Protocolo de procedimientos de laboratorio

2013

I.

PROPOCITO: Pormenorizar los procesos de aislamiento bacteriano para Salmonella. Bajo un solo procedimiento y como parte del sistema de Control de Calidad del laboratorio de Microbiologa.

II.

ALCANCE: Estos procedimientos sern usados para aislar las bacterias antes mencionadas en muestras de heces, tejidos intestinales e hisopados.

III.

DEFINICIONES: ****** REFERENCIAS:

IV.

V.

MUESTRAS: Tejidos intestinales, heces e hisopados (rectales e intestinales).

VI.

REQUISITOS: 1. Disponer de los equipos, materiales y reactivos necesarios. 2. Los medios deben ser preparados con anticipacin 3. La persona encargada de manipular la prueba debe estar entrenada para el uso de material infeccioso y tcnicas de siembra y aislamiento. 4. Se debe usar guantes, mascarilla y mechero por todo el tiempo que dure la prueba. 5. Las muestras deben ser preferencialmente frescas o refrigeradas.

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VII. PROCEDIMIENTOS:

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Etapa I: Preparacin de muestras. Debido a la naturaleza de la bacteria sospechosa las muestras se tendran en incubacion en medio anaerobico utilizando para eso las jarras de anaerobiosis.

A)Medio de preenriquesimiento: Pesar 10 a 25 g de la muestra y agregar en proporcin de 1/10 agua peptonada tamponada (APT). Medio: caldo de preenriquesimiento APT Temperatura de incubacin: 37 1 C Tiempo: 16 20 horas. Condiciones: Anaerobiosis. B) Medio de enriquecimiento: Medio: caldo de RappaportVassiliadis T de incubacin: 41.5C Tiempo: 18 24 horas. Condiciones: Anaerobiosis. Etapa II: Siembra de las muestras en medio de cultivo

Del Caldo Rappaport-Vassiliadis que fue incubado se toman las muestras necesarias para realizar las siembras en los siguientes medios:
a) Medio general:

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Utilizamos el medio general Trypticasa de Soya que es un medio solido que permite el crecimiento de organismos tanto positivos como negativos. Medio: Agar TSA T de incubacin: 45C Tiempo: 24 48 horas. Condiciones: Anaerobiosis.
b) Medio Selectivo:

Utilizamos el medio Agar XLD. Es un medio slido en el cual crece selectivamente Salmonella spp. e inhibe el crecimiento de bacteria Gram positivas. Medio: Agar XLD T de incubacin: 37C Tiempo: 18-24 horas. Condiciones: Anaerobiosis. Utilizamos el medio E M B agar (Eosina y azul de metilo).Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Las colonias de Salmonella son translcidas de color mbar o incoloras. Medio: EMB agar T de incubacin: 35-37C Tiempo: 18-24 horas. Condiciones: Anaerobiosis Utilizamos el medio salmonella shigella agar para observar la no fermentacin de lactosa (colonias incoloras) y la presencia de H2S (pigmento negro). Medio: salmonella shigella T de incubacin: 35-37C Tiempo: 24 48 horas. Condiciones: Anaerobiosis.

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Etapa III: Identificacin bioqumica bacteriana. 1. Tomamos colonias sospechosas de Salmonella ye identificamos las bacterias mediante tcnicas de coloracin. Describir la morfologa colonial de cada bacteria en los medios sembrados y considerando los siguientes aspectos: Tamao: (dimetro en mm) de la colonia. Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, etc. Elevacin: plana, elevada, convexa, pulvinada o umbonada. Margen: entero, ondulado, lobulado, dentado, filamentoso o encrespado. Tipo de superficie: lisa, rugosa o granular. Caractersticas pticas: opaca o translcida. Produccin de pigmentos. Luego de la muestra obtenida de TSA elegir una colonia y realizar las siguientes coloraciones. a) Coloracin Gram. Para observar la formar de la bacteria y a su vez confirmar si es gram positiva o gram negativa. b) Coloracin tinta china. Para observar la capsula de la bacteria si es que la tuviera. 2. Realizar el diagnostico diferencial a travs de pruebas bioqumicas. Las pruebas bioqumicas a realizarse incluyen: prueba de la catalasa, prueba de la oxidasa, fermentacin de azucares, reduccin de nitritos, produccin de indol, movilidad, crecimiento en citrato, produccin de ureas