TIOSSEM

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING
CENTRO DE CINCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
SNTESE E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO -(-)-BISABOLOL
Dissertao apresentada por Alan Patrick da Silva ao Programa de Ps-Graduao em Qumica do Departamento de Qumica do Centro de Cincias Exatas da Universidade Estadual de Maring como parte dos requisitos para a obteno do ttulo de Mestre em Qumica
MARING, JUNHO/2009
Alan Patrick da Silva
SNTESE E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO
-()-BISABOLOL
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING
Maring Paran Brasil

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING CENTRO DE CINCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
ALAN PATRICK DA SILVA
SNTESE E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO -()-BISABOLOL
Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Qumica Aplicada do Departamento de Qumica da Universidade Estadual de Maring, como um dos requisitos para a obteno do ttulo de Mestre em Qumica
rea de Concentrao: Sntese Orgnica
Orientadora: Profa. Dra. Cleuza Conceio da Silva
Maring PR, junho de 2009

Dados Internacionais de Catalogao-na-Publicao (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maring PR., Brasil)
Silva, Alan Patrick da S586s Sntese e avaliao da atividade antitumoral de tiossemicarbazonas derivadas do -(-)-bisabolol / Alan Patrick da Silva. -- Maring : 2009. 220 f. : il. color., figs., tabs., esq.
Orientador : Prof. Dr. Cleuza Conceio da Silva. Dissertao (mestrado) - Universidade Estadual de Maring, Departamento de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Qumica Aplicada, 2009.
1. Tiossemicarbazonas. 2. Leucemia linfide (K-562) Atividade antitumoral. 3. -bisabolol. 4. Atividade antitumoral - Clulas de leucemia. 5. Terpenos - bisabolol. 6. Leucemia linfide - -bisabolol - Estudo. 7. Leucemia linfide - Tiossemicarbazonas - Estudo. I. Silva, Cleuza Conceio da, orient. II. Universidade Estadual de Maring. Departamento de Qumica. Programa de Ps-Graduao em Qumica Aplicada. III. Ttulo.
CDD 21.ed.547.2
Este trabalho dedicado primeiramente a Deus, pela vida, oportunidade e capacitao; a minha esposa Suziane, por todo o amor, apoio e incentivo; a minha me Zenaide, por nunca ter desistido de lutar por mim e pelos meus irmos, por mais que a vida lhe impusesse to extremas dificuldades.

Honra o mdico por causa da necessidade, pois foi o Altssimo quem o criou. (Toda a medicina provm de Deus), e ele recebe presentes do rei: a cincia do mdico o eleva em honra; ele admirado na presena dos grandes. O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato no os despreza. Uma espcie de madeira no adoou o amargor da gua? Essa virtude chegou ao conhecimento dos homens. O Altssimo deu-lhes a cincia da medicina para ser honrado em suas maravilhas; e dela se serve para acalmar as dores e cur-las; o farmacutico faz misturas agradveis, compe ungentos teis sade, e seu trabalho no terminar, at que a paz divina se estenda sobre a face da terra. (...) Que sabedoria poderia ter o homem que conduz o arado, que faz ponto de honra aguilhoar os bois, que participa de seu labor, e s sabe falar das crias dos touros? Ele pe todo o seu corao em traar sulcos, e o seu cuidado engordar novilhas. Igualmente acontece com todo carpinteiro, todo arquiteto, que passa no trabalho os dias e as noites. (...) Assim acontece com o ferreiro (...). Ele aplica o seu corao em aperfeioar a sua obra, e pe um cuidado vigilante em tornla bela e perfeita. O mesmo sucede com o oleiro (...). Com o seu brao d forma ao barro, torna-o malevel com os ps, aplica o seu corao em aperfeioar o verniz, e limpa o forno com muita diligncia. Todos esses artistas esperam (tudo) de suas mos; cada um deles sbio em sua profisso. Sem eles nenhuma cidade seria construda, nem habitada, nem freqentada; mas eles (...) no se sentaro nas cadeiras dos juzes, no entendero as disposies judicirias, no apregoaro nem a instruo nem o direito, nem sero encontrados a estudar as mximas. Entretanto, sustentam as coisas deste mundo. (...) O sbio procura cuidadosamente a sabedoria de todos os antigos, (...) guarda no corao as narrativas dos homens clebres e penetra, ao mesmo tempo, nos mistrios das mximas, nos segredos dos provrbios e vive com o sentido oculto das parbolas. Exerce o seu cargo no meio dos poderosos e comparece perante aqueles que governam. (...) Desde o alvorecer aplica o corao viglia para se unir ao Senhor que o criou, e ora na presena do Altssimo. Abre sua boca para orar e pede perdo de seus pecados.
Eclo. 38 40
AGRADECIMENTOS
Ao Deus e Senhor da minha vida, Jesus Cristo, por permitir e possibilitar a realizao deste trabalho; minha esposa Suziane, por me apoiar, incentivar e ajudar em todos os momentos; minha me Zenaide e meu padrasto Aguinaldo, pelo apoio e compreenso; Aos meus irmos Cludio, Gilda, Lilian, Rhaulivan, Jefferson e Alyson pelo apoio e amizade; Ao meu sogro Dirceu e minha sogra Suely, pelo carinho e apoio; Profa. Dra. Cleuza Conceio da Silva, pelo crdito, projeto, orientao, ensinamentos, respeito e amizade; Profa. Dra. Ceclia Maria Alves de Oliveira, pelas contribuies: na interpretao de dados e no projeto, com os dados referentes realizao da primeira etapa de reao, e elaborao do artigo; Manuele, meu brao direito no laboratrio, pela grande amizade, colaborao na realizao da parte experimental e representao nos congressos; empresa Citrleo Indstria e Comrcio de leos Essenciais Ltda., por gentilmente ceder a matria-prima para a realizao deste trabalho; Ao Prof. Dr. Lcio Cardozo Filho, do DEQ UEM, pelo contato com a empresa Citrleo e valiosas dicas; Profa. Dra. Silvana Maria de Oliveira Santin, do DQI UEM, pela amizade e ensinamentos; Ao Paulo (Coco), pela colaborao na realizao da parte experimental; Aos meus amigos e companheiros de laboratrio Manuele, Elisa, Jlio, Ana Paula, Fbio, Bia, Vanessa, Narcimrio, Sabrina, Paulo, Paulo (Cco), Glucio, Thiago, Rato, Llian, Rafo, Hugo, Rodrigo, Las e Tayline, pela amizade e os cafs compartilhados; Ivnia, pela amizade, excelentes espectros de RMN, dicas e prestatividade; Ao Claudemir e a Cristina pela constante boa vontade, simpatia no atendimento e nos esclarecimentos. Ao Prof. Dr. Joo Ernesto de Carvalho, pesquisadora Dra. Ana Lcia T. G. Ruiz e ao CPQBA Unicamp, pela avaliao de atividade biolgica antitumoral dos compostos sintetizados; Ao CnPQ e ao DQI UEM, pelo suporte finaceiro;

Ao Programa de Ps-graduao em Qumica Aplicada, do DQI UEM, pela oportunidade de realizao deste trabalho; A todos os professores do DQI UEM, pelos conhecimentos adquiridos ao longo destes anos; em especial, Mauro (Qumica Geral), Clara in memorian (Qumica Geral Experimental), Elza (Qumica Inorgnica), Maria Helena (Qumica Orgnica), Rosana (Qumica Inorgnica Experimental), Eduardo Toledo (Qumica Inorgnica Experimental), Silvana (Qumica Orgnica Experimental), Helena (Qumica Analtica Quantitativa), Florngela (FsicoQumica), Cleuza (Qumica Orgnica II), Hioka (Fsico-Qumica Experimental), Solange (Instrumentao do Ensino em Qumica), Willian (Anlise Instrumental) e Jac (Metodologia de Ensino em Qumica e Prtica de Ensino em Qumica, Fsica e Matemtica); Ao Prof. Carlos Vincius de Souza, desde os tempos de ensino mdio, pela amizade e grande incentivo pelo meu gosto a Qumica; Aos meus grandes amigos Valdenilson, Ronnie e Dcio, pelo companheirismo e pela torcida em todos estes anos; E a todos aqueles que, de alguma maneira, contriburam para a realizao deste trabalho. Muito Obrigado!
SUMRIO
NDICE DE ESQUEMAS NDICE DE FIGURAS NDICE DE TABELAS ABREVIAES E SMBOLOS RESUMO ABSTRACT i i vi viii x xii
1. INTRODUO 1.1. Tiossemicarbazonas 1.1.1. Aspectos Qumicos 1.1.2. Aspectos Biolgicos 1.1.3. Tiossemicarbazonas Derivadas de Terpenos Naturais 1.2. -Bisabolol 1.2.1. Aspectos Qumicos 1.2.2. Aspectos Biolgicos 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivos Gerais 2.2. Objetivos Especficos 3. RESULTADOS E DISCUSSES 3.1. -Bisabolol 3.2. Rota Sinttica 3.2.1. 1 Etapa: Sntese do Isotiocianato e do Tiocianato Derivados do -Bisabolol 3.2.1.1. Condies Experimentais 3.2.1.2. Intermedirios de Reao 3.2.2. Sntese da Tiossemicarbazida Derivada do -Bisabolol
1 2 2 4 8 12 12 13 15 15 15 17 17 17 18 18 20 22
3.2.2.1. Condies Experimentais 3.2.2.2. Intermedirios de Reao 3.2.3. Sntese das Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol 3.2.3.1. Condies Experimentais 3.2.3.2. Intermedirios de Reao 3.3. Avaliao de Atividade Antitumoral 4. CARACTERIZAO ESTRUTURAL 4.1. -Bisabolol 4.2. Isotiocianato e Tiocianato Derivados do -Bisabolol 4.2.1. Isotiocianato 4.2.2. Tiocianato 4.3. Tiossemicarbazida Derivada do -Bisabolol 4.4. Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol 4.4.1. Benzaldedo-tiossemicarbazona 4.4.2. Benzaldedo-tiossemicarbazonas Substitudas 4.4.2.1. (p-Metil, p-Metxi, p-Hidrxi e p-Dimetilamino)Benzaldedo-tiossemicarbazonas 4.4.2.2. (o, m e p)-Nitro-Benzaldedo-tiossemicarbazonas 4.4.2.3. (o, m e p)-Cloro-Benzaldedo-tiossemicarbazonas 4.4.3. Acetofenona- tiossemicarbazona 4.4.4. Benzofenona- tiossemicarbazona 5. CONCLUSES 6. PARTE EXPERIMENTAL 6.1. Instrumentao 6.2. Mtodos Cromatogrficos 6.3. Solventes e Reagentes 6.4. Separao do -Bisabolol a Partir do leo de Candeia 6.5. Sntese e Purificao do Isotiocianato Derivado do -Bisabolol
22 24 24 24 29 30 42 42 51 51 61 71 81 81 92 92 127 157 183 193 203 205 205 205 206 206 207
6.6. Sntese e Purificao da Tiossemicarbazida Derivada do - 207

