El laboratorio en el diagnstico de la infeccin chagsica

Dra. Beatriz Basso Profesora, Servicio de Neonatologia, Ctedra de Pediatra y Neonatologa Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de Crdoba Universidad Nacional de Crdoba Jefa del Laboratorio de Parasitologa, Coordinacin Nacional de Control de Vectores, Crdoba

Dr. Edgardo Moretti Profesor, Servicio de Neonatologia, Ctedra de Pediatra y Neonatologa Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de Crdoba Jefe de Laboratorio, Coordinacin Nacional de Control de Vectores, Crdoba

INTRODUCCION La Enfermedad de Chagas es una de las principales endemias en nuestro pas y en Latinoamrica. Para su correcto diagnstico debe interactuar todo el equipo de salud, y evaluar los datos clnicos, de laboratorio y epidemiolgicos. Es importante resaltar que el Laboratorio juega un rol fundamental y muchas veces determinante en el diagnstico de infeccin. Por ello, es imprescindible conocer dos aspectos cruciales, de acuerdo a los objetivos del estudio:

Cundo realizar un anlisis Qu pruebas efectuar

En este sentido, se debe tener en cuenta que independientemente de la va de transmisin del T. cruzi, cuando ste ingresa al organismo, cumple sus primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que comprenden entre 7 a 15 das, perodo despus del cual recin se pueden detectar parsitos circulantes y posteriormente anticuerpos contra el parsito. De tal manera, como en otras enfermedades infecciosas, en Enfermedad de Chagas existe un 1

periodo de ventana, que es indispensable conocer, para evitar la realizacin de estudios parasitolgicos y/o serolgicos en un momento inadecuado, con la consecuencia de posibles falsos resultados negativos. Es fundamental tener en cuenta la siguiente premisa:

LA MEJOR PRUEBA DE LABORATORIO PIERDE SU UTILIDAD CUANDO SE REALIZA EN EL MOMENTO INADECUADO

Luego de este perodo de ventana, comienza la fase aguda, en donde la suma de las pruebas parasitolgicas presentan una sensibilidad superior al 95%, para luego decaer hasta llegar al 50% o menos en el periodo crnico de la enfermedad. A partir de los 30 das aproximadamente, deben implementarse simultneamente las metodologas serolgicas. Desde el final del perodo agudo y durante todo el curso posterior de la infeccin, las pruebas serolgicas en su conjunto presentan una sensibilidad cercana al 100% (Fig. 1)

Fig. 1: Sensibilidad (S) de los mtodos parasitolgicos en el perodo de latencia, agudo y crnico

Parasitologa 100

Serologa

50 S

Latencia
Infeccin

Agudo

Crnico

Estudios parasitologicos:
Toma de muestra: En el momento del contagio deben realizarse al menos dos pruebas serolgicas para Chagas, a los fines de conocer si el paciente tiene ya una infeccin previa. Si la misma es negativa, es necesaria una segunda muestra, obtenida respetando el periodo de latencia o ventana desde el inicio de la posible infeccin. Como se ha mencionado, en el perodo agudo debe realizarse la bsqueda del parsito mediante mtodos parasitolgicos, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analticos, dependiendo de la disponibilidad de recursos humanos capacitados y equipamiento en cada laboratorio.

COMO EN TODA ENFERMEDAD INFECCIOSA, LA DETECCIN DEL PARASITO ES EL NICO PARMETRO DE CERTEZA DIAGNSTICA

Las metodologas actualmente recomendadas son: Examen en fresco: es el ms simple y consiste en examinar una gota de sangre al microscopio, entre porta y cubreobjetos. Tcnica de concentracin de Strout: se realiza en sangre obtenida sin anticoagulante. Una vez retrado el cogulo, se centrifuga a bajas revoluciones, se aspira luego el suero y con el sedimento, (hemates y leucocitos no retenidos por el cogulo y resto de suero) se vuelve a centrifugar a mayor velocidad. El sedimento se observa al microscopio entre porta y

cubreobjetos, a 40x; deben realizarse 3 o 4 preparados, no menos de 300 campos/ preparado. En los casos positivos se observan los tripomastigotes con su clsico movimiento, que resulta inconfundible para un observador experimentado. Si se realiza fijacin y coloracin, lo cual en esta tcnica no es indispensable pero puede ser de utilidad para laboratoristas con poca experiencia, se observarn los tripomastigotes con su forma tpica, con ncleo central y cinetoplasto subterminal (Fig 2) Para neonatos se puede usar la microtcnica o microstrout, cuya nica diferencia es que se realiza con un volumen de sangre menor (aproximadamente 500 ul, en tubos de plstico tipo Eppendorf). En nuestra experiencia esta microtcnica tiene una sensibilidad elevada, similar a la tcnica del Strout convencional. 3

Fig. 2: Tripomastigotes de sangre perifrica coloreados con Giemsa (400 x)

La Tcnica del tubo capilar descripta por primera vez por Woo (5), en nuestra experiencia no es aconsejable por: a) Puede brindar falsos resultados negativos debido a que: si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parsitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difcil de observar la presencia del parsito si el capilar no se rompe en la interfase, entre la capa de glbulos blancos y el suero. Cuando el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la observacin b) Por razones de Bioseguridad del operador: Esto es crucial, ya que para su

observacin deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que ste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc

Hemocultivo: mtodo estandarizado en nuestro laboratorio (3 y 4). Es el mtodo de eleccin por su menor agresividad para los pacientes, fundamentalmente en la poblacin neonatal, mayor precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura Brevemente, se siembra sangre heparinizada, recogida en condiciones de estricta asepsia, en medio monofsico (Infusin Cerebro Corazn) y bifsico (pico de flauta de agar 4

sangre). Se incuba a 28C y se realizan observaciones microscpicas y subcultivos peridicos, desde los 7 y hasta un mximo de 60 das. En nuestra experiencia, la positividad en neonatos infectados o agudos se observa generalmente entre los 7 y los 21 das. En los primeros das pueden observarse masas de amastigotes, que luego se transforman en epimastigotes activamente mviles (Fig 3a) . La confirmacin de la presencia de masas de amastigotes o epimastigotes se realiza mediante coloracin de Giemsa ( se deja secar el preparado e inmediatamente se fija con metanol durante 5 minutos y se colorea con Giemsa 1:10, durante 15 minuto aproximadamente, de acuerdo al tipo de reactivo empleado y se lava suavemente con agua destilada. Dejar secar y observar con aceite de inmersin con objetivo de 100x). (Fig 3b).

Fig 3: a) Rosetas de epimastigotes y epimastigotes libres en un hemocultivo (contraste de fase, 400x) b) Epimastigotes coloreados con Giensa

Xenodiagnstico: se realiza con la aplicacin de 4 cajas con 10 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 das de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elstica. Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos, luego se deja a 28C y 70% de humedad durante 30 o 60 das. El material se obtiene por compresin de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solucin fisiolgica estril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega. (Fig 4) Para obtener una mejor sensibilidad, se puede realizar coloracin de Giemsa lento (1:10) previa fijacin con vapores de formol durante 12 24 horas a temperatura ambiente o a 28C 5

(esto se realiza colocando el preparado, dentro de una cpsula de Petri, con un papel absorbente embebido con formol. Luego de la coloracin, se enjuaga con agua destilada, se seca y se observa, de la misma forma que las coloraciones precedentemente descriptas.. Si bien el xenodiagnstico es considerado el mtodo de referencia, fue utilizado en nuestro grupo hasta el desarrollo del hemocultivo, siendo posteriormente reemplazado por ste, por las ventajas que tiene.(ver Tabla1)

Fig 4. a) Cajas con ninfas de Triatoma infestans aplicadas en el brazo de un paciente b) Expresin de una ninfa para obtencin de materia fecal c) Imagen microscpica (400x) de un xenodiagnstico positivo

PCR: En lo que respecta a los mtodos de biologa molecular, como la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que ha significado un extraordinario avance cientfico, existe acuerdo generalizado de que an presenta resultados muy controvertidos en el diagnstico de la infeccin chagsica, y actualmente no esta validada para su empleo en el diagnstico clnico. Por el momento, y hasta que se logre su estandarizacin y posterior validacin, la misma slo es utilizada en el mbito de laboratorios de investigacin.

En la Tabla 1 se resumen las Ventajas y Desventajas de las pruebas parasitologicas en el diagnstico de Enfermedad de Chagas

Enfermedad de Chagas Diagnstico parasitolgico

Ventajas Desventajas

Strout, Microstrout

Hemocultivo

Resultado precoz Certeza diagnstica Sencillez operativa Bajo costo Elevada sensibilidad Certeza diagnstica Facilidad en la obtencin de la muestra Mediano costo Gold standard

Sensibilidad operador dependiente

Requiere experiencia del operador Contaminaciones

Xenodiagnstico

Mtodo cruento Reacciones alrgicas Infraestructura compleja Falsos positivos contaminnaciones) Falsos negativos inhibicin.biolgica) Infraestructura compleja Costos elevados An No Validada

PCR

Elevada Sensibilidad

En resumen, los mtodos parasitolgicos clsicos: examen en fresco, Strout o microStrout y Hemocultivo empleados secuencialmente, permiten detectar el parsito, y consecuentemente efectuar el diagnstico de certeza, en cerca del 100 % de los casos durante el perodo agudo y en la infeccin congnita.

Estudios Inmunoserologicos
La serologa es una disciplina basada en la deteccin de anticuerpos especficos contra un determinado microorganismo, en este caso el Trypanosoma cruzi. Debera llamarse con mayor propiedad Inmunodiagnstico, ya que serologa es un trmino antigo que alude a la utilizacin de suero como material biolgico en el cual se realiza el estudio. De todos modos, ambos trminos se consideran sinnimos. El concepto bsico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parsito y, por lo tanto, sus resultados nunca proporcionan certeza diagnstica y deben medirse en trminos de probabilidad. Para que las probabilidades de xito en el diagnstico serolgico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente el mtodo a emplear, el momento de la toma de muestra y, asimismo, interpretar adecuadamente los resultados. Existen algunos mitos que consideramos deben ser descartados. El primer mito, es que la serologa resuelve todos los problemas diagnsticos. Nada ms alejado de la realidad, que cualquier lector de las bases elementales de la inmunologa no puede desconocer. A diferencia de lo que ocurre en Qumica Clnica, en Serologa se buscan sustancias (anticuerpos o eventualmente antgenos) normalmente ausentes, por lo cual un resultado se expresa como Positivo o Negativo (Todo o nada), lo cual merece una interpretacin diferente. Por otro lado, los informes no se expresan en unidades concretas sino relativas (ttulo) y, asimismo, se establece un valor de corte arbitrario que puede no ser el mismo para distintas regiones geogrficas, por la presencia en alguna de ellas de otros parsitos que puedan interferir en el diagnstico, dando reacciones cruzadas. Por estas razones, y otras cuya descripcin escapa al objetivo de este captulo:

La serologa debe interpretarse siempre en trminos de probabilidad y en el contexto de la epidemiologa y la clnica.

Mtodos serolgicos Los mtodos actualmente validados son: ELISA (Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay) Fig 4a Inmunofluorescencia (IF) Fig 4b Hemaglutinacin indirecta (HAI) Fig 4c

Fig 4. Fotografas de las reacciones de ELISA, Inmunofluorescencia y Hemaglutinacin

La tcnica para estos mtodos se detalla en los insertos del fabricante. A continuacin se explica brevemente cada una de ellas:

a) La reaccin de ELISA consiste en pegar antgenos solubles del Trypanosoma cruzi (totales o recombinantes) en placas de poliestireno. Sobre cada uno de los reservorios de la placa se coloca suero de pacientes que, si tienen anticuerpos se unen a los antgenos del Tripanosoma. Luego de lavar para eliminar protenas sricas no involucradas en la unin antgeno-anticuerpo, se agrega un reactivo constitudo por anticuerpo anti inmunoglobulinas humanas marcado con una enzima (usualmente peroxidasa o fosfatasa alcalina). Despus de un perodo de incubacin y nuevos lavados, se agrega un sustrato de la enzima que, si en la fase slida se encuentra el doble complejo antgeno- anticuerpo del paciente- anticuerpo marcado, desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la concentracin de anticuerpos del paciente y a la afinidad de los mismos. Para la medicin de esta intensidad de color es necesario contar con en espectrofotmetro de lectura vertical. Eventualmente, en laboratorios de baja complejidad se puede efectuar la lectura visual. En la Fig 4 a se pueden observar las reacciones positivas color amarillo y las negativas incoloras. 9

b) El mtodo de inmunofluorescencia tiene un fundamento similar, con algunas diferencias importantes. La primera es que el antgeno es particulado (el parsito entero fijado con formaldehdo o glutaraldehdo). La segunda diferencia radica en que el segundo anticuerpo est marcado con una sustancia fluorescente, ususalmente isotiocianato de fluorescena y, por ltimo, la lectura se realiza en un microscopio equipado con luz UV. Actualmente existen tcnicas combinadas, donde la seal fluorescente puede leerse en un aparato y de esa forma evitar la subjetividad del operador

c) La Hemaglutinacin indirecta se basa en la propiedad que tienen las protenas de adsorberse sobre la superficie de glbulos rojos de carnero o de ave modificada qumicamente y actuar como soporte del antgeno. Si en el suero del paciente existen anticuerpos contra los antgenos del parsito, los glbulos rojos se aglutinan

No existen actualmente otras pruebas validadas para diagnstico de infeccin chagsica. Un mtodo que fue de gran utilidad durante muchos aos, como la Fijacin de Complemento (Guerreiro-Machado) ha dejado de utilizarse por razones operativas, entre ellas la dificultad para conseguir los reactivos y su estandarizacin. Otras tcnica como la aglutinacin de partculas de ltex sensibilizadas con antgeno de T. cruzi es desaconsejada por su baja confiabilidad (sensibilidad, especificidad y reproductividad). Por ltimo, reacciones como la

Inmunocromatografa, que pueden ser muy tiles por la posibilidad de utilizarlas como mtodos de screening rpidos en terreno, no estn an disponibles en el mercado en nuestro pas.

Parmetros para determinar la confiabilidad de un mtodo: Sensibilidad (S), Especificidad (E) y Valor predictivo (VP).

S: capacidad de un mtodo de dar resultado positivo en presencia de infeccin E: capacidad de un mtodo de dar resultado negativo en ausencia de infeccin VP: probabilidad que un individuo con resultado positivo est realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado negativo sea realmente no infectado (VP-)

Las dos primeras son intrnsecas del mtodo, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infeccin. As, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es ms alto que en una zona no endmica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor). (Stites, D; Abbas T., 2007) 10

Como ningn mtodo tiene 100% de E, las pautas para diagnstico de la infeccin chagsica (Manual para la atencin del paciente infectado con Tripanosoma cruzi.

Ministerio de Salud de la Nacin. 2005) determinan que, para que un individuo sea considerado chagsico, deben dar positivos al menos dos mtodos serolgicos diferentes (ELISA + HAI, ELISA + IF o HAI + IF)

Existe una difundida creencia acerca de que la IF es el mtodo de referencia. Ello no es as. Sin dudas se trata de una buena metodologa, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no est al alcance de pequeos laboratorios y no es una tcnica adecuada para procesar elevado nmero de muestras.

Actualmente, la reaccin ms sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotmetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad., permite procesar elevado nmero de muestras y, adems, es la que mejores resultados permite obtener en muestras de sangre entera (sangre con glicerina, papel de filtro) o con otros fluidos biolgicos como el trasudado mucoso oral (Basso y col, 1987; Moretti y col, 2004)

La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulacin del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y tambin es adecuada para procesamiento de elevado nmero de muestras.

EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS SEROLOGICAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL

Teniendo en cuenta La posibilidad de reacciones cruzadas con otros parsitos, la realizacin de dos o ms pruebas serolgicas no garantiza que el resultado obtenido sea unvoco. Por ello, pueden presentarse situaciones que es necesario conocer y resolver:

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Primer dilema Resultados discordantes

Se llama discordancia serolgica cuando en un mismo paciente dos pruebas dan distinto resultado

Es una situacin frecuente en pacientes tratados y en embarazadas Resultado posible en un agudo

Ejemplos de resultados y su interpretacin

ELISA HAI Interpretacin

+ +
Positivo

Negativo

+ Discordante

+
Discordante

Qu hacer ante un resultado discordante ? El Bioqumico Repetir el estudio con la misma muestra Realizar una tercera reaccin Solicitar nueva muestra, en lo posible luego de un mnimo de 30 das

El Mdico NO CONSIDERAR COMO INFECTADO SI AL MENOS DOS METODOS NO DAN RESULTADO + Aceptar y explicarle al paciente que los mtodos de laboratorio tienen alcances y limitaciones y que deben valorarse en el contexto clnico y epidemiolgico

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Otra situacin que suele presentarse en mtodos con lectura espectrofotomtrica, como es el caso de ELISA, es que los valores de Densidad Optica (DO) se siten muy cerca del valor de corte ( 10% ), en cuyo caso el resultado no debe considerarse positivo ni negativo, sino indeterminado Segundo dilema Resultados indeterminados:

Cuando en una reaccin con lectura espectrofotomtrica se obtiene una densidad ptica dentro de la denominada zona gris ( 10% del nivel de corte del kit utilizado) Ejemplo: Nivel de Corte: DO 200 Zona gris : 180 - 220

Qu hacer con un resultado indeterminado?

Seguir el mismo criterio que para las Discordantes No debe considerarse Positivo o Negativo

Objetivos de las pruebas inmunoserolgicas

Para la interpretacin de los resultados es fundamental conocer el objetivo de las pruebas, que pueden ser varios (diagnstico, control de tratamiento, seleccin de dadores de sangre, etc). Simplificando, desde un punto de vista epidemiolgico y clnico la serologa se puede utilizar para: Screening Confirmacin diagnstica

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Para el primer caso se necesita una elevada sensibilidad, mientras que la confirmacin requiere alta especificidad. En nuestra experiencia en estudios

epidemiolgicos la reaccin de ELISA es la ms adecuada si se realiza una sola tcnica, (no recomendado segn las pautas que establecen la realizacin de dos tcnicas) ya que presenta una sensibilidad muy elevada. Para la confirmacin, como se ha dicho ms arriba, es imprescindible la positividad de al menos dos mtodos.

Como se puede deducir de la figura 1 (Pag 2), durante el perodo de latencia o ventana, que dura desde el momento de la infeccin hasta aproximadamente 10-15 das, no existe ninguna prueba que deba realizarse, ya que seguramente se obtendrn resultados falsos negativos. Solamente se puede efectuar serologa a los fines de conocer si exista infeccin anterior.

Resumen: En el perodo agudo, hasta aproximadamente los 30 das, son de eleccin las pruebas parasitolgicas, que tienen una muy elevada sensibilidad, mientras que en el perodo indeterminado o crnico los parsitos circulantes son escasos y difcilmente detectables, por lo cual deben utilizarse las pruebas serolgicas.

Diagnstico de la infeccin congnita o del primer ao de vida. (ver captulo

Enfermedad de Chagas congnita, Moya y col)

Existen situaciones

que requieren un tratamiento especial, como la infeccin

congnita. Nuestro grupo de trabajo desarroll un algoritmo diagnstico que permite la identificacin de los hijos de madres chagsicas que se infectaron durante el embarazo (Moretti y col, 2007; Moya y col, 1985; 1989; 1997; 2005) Es muy importante tener en cuenta que la incidencia de transmisin congnita es de 2 a 8% segn la mayora de los autores. En nuestro grupo alcanza al 2,4 %. Ello tiene un doble 14

significado. Por un lado, es imprescindible el tratamiento de los nios que nacen infectados, pues ello permite una curacin definitiva. Por el otro, se debe evitar el tratamiento innecesario en los hijos de madres chagsicas no infectados, ya que las drogas utilizadas no estn exentas de efectos secundarios ( Moya y col, 1985; 1997 )

Segn el Consenso de Cochabamba ( Carlier y col, 2003), se define infeccin congnita cuando a) el nio nace de una madre serolgicamente positiva (y ocasionalmente parasitolgicamente positiva ) ( Moretti y col, 2005). b) Se encuentran parsitos en sangre de cordn o sangre del neonato al nacer o durante los primeros meses, siempre que no haya recibido transfusiones o viva en zona con transmisin vectorial activa c) Se detecten anticuerpos contra el Tripanosoma cruzi cuando hayan desaparecido los anticuerpos maternos de circulacin, lo cual actualmente se acepta que ocurre entre los 9 y 12 meses de vida.

La deteccin del parsito asegura el diagnstico, mientras que la deteccin de anticuerpos sufre la interferencia de los anticuerpos maternos. Como la deteccin de IgM no ha demostrado ser eficaz para el diagnstico de infeccin chagsica, es necesario recurrir a las curvas serolgicas, que miden los niveles de IgG srica del hijo de madre chagsica.

Es importante destacar que el recin nacido hijo de madre chagsica siempre es serolgicamente positivo, independientemente de si est infectado o no. La nica excepcin es que la madre tenga niveles de anticuerpos muy bajos, en el lmite de sensibilidad de las tcnicas empleadas y, debido a las oscilaciones propias del mtodo, la pruebas en el nio caigan debajo de ese lmite. Esto es claramente una excepcin, al contrario de lo expresado por algunos autores, y en nuestra experiencia prcticamente no lo observamos.

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Existen bsicamente dos tipos de curvas serolgicas, como se muestra en la Fig. 2, segn el nio nazca infectado, en cuyo caso mantendr o incrementar sus niveles de anticuerpos durante el primer ao de vida, o que por el contrario su positividad se deba a la presencia de anticuerpos maternos. En este ltimo caso, los ttulos de anticuerpos caern hasta negativizarse, siguiendo el catabolismo de la IgG materna. La negativizacin puede ocurrir entre los 6 y 12 meses de vida. (Fig 5)

300 250 200

Ttulo

150 100 50 0 0 3 6 9 12

Meses

Fig 5: Ejemplo de curvas serolgicas en neonatos con infeccin congnita ( pasaje placentario de anticuerpos maternos ( )

) o con

Es muy importante tener en cuenta que un porcentaje bajo de madres chagsicas transmite la infeccin, entre un 3 y un 5% segn la mayora de los autores, por lo cual la gran mayora de los hijos de madres chagsicas presentarn una curva descendente.

A los fines acadmicos y epidemiolgicos, se puede distinguir si la infeccin de un nio durante el primer ao de vida se debe a transmisin materna o por otra va (vectorial, transfusional), de acuerdo al siguiente esquema (Moya y Moretti, 1997)

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Diagnstico de la infeccin chagsica por el laboratorio durante el primer ao de vida en hijos de madres chagsicas

Grupo

Parasitologa RN * + 1er ao --------RN + +

Serologa 3-6 m + + 9-12 m + +

Interpretacin Diagnstica

Infeccin congnita

Infeccin de origen no confirmado* (Vectorial?, transfusional?, digestiva?)

+ +

+ +/

Infeccin de origen no confirmado*

Ausencia de infeccin

* El diagnstico parasitolgico puede realizarse en el momento del nacimiento, o durante el primer ao de vida. Para confirmar infeccin congnita debe detectarse el parsito y descartar cualquier otra posible va de infeccin

Desde el punto de vista teraputico, cualquiera sea la va de infeccin, el tratamiento es efectivo mientras ms temprano se realice, en nuestra experiencia antes de los tres aos de vida, por lo cual es importante realizar el diagnstico lo ms precozmente posible

Actualmente, existe una Ley Nacional ( No.26281) que obliga a la investigacin de infeccin chagsica en toda mujer embarazada. (ARTICULO 4 - Es obligatoria la realizacin y la notificacin de las pruebas diagnosticas establecidas segn Normas Tcnicas del Ministerio de Salud, en toda mujer embarazada, en los recin nacidos, hijos de madres infectadas, hasta el primer ao de vida y en el resto de los hijos, menores de CATORCE (14) aos de las mismas madres) Para la implementacin de esta ley se deben seguir los siguientes pasos:

1- Deteccin de la gestante chagsica: se debe realizar el control serolgico a todas las embarazadas con por lo menos dos reacciones serolgicas normatizadas, HAI, ELISA y/o IF (de acuerdo a la disponibilidad de cada centro). 17

2- Se deben estudiar

todos los hijos de madre chagsica de acuerdo al algoritmo

establecido y que se muestra ms abajo a) Serologa: HAI y ELISA o IF (HAI y IF tituladas), al momento del nacimiento y durante el primer ao de vida b) Parasitologa: Nuestro grupo recomienda el micro Strout 3- Si el examen parasitolgico es positivo, se debe iniciar inmediatamente el tratamiento. De lo contrario, debern realizarse controles mediante serologa titulada, durante el 1 ao de vida, opcionalmente y de acuerdo a la necesidad clnica, entre los 3 - 6 meses de vida y fundamentalmente al ao de vida. 4- Todos los nios que no hayan sido estudiados para Chagas, al cumplir el primer ao de vida, se les deber realizar serologa convencional en los centros de salud respectivos. Esto ser posible cuando asistan para ser inmunizados con la vacuna triple viral, (algunas jurisdicciones superan el 80% de cobertura en este grupo etreo). Se deber tener en cuenta que debido a la transferencia pasiva de anticuerpos de tipo IgG de la madre al nio, antes de los 9-12 meses de edad, es necesario demostrar la presencia del parsito para realizar el diagnstico de infeccin. Despus de los 12 meses la reactividad serolgica confirma la infeccin. Todos los nios con infeccin confirmada sern tratados de acuerdo a las Normas Nacionales de Atencin al Infectado Chagsico.

EL DIAGNOSTICO DE INFECCION CONGENITA SE REALIZA POR METODOS PARASITOLOGICOS A PARTIR DEL NACIMIENTO Y DURANTE LOS PRIMEROS MESES DE VIDA Y POR METODOS SEROLOGICOS A PARTIR DE LOS 9-12 MESES

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Algoritmo para el diagnstico y el tratamiento del hijo de madre chagsica durante el primer ao de vida

RN

3- 6 meses ( Opcional)

9 12 meses

Parasitologa Serologa + + +

Tratamiento Seguimiento

+ +

+ +

Tratamiento Tratamiento Fin del estudio Seguimiento

+ +

Tratamiento Tratamiento Fin del estudio

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Perspectivas de nuevas metodologas

El material antignico que se emplea en los mtodos serolgicos convencionales es, o el parsito completo (IF) fijado o componentes solubles crudos del parsito obtenidos por diferentes procedimientos (ELISA, HAI). Se han utilizado asimismo fracciones antignicas semipurificadas (Cervetta y col, 1988; Moretti y col, 1998), fundamentalmente para tratar de encontrar marcadores de eficacia teraputica o indicadores pronsticos. Ms recientemente se estn utilizando antgenos recombinantes o pptidos sintticos (Silveira y col, 2001; Girones y col, 2001). De hecho, ya se encuentran disponibles en el mercado kits diagnsticos preparados con antgenos recombinantes. La idea original de utilizar un antgeno o un pptido para optimizar la especificidad no proporcion los resultados esperados, por lo cual actualmente se utilizan mezclas de recombinantes, que incrementan la sensibilidad sin resentir la especificidad. Se ha preconizado el empleo de mtodos con antgenos totales en las reacciones de screenning y metodologa recombinante para la confirmacin, aunque esta estrategia todava no est protocolizada. Respecto a nuevos mtodos, algunos autores preconizan la inmunocromatografa (Luquetti y col, 2003), mtodo simple que puede realizarse con sangre entera y requiere pocos minutos y entrenamiento mnimo del personal. Su ventaja esencial es que permite ser realizada en terreno, detectar los positivos y all mismo tomarles muestra de suero, que siempre es el material biolgico para confirmacin diagnstica, evitando nuevos viajes y la toma de segundas muestras. En nuestro pas an no est disponible en el mercado.

Materiales biolgicos
Por definicin, el material biolgico de eleccin es el suero. Sin embargo, en el trabajo de campo requiere un instrumental no siempre disponible, por lo cual son de eleccin los mtodos que utilizan sangre capilar. En este sentido, en Brasil se utiliza sangre recolectada en papel de filtro y en Argentina el Ministerio de Salud distribuye equipos que contienen frascos con glicerina como conservante (Serokits). En nuestra experiencia, el screening utilizando ambos materiales brinda resultados similares (Basso y col, 1987). En nuestro laboratorio, se ha estudiado la performance del Trasudado mucoso oral como material biolgico (Moretti y col, 2004). Este material se obtiene con un dispositivo sencillo, que consta de una almohadilla embebida en una solucin hipertnica que se coloca 2 minutos entre la enca y la mejilla. El material que se obtiene es un trasudado, cuya concentracin de inmunoglobulinas permite realizar serologa, principalmente empleando la tcnica de ELISA, con sensibilidad similar a la obtenida con suero o sangre conservada en papel de filtro o glicerina. La gran ventaja es que se trata de un mtodo no invasivo, de gran aceptacin entre los nios y que mejora las condiciones de bioseguridad en terreno, al no manipular sangre ni elementos punzantes. Este dispositivo no est an disponible en el mercado en nuestro pas, por lo cual no se puede utilizar a gran escala.

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Para screenings puede emplearse sangre entera recolectada en papel de filtro o glicerina, as como Trasudado mucoso oral LA CONFIRMACIN DIAGNOSTICA DEBE REALIZARSE UNICAMENTE EN SUERO Y CON DOS MTODOS SEROLGICOS

En resumen, es importante destacar que las pruebas serolgicas para

infeccin

chagsica pueden realizarse en laboratorios de baja o mediana complejidad y que el diagnstico precoz es esencial para la prevencin de la patologa. Se debe remarcar que slo es necesario conocer el momento indicado para realizar el estudio, las pruebas a realizar, que deben estar sometidas a estrictos controles de calidad, y su interpretacin, que debe ser interdisciplinaria y tener en cuenta el contexto clnico-epidemiolgico

CONCLUSION El diagnstico de la infeccin chagsica est protocolizado, no requiere equipamiento sofisticado y su correcta realizacin e interpretacin es de invalorable utilidad clnica y epidemiolgica. Un diagnstico correcto y oportuno en el paciente con infeccin aguda o congnita, o durante los primeros aos de vida, permite el tratamiento etiolgico con alta eficacia teraputica y, en el paciente crnico, su seguimiento evolutivo. De esta forma, se ayuda a mejorar la calidad de vida del elevado nmero de personas infectadas o en riesgo de infeccin en los pases del rea endmica, y asimismo en regiones tradicionalmente no endmicas y en las cuales la infeccin chagsica es un problema de salud emergente, como consecuencia de las migraciones y la transmisin interhumana

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