DESARROLLO DE LIPASAS CON APLICACIN EN LA INDUSTRIA PAPELERA

F. I. Javier Pastor , Nria Prim , Oscar Gallardo , Cristian Ruiz , Teresa Vidal , Pilar Diaz
1 1 1 1 1 2 1

Espaa. Departamento de Microbiologa. Facultad de Biologa. Universidad de Barcelona. Av. Diagonal 645, 08028 Barcelona. Tel: 34-93-4034626. Fax: 34-93-4034629. fpastor@bio.ub.es 2 Espaa. Departamento de Ingeniera Textil y Papelera. Escuela Tcnica Superior de Ingenieros Industriales (ETSEIT). C/ Coln 11, 08222 Terrassa. Tel: 34-93-7398288. Fax: 34-93-7398101. tvidal@etp.upc.es.

Resumen
En el presente trabajo se ha caracterizado una lipasa bacteriana y analizado su potencial aplicabilidad en la industria papelera. A partir de la cepa lipoltica Bacillus sp. BP-7, aislada en nuestro grupo, se ha clonado y caracterizado la lipasa EstA1 con gran actividad enzimtica. El enzima presenta un peso molecular de 52 kDa y un punto isoelctrico de 5,15. La secuenciacin del gen codificante indica que el enzima es homlogo a las lipasas de la subclase bacteriana de carboxilesterasas del tipo B. El enzima presenta mxima actividad lipoltica a 45C y pH 7,5, mostrando un nivel alto de actividad a pH 8,4. El enzima permanece estable al menos durante 8 horas a 45C y pH 7,5. Estas caractersticas permiten su utilizacin en las condiciones del proceso de destintado del papel reciclado.

Palabras Clave: Destintado, Lipasas, Enzimas, Reciclado

Introduccin
La aplicacin de enzimas en la industria papelera ha permitido el desarrollo de tecnologas alternativas de fabricacin, ms respetuosas con el medio ambiente que las convencionales y que, en muchos casos, pueden denominarse tecnologas limpias. En este contexto, la aplicacin de xilanasas como potenciadores del blanqueo de la pasta de papel permite el establecimiento de secuencias de blanqueo ECF y TCF rentables, con una importante disminucin en los vertidos de organoclorados absorbibles (AOX) (1). Dada la complejidad y variedad de los procesos papeleros, varios grupos de investigacin estn estudiando la aplicacin de enzimas en otras etapas de fabricacin, tal como el uso de celulasas para el desgote o como potenciadoras del refinado (2). La fabricacin de papel a partir de fibras recicladas constituye otra alternativa papelera respetuosa con el medio ambiente. Una de las etapas clave en el reciclado de papel es el destintado de las fibras. El uso de celulasas, hemicelulasas y amilasas para el destintado enzimtico de las fibras es objeto de estudio de diversos laboratorios (3,4). Dado que muchas tintas son de naturaleza lipdica, una aproximacin diferente es el uso de enzimas con actividad lipasa para facilitar el destintado del papel. En el presente trabajo se ha caracterizado una lipasa bacteriana y evaluado su actividad en las condiciones del proceso de destintado del papel reciclado. Los resultados indican que la enzima presenta unas propiedades adecuadas para su uso papelero. En el momento actual se est evaluando la potencial aplicacin de la enzima en el destintado del papel reciclado y en la eliminacin de pitch.

Metodologa
La construccin de la genoteca de Bacillus sp. BP-7 en la cepa hospedadora Escherichia coli Xl1 fue realizada utilizando como vector el plsmido pUC19, por el mtodo descrito por Blanco et al. (2). El anlisis de la actividad lipasa de los clones recombinantes obtenidos se realiz en placas de medio slido suplementado con tributirina al 1% y Rodamina B al 0.0002% (5). El cultivo del clon recombinante E. coli/pUCE1 y la obtencin de lipasa se realiz tal como describen Prim et al. (6). La actividad lipasa de los extractos celulares crudos o de los sobrenadantes de cultivo se determin midiendo la liberacin de para-nitrofenol (pNP) o 4-metilumbeliferona (MUF) a partir de sustratos derivados de pNP o MUF (6). Una unidad de actividad enzimtica se defini como la cantidad de enzima que libera 1 mol de pNP o MUF por minuto en las condiciones de ensayo. Los anlisis mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico (SDSPAGE) o isoelectroenfoque, as como los de actividad enzimtica en geles (zimograma) se realizaron tal como describen Diaz et al. (7). La secuenciacin de la lipasa y los anlisis de homologa de secuencia se realizaron tal como describen Blanco et al. (2)

Resultados
Se construy una genoteca de la cepa lipoltica Bacillus sp. BP-7 y se realiz el escrutinio de clones productores de lipasas en placas de medio slido con tributirina. Como resultado se aislaron tres clones con elevada actividad lipasa, que contenan un fragmento de ADN heterlogo comn. De entre ellos el clon E. coli Xl1/pUCE1 fue seleccionado para estudios posteriores. El anlisis de la actividad enzimtica de extractos celulares de E. coli Xl1/pUCE1 sobre sustratos derivados de pNP y MUF mostr que la enzima clonada hidrolizaba eficientemente steres de cidos grasos de cadena corta (Tabla 1). La enzima mostr mxima actividad sobre Tabla 1. Especificidad de sustrato de EstA1 Sustrato pNP-Acetato pNP-Butirato pNP-Valerato pNP-Caproato pNP-Caprilato pNP-Caprato pNP-Laurato pNP-Palmitato pNP-Estearato MUF-Butirato MUF-Palmitato MUF-Estearato MUF-Oleato
a

Actividad (u/mg ) 0.215 2.28 2.10 2.09 0.78 9.4x10 2.5x10 1x10 1x10
-2 -2

-1

-3 -5

0.28 ND ND
a a -3

3x10

No detectable

pNP-butirato (C4), mientras que la actividad decreca a medida que la longitud de los cidos grasos aumentaba. El enzima mostr una cintica de hidrlisis de sustrato del tipo MichaelisMenten, con una KM de 0.026 mM para el MUF-butirato y 0.055 mM para el MUF-oleato. Estos datos indican que la lipasa clonada posea actividad tipo esterasa (8), por lo cual el enzima se denomin EstA1. La secuencia de nucletidos del gen codificante de la lipasa clonada fue determinada. La secuencia proteica deducida de la del gen secuenciado indic que la lipasa estaba constituda por 487 aminocidos. La secuencia proteica deducida mostr homologa con las 189 carboxilesterasas del tipo B (9). La enzima clonada contena la secuencia consenso GES AG, correspondiente al centro cataltico de las lipasas/esterasas de dicha familia (9). Las caractersticas moleculares de la enzima clonada fueron determinadas por tcnicas electroforticas seguidas de zimograma. Los anlisis de extractos del clon E. coli Xl1/pUCE1 mediante SDS-PAGE e isoelectroenfoque revelaron que la lipasa producida en el clon recombinante muestra un peso molecular aparente de 53 kDa y un punto isoelctrico de 5,1 (Figura 1).

A
kDa pI

53 1 2 3

5.1 1 2

Figura 1. Anlisis de EstA1 en geles de poliacrilamida con SDS (A) o de isoelectroenfoque (B). 1: extractos de E. coliXl1/pUCE1; 2: sobrenadante de cultivo de Bacillus sp. BP-7; 3: extractos control negativo de E. coliXl1/pUC19.

El estudio del efecto de las condiciones ambientales en la actividad enzimtica de EstA1 mostr que la temperatura y pH ptimos de la actividad lipasa eran 45C y pH 7,5, respectivamente. Sin embargo, la enzima presenta un buen nivel de actividad a temperaturas y pH diferentes a los ptimos. De esta forma, a pH alcalinos inferiores a 9,0 la enzima mostr gran actividad (Figura 2). La lipasa EstA1 mostr gran estabilidad a temperaturas de hasta 45C, no mostrando prdida de actividad cuando se incub en tampones a pH 7,5 y temperaturas entre 0 y 45C durante 8 h. Sin embargo a temperaturas superiores a 50C la enzima sufri una rpida inactivacin. El estudio del efecto de cationes metlicos en la actividad de la enzima mostr que la lipasa se 2+ + 2+ 2+ 2+ inhiba por completo en presencia de Hg y Ag . Los cationes Cu , Zn y Ni causaban 2+ tambin una importante inhibicin, mientras que en presencia de Mg la actividad resultaba estimulada en un 40% sobre el control. La enzima result inhibida por cido ftico y por agentes modificadores de triptfano y cistena tales como N-bromosuccinimida (NBS), y phidroximercuribenzoato. El fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) caus una importante

inhibicin de la actividad, hecho que concuerda con la presencia de un resduo serina en el centro activo de la enzima.

120

120

% Actividad relativa

100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80

% Actividad relativa

100 80 60 40 20 0 0 2 4

Temperatura

pH

10

12

Figura 2. Influencia de la temperatura y el pH en la actividad de EstA1

Discusin
Los trabajos realizados han permitido caracterizar una lipasa bacteriana con elevada actividad sobre steres de cidos grasos de cadena corta. La especificidad de sustrato de la lipasa clonada, as como sus caractersticas cinticas indican claramente que pertenece al grupo de las esterasas. La secuenciacin del gen codificante indica que la enzima clonada presenta elevada homologa con las de la subclase bacteriana de carboxilesterasas del tipo B. Este grupo de lipasas presenta enzimas con importantes aplicaciones biotecnolgicas potenciales (10). Los estudios de especificidad de sustrato indican una preferencia por steres de cadena corta, aunque muestran que la enzima presenta tambin actividad sobre steres de cidos grasos de cadena media y larga. Los sustratos sintticos utilizados para evaluar la actividad del enzima (derivados del pNP y MUF) presentan una composicin distinta a las tintas de impresin, que a su vez muestran una gran heterogeneidad y variedad en cuanto a composicin. Por este motivo, para analizar la potencial actividad de la enzima en el proceso del destintado, se hace necesario realizar el estudio directamente mediante ensayo papelero. Los estudios de la influencia del pH y temperatura en la actividad enzimtica indican que la enzima muestra elevada actividad en las condiciones del destintado del papel reciclado. En concreto, a pH 8,4, habitual en el proceso, la enzima presenta un 60% de la actividad mxima. Este hecho, conjuntamente con la elevada estabilidad del enzima, posibilitan el uso industrial de la lipasa caracterizada. En el momento actual se est procediendo a la sobreproduccin de la enzima en cantidades elevadas para su posterior evaluacin papelera en el destintado del papel reciclado, as como en la eliminacin del pitch.

Conclusiones
Se ha clonado y caracterizado la lipasa EstA1 que pertenece a la subclase bacteriana de carboxilesterasas del tipo B. La enzima presenta un tamao molecular aparente de 53 kDa y un punto isoelctrico de 5,1. La lipasa caracterizada muestra elevada actividad en las condiciones del proceso de destintado del papel reciclado.

Agradecimientos
Este trabajo ha sido realizado con apoyo financiero de la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa (CICYT, Espaa), proyecto ALI97-0356-C02-02, y por el II Pla de Recerca de

Catalunya (Generalitat de Catalunya), proyecto 1997SGR 00473. Agradecemos la colaboracin tcnica de M. Snchez y M. Soriano.

Referencias
1. Viikari, L., Kantelinen, A.., Sundquist, J. and Linko, M. Xylanases in bleaching: From an idea to the industry, FEMS Microbiol. Rev., vol.13, pp.335-330. (1994) 2. Blanco, A.,Daz, P., Martnez, J., Vidal, T., Torres, A. L. and Pastor, F. I. J. Cloning of a new endoglucanase gene from Bacillus sp. BP-23 and characterisation of the enzyme. Performance in paper manufacture from cereal straw, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 50, pp.48-54. (1998) 3. Bajpai, P. and Bajpai, P.K. Deinking with enzymes: a review, Tappi J., vol.81, num. 12, pp. 111-117. (1998) 4. Zollner, H.K. and Schroeder, L.R. Enzymatic deinking of nonimpact printed white office paper with -amylase, Tappi J., vol.81, num.3, pp.166-170. (1998) 5. Kouker G. and Jaeger, K. E. Specific and sensitive plate assay for bacterial lipases, Appl Environ. Microbiol., vol.53, pp.211-213. (1987) 6. Prim, N., Blanco, A., Martnez, J., Pastor, F.I.J. and Diaz, P. estA, a gene coding for a cell-bound esterase from Paenibacillus sp. BP-23, is a new member of the bacterial subclass of type B carboxylesterases, Res. Microbiol., vol.151, pp.303-312. (2000) 7. Diaz, P., Prim, N. and Pastor, F.I.J. Direct fluorescence-based lipase activity assay, BioTechniques, vol.27, num.4, pp.697-699. (1999) 8. Jaeger, K. E., Dijkstra, B. W. and Reetz, M. T. Bacterial biocatalysts: molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of lipases, Annu. Rev. Microbiol. vol.53, pp.315-351. (1999) 9. Wang, C.S., and Hartsuck, J.A. Bile salt-activated lipase. A multiple function lipolytic enzyme, Biochim. Biophys. Acta, vol.1166, pp.1-19. (1993) 10. Jaeger, K.E. and Reetz, M.T. Microbial lipases form versatile tools for biotechnology, Trends Biochem. Biotech., vol.16, pp.396-403. (1998)