Bisabolol 6.7. Sntese e Purificao da Srie de Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol 6.8. Determinao do do -Bisabolol e dos Compostos Sintetizados 208 209 210 211 222
6.9. Determinao do Ponto de Fuso dos Compostos 2527 6.10. Avaliao de Atividade Antitumoral 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
NDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1: Formas tautomricas das tiossemicarbazonas. Esquema 2: Rota sinttica para as tiossemicarbazonas derivadas do canfeno. Esquema 3: Rota sinttica para a obteno das tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol. Esquema 4: Proposta de intermedirios de reao para a formao de 17 e 18. Esquema 5: Ligao de hidrognio do grupo OH com o HSCN direcionando sua adio a dupla ligao da cadeia aberta. Esquema 6: Proposta de intermedirios de reao para a formao de 19. Esquema 7: Proposta de intermedirios de reao para a formao de 20 32. 30 22 24 21 18 4 9
NDICE DE FIGURAS
Figura 1: Numerao da cadeia principal das tiossemicarbazonas Figura 2: Arranjos estruturais anti e sin de tiossemicarbazonas Figura 3: Efeito de ressonncia retirador de eltrons do grupo nitro-fenil sobre a carbonila Figura 4: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 15 Figura 5: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 15 Figura 6: Espectro de RMN
13
3 3 28 45 46 47 48 49 50 54 55 56 57 58 59
i
C em CDCl3 do composto 15
Figura 7: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 15 Figura 8: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 15 Figura 9: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 15 Figura 10: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 17 Figura 11: Espectro de Massas (70eV, TR=2,17) do composto 17 Figura 12: Espectro de RMN H em CDCl3 do composto 17 Figura 13: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 17 Figura 14: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 17 Figura 15: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 17
1
Figura 16: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 17 Figura 17: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 18 Figura 18: Espectro de Massas (70eV, TR=2,17) do composto 18 Figura 19: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 18 Figura 20: Espectro de RMN
13
60 64 65 66 67 68 69 70 74 75 76 77 78 79 80 84 85 86 87 88 89 90 95 96 97 98 99 100 101 103 104 105 106 107

ii
Figura 21: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 18 Figura 22: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 18 Figura 23: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 18 Figura 24: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 19 Figura 25: Espectro de Massas (70eV, TR=1,05) do composto 19 Figura 26: Espectro de RMN H em CDCl3 do composto 19 Figura 27: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 19 Figura 28: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 19 Figura 29: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 19 Figura 30: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 19 Figura 31: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 20 Figura 32: Espectro de Massas (70eV, TR=1,53) do composto 20 Figura 33: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 20 Figura 34: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 20 Figura 35: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 20 Figura 36: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 20 Figura 37: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 20 Figura 38: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 21 Figura 39: Espectro de Massas (70eV, TR=1,38) do composto 21 Figura 40: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 21 Figura 41: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 21 Figura 42: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 21 Figura 43: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 21 Figura 44: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 21 Figura 45: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 22 Figura 46: Espectro de Massas (70eV, TR=1,44) do composto 22 Figura 47: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 22 Figura 48: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 22 Figura 49: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 22
1
Figura 50: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 22 Figura 51: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 22 Figura 52: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 23 Figura 53: Espectro de Massas (70eV, TR=2,04) do composto 23 Figura 54: Espectro de RMN H em CDCl3 do composto 23 Figura 55: Espectro de RMN
13 1
108 109 111 112 113 114 115 116 117 119 120 121 122 123 124 125 130 131 132 133 134 135 136 137 139 140 141 142 143 144 145 146 148 149
iii
Figura 56: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 23 Figura 57: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 23 Figura 58: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 23 Figura 59: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 24 Figura 60: Espectro de Massas (70eV, TR=2,09) do composto 24 Figura 61: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 24 Figura 62: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 24 Figura 63: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 24 Figura 64: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 24 Figura 65: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 24 Figura 66: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 25 Figura 67: Espectro de Massas (70eV, TR=1,72) do composto 25 Figura 68: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 25 Figura 69: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 25 Figura 70: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 25 Figura 71: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 25 Figura 72: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 25 Figura 73: Ampliao do espectro de RMN HMQC do composto 25 Figura 74: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 26 Figura 75: Espectro de Massas (70eV, TR=1,75) do composto 26 Figura 76: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 26 Figura 77: Espectro de RMN
13
Figura 78: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 26 Figura 79: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 26 Figura 80: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 26 Figura 81: Curva de DSC (10C min-1, 50mL min-1) do composto 26 Figura 82: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 27 Figura 83: Espectro de Massas (70eV, TR=1,98) do composto 27
Figura 84: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 27 Figura 85: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 27 Figura 86: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 27 Figura 87: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 27 Figura 88: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 27 Figura 89: Curva de DSC (10C min , 50mL min ) do composto 27 Figura 90: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 28 Figura 91: Espectro de Massas (70eV, TR=1,73) do composto 28 Figura 92: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 28 Figura 93: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 28 Figura 94: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 28 Figura 95: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 28 Figura 96: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 28 Figura 97: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 29 Figura 98: Espectro de Massas (70eV, TR=1,44) do composto 29 Figura 99: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 29 Figura 100: Espectro de RMN
13 -1 -1
150 151 152 153 154 155 159 160 161 162 163 164 165 167 168 169 170 171 172 173 175 176 177 178 179 180 181 185 186 187 188 189 190 191
iv
Figura 101: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 29 Figura 102: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 29 Figura 103: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 29 Figura 104: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 30 Figura 105: Espectro de Massas (70eV, TR=1,29) do composto 30 Figura 106: Espectro de RMN H em CDCl3 do composto 30 Figura 107: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 30 Figura 108: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 30 Figura 109: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 30 Figura 110: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 30 Figura 111: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 31 Figura 112: Espectro de Massas (70eV, TR=1,66) do composto 31 Figura 113: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 31 Figura 114: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 31 Figura 115: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 31 Figura 116: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 31 Figura 117: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 31
1
Figura 118: Espectro de IV (pastilha de KBr) do composto 32 Figura 119: Espectro de Massas (70eV, TR=2,04) do composto 32 Figura 120: Espectro de RMN 1H em CDCl3 do composto 32 Figura 121: Espectro de RMN 13C em CDCl3 do composto 32 Figura 122: Espectro de RMN DEPT em CDCl3 do composto 32 Figura 123: Espectro de RMN COSY em CDCl3 do composto 32 Figura 124: Espectro de RMN HMQC em CDCl3 do composto 32 Figura 125: Grfico de % de crescimento x concentrao para DR. Figura 126: Grfico de % de crescimento x concentrao para 16. Figura 127: Grfico de % de crescimento x concentrao para 17. Figura 128: Grfico de % de crescimento x concentrao para 18. Figura 129: Grfico de % de crescimento x concentrao para 19. Figura 130: Grfico de % de crescimento x concentrao para 20. Figura 131: Grfico de % de crescimento x concentrao para 21. Figura 132: Grfico de % de crescimento x concentrao para 22. Figura 133: Grfico de % de crescimento x concentrao para 23. Figura 134: Grfico de % de crescimento x concentrao para 24. Figura 135: Grfico de % de crescimento x concentrao para 25. Figura 136: Grfico de % de crescimento x concentrao para 26. Figura 137: Grfico de % de crescimento x concentrao para 27. Figura 138: Grfico de % de crescimento x concentrao para 28. Figura 139: Grfico de % de crescimento x concentrao para 29. Figura 140: Grfico de % de crescimento x concentrao para 30. Figura 141: Grfico de % de crescimento x concentrao para 31. Figura 142: Grfico de % de crescimento x concentrao para 32.
195 196 197 198 199 200 201 212 212 213 213 214 214 215 215 216 216 217 217 218 218 219 219 220 220
NDICE DE TABELAS
Tabela 1: Dados experimentais para a obteno de 17 e 18 Tabela 2: Dados experimentais para a obteno de 19 Tabela 3: Dados experimentais da obteno de 20 32 Tabela 4: Dados experimentais para a obteno de 20 Tabela 5: Valores de GI50 (g mL-1) de DR, 15 e 17 32 Tabela 6: Valores de TGI (g mL-1) de DR, 15 e 17 32 Tabela 7: Valores de LC50 (g mL-1) de DR, 15 e 17 32 Tabela 8: Dados de RMN 1H, 13C, DEPT, HMQC e COSY para 15 em CDCl3 Tabela 9: Dados de RMN 1H, 13C, DEPT, HMQC e COSY para 17 em CDCl3 Tabela 10: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 11: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 12: Dados de RMN H, CDCl3 Tabela 13: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 14: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 15: Dados de RMN H, CDCl3 Tabela 16: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 17: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 18: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 19: Dados de RMN 1H, CDCl3
13 13 13 13 1 13 13 13 1 13 13 13
20 23 26 27 31 33 35 44 53 63
C, DEPT, HMQC e COSY para 18 em C, DEPT, HMQC e COSY para 19 em 73 C, DEPT, HMQC e COSY para 20 em 83 C, DEPT, HMQC e COSY para 21 em 94 C, DEPT, HMQC e COSY para 22 em 102 C, DEPT, HMQC e COSY para 23 em 110 C, DEPT, HMQC e COSY para 24 em 118 C, DEPT, HMQC e COSY para 25 em 129 C, DEPT, HMQC e COSY para 26 em 138 C, DEPT, HMQC e COSY para 27 em 147
vi
Tabela 20: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 21: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 22: Dados de RMN H, CDCl3 Tabela 23: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 24: Dados de RMN 1H, CDCl3 Tabela 25: Dados de
1
13
C, DEPT, HMQC e COSY para 28 em 158 C, DEPT, HMQC e COSY para 29 em 166 C, DEPT, HMQC e COSY para 30 em 174 C, DEPT, HMQC e COSY para 31 em 184 C, DEPT, HMQC e COSY para 32 em 194
13
13
13
13
para o -bisabolol e seus derivados sintetizados
209 209 210
Tabela 26: Ponto de Fuso para os compostos 26 e 27 Tabela 27: Linhagens de clulas utilizadas na avaliao de atividade antitumoral
vii
ABREVIAES E SMBOLOS
13
Carbono-13 Cromatografia em coluna Cromatografia em camada delgada analtica Concentrao Espectroscopia de correlao (1H 1H) Dubleto Duplo dubleto Incremento sem distoro por transferncia de polarizao Dimetilssulfxido Calorimetria diferencial de varredura Eltron-volt Configurao espacial onde os grupos de maior prioridade esto em lados opostos em uma molcula Espectroscopia no infra-vermelho com transformada de Fourier Concentrao que inibe 50% do crescimento celular Hidrognio-1 ou prton Correlao heteronuclear de quantum-mltiplo Hertz Concentrao que inibe 50% da populao Unio Internacional da Qumica Pura e Aplicada Constante de acoplamento Concentrao que letal a 50% da populao Multipleto Razo massa/carga Megahertz Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio Ponto de fuso Partes por milho Ressonncia magntica nuclear Rotaes por minuto Mistura de sais enriquecidos com aminocidos, vitaminas e
viii
CC CCDA Conc. COSY d dd DEPT DMSO DSC eV E FTIR GI50

1
HMQC Hz IC50 IUPAC J LC50 m m/z MHz MTT P.F. ppm RMN rpm RPMI
outros componentes essenciais para o crescimento celular s SFB sl t td TGI Z Singleto Soro fetal bovino Singleto largo Tripleto Tripleto de dubletos Concentrao que inibe 100% do crescimento celular Configurao espacial onde os grupos de maior prioridade esto do mesmo lado em uma molcula Medida do desvio da luz plano-polarizada a 20C C H Deslocamento qumico Deslocamento qumico de carbono-13 Deslocamento qumico de prton
ix
RESUMO
Palavras-chave: tiossemicarbazonas, terpenos, -bisabolol, atividade
antitumoral, clulas de leucemia linfide (K-562). Na busca por novos compostos semi-sintticos com atividade anticncer, nosso grupo de pesquisa iniciou a sntese de novas tiossemicarbazonas derivadas de terpenos naturais. A unidade terpnica ligada ao nitrognio terminal, uma vez que na literatura no h relatos de tiossemicarbazonas com variaes estruturais nesta posio, mas somente no carbono imnico. Seguindo o projeto de nosso grupo de pesquisa, este trabalho descreve a sntese de novas tiossemicarbazonas com o lcool sesquiterpnico natural -(-)bisabolol ligado ao nitrognio terminal e os grupos fenil e fenil substitudo ligados ao carbono imnico. O -(-)-bisabolol utilizado obtido do fracionamento do leo da espcie Eremanthus erythropappus (DC.) McLeish (Asteraceae). As tiossemicarbazonas derivadas do -(-)-bisabolol foram sintetizadas atravs da condensao entre a correspondente tiossemicarbazida e a acetofenona, a benzofenona, o benzaldedo e seus derivados substitudos, com os grupos CH3, OCH3, OH e N(CH3)2 em para, e os grupos NO2 e Cl em orto, meta e para. O rendimento para estas reaes foi de 8298%. A tiossemicarbazida foi obtida pela adio entre o isotiocianato derivado do -(-)-bisabolol e a hidrazina, com um rendimento de 71%. O isotiocianato foi obtido pela adio seletiva de HSCN a uma das duas duplas ligaes trissubstitudas do -(-)-bisabolol, com um rendimento de 46%. A avaliao dos compostos sintetizados frente s clulas tumorais de leucemia linfide (K-562), melanoma (UACC-62), pulmo tipo no-pequenas clulas (NCI-H460), mama (MCF-7), mama que expressa o fentipo de resistncia MDR (NCI-ADR), clon (HT-29), ovrio (OVCAR-3) e prstata (PCO-3), mostrou que, apesar de o -bisabolol ser ativo apenas contra clulas tumorais de leucemia linfide (K-562) com seletividade moderada, a maioria dos seus derivados sintetizados so ativos contra todas as linhagens celulares avaliadas, mas com seletividade para clulas de leucemia, na maioria dos casos. Todos foram mais ativos que o -bisabolol, com destaque para a tiossemicarbazida (19), a m-nitrobenzaldedo-tiossemicarbazona (26), a o-cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona (28),
x
m-cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona
(29),
p-cloro-benzaldedo-
tiossemicarbazona (30) e a acetofenona-tiossemicarbazona (31), que apresentaram potentes propriedades antitumorais seletivamente para clulas de leucemia, sendo muito mais ativas que a droga padro utilizada no teste, a doxorrubicina. Portanto, as tiossemicarbazonas derivadas do -(-)-bisabolol foram sintetizadas com rendimentos satisfatrios e apresentaram grande potencializao das propriedades antitumorais em relao a ele, mantendo sua seletividade para clulas de leucemia, o que, aliado relativa facilidade de sntese, faz destes compostos promissores agentes anticancergenos.
xi
ABSTRACT
Keywords: thiosemicarbazones, terpenes, -bisabolol, antitumoral activity, cells of leukemia (K-562). In the search for semi-synthetics compounds with anticancer activity, our research group began the synthesis of novel thiosemicarbazones derivatives of natural terpenes. The terpenic moiety is linked to terminal nitrogen, once in the literature arent described thiosemicarbazones with structural variations in this position, but only iminic carbon. Following the project of our research group, does this work describe the synthesis of novel thiosemicarbazones with the natural sesquiterpenic alcohol -(-)bisabolol done linked to the terminal nitrogen and the groups phenyl and phenyl substituted linked to the iminic carbon. The used -(-)-bisabolol is obtained of the fractionation of the oil of the species Eremanthus erythropappus (DC.) McLeish (Asteraceae). The thiosemicarbazones derivatives of the -(-)-bisabolol were synthesized through the condensation between the correspondent thiosemicarbazide and the acetophenone, the benzophenone, the benzaldehyde and derivatives substituted, with the groups CH3, OCH3, OH e N(CH3)2 in para, and the groups NO2 e Cl in orto, meta and para. The yield for these reactions was of 8298%. The thiosemicarbazide was obtained by the addition between the isothiocyanate derivative of the -(-)bisabolol and the hydrazine, with a yield of 71%. The isothiocyanate was obtained by the selective addition of HSCN to only one of the two trisubstituted double bonds of the -(-)-bisabolol, with a yield of 46%. The evaluation of the synthesized compounds front to tumoral cells of leukemia (K-562), melanoma (UACC-62), lung type no-small cells (NCI-H460), breast (MCF-7), breast that expresses the resistance phenotype MDR (NCI-ADR), colon (HT-29), ovarian (OVCAR-3) and prostate (PCO-3) showed that, in spite of the -bisabolol to be active just against cells tumorals of leukemia with moderate selectivity, most of yours derivatives are active against all of the appraised cellular lineages, but with selectivity for cells of leukemia, in most of the cases. All the synthesized compounds were more active than the -bisabolol, with prominence for thiosemicarbazide (19), m-nitro-benzaldehyde-thiosemicarbazone (26), o-chloroxii
benzaldehyde-thiosemicarbazone (28), m-chloro-benzaldehyde-thiosemicarbazone (29), p-chloro-benzaldehyde-thiosemicarbazone (30) and acetophenonethiosemicarbazone (31), that they presented potent antitumorals properties, being much more active than the drug pattern used in the test, the doxorrubicin. Therefore, the thiosemicarbazones derivatives of the -bisabolol were synthesized with satisfactory yields and they presented great increase of the antitumorals properties in relation to him, maintaining its selectivity for cells of leukemia, together with their easiness of synthesis, does these compounds promising anticancer agents.
xiii
1. INTRODUO
1. INTRODUO
Atualmente, muitas doenas epidemiolgicas ainda flagelam o mundo e, portanto, requerem novos medicamentos, mais eficazes e de mais baixo custo. Uma forma de atingir esses objetivos atravs da modificao estrutural, que, por sua vez, permite obter compostos mais ativos. Este mtodo, tambm chamado de modificao molecular, constitui-se no mais usado e econmico para a obteno de compostos biologicamente ativos e, tambm, possibilita aperfeioar a atividade de princpios ativos naturais. Assim, muitas mudanas podem ser introduzidas numa molcula, dependendo de seus centros reativos1,2. Nessa perspectiva, uma estratgia que merece destaque a de combinar, em uma mesma molcula, compostos que sejam bioativos individualmente. Atravs da juno das molculas ativas, espera-se um efeito cooperativo das mesmas, o que potencializa a atividade biolgica nos compostos sintetizados. Entre as doenas de destacada relevncia mdica est, sem dvida, o cncer (em portugus brasileiro) ou cancro (em portugus europeu). O cncer pode afetar pessoas de todas as idades, mas o risco para a maioria dos tipos de cncer aumenta com o acrscimo da idade.3,4 O cncer causa cerca de 13% de todas as mortes no mundo, sendo os cnceres de pulmo, estmago, fgado, clon e mama os que mais matam5. Fatores de risco incluem geografia (mais cncer de pele em pases tropicais que em nrdicos), etnia, hbitos alimentares, idade avanada e genes hereditrios que causam predisposio para o cncer6. Portanto, o desafio de produzir medicamentos, e outros produtos sintticos, que satisfaam grande parte das necessidades da sociedade moderna permanecem atuais; e neste caminho que este trabalho se enquadra. Atravs de uma metodologia desenvolvida por um membro de nosso grupo de pesquisa, ns sintetizamos derivados terpnicos de isotiocianatos, os quais so obtidos, de forma simples, utilizando-se a reao de adio direta de HSCN a duplas ligaes7,8. Estes derivados tm servido de intermedirios sintticos para uma srie de importantes compostos, tais como tiossemicarbazonas9,10, tiourias11 e guanidinas. Para se chegar s tiossemicarbazonas, reagimos os isotiocianatos com hidrato de hidrazina, conforme metodologia descrita na literatura12,13,14, obtendo-se as tiossemicarbazidas intermedirias que, em seguida, so condensadas quimiosseletivamente com
1
1. INTRODUO
determinados aldedos e cetonas chegando-se s tiossemicarbazonas, tambm como descrito na literatura12,15.
1.1. Tiossemicarbazonas
H mais de 50 anos a Qumica Medicinal vem estudando uma importante classe de compostos sintticos, as tiossemicarbazonas. Estes compostos so geralmente obtidos pela reao de condensao quimiosseletiva de tiossemicarbazidas com aldedos e/ou cetonas, e recebem a denominao da classe tiossemicarbazona aps o nome do respectivo aldedo ou cetona condensado12. Elas podem apresentar diferentes atividades biolgicas em sua forma livre ou complexadas com metais de transio. Alm disso, elas so intermedirias para a sntese de compostos heterocclicos biologicamente ativos12,16. Do ponto de vista sinttico, as tiossemicarbazonas apresentam, como caracterstica principal, vrias rotas de obteno, assim como sua vasta aplicao como intermedirios de muitos ncleos importantes. Em geral, estas molculas apresentam baixo custo de sntese, alm de grande economia de tomos, uma vez que quase todos os tomos dos compostos reagentes estaro presentes na molcula final12.
1.1.1. Aspectos Qumicos

Segundo a IUPAC, o esqueleto do grupo tiossemicarbazona obedece numerao dos tomos da cadeia principal mostrada na figura 112,16.
S N H
2 3
R1 R2
N R3
R4
R1, R2, R3 e R4 = H, alquil ou aril
Figura 1: Numerao da cadeia principal das tiossemicarbazonas.
1. INTRODUO
As tiossemicarbazonas no substitudas na posio N-4 apresentam estrutura bsica, C=N-NHCS-NH2, aproximadamente planar, com o tomo de enxofre em posio anti em relao ao tomo de nitrognio da funo imina (1, Figura 2). Fatores eletrnicos e estricos contribuem para este arranjo estrutural, porm, possivelmente o fator mais importante que o tomo de enxofre em posio anti possibilita a ocorrncia de ligao de hidrognio intramolecular entre o nitrognio da imina e os hidrognios da tioamida. Por outro lado, este arranjo estrutural muda significativamente se forem adicionados grupos substituintes na posio N-4, favorecendo a conformao sin entre o tomo de nitrognio da imina e o tomo de enxofre (2, Figura 2)12.
H
R1 N R2
H N
R1 N R2 N
S N R3 R4
(1) a n t i H
H (2) s y n R1, R2, R3 e R4 = H, alquil ou aril.
Figura 2: Arranjos estruturais anti e syn de tiossemicarbazonas. As tiossemicarbazonas apresentam-se como sistemas com extrema
deslocalizao eletrnica, principalmente quando h grupos aromticos ligados ao carbono da imina. Devido a esta deslocalizao eletrnica, as tiossemicarbazonas podem coexistir na forma tiona ou tiol em equilbrio tautomrico12 (Esquema 1).
H N N Ar tiona N H H N N S Ar = aril Ar tiol N
SH
Esquema 1: Formas tautomricas das tiossemicarbazonas. As tiossemicarbazonas so geralmente obtidas como misturas de ismeros E e Z, com relao ao grupo imnico, no estado slido. Em soluo, h isomerizao da configurao Z para E, devido a sua maior estabilidade termodinmica. As tiossemicarbazonas derivadas de aldedos tendem a formar preferencialmente o
3
1. INTRODUO
ismero E, termodinamicamente mais estvel, enquanto que nas derivadas de cetonas assimtricas a proporo entre E e Z depende da estrutura dos substituintes ligados carbonila de origem12. A sntese de tiossemicarbazonas extensamente explorada e descrita na literatura. Em geral, duas estratgias podem ser empregadas: a obteno direta, atravs da reao de aldedos e/ou cetonas quimiosseletivamente com as tiossemicarbazidas; e a obteno indireta, atravs da preparao prvia das tiossemicarbazidas, utilizando hidrazina e diferentes reagentes, seguida de condensao com o derivado carbonilado especfico12. Neste trabalho, as tiossemicarbazonas sero obtidas pelo mtodo indireto. A tiossemicarbazida a reagir quimiosseletivamente com os determinados aldedos e cetonas ser preparada pela reao de um isotiocianato com hidrato de hidrazina, conforme metodologia descrita na literatura12,13,14.
1.1.2. Aspectos Biolgicos

As importantes atividades biolgicas apresentadas por tiossemicarbazonas so: antitumoral17, antiproliferativa18, citotxica19, antibacteriana20, antiviral21, antiprotozoria22, antimicrobiana23, antifngica30, dentre outras. No que se refere atividade antitumoral, descrita na literatura a grande potencialidade da substncia 3-aminopiridina-2-carboxaldedo tiossemicarbazona (triapina 3-AP) (1) como uma das principais substncias orgnicas no combate a tipos especficos de clulas tumorais, tais como carcinoma de fgado M-109, carcinoma de ovrio humano A2780 e em ratos apresentando leucemia L121024.
H N H2N N N (1)
S NH2
triapina-3-AP
1. INTRODUO
Um pr-frmaco (2) desta tiossemicarbazona foi desenvolvido pela incluso do grupamento bezoil-fosfato na estrutura da molcula, com objetivo de melhorar as propriedades farmacocinticas e, tambm, sua utilidade teraputica frente a clulas tumorais M-109. A bioativao do pr-frmaco ocorreria aps uma quebra na ligao fsforo oxignio, mediada por uma fosfatase alcalina, levando a um intermedirio que passaria por uma srie de fragmentaes para formar, finalmente, a 3aminopiridina-2-carboxaldedo tiossemicarbazona25.
(NaO)2(O)PO O N O Pr--frmaco da triapina-3-AP N
(2) H H N N NH2 S
Estudos pr-clnicos de fase I da triapina-3-AP indicaram resultados promissores em pacientes em estgio avanado de cncer utilizando doses variando de 5 mg/m2 a 105 mg/m2, incluindo atividade sobre tumores resistentes hidroxiuria, sem o aparecimento de toxicidade significativa26. Atualmente, esta substncia encontra-se em ensaios clnicos de fase II16,27. Tiossemicarbazonas derivadas de uma srie de aldedos naturais foram ensaiadas in vitro contra clulas tumorais leucmicas (U937), como as derivadas do (3R)-(+)-citronelal (3), citral (4) e uridina (5) que apresentaram inibio da proliferao celular quando usadas em concentraes de at 10g/mL18.
H3C H NH N ( 3) S H H2N S N N O N O O NH O H NH2 NH N (4) S NH2
H O
(5)
1. INTRODUO
As tiossemicarbazonas derivadas da isatina (6) tambm so biologicamente muito importantes, como a N-metilisatina-tiossemicarbazona (metisazona) (7), utilizada clinicamente como antiviral desde a dcada de 60 no tratamento da profilaxia da varola, e tambm mais tarde no tratamento de complicaes resultantes da vacinao. Uma srie de compostos com atividade antiviral foi reportada recentemente na literatura, destacando-se o composto (8) que apresentou IC50 de 0,6mol L-1 frente ao Vaccinia virus, sendo cerca de seis vezes mais potente que a metisazona26.
H NH2 S O N (7) CH3 (8) N N N Br O N S NH2
H O O N (6) H N N
Modificaes estruturais em tiossemicarbazonas podem levar manifestao de atividades biolgicas especficas, como as tiossemicarbazonas (N)heterocclicas. Elas apresentam um anel heterocclico ligado ao carbono imnico, sendo que o heterotomo est posicionado em com relao cadeia lateral. Estas tiossemicarbazonas apresentam importantes atividades farmacolgicas, tais como a tiossemicarbazona derivada da 1-formilisoquinolina (9) com atividade antileucmica descrita desde 195616. Recentemente, foi relatada atividade parasiticida para tiossemicarbazonas (N)-heterocclicas29, como a acetilpiridina (10) que apresentou inibio do Trypanosoma brucei.
H N N (9) H N S NH2 N (10) N H N S NH2
Recentemente foi sintetizada uma tiossemicarbazona com excelente atividade antitumoral e antifngica, a acetil-pirazina-N,N-dimetil-tiossemicarbazona (11). Ela foi
6
1. INTRODUO
testada contra uma linhagem de clulas humanas de neuro-epitelioma SK-N-MC apresentando um GI50 de 0,01 M. Este valor de GI50 comparvel ao da droga padro Dp44Mt (12), cujo GI50 de 0,008 M. A atividade antifngica manifestada foi contra Absidia corymbifera 272, um fungo filamentoso relativamente raro e oportunista causador da mucormicose. O MIC apresentado pelo composto foi de 12 4 M aps 24h de incubao, enquanto que o antifngico padro utilizado, a anfotericina B, apresentou MIC de 1,08 0,01 M, para o mesmo tempo de incubao30.
CH3 N N N (11)
H N S N N
H N S N
N (12)
1.1.3. Tiossemicarbazonas Derivadas de Terpenos Naturais
Entre as tiossemicarbazonas com relevante atividade biolgica, a maioria possui variaes estruturais somente nos substituintes R1 e R2. Variaes no substituinte R3 no so usuais e, quando ocorrem, geralmente so por grupos alquila (metila, etila) ou arila, no havendo na literatura relatos da presena de grupos terpnicos nesta posio. Quando ocorrem, estes grupos so condensados com N1, formando a parte imnica, assim como (3) e (4). Levando em conta o fato de no haver na literatura relatos da presena de grupos terpnicos na posio R3 e seguindo a estratgia de combinar molculas bioativas, nosso grupo de pesquisa iniciou um trabalho de sntese de tiossemicarbazonas derivadas de terpenos naturais nesta posio. Na busca por novas molculas com atividade antitumoral, foi sintetizada uma srie de tiossemicarbazonas derivadas do monoterpeno natural canfeno (13)31,32.
1. INTRODUO
(13)
As benzaldedo-tiossemicarbazonas contendo o canfeno foram sintetizadas pela condensao da tiossemicarbazida derivada deste terpeno, preparada segundo j descrito, com o benzaldedo e seus derivados contendo em suas estruturas os grupos atratores de densidade eletrnica Cl e NO2 nas posies orto, meta e para; e os grupos doadores de densidade eletrnica CH3, OCH3, OH e N(CH3)2 na posio para (Esquema 2).
H HSCN NCS NH2NH2 N S
H N NH2
H N RPhCHO S
H N H N
R R = H, p-CH3, p-OCH3, p-OH, p-N(CH3)2, o-NO2, m-NO2, p-NO2, o-Cl, m-Cl e p-Cl.
Esquema 2: Rota sinttica para as tiossemicarbazonas derivadas do canfeno A srie de benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do canfeno foi avaliada quanto ao potencial biolgico frente a clulas de melanoma humano SK MEL 37. A observao em microscpio do tico da viabilidade e celular do indicou que as tiossemicarbazonas derivadas do benzaldedo, do p-hidrxi-benzaldedo, do pdimetilamino-benzaldedo, m-nitrobenzaldedo m-clorobenzaldedo mostraram relevante atividade citotxica frente s clulas de melanoma testadas,
1. INTRODUO
apresentando IC50 (concentrao que inibe 50% da populao) de 14,96; 12,83; 16,53; 25,05; e 13,83 M, respectivamente, enquanto que a droga padro de controle positivo utilizada no ensaio, a doxorrubicina, apresentou um IC50 de 32,02 M31,32. Seguindo a mesma metodologia, nosso grupo de pesquisa tambm sintetizou uma srie de benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do monoterpeno natural R(+)-limoneno (14), na posio R3, e do benzaldedo e seus derivados, na posio R111. A escolha do R-(+)-limoneno para a sntese desta srie de tiossemicarbazonas deveu-se a sua abundncia, bem como a conhecida atividade de monoterpenos, puros33,34 ou em composio majoritria de leos essenciais35-37, como antiparasitrios. Esta srie de benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do limoneno foi avaliada in vitro frente forma epimastigota de Leishmania amazonensis. Os resultados mostraram que as tiossemicarbazonas derivadas do ocloro-benzaldedo, m-cloro-benzaldedo e p-cloro-benzaldedo apresentam relevante atividade antileishmania. Os valores de IC50 apresentados por estes compostos so menores que 10M; valores estes comparveis ao apresentado pela droga padro utilizada, a anfotericina B, que de 1,09 M 38.
H N H
S N H N R' (14)
R = H, p-CH3, p-OCH3, p-OH, p-N(CH3)2, o-NO2, m-NO2, p-NO2, o-Cl, m-Cl e p-Cl.
Outra srie de benzaldedo-tiossemicarbazonas derivada de terpenos naturais (15) sintetizada por nosso grupo de pesquisa foi a que leva o diterpeno cido caurenico na posio R3 e o benzaldedo e seus derivados na posio R1. A escolha do cido caurenico para a sntese desta srie de tiossemicarbazonas
9
1. INTRODUO
deveu-se a sua abundncia na espcie vegetal Croton floribundus (Euphorbiaceae), onde representa 2% do peso seco das cascas, a relativa facilidade de extrao, bem como a grande variedade de atividades biolgicas apresentadas por ele, tais como: antiproliferativa, antiinflamatria, antifngica, antitripanossoma, entre outras. Esta srie de benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do cido caurenico foi avaliada frente forma epimastigota de Trypanossoma cruzi. Os resultados mostraram que a tiossemicarbazona derivada do o-nitro-benzaldedo apresenta expressiva atividade antitripanossoma, com um valor de IC50 de 2,0M, enquanto que as drogas padro utilizadas no teste, benznidazol e nifurtimox, apresentam IC50 de 7,4M e 7,7M, respectivamente39.
R
CH3 N H H
S N H N R'
CH3
HOOC
H CH3
(15)
R = H, p-CH3, p-OCH3, p-OH, p-N(CH3)2, o-NO2, m-NO2, p-NO2, o-Cl, m-Cl e p-Cl.
1.2. AlfaBisabolol
1.2.1. Aspectos Qumicos

O -(-)-(1S,7S)-bisabolol (16) ou (-)-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]hept-5-en-2-(S)-ol (nome oficial atribudo pela IUPAC), tambm conhecido como levomenol, um lcool sesquiterpnico monocclico insaturado natural. quase insolvel em gua e glicerina, mas bastante solvel em etanol, outros lcoois
10
1. INTRODUO
de cadeia maior e solventes de baixa polaridade. O seu epmero, -(+)-(1R,7S)bisabolol, tambm encontrado naturalmente, apesar de ser raro. O -bisabolol sinttico normalmente uma mistura racmica dos dois epmeros40.
15 4 5 6 H HO 14 1 7 3 2 13 8 9 10 11 12
(16)*
O -(-)-bisabolol est presente em leos extrados de diversas plantas, tais como arnica (Arnica amplexicaulis e Arnica chamissonis)41 e salvia (Salvia stenophylla)41, mas mais abundante na camomila (Matricaria recutita - Compositae), onde constitui mais de 50% do leo essencial extrado42, e nas candeias Asteraceae43,44 (candeia-amarela: Eremanthus erythropappus (DC.) McLeish; candeia-branca: Eremanthus incanus (Less.) Less; e cadeia-da-serra: Vanillosmopsys erythropappa (DC.) Schuh. Bip., entre outras). Entre as candeias, a espcie mais rica em -(-)bisabolol a candeia-amarela, onde ele constitui cerca de 73% de seu leo essencial, quando este leo extrado por arraste de vapor e o -bisabolol separado dele por destilao direta45. A literatura cientfica no relata a sntese de tiossemicarbazidas e tiossemicarbazonas derivadas do alfa-bisabolol, nem, tampouco, sobre seus potenciais biolgicos. O isotiocianato derivado do alfa-bisabolol j foi sintetizado por um membro de nosso grupo de pesquisa8. No entanto, seu potencial biolgico ainda no foi explorado.
1.2.2. Aspectos Biolgicos

Na literatura, reportam-se muitas atividades biolgicas para o -bisabolol, sendo as principais: antitumoral42,46,47, antimutagnica41, anti-inflamatria41-52,
*N. A.:Neste trabalho, a numerao das estruturas do -bisabolol e seus derivados seguir a forma usual.
11
1. INTRODUO
antioxidante48,
anti-irritante49,
antimicrobiana49,
inseticida50,
analgsica41,
antibitica41, gastro-protetora41, entre outras. O -bisabolol j foi testado quanto a sua toxicidade sendo considerado atxico53. Ensaios de toxicidade mostraram que se trata de um composto atxico para animais, uma vez que a LD50 (dose que letal a 50% da populao), testada em ratos e camundongos, apresentou um valor de 13 14g/kg de massa corporal47,50, ou em torno de 15mL/kg49. H muitos anos, por no apresentar toxicidade e devido s suas propriedades farmacolgicas, principalmente atividades antiinflamatria e antiirritante, o -bisabolol utilizado pela indstria farmacutica em composies dermatolgicas. Tambm tem uso na indstria de cosmticos na formulao de loes ps-barba, cremes para as mos e para o corpo e pomadas, inclusive para uso em bebs41. Alm disso, os sesquiterpenos so comumente identificados como compostos ativos em plantas medicinais que apresentam importantes atividades biolgicas, como antiinflamatria, fungicida e antitumoral. Em particular, sesquiterpenos com grupos hidroxila so, geralmente, mais ativos contra tumores que os
49,54
correspondentes terpenos constitudos apenas de carbono e hidrognio
Portanto, torna-se ainda mais importante a escolha do lcool sesquiterpnico natural -(-)-bisabolol, como composto de partida, na busca de novos compostos semisintticos com atividade antitumoral.
1.3. Proposta Sinttica do Trabalho:

Neste trabalho, ns utilizamos o -(-)-bisabolol que extramos do leo de E. erythropappus, cedido gentilmente pela empresa CITRLEO Indstria e Comrcio de leos Essenciais Ltda., situada no municpio de Torrinha SP, atravs do Prof. Dr. Lcio Cardozo Filho, do Departamento de Engenharia Qumica, desta Universidade. A obteno das tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol realizada em 3 etapas. A primeira etapa a sntese do isotiocianato e, consequentemente, do tiocianato atravs da reao de adio de HSCN ao bisabolol. A segunda etapa a sntese da tiossemicarbazida, que ocorre atravs da reao de adio de NH2NH2 ao isotiocianato. A ltima etapa a sntese das
12
1. INTRODUO
tiossemicarbazonas, feita atravs da reao de condensao da tiossemicarbazida com os determinados aldedos e cetonas. A rota sinttica utilizada est descrita no Esquema 3.
H KHSO4 + KSCN H HO (16) CHCl3 HO (17) NCS NH2NH2 Etanol
H HO (18) SCN
R RPhC(R)O/H H HO (19) N H S N H NH2 Etanol

+
H HO R' = H, CH3 ou Ph. N H
S N H N R' (20-32)
R = H, CH3, OCH3, OH, N(CH3)2, NO2, Cl.
Esquema 3: Rota Sinttica para a obteno das tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol
13
2. OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais

Utilizando-se da metodologia de se combinar, em uma mesma estrutura, molculas bioativas individualmente e, levando-se em conta as atividades biolgicas apresentadas pelo -bisabolol e pelas tiossemicarbazonas, a ausncia de relatos na literatura de tiossemicarbazonas derivadas de sesquiterpenos, a elevada concentrao de -bisabolol no leo de candeia e a relativa facilidade em se adquirir este leo, este trabalho visa sntese de tiossemicarbazonas derivadas do bisabolol, com o objetivo de se obter compostos com provvel potencial antitumoral.
2.2. Objetivos Especficos:

- Sintetizar o isotiocianato derivado do -bisabolol, conforme procedimento descrito na literatura8, buscando diminuir o tempo e aumentar o rendimento da reao; - Sintetizar a tiossemicarbazida derivada do -bisabolol; - Sintetizar a benzaldedo-tiossemicarbazona e a srie de benzaldedotiossemicarbazonas com os substituintes Cl e NO2 nas posies orto, meta e para, e os grupos CH3, OCH3, OH e N(CH3)2 em para, derivadas do -bisabolol. - Sintetizar as cetona-tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol, com as pores cetnicas oriundas da acetofenona e da benzofenona. Para, em seguida: - Avaliar a atividade antitumoral do -bisabolol e dos compostos sintetizados frente a clulas tumorais de: leucemia linfide linhagem K-562; melanoma linhagem UACC-62; pulmo (tipo no-pequenas clulas) linhagem NCI-H460; mama linhagem MCF-7; mama (que expressa o fentipo de resistncia MDR)
14
2. OBJETIVOS
linhagem NCI-ADR; clon linhagem HT-29; ovrio linhagem OVCAR-3 e prstata - linhagem PCO-3, utilizando-se do mtodo colorimtrico com sulforrodamina B, de acordo com as normas do National Cancer Institute (NCI) dos Estados Unidos da Amrica, utilizando a doxorrubicina como controle positivo55,56,57.
15
3. RESULTADOS E DISCUSSO
3.1. -Bisabolol
O -bisabolol (16) foi purificado a partir do leo de candeia atravs de CC em slica gel utilizando-se hexano como eluente. A separao ocorreu com relativa facilidade, pois em um nico processo cromatogrfico obteve-se o -bisabolol totalmente puro com um rendimento de 85%. Trata-se de um leo incolor, pouco viscoso, de cheiro amadeirado, floral, levemente adocicado e caracterstico.
H HO (16)
3.2. Rota Sinttica

A rota sinttica para a obteno das tiossemicarbazonas derivadas do -
bisabolol realizada em 3 etapas, conforme j descrito no esquema 3.
3.2.1. 1 Etapa: Sntese do Isotiocianato e do Tiocianato Derivados do -Bisabolol
3.2.1.1. Condies Experimentais

A sntese do isotiocianato (17) e, consequentemente, do tiocianato (18) derivados do -bisabolol seguiu a metodologia descrita na literatura7-11.
16
H HO NCS (17)
H HO SCN (18)
No entanto, para que se chegasse s melhores condies para o processo, foi necessrio aperfeioar as condies reacionais. As condies que mais aumentaram o rendimento da reao e requereram o menor tempo, foram: a adio direta dos sais KSCN e KHSO4, previamente secos, triturados e misturados, sobre o -bisabolol em agitao, seguido da adio de pequena quantidade de CHCl3 para homogeneizar a mistura, ao invs da adio da soluo clorofrmica de HSCN, conforme descrito na literatura8. Segundo o que reportado, o rendimento para esta reao, quando se usa HSCN em soluo clorofrmica, de 24% para o isotiocianato e de 11% para o tiocianato. No entanto, utilizando-se a adio direta dos sais KSCN e KHSO4 ao meio reacional, ao invs da referida soluo, obteve-se um rendimento de 46% para o isotiocianato e de 22% para o tiocianato, aps ambos purificados por CC em slica gel utilizando uma mistura de hexano e acetato de etila (0 30%) como eluente. Uma possvel explicao para o melhor rendimento da reao seria o fato da diminuio do efeito de polimerizao do HSCN. Quando se utiliza soluo clorofrmica deste cido, ocorre uma grande quantidade de polimerizao deste no meio reacional, o que diminui drasticamente sua disponibilidade para reagir com o substrato, ao passo que, utilizando-se a adio direta dos sais, o HSCN vai sendo consumido conforme formado no meio reacional. Desta forma, o efeito de polimerizao consideravelmente diminudo. Durante o processo de otimizao das condies reacionais, observou-se alguns fatores que prejudicam a reao. O primeiro fator o aquecimento. Quando a reao foi realizada em refluxo, verificou-se que o tempo de reao continuou elevado e o rendimento diminuiu consideravelmente. provvel que a temperatura
17
elevada favorea a polimerizao do HSCN. Outro fator o aumento da quantidade de soluo clorofrmica de HSCN no meio reacional, mesmo que adicionado gradualmente. Neste caso, verificou-se que o rendimento no se altera de maneira considervel. Como j foi mencionado, o HSCN se polimeriza com relativa facilidade. Desta forma, o aumento de sua concentrao favorece sua polimerizao. Um resumo das condies experimentais testadas, com os respectivos rendimentos e tempos de reao, encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1: Dados experimentais para a obteno de 17 e 18.

Experimentos
-bisabolol (a) (g) KSCN (b) (g) + KHSO4(c) (g) + CHCl3 (mL) Proporo a:b:c (mol) Temperatura Tempo (dias) Isotiocianato obtido (g) Rendimento (%) Tiocianato obtido (g) Rendimento (%)
1
1,01 3,55 + 4,96 + 10 (1 adio) 1:8:8 Ambiente 6 0,310 24,5
2
1,00 7,09 + 9,96 + 20 (2 adies) 1:16:16 Ambiente 8 0,332 26,2
3
1,01 14,21 + 19,92 + 40 (4 adies) 1:32:32 Ambiente 12 0,301 23,8
4
1,01 3,60 + 4,98 + 15 (1 adio) 1:8:8 Refluxo 6 0,228 18,0
5
1,02 0,89 + 2,54 + 0 (1 adio) 1:2:4 Ambiente 2 0,582 46,0
0,124 9,8
0,145 11,5
0,114 9,0
0,052 4,1
0,280 22,1
3.2.1.2. Intermedirios de Reao
A reao entre o -bisabolol e o HSCN ocorre conforme as adies de cidos a duplas ligaes, ou seja, o -bisabolol atua como nuclefilo e o HSCN como eletrfilo. Entretanto, conforme descrito na literatura7,8, como o solvente da reao pouco polar e aprtico, a reao provavelmente ocorre com formao de par inico ntimo. O tiocianato se forma primeiro, pois no ambiente reacional o enxofre mais nucleoflico. Em seguida, tambm com provvel formao de par inico ntimo, ocorre isomerizao para isotiocianato, mais estvel termodinamicamente. Uma proposta de intermedirios para a reao apresentada no Esquema 4.
18
CHCl3 H HO H S C N H HO
+ S C
H HO SCN
H HO
isomerizao
H HO NCS
+ S C
Esquema 4: Proposta de intermedirios de reao para a formao de 17 e 18. A adio de HSCN ao -bisabolol regioespecfica, pois o hidrognio adiciona-se ao carbono da dupla ligao menos substitudo. Esta reao tambm sitiosseletiva, pois ocorre apenas em uma das duas duplas ligaes trissubstitudas presentes em sua estrutura. Segundo o que reportado na literatura8, a presena de grupos polares capazes de realizar ligaes de hidrognio nas proximidades da dupla ligao a reagir diminui a cintica global da reao, mas aproxima o grupo HSCN do stio de reao e diminui o efeito de sua polimerizao. Neste caso, a distncia entre as duas duplas ligaes em relao ao grupo OH a mesma. No entanto, a dupla ligao da cadeia aberta favorecida pelo fato de o processo de atrao do HSCN pelo grupo OH passar por um possvel estado de transio mais estvel, conforme representado no Esquema 5.
H3C H
CH3 H H O C N
+
Esquema 5: Ligao hidrognio do grupo OH com o HSCN direcionando sua adio dupla ligao da cadeia aberta.
19
3.2.2. 2 Etapa: Sntese da Tiossemicarbazida Derivada do Bisabolol
Conforme metodologia descrita na literatura9,10,58, procedeu-se a sntese da tiossemicarbazida (19) derivada do -bisabolol, sendo esta obtida com um rendimento de 71%, aps purificao por CC em slica gel, eluda com uma mistura de hexano e acetato de etila (0 75%), na forma de um leo muitssimo viscoso, de colorao amarelo-esverdeada translcida e odor irritante, forte e caracterstico.
H HO (19) N H
S N H NH2
Para que se chegasse s melhores condies para o processo, foi necessrio aperfeioar as condies reacionais. As condies que mais aumentaram o rendimento da reao e requereram o menor tempo, foram: O uso dos reagentes (isotiocianato:NH2NH2x2HCl:NaHCO3) na proporo molar 1:2:6 e a manuteno da temperatura de refluxo na faixa de 80 90C. O uso de excesso de cloridrato de hidrazina favorece a reao por aumentar o nmero de choques favorveis entre as molculas dos reagentes. J o grande excesso de bicarbonato de sdio favorece, primeiramente, uma neutralizao mais eficaz do HCl, liberando toda a hidrazina livre para reagir. Alm disso, favorece a troca de prtons intramolecular, agindo como catalisador, em uma das etapas do mecanismo proposto58 para a reao. Alguns fatores podem prejudicar a reao, conforme observado no processo de otimizao. A temperatura um pouco mais baixa durante o refluxo, que diminui o
20
estado de agitao das molculas, e o uso dos reagentes em proporo equimolar, pois diminui o nmero de colises entre suas molculas. Um resumo das condies experimentais testadas, com os respectivos rendimentos e tempos de reao, encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2: Dados experimentais para a obteno de 19.

Experimentos
Isotiocianato (a) (g) + 10mL de Etanol NH2NH2.2HCl (b) (g) + NaHCO3(c) (g) Proporo a:b:c (mol) Temperatura de refluxo (C) Tempo (h) Tiossemicarbazida obtida (g) Rendim. (%)
1
0,105
2
0,103
3
0,101
4
0,101
5
0,102
0,040 + 0,064 1:1:2 70 80 24 0,037 32,0
0,039 + 0,129 1:1:4 70 80 24 0,065 55,6
0,080 + 0,130 1:2:4 80 90 12 0,071 60,1
0,081 + 0,191 1:2:6 70 80 6 0,075 64,1
0,079 + 0,195 1:2:6 80 90 2 0,083 70,9

A reao de adio de hidrazina ao isotiocianato ocorre conforme as adies de aminas carbonilas, ou seja, a hidrazina atua como nuclefilo e o isotiocianato como eletrfilo. Desta forma, a hidrazina ataca o carbono do grupo isotiocianato deslocalizando a dupla ligao C N para o nitrognio formando um intermedirio dipolar. Este intermedirio estabilizado pela troca intramolecular de um prton. Durante a reao prvia de neutralizao do cloridrato de hidrazina com bicarbonato de sdio, utilizou-se um pequeno excesso de bicarbonato de sdio para garantir que toda a hidrazina estaria livre para reagir. Foi utilizado tambm um pequeno excesso de cloridrato de hidrazina para aumentar sua disponibilidade para reagir, o que melhorou o rendimento da reao. Uma proposta de intermedirios para a reao demonstrado no Esquema 6.
21
Etanol H HO N C H2N S NH2 H HO N S
+ N H
NH2
H HO N H
S N H NH2
Esquema 6: Proposta de intermedirios de reao para a formao de 19.
3.2.3. 3 Etapa: Sntese das Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol

A srie de tiossemicarbazonas (20 32) derivadas do -bisabolol foi sintetizada com base na metodologia descrita na literatura9,10,18,39. O tempo de reao foi, para todos os casos, entre 30 min e 2 h e o rendimento ficou entre 82 e 98%, aps purificao por CC em slica gel, usando-se uma mistura de hexano e acetato de etila (0 40%) como eluente.
(20 - 32)
H HO N H
S N H N R'
R' = H e R = H, p-CH3, p-OCH3, p-OH, p-N(CH3)2, o-NO2, m-NO2, p-NO2, o-Cl, m-Cl e p-Cl (20 - 30);R' = CH e R = H (31); R' = Ph e R = H (32)
3
22
A forma fsica e a cor de cada tiossemicarbazona derivada do -bisabolol, bem como a massa sintetizada de cada uma e seus respectivos rendimentos reacionais e tempos de reao so apresentados na tabela 3. Tabela 3: Dados experimentais da obteno de 20 32.
Comp. 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Forma Fsica; Cor leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho translcido leo muito viscoso; amarelo-escuro translcido leo muito viscoso; amarelo translcido Slido; amarelo Slido; alaranjado leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho-claro translcido leo muito viscoso; castanho-claro translcido Massa obtida (g) 0,327 0,326 0,380 0,376 0,370 0,419 0,355 0,417 0,371 0,351 0,376 0,366 0,393 Rendimento (%) 85 82 90 86 92 98 83 98 89 84 90 84 82 Tempo de Reao (min) 60 100 90 100 70 30 90 30 50 90 50 90 120
Para que se chegasse s melhores condies para o processo, foi necessrio aperfeioar as condies reacionais. Para tal, testou-se as variantes reacionais para a sntese da benzaldedo-tiossemicarbazona derivada do -bisabolol (20). Depois de otimizado o processo, repetiu-se as condies aperfeioadas na sntese das demais tiossemicarbazonas. As condies que mais aumentaram o rendimento da reao e
23
requereram
menor
tempo,
foram:
uso
dos
reagentes
(tiossemicarbazida:benzaldedo) na proporo molar 1:2, realizao da reao temperatura ambiente e o uso de 5 gotas do catalisador cido (soluo de H2SO4 30%). O uso de excesso de benzaldedo, como em todo caso de excesso de um dos reagentes, aumenta sua disponibilidade para reagir e aumenta o nmero de colises efetivas entre as molculas dos reagentes, o que favorece a reao. A catlise cida para este tipo de reao conhecidamente eficiente, pois a captao de um prton pelo oxignio carbonlico ativa o carbono aumentando sua eletrofilidade. No entanto, no se pode utilizar o catalisador cido em excesso, pois pode ocorrer a protonao da tiossemicarbazida, o que prejudicaria muito a reao, uma vez que esta perderia seu poder nucleoflico. Entretanto, por se tratar de uma reao conhecida, sabe-se que o ideal manter o pH do meio reacional em torno de 4 5. O nico fator que no favoreceu o rendimento da reao foi a sua realizao em refluxo, mas houve uma significativa diminuio do tempo de reao. Um resumo das condies experimentais testadas, com os respectivos rendimentos e tempos de reao, encontram-se na Tabela 4. Tabela 4: Dados experimentais para a obteno de 20.
Experimentos
Tiossemicarbazida (a) (g) + 10mL de Etanol C6H5CHO (b) (g) Proporo a:b (mol) Catlise cida (soluo de H2SO4 30%) (gotas) Temperatura Tempo (h) Tiossemicarbazona obtida (g) Rendim. (%)
1
0,105 0,040 1:1 0 Ambiente 24 0,071 52,8
2
0,103 0,039 1:1 2 Ambiente 10 0,072 53,5
3
0,101 0,040 1:1 2 Refluxo 3 0,068 50,5
4
0,101 0,053 1:1,5 5 Ambiente 1 0,109 81,0
5
0,102 0,071 1:2 5 Ambiente 0,5 0,115 85,5
A diferena nos tempos de reao apresentados na obteno das tiossemicarbazonas (tabela 3) pode ser explicada com base na substituio da poro aromtica do respectivo aldedo utilizado em cada caso. Notou-se que, em geral, os grupos retiradores de densidade eletrnica (NO2 e Cl) diminuram o tempo de reao, enquanto que os grupos doadores de densidade eletrnica (CH3,OCH3, OH e N(CH3)2) aumentaram o tempo de reao, mesmo que pouco, com relao ao benzaldedo no substitudo.
24
A explicao para a maior velocidade de reao dos aldedos substitudos com grupos retiradores de densidade eletrnica est na ativao da carbonila, que ocorre atravs do efeito de ressonncia retirador de eltrons do grupo fenil substitudo sobre a carbonila, tornando-a mais eletroflica. Os aldedos substitudos com o grupo nitro foram os que apresentaram os menores tempos de reao, uma vez que este grupo o retirador de densidade eletrnica mais forte. Na sequncia, apresentaram menores tempos de reao os aldedos substitudos pelo grupo cloro, retirador de densidade eletrnica fraco. Os aldedos substitudos com grupos doadores de densidade eletrnica apresentaram tempos de reao um pouco maiores. Isto ocorre devido ao efeito oposto, o de ressonncia doador de densidade eletrnica do grupo fenil substitudo carbonila. Este efeito aumenta a densidade eletrnica sobre o carbono carbonlico tornando-o menos eletroflico, portanto, menos reativo. Os maiores tempos de reao foram apresentados pelas cetonas. Isto ocorre devido menor reatividade apresentada pelas carbonilas cetnicas, ligadas diretamente a dois grupos doadores de densidade eletrnica. As maiores velocidades de reao foram apresentadas pelos aldedos substitudos pelo grupo nitro nas posies orto e para com relao carbonila. Isto pode ser explicado pelo forte efeito de ressonncia retirador de eltrons apresentado pelos grupos orto e para-nitro-fenil sobre a carbonila tornando-a mais suscetvel ao ataque do nuclefilo. J quando o grupo nitro encontra-se como substituinte em meta com relao carbonila, a velocidade da reao menor. Isto ocorre porque, nesta posio, o efeito de ressonncia retirador de eltrons no retira densidade eletrnica do carbono ligado carbonila, no sendo possvel ativ-la. Este efeito est representado na figura 3.
-O
+
O
-O
O + O N+ O
+
O
Figura 3: Efeito de ressonncia retirador de eltrons do grupo nitro-fenil sobre a
carbonila
25
A reao de condensao entre a tiossemicarbazida e os aldedos e cetonas escolhidos ocorre conforme o conhecido mecanismo de formao de iminas com catlise cida. Neste caso, durante a etapa de adio, a tiossemicarbazida atua como nuclefilo e o aldedo ou cetona correspondente atua como eletrfilo. Assim, a tiossemicarbazida, atravs do par de eltrons livres do grupo NH2 terminal, ataca o carbono carbonlico do aldedo ou cetona, que j se encontra ativado pela captao de um prton pelo oxignio, deslocalizando a ligao dupla C O para o oxignio e formando um intermedirio carregado positivamente no nitrognio. Esta carga positiva transferida para o oxignio pela troca intramolecular de um prton atravs da ao da gua, presente em pequena quantidade. Em seguida, ocorre a eliminao de uma molcula de H2O formando outro intermedirio com carga positiva no nitrognio. Para estabilizar a estrutura, o prton excedente do nitrognio retirado pela gua regenerando o catalisador (on hidrnio). O mecanismo para a reao demonstrado no Esquema 7.
+
H R H H HO N H S N H R' NH2 H3O+ H HO N H S H N H N H O H O R' R H H H H O
H3O+
R H HO N H S N H H N H R' R O
+ H
-H2O H HO N H S N H N H H R O R'
H HO N H
S N H N R'
H3O+
Esquema 7: Mecanismo de reao para a formao de 20 32.
26
3.3. Avaliao de Atividade Antitumoral
A atividade antitumoral do -bisabolol e dos compostos sintetizados foi avaliada in vitro contra 8 linhagens de clulas tumorais humanas: leucemia linfide (K-562); melanoma (UACC-62); pulmo tipo no-pequenas clulas (NCI-460); mama (MCF-7); mama que expressa o fentipo de resistncia MDR (NCI-ADR); clon (HT-29); ovrio (OVCAR-3) e prstata (PCO-3). O quimioterpico doxorrubicina foi utilizado como padro de controle positivo. Foram calculados trs parmetros de resposta avaliao (GI50, TGI e LC50) para cada composto e linhagem de clula testada. O parmetro GI50 (concentrao que inibe 50% do crescimento celular) refere-se atividade inibitria de crescimento. O parmetro TGI (concentrao que inibe totalmente o crescimento celular) refere-se atividade citosttica. E o parmetro LC50 (concentrao que mata 50% das clulas) refere-se atividade citotxica. Os valores de MG-MID (mean-graph midpoint ponto mdio do grfico) para os trs parmetros de resposta foram calculados fornecendo a atividade mdia de cada composto contra todas as linhagens celulares avaliadas. Este clculo foi feito atravs da mdia entre os logartmos dos valores de GI50, TGI ou LC50, apresentados por cada composto para cada uma das 8 linhagens celulares avaliadas, seguido do clculo do anti-logartmo desta mdia. Tambm foi calculada a seletividade () de cada composto frente s clulas tumorais testadas. Segundo o que reportado na literatura62, este clculo feito dividindo-se os valores de MG-MID pelos valores de GI50, TGI ou LC50 referentes a uma linhagem celular em particular. A seletividade considerada baixa se <10, moderada se 10<<100 e elevada se >100. Os valores de seletividade sero apresentados apenas quando esta for moderada ou elevada. Os valores de GI50, GI50 (MG-MID) e GI50 apresentados pelo -bisabolol, seus derivados sintetizados e a doxorrubicina (DR) encontram-se na Tabela 5.
27
Tabela 5: Valores de GI50 (M), GI50 (MG-MID) (M) e GI50 (valores entre
parnteses) para os compostos DR e 16 32.

UACC-62 MCF-7 NCI-ADR NCI-H460 PCO-3 OVCAR-3 HT-29 K-562 MG-MID
DR 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
0,18 >100 9,96 4,27 18,50 12,70 11,57 7,42 8,87 >100 6,05 7,84 20,83 53,27 7,81 7,35 22,36 >100
0,04 >100 16,01 18,86 15,31 7,72 7,23 6,50 6,23 13,95 18,59 6,72 17,70 31,23 7,35 6,89 23,61 36,73
5,99 >100 16,72 56,58 0,76 6,97 6,51 6,73 8,39 25,2 20,38 6,72 12,77 >100 7,35 7,58 0,75 3,31
0,05 >100 9,25 8,90 12,76 38,35 10,12 5,10 1,46 19,57 20,61 8,29 10,08 24,57 44,31 8,72 12,60 13,46
0,17 >100 11,03 8,90 26,80 8,47 6,75 7,66 6,23 13,72 39,87 5,60 18,14 18,83 11,25 7,58 19,95 >100
0,07 >100 12,09 95,01 17,23 6,97 6,02 6,50 6,23 3,60 7,39 8,51 13,44 42,02 8,27 6,66 14,26 >100
0,18 >100 11,38 29,53 49,44 9,96 10,36 7,42 8,15 27,65 6,94 14,11 12,32 23,65 6,89 7,35 28,36 >100
0,03 6,37(11,7) 16,66 14,80 0,02(289) 0,13(47,1) 0,14(34,9) 0,22(19,9) 0,60 0,08(121) 0,19(42,6) 0,02(187) 4,22 0,15(121) 0,03(165) 0,04(97) 0,01 (502) 1,94(14,1)
0,14 70,88 12,57 18,70 5,78 6,13 4,88 4,37 4,35 9,65 8,09 3,75 12,51 18,09 4,95 3,86 5,02 27,40
Segundo o que reportado na literatura62, compostos que apresentam valores de GI50 100M so considerados ativos. Assim sendo, 13 dos 17 compostos avaliados apresentaram atividade inibitria de crescimento tumoral contra todas as linhagens celulares testadas, mostrando valores de GI50 (MG-MID) de 3,75 18,70M. O -bisabolol (16) foi ativo apenas contra as clulas de leucemia linfide (K-562), apresentando-se como o composto menos ativo, com um valor de GI50 (MGMID) de 70,88M. O composto 24 foi inativo apenas contra as clulas de melanoma (UACC-62) mostrando um valor de GI50 (MG-MID) de 9,65M. O composto 28 se apresentou inativo apenas contra as clulas tumorais de mama com resistncia (NCI-ADR) e seu valor de GI50 (MG-MID) foi de 18,09M. J o composto 32 foi ativo contra as clulas tumorais de pulmo (NCI-H460), mama (MCF-7), mama com resistncia (NCI-ADR) e leucemia linfide (K-562), com um valor de GI50 (MG-MID) de 31,96M.
28
Entre os compostos avaliados, no que se refere atividade inibitria de crescimento tumoral, se destacaram os compostos 19, 24, 26, 28, 29, 30 e 31, que apresentaram elevada seletividade para clulas de leucemia linfide (K-562) e potente atividade contra esta linhagem celular, onde os compostos 19, 26 e 31 exibiram atividade maior que a droga padro doxorrubicina, o composto 29 exibiu atividade igual e o composto 30 exibiu atividade prxima ao padro. Os compostos
20, 21, 22 e 25, que apresentaram moderada seletividade e excelente atividade
contra clulas de leucemia. O composto 23 apresentou tima atividade contra clulas de leucemia, mas com baixa seletividade. Os compostos 16 e 32 apresentaram seletividade moderada para clulas de leucemia, mas com atividade tambm moderada. Os compostos 19 e 31 apresentaram potente atividade contra clulas de mama com resistncia (NCI-ADR), mas com baixa seletividade. Os valores de TGI, TGI (MG-MID) e TGI apresentados pelo -bisabolol, seus derivados sintetizados e a doxorrubicina (DR) encontram-se na Tabela 6.
Tabela 6: Valores de TGI (M), TGI (MG-MID) (M) e TGI (valores entre parnteses) para os compostos DR e 16 32.
DR 0,33(11,4) 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
>100 42,53 >100 >100 43,83 39,04 22,11 40,05 >100 16,62 24,66 62,20 >100 18,14 13,82 93,3 >100
1,84 >100 63,13 98,62 84,15 28,68 >100 94,94 21,20 >100 >100 18,26 >100 >100 19,54 15,82 62,87 >100
>100 >100 >100 >100 29,04 23,76 30,51 56,98 6,07 >100 >100 37,95 >100 >100 31,94 36,37 >100 >100
1,42 >100 >100 75,73 84,02 >100 >100 >100 20,72 >100 >100 68,61 >100 >100 >100 >100 >100 >100
2,30 >100 71,96 55,66 >100 36,16 45,66 76,05 13,89 >100 >100 20,67 >100 >100 37,79 22,71 >100 >100
8,11 >100 93,74 >100 >100 12,87 11,76 15,80 17,39 >100 16,22 40,77 88,64 >100 26,50 12,77 59,52 >100
46 >100 47,94 >100 >100 36,51 80,36 35,15 31,46 >100 16,84 57,05 62,81 >100 16,53 22,59 >100 >100
0,55 >100 >100 >100 0,38(108) 20,87 7,95 34,85 31,08 41,96 7,84 0,56(36,7) 9,56 4,11(16,3) 1,06(18,3) 0,73(21,6) 0,07 (505) 4,19(16,0)
3,77 >100 73,68 89,61 40,88 31,83 37,71 45,26 19,96 89,71 37,06 20,53 65,31 67,10 19,38 15,76 35,36 67,26
29
No que se refere atividade citosttica, apenas os compostos 23 e 26 se apresentaram ativos contra todas as linhagens celulares testadas, com valores de TGI (MG-MID) de 19,96M e 20,53M, respectivamente. O -bisabolol (16) foi o nico composto que foi totalmente inativo contra as clulas tumorais avaliadas, apresentando um valor de TGI (MG-MID) > 100M. Os compostos 20, 22, 29 e 30 foram inativos apenas contra as clulas de pulmo (NCI-460), com valores de TGI (MG-MID) de 15,76 45,26M. O composto 21 foi inativo apenas contra as clulas tumorais de mama (MCF-7) e pulmo (NCI-H460), com um valor de TGI (MG-MID) de 37,71M. O composto 17 foi inativo contra as clulas tumorais de mama com resistncia (NCI-ADR), pulmo (NCI-H460) e leucemia linfide (K-562), com um valor de TGI (MG-MID) de 73,68M. O composto 19 foi ativo contra clulas tumorais de pulmo (NCI-H460), mama (MCF-7), mama com resistncia (NCI-ADR) e leucemia linfide (K-562), com um valor de TGI (MG-MID) de 40,88M. Os compostos 25 e 27 foram ativos contra as clulas tumorais de melanoma (UACC62), ovrio (OVCAR-3), clon (HT-29) e leucemia linfide (K-562), com valores de TGI (MG-MID) de 37,06M e 65,31M, respectivamente. O composto 18 foi ativo contra clulas tumorais de mama (MCF-7), pulmo (NCI-H460) e prstata (PCO-3), com um valor de TGI (MG-MID) de 89,61M. O composto 31 foi ativo contra clulas tumorais de melanoma (UACC-62), ovrio (OVCAR-3) e leucemia linfide (K-562), com um valor de TGI (MG-MID) de 42,11M. Os compostos 24, 28 e 32 foram ativos apenas contra as clulas de leucemia linfide (K-562), com valores de TGI (MG-MID) de 89,71M, 67,10M e 68,75M, respectivamente. Entre os compostos avaliados, no que se refere atividade citosttica, alguns se destacaram contra clulas de leucemia linfide (K-562): os compostos 19 e 31, que apresentaram elevada seletividade e potente atividade, sendo mais ativos que a doxorrubicina, e os compostos 26 e 30, que apresentaram moderada seletividade e excelente atividade. Contra esta linhagem celular, os compostos 28, 29 e 32 apresentaram seletividade moderada, mas com atividade tambm moderada.
30
Os valores de LC50, LC50 (MG-MID) e LC50 apresentados pelo -bisabolol, seus derivados sintetizados e a doxorrubicina (DR) encontram-se na Tabela 7.
Tabela 7: Valores de LC50 (M), LC50 (MG-MID) (M) e LC50 (valores entre
parnteses) para os compostos DR e 16 32.

DR 0,46(89,2) 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
>100 >100 >100 >100 48,38 52,29 48,49 55,63 >100 49,33 49,33 >100 >100 42,71 40,64 >100 >100
46 >100 >100 >100 >100 60,35 >100 >100 56,35 >100 >100 47,31 >100 >100 45,92 44,32 >100 >100
>100 >100 >100 >100 >100 59,85 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100
37,90 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100
>100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 50,12 >100 >100 52,45 >100 >100 56,95 48,45 >100 >100
>100 >100 >100 >100 >100 43,64 45,30 46,17 54,44 >100 41,93 >100 >100 >100 47,99 40,64 >100 >100
>100 >100 90,3 >100 >100 57,36 >100 >100 58,51 >100 44,40 >100 >100 >100 45,92 47,30 >100 >100
>100 >100 >100 >100 9,58 >100 >100 >100 >100 >100 >100 12,56 45,52 8,50 56,26 10,33 1,54(38,5) 10,29
41,02 >100 98,73 >100 74,59 67,66 83,52 82,94 68,77 >100 74,20 59,34 90,93 73,48 58,57 45,17 59,35 75,26
Quanto atividade citotxica, os compostos 16, 18 e 24 foram os nicos que se mostraram totalmente inativos contra as clulas tumorais avaliadas, apresentando valores de LC50 (MG-MID) > 100M. Os compostos 29 e 30 foram inativos apenas contra as clulas de mama com resistncia (NCI-ADR) e pulmo (NCI-H460), com valores de LC50 (MG-MID) de 58,57M e 45,17M, respectivamente. O composto 20 foi inativo contra clulas tumorais de pulmo (NCI-H460), prstata (PCO-3) e leucemia linfide (K-562), com um valor de LC50 (MG-MID) de 67,66M. O composto
23 foi inativo contra clulas tumorais de mama com resistncia (NCI-ADR), pulmo
(NCI-H460) e leucemia linfide (K-562), com um valor de LC50 (MG-MID) de 68,77M. O composto 26 foi ativo contra clulas tumorais de melanoma (UACC-62), mama (MCF-7), prstata (PCO-3) e leucemia linfide (K-562), mostrando um valor de LC50 (MG-MID) de 59,34M. O composto 25 foi ativo contra clulas tumorais de
31
melanoma (UACC-62), ovrio (OVCAR-3) e clon (HT-29), apresentando um valor de LC50 (MG-MID) de 74,20M. Os compostos 21 e 22 foram ativos contra clulas tumorais de melanoma (UACC-62) e ovrio (OVCAR-3), com valores de LC50 (MGMID) de 83,52M e 82,94M, respectivamente. Os compostos 19, 27, 28, 31 e 32 foram ativos apenas contra as clulas de leucemia linfide (K-562), mostrando valores de LC50 (MG-MID) de 74,58M; 90,93M; 73,48M; 68,45M e 83,43M, respectivamente. O composto 17 foi ativo apenas contra as clulas tumorais de clon (HT-29), com um valor de LC50 (MG-MID) de 98,73M. Entre os compostos avaliados, quanto atividade citotxica, alguns compostos se destacaram contra clulas de leucemia linfide (K-562), enquanto que a doxorrubicina inativa contra esta linhagem celular: o composto 31, que apresentou seletividade moderada e atividade tambm moderada, e os compostos
19 e 28, que apresentaram atividade moderada, mas com baixa seletividade. Contra
esta linhagem celular, tambm os compostos 26 e 30 apresentaram considervel atividade, mas com baixa seletividade. Analisando-se os resultados da avaliao de atividade antitumoral do bisabolol e seus derivados sintetizados, pde-se observar que a incorporao de HSCN molcula de -bisabolol (16), formando o isotiocianato (17) e, consequentemente, o tiocianato (18), atribuiu a estes derivados propriedades antitumorais contra todas as linhagens celulares avaliadas. Em relao ao bisabolol, a atividade inibitria de crescimento tumoral aumentou cerca de 6 vezes para 17 e 4 vezes para 18, no que se refere atividade mdia, e diminuiu cerca de 2,5 vezes para ambos os compostos, no que se refere atividade contra clulas de leucemia. Quanto propriedade citosttica, o -bisabolol mostrou-se inativo enquanto que estes derivados apresentaram pequena atividade. Quanto propriedade citotxica, os compostos 16 e 18 mostraram-se inativos enquanto que o composto 17 demonstrou pequena atividade contra clulas de clon. A adio de hidrazina ao isotiocianato, gerando a tiossemicarbazida (19), mostrou-se como uma modificao estrutural que provocou grande aumento nas propriedades antitumorais dos compostos sintetizados. Quanto atividade inibitria de crescimento tumoral, o composto 19 apresentou grande seletividade e potente atividade contra clulas de leucemia, sendo tambm cerca de 2 vezes mais ativo que 17 e cerca de 3 vezes mais ativo que 18, no que se refere atividade mdia. Tambm demonstrou potente atividade contra clulas de mama com resistncia, apesar da baixa seletividade para esta linhagem celular. Quanto atividade
32
citosttica, o mesmo fato pde ser observado, onde o composto 19 apresentou grande seletividade e potente atividade contra clulas de leucemia, sendo tambm cerca de 2 vezes mais ativo que 17 e 18, no que se refere atividade mdia. Quanto atividade citotxica, o composto 19 apresentou-se ativo apenas contra clulas de leucemia, com baixa seletividade e moderada atividade, sendo tambm mais ativo que 17, no que se refere atividade mdia. O composto 18 mostrou-se inativo. Comparando-se as propriedades antitumorais do composto 19 com as da doxorrubicina, se observa que 19 mais ativo contra clulas tumorais de leucemia e mama com resistncia. Este expressivo aumento nas propriedades antitumorais provocado pelo grupo tiossemicarbazida pode indicar o envolvimento direto deste grupo no mecanismo de ao antitumoral do composto 19. A condensao da tiossemicarbazida com o benzaldedo, seus derivados substitudos, a acetofenona e a benzofenona, gerando as tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol (20 32), provocou diversas alteraes nas propriedades antitumorais dos compostos sintetizados. A benzaldedo-tiossemicarbazona (20) apresentou menores propriedades antitumorais que a tiossemicarbazida, mas ainda maiores que o -bisabolol e o isotiocianato, e tambm moderada seletividade para clulas de leucemia, em relao atividade inibitria de crescimento tumoral. Para esta linhagem celular, as propriedades antitumorais de 20 diminuram muito em relao tiossemicarbazida, apesar de, na mdia, mostrar-se mais ativo no que se refere s propriedades citosttica e citotxica. As benzaldedo-tiossemicarbazonas contendo os grupos CH3, OCH3, OH e N(CH3)2, doadores de densidade eletrnica, em para (21 24), apresentaram propriedades antitumorais muito prximas das de 20. Na atividade inibitria de crescimento tumoral, apenas 24 foi menos ativo, na atividade mdia, mas altamente seletivo e potencialmente ativo contra clulas de leucemia. Os outros compostos foram mais ativos, na atividade mdia, e o nico que no se mostrou seletivo para clulas de leucemia foi 23, apesar de sua tima atividade contra estas clulas. Na atividade citosttica, tambm o composto 24 foi menos ativo, sendo moderadamente eficiente apenas contra clulas de leucemia. Os outros compostos foram mais ativos, na atividade mdia, e o nico que no se mostrou seletivo para clulas de leucemia foi 23, apesar de sua potente atividade contra estas clulas. Na atividade citotxica, os compostos 21, 22 e 23 mostraram atividade mdia semelhante de 20, com 22 e
23 ligeiramente menos ativos. Portanto, a presena de grupos doadores de
densidade eletrnica, ligados em para na poro aromtica, provocou pequena

33
melhora nas propriedades antitumorais dos compostos sintetizados em relao benzaldedo-tiossemicarbazona (20), com destaque para a presena do grupo dimetilamino presente no composto 24, que proporcionou seletividade para clulas de leucemia. As benzaldedo-tiossemicarbazonas contendo o grupo NO2, forte retirador de densidade eletrnica, em orto, meta e para (25 27), apresentaram propriedades antitumorais variadas. Na atividade inibitria de crescimento tumoral, o composto 26 foi altamente seletivo e potencialmente ativo contra clulas de leucemia, sendo, inclusive, mais ativo que a doxorrubicina. O composto 25 foi moderadamente seletivo e bastante ativo contra clulas de leucemia. Apenas 27 foi moderadamente ativo e no seletivo para esta linhagem celular. Na atividade citosttica, apenas 26 se mostrou potencialmente ativo e moderadamente seletivo para clulas de leucemia, e na atividade mdia, tambm 26 se mostrou mais ativo que 20, enquanto que 25 demonstrou atividade prxima de 20 e 27 se mostrou 2 vezes menos ativo. Na atividade citotxica, os trs compostos mostraram atividades mdias semelhantes de 20, com 27 ligeiramente menos ativo. Portanto, a presena do grupo NO2, forte retirador de densidade eletrnica, mostrou potencializar as propriedades antitumorais dos compostos sintetizados, quando ligado em meta na poro aromtica. As benzaldedo-tiossemicarbazonas contendo o grupo Cl, retirador fraco de densidade eletrnica, em orto, meta e para (28 30), apresentaram propriedades antitumorais variadas. Na atividade inibitria de crescimento tumoral, os trs compostos se apresentaram potencialmente ativos e com grande seletividade para as clulas de leucemia, enquanto que na atividade mdia, apenas o composto 28 mostrou-se menos ativo que 20. Na atividade citosttica, os trs compostos se apresentaram moderadamente ativos e seletivos para as clulas de leucemia, enquanto que na atividade mdia, apenas o composto 28 mostrou-se menos ativo que 20. Na atividade citotxica, os trs compostos mostraram atividades mdias semelhantes de 20, com 30 ligeiramente mais ativo. Portanto, a presena do grupo Cl, retirador fraco de densidade eletrnica, mostrou potencializar as propriedades antitumorais dos compostos sintetizados com relao ao composto 20, quando ligado na poro aromtica, seja em orto, meta ou para. A acetofenona-tiossemicarbazona derivada do -bisabolol (31) se apresentou como o composto mais ativo de toda a srie sintetizada, revelando propriedades antitumorais maiores que a tiossemicarbazida e a doxorrubicina. Na atividade
34
inibitria de crescimento tumoral, demonstrou potente atividade e elevada seletividade para clulas de leucemia, potente atividade, mas com baixa seletividade, para clulas de mama com resistncia, e ainda excelente atividade mdia. Na atividade citosttica, tambm demonstrou potente atividade e elevada seletividade para clulas de leucemia, apesar da pequena atividade mdia. Na atividade citotxica, demonstrou moderada atividade somente para clulas de leucemia com moderada seletividade, sendo inativo contra as demais linhagens celulares avaliadas. Logo, o composto 31 apresentou excelentes propriedades antitumorais, muito melhores que o composto 20, tambm no substitudo na poro aromtica. Isto indica que a presena do grupo metil, ligado ao carbono imnico, potencializa muito as propriedades antitumorais em relao aos demais compostos sintetizados, podendo este grupo estar envolvido diretamente no mecanismo de ao antitumoral do composto 31. A benzofenona-tiossemicarbazona derivada do -bisabolol (32) se apresentou como o composto menos ativo de toda a srie sintetizada, revelando propriedades antitumorais bem menores que a benzaldedo-tiossemicarbazona. Na atividade inibitria de crescimento tumoral, demonstrou moderada atividade e seletividade para clulas de leucemia, mas com baixa atividade mdia, sendo apenas mais ativa que o -bisabolol. Na atividade citosttica, tambm demonstrou moderada atividade e seletividade para clulas de leucemia, sendo ativa apenas contra esta linhagem celular. Na atividade citotxica, tambm se demonstrou ativa somente contra clulas de leucemia, apresentando pequena atividade e baixa seletividade. O fato de o composto 32 apresentar propriedades antitumorais muito pequenas indica que a presena de 2 grupos fenil, ligados ao carbono imnico, diminui muito as propriedades antitumorais em relao aos demais compostos sintetizados, apesar de manter a tendncia de seletividade para clulas de leucemia. Com base nos resultados da avaliao de atividade antitumoral do -bisabolol e seus derivados sintetizados, pde-se observar que todos os seus derivados so mais ativos, o que mostra que as modificaes estruturais realizadas surtiram o efeito esperado. Entretanto, o -bisabolol se mostrou seletivamente ativo contra clulas de leucemia, em relao s oito linhagens celulares avaliadas, podendo indicar que a grande seletividade de seus derivados por esta linhagem celular devese sua participao direta no mecanismo de ao antitumoral. Quanto s converses de grupos funcionais realizadas durante a rota sinttica, observou-se que a converso do -bisabolol em isotiocianato provocou um grande aumento das
35
propriedades antitumorais no composto 18, apesar de reduzir drasticamente a seletividade para clulas de leucemia; a converso do grupo isotiocianato em tiossemicarbazida potencializou ainda mais as propriedades antitumorais no composto 19 e proporcionou novamente grande seletividade para clulas de leucemia; e a converso do grupo tiossemicarbazida em tiossemicarbazona manteve elevadas as propriedades antitumorais dos compostos 20 31, com apenas o composto 32 se mostrando menos ativo, e manteve, na maioria dos casos, a seletividade para clulas de leucemia.
36
4. CARACTERIZAO ESTRUTURAL
4.1. -Bisabolol
15 4 5 6 H HO 14 1 7 3 2 13 8 9 10 11 12
A confirmao da estrutura do -bisabolol (16) foi feita por meio das tcnicas de FTIR e de RMN de 1H, 13C, 13C/DEPT, COSY e HMQC. No espectro no IV (figura 4) foram observadas: banda tpica de OH de lcool em 3440cm-1, bastante intensa e alargada; bandas de deformao axial de C-H em 3000 2750cm-1; banda de deformao angular de C-H em 15001400cm-1 e banda tpica de deformaes axiais de dupla ligao no conjugada em 1670cm-1. Os sinais so condizentes com os apresentados na literatura59. No espectro de RMN 1H (figura 5 e tabela 8) observaram-se os sinais caractersticos dos hidrognios olefnicos, em 5,12 (H10, t, 1H, 7,2 Hz) e 5,36 (H3, m, 1H), e dos hidrognios metlicos, em 1,10 (H14, s, 3H), 1,64 (H12, s, 3H), 1,68 (H13, s, 3H) e 1,62 (H15, s, 3H). Os dados de RMN 1H apresentados na literatura59 para o -bisabolol indicam os sinais para H12 e H14 com os deslocamentos qumicos invertidos, o que pode ser comprovado com os sinais de RMN 1H dos derivados sintticos do -bisabolol. Como as alteraes estruturais ocorrem em C11, observa-se que apenas os hidrognios metlicos H12 e H13 sofrem alteraes relevantes em seus deslocamentos qumicos. Desta forma, como o sinal em 1,10 permanece sem alteraes significativas nos derivados sintticos, conclui-se que este relativo H14 e no H12, como apresentado na literatura59. No espectro de RMN
13
C/DEPT (figuras 6 e 7 e tabela 8) foram observados
sinais que possibilitaram identificar 15 carbonos, sendo 4CH3, 5CH2, 3CH e 3C. Destes, so caractersticos os sinais em: 124,7 (C10, CH), 131,6 (C11, C), 120,7
37
(C3, CH) e 134,1 (C4, C), correspondentes a carbonos olefnicos; e 25,8 (C12, CH3), 17,7 (C13, CH3), 23,2 (C14, CH3) e 23,5 (C15, CH3), correspondentes a carbonos metlicos. Os dados de RMN
13
C apresentados na literatura59 para o 13
bisabolol indicam os sinais para C12 e C14 com os deslocamentos qumicos invertidos, o que pode ser comprovado com os sinais de RMN C dos derivados sintticos do -bisabolol. Como as alteraes estruturais ocorrem em C11, observase que apenas os carbonos metlicos C12 e C13 sofrem alteraes relevantes em seus deslocamentos qumicos. Desta forma, como o sinal em 23,2 permanece sem alteraes significativas nos derivados sintticos, conclui-se que este relativo C14 e no C12, como apresentado na literatura59. No mapa de contornos COSY (figura 8 e tabela 8) foi possvel observar as correlaes entre: H1 H14; H2 H3; H3 H15; H9 H10; H10 H12 e H13. O mapa de contornos HMQC (figura 9) auxiliou a anlise dos espectros de RMN
1
H e
13
C, confirmando, por exemplo, os deslocamentos qumicos dos
hidrognios metlicos. O literatura59. Com base nos dados espectroscpicos e na propriedade fsica
59
para o -bisabolol (tabela 25) foi de -48,52 estando de acordo com a , estando
estes em conformidade com a literatura , confirma-se que o composto isolado a partir do leo de candeia o (-)--bisabolol ou (-)-2-(S)-6-metil-2-[1-(S)-4metilciclohex-3-enil]-hept-5-en-2-ol.
38
15 4 5 6 H HO 14 1 7 3 2 13 8 9 10 11 12
Tabela 8: Dados de RMN 1H, 13C, DEPT e COSY para 16 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 C (DEPT) 43,1 (CH) 27,0 (CH2) 120,7 (CH) 134,1 (C) 31,1 (CH2) 23,4 (CH2) 74,3 (C) 40,3 (CH2) 22,2 (CH2) 124,7 (CH) 131,6 (C) 25,8 (CH3) 17,7 (CH3) 23,2 (CH3) 23,5 (CH3) H (mult., J em Hz) 1,58 (s) 1,29 (m) 5,36 (m) --1,96 (m) 1,90 (m) --1,49 (m) 2,04 (m) 5,12 (t, 7,2) --1,64 (s) 1,68 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) COSY H14 H3 H2 e H15 ----------H10 H9, H12 e H13 ------H1 H3
39
40
41
42
43
44
45
4.2. Isotiocianato e Tiocianato Derivados do -Bisabolol
4.2.1. Isotiocianato
15 4 5 6 H HO 14 1 7 3 2 13 8 9 10 11 12 16 N C S
A confirmao da estrutura do isotiocianato derivado do -bisabolol (17) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H,
13
C, 13C/DEPT, COSY e HMQC. No espectro no IV (figura 10), alm das bandas observadas para o -
bisabolol (j mencionadas), observou-se uma banda alargada caracterstica da dupla ligao cumulada do grupo NCS58,60 em 2092 cm-1. Esta informao indica que o HSCN foi realmente incorporado molcula de -bisabolol. No espectro de massas de baixa resoluo (figura 11), observou-se o pico do on molecular em m/z 281 e o do fragmento correspondente a perda de NCS e OH em m/z 206.
No espectro de RMN 1H (figura 12 e tabela 9), foram observadas, como
mudanas mais significativas, o desaparecimento do sinal de hidrognