise la etiqueta de los medios de cultivo, anote el nombre, la composicin y forma de preparacin. Realice los clculos para preparar los siguientes volmenes de medio de cultivo tanto lquido como slido: 325, 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml Prepare en un erlenmeyer 325 mililitros de agar. De acuerdo a las indicaciones de preparacin se utilizan 20 gramos de medio deshidratado por litro de agua. Recuerde para el clculo se realiza una regla de tres: 20 gr....... X gr......... 1000 ml 325ml X= (20 gr.x 325ml)/1000= 6.5 gr.

Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el agitador. A continuacin lleve la preparacin a disolver en la plancha de calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolucin total del Agar. Mida el pH con ayuda de cinta indicadora de pH. El rango de pH en este medio es de 7.0 a 7.5. Si se hace necesario la correccin del pH, aada al medio de cultivo preparado la cantidad adecuada de solucin de cido clorhdrico o de hidrxido sdico segn el caso. Tape la boca del erlenmeyer con un tapn de papel kraft y selle con cinta de enmascarar. Si las normas de preparacin no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centgrados, durante 15 minutos. Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45C. Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri, previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique. A continuacin realice la prueba de esterilidad que consiste en llevar los medios a incubar a 37 grados centgrados durante 12 o 24 horas. Esta prueba se evala por la presencia o ausencia de crecimiento posterior a la incubacin. Las placas con medio de cultivo y el caldo preparado son claros e incoloros hasta con una tonalidad amarillenta.

 Prepare caldo nutritivo para tal fin solamente se emplean 8 gramos de Agar deshidratado por litro de agua. Realice la preparacin de la misma manera. Dispense el caldo directamente en los tubos con tapa rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada. Finalmente tenga en cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo, solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar inclinado. Siembra de Microorganismos Materiales y equipos: Asas Cepa Tubos Tubos Cajas Mechero Cinta Fsforos Agar Cajas Incubadora bacteriolgicas microorganismo nutritivo inclinado nutritivo bunsen enmascarar fundido estriles

con

pura con con

de agar de de nutritivo petri caldo agar nutritivo

Procedimiento Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Sistemas de siembra y los vdeos: Mtodos de siembra parte 1, parte 2 y parte 3 Siembra de medio slido a medio lquido

Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha.
Para crear Esterilice un ambiente un asa de esterilidad encienda el mechero recta a la llama de un y trabaje mechero siempre y al lado djela de el.

enfriar.

Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tpelo y djelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero despus de usarla. Incube los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente Siembra de medio lquido a slido Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.

Siembra de medio slido a slido Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla

Realice una estra que atraviese el centro del agar. Luego realice estras en ngulo recto con respecto a la estra inicial. Voltee el agar en ngulo de 90 grados y realice estra hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento

Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estras y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas. Siembra por estras

Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto numero uno, realice estras hasta el numero 2. Esterilice el asa, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 3, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 4 y as sucesivamente hasta llegar al numero 6. Siembra masiva

Tome un hisopo estril e introdzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluacin del crecimiento en las placas de agar se hace a travs de la observacin de colonias en la superficie . Siembra en agar inclinado

Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de colonias en la superficie. Siembra en profundidad Marque la caja de petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas.