(Este documento an se encuentra en revisin y puede ser sujeto de cambios que seran notificados oportunamente) PRCTICA 3 MTODOS Y TCNICAS

DE AISLAMIENTO DE HONGOS Y HETEROKONTAS FITOPATGENOS

I. INTRODUCCIN Al igual que los dems seres vivos, los microorganismos necesitan nutrientes apropiados, as como condiciones ambientales favorables para su desarrollo y reproduccin. En esta prctica de laboratorio se darn los lineamientos para poder realizar el aislamiento y cultivo de Hongos y Heterokontas fitopatgenos OBJETIVO: Reconocer las tcnicas para el aislamiento de agentes fitopatgenos a partir de material vegetal enfermo. III. INSTRUCCIONES PRE-PRACTICA Realice investigacin en libros de Microbiologa, Fitopatologa, pginas de Internet sobre: Mtodos y tcnicas para el aislamiento de agentes fitopatgenos a partir de tejido vegetal y de otros substratos, la tcnica de cultivos trampa y el uso de solucin de suelo Traer al laboratorio en pareja los siguientes materiales Dos muestras de material vegetal enfermo, una afectada por hongos (que no sea roya o carbn) y otra con dao ocasionado por Pythium o Phytophthora (tizn del tomate o de papa, pudricin de tallos o races). Tres manzanas verdes sanas y sin golpes o daos mecnicos, en su defecto tambin pueden traer tres tomates verdes o bien cualquier otra fruta que pueda ser utilizada como cultivo trampa segn referencias de literatura comprobables. Un rollo de Tape transparente de 2 (este ltimo deber quedar en el laboratorio como donacin) IV. AL INGRESO A LABORATORIO Entregar el informe de la Post practica 2. Entregar los materiales solicitados. Ojo (Los materiales sern colectados antes del ingreso al laboratorio, no podrn ingresar a la prctica si no traen el material solicitado)

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III.

MATERIAL Y EQUIPO Material vegetal enfermo, una manzana o tomate verde, caja con instrumental de laboratorio, cristalera estril (vidrios de reloj y cajas petri), medios de cultivo, mechero, alcohol, hipoclorito de sodio, agua destilada y estril, papel absorbente estril, asa, pinzas, atomizador, papel absorbente, film, marcador indeleble, microondas, campana de flujo laminar.

VI.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ORGANIZACIN DE MATERIALES Al inicio del laboratorio se dar una breve exposicin sobre el cultivo de los microorganismos. Todo el material a utilizar durante el proceso de cultivo de microorganismos debe estar esterilizado. Cristalera, medios de cultivo, papel y agua, La mesa o el lugar de trabajo debe estar lo ms ordenado posible y libre de cualquier artculo o material que no se vaya a utilizar durante el proceso cultivo de microorganismos. Preparacin de la muestra infectada. Cortar porciones de tejido vegetal de aproximadamente 0.5 x 0.5 cm., tratando de abarcar tejido sano y enfermo. Se colocaran 4 porciones por caja petri, se sembrarn 2 cajas petri y 2 tubos de ensayo, por lo que en total el estudiante deber obtener 10 porciones de tejido vegetal. Los cuadritos deber colocarlos en papel filtro.

Esquema para la toma de tejido vegetal con sntomas de enfermedad para procesarlo previo a la siembra en medio de cultivo.

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PREPARACIN DEL LABORATORISTA Antes de iniciar el trabajo deber lavarse las manos con agua y jabn, luego deber humedecrselas con alcohol etlico al 70%. Cuando est trabajando: No deber exhalar sobre la caja petri, tubo de ensayo frasco o recipiente que contiene el medio y en el cual va a cultivar el microorganismo. Cuando introduzca el tejido enfermo en la caja de petri deber hacerlo rpido y sin que el mismo roce las paredes internas o externas del recipiente. As mismo, no debe tocar otra superficie que no sea el medio y el instrumento que se utiliza para el traslado del tejido enfermo. PREPARACIN DE MESA E INSTRUMENTOS DE TRABAJO Los instrumentos de trabajo, pinza, asas, agujas, etc. antes y despus de utilizarse debern esterilizarse en el mechero y posteriormente, deber enfriarse en alcohol etlico, antes de utilizarse deber flamearse para eliminar el alcohol impregnado. Los vidrios de reloj sern desempacados y colocados en fila al lado izquierdo del mechero. En el primer vidrio de reloj se depositar agua estril; en el segundo, alcohol etlico; en el tercero, agua estril; en el cuarto, hipoclorito de sodio al 0.5% o sea 10% de solucin comercial de Cloro; en el quinto y en el sexto, agua estril. Los instrumentos a utilizar, el frasco con alcohol y las cajas de petri debern colocarse al lado derecho del mechero. PROCEDIMIENTO PARA EFECTUAR LA SIEMBRA Las porciones de tejido vegetal debern depositarse en el primer vidrio de reloj (agua estril). Seguidamente debern trasladarse al vidrio de reloj que contiene alcohol, debern permanecer aqu durante 30 seg. Posteriormente se trasladarn al siguiente vidrio de reloj que contiene agua estril, para eliminar el exceso de alcohol. Seguidamente se procede a pasarlos al siguiente vidrio de reloj con hipoclorito de sodio, debern permanecer durante a 30 segundos. Posteriormente debern pasarse sucesivamente en los dos vidrios de reloj que contienen agua estril. Colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estril, para quitarles el exceso de agua. Pasar las porciones de tejido a papel estril con el fin de eliminar el exceso de agua en los tejidos. Depositar las porciones de tejido en la caja petri o tubo de ensayo donde se har crecer el microorganismo.

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Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero, evitar exhalar sobre el medio de cultivo. Previo a introducir el tejido enfermo, debe flamear la boca del recipiente donde se cultivar el microorganismo. Las cajas petri debern identificarse con el nombre de la persona y da de laboratorio e incubarse a 28 C durante 8 das.

Agua estril estril

Alcohol etlico

Agua estril

NaClO4

Agua estril

Agua estril

Papel filtro

Siembra Desinfeccin y siembra de tejidos vegetales en medio de cultivo

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CULTIVO TRAMPA La tcnica de la manzana o tomate verde consiste bsicamente en ofrecer al microorganismo las substancias y elementos necesarios para activar las esporas de resistencia, en este caso se trabajara especficamente con Oomycetos (Pythium y Phytophthora) a) Las manzanas se lavan con agua corriente y desinfectan con alcohol etlico al 70%. Con un sacabocados a cada fruta se le hacen de 3 a 4 perforaciones, (1x1 cm.) y con una profundidad de 1.5 cm, sin desechar las porciones de fruta retirada. En la fotografa se muestra cmo se realizan las perforaciones.

b)

Perforado de la fruta de manzana por medio de sacabocados para dejar el espacio inocular la muestra de suelo o races

c)

d) e)

f)

g)

En cada una de las perforaciones se introduce suelo de cada una de las muestras colectadas procurando llenar el boquete preparado hasta el ras del pericarpio, como lo muestra las fotografas A y B El suelo de cada perforacin se hidrata con agua destilada, y se cubre con cinta adhesiva, como se observa en la fotografa C Cada manzana se identifica con el cdigo de origen de la muestra, para ello se utiliza marcador indeleble. La fotografa D muestra cmo se identifican las manzanas con el cdigo de cada muestra, y en la fotografa E, se muestra una fruta preparada con la tcnica del cultivo trampa lista para incubacin. Posteriormente incuban en un recipiente cerrado a temperatura ambiente por espacio de 36 a 48 horas, luego de las cuales pueden verse las lesiones ocasionadas por Pythium o Phytophthora alrededor de los puntos de inoculacin. En la fotografa F se muestra un proceso de incubacin a medio ambiente. Cuando la inoculacin resulta positiva y el agente coloniza dentro de la manzana, pueden observarse lesiones firmes color marrn rodeando los puntos de inoculacin. En la fotografa G se muestran los sntomas desarrollados y considerados como positivos a la presencia de Oomycetos en frutas de manzana inoculadas con un sustrato considerado como sospechoso de contener a alguno de estos patgenos

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h)

i)

Se procede al aislamiento in vitro en medio de cultivo selectivo (PARPBH), para ello se cortan las manzanas que presentan sntomas positivos y se procede a extraer tejido infectado de pulpa en la regin ms externa de la lesin o zona de avance. En la fotografa H se muestra la forma en que es separada cada una de las lesiones y se procede a observar su consistencia y velocidad de avance. Simultneamente se procede a cultivar las semillas de la fruta en solucin de suelo para que genere estructuras reproductivas.

A B

A) Inoculacin de cada muestra de suelo en cada una de las perforaciones hechas a la fruta de manzana. B) Hidratacin del suelo con agua destilada estril para favorecer el desarrollo de Oomycetos.

C D C) Selladoc de cada perforacin en la manzana inoculada con suelo con cinta adhesiva. D) Luego
de selladas las perforaciones se procede a identificar la fruta con marcador indeleble

E) Frutos de manzana inoculados con suelo, sellados e identificados ,

F) en proceso de

incubacin a temperatura ambiente

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H
G) Frutos de manzana inoculados con suelo, presentan sntomas de la presencia de Oomycetos, la fruta con la lesin externa, H) Fruta cortada para ser procesada en el siguiente paso del aislamiento

Tcnica de solucin de extracto de suelo Esta tcnica se utiliza para obtener estructuras reproductivas, como los esporangios. Se puede utilizar para extraer a partir de races infectadas, tallos o bien las semillas de la manzana colonizada, que presenten micelio, y as hacer un anlisis preliminar del agente presente. a) b) c) d) e) f) Se pesan 50 g de suelo y se mezclan con 500 cc de agua. Se deja por 24 horas reposando la solucin. Se toman 100 cc de la solucin y se afora a 1000 cc con agua destilada Se esteriliza en autoclave por 20 minutos a 15 psi La solucin se deja enfriar y est lista para utilizar. Para provocar desarrollo de esporangios, se colocan en una caja de Petri, 10 cc de la solucin y se depositan en ella las semillas con micelio de Pythium y Phytophthora, provenientes de las manzanas inoculadas con suelo o races y que dieron positivo. Se identifican las cajas y se dejan en incubadora a 23 C. El micelio crece en el trmino de 24-48 horas, en la fotografa a continuacin se presenta el resultado de una incubacin positiva.

g)

Semillas de manzana con micelio desarrollado en solucin de extracto de suelo, proveniente de muestras colectadas

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VI.

ACTIVIDADES POST PRCTICA Tomar datos del desarrollo del cultivo cada 24 horas Determinar el microorganismo aislado. Prepare el reporte post practica que contenga el resumen de las actividades realizadas, los resultados obtenidos y adems realice investigacin bibliogrfica y responda los siguientes cuestionamientos: o Que otras tcnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que afectan plantas o Que otros Medios selectivos pueden ser utilizados para el aislamiento de Hongos y Heterokontas o Cmo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo fitopatgeno.

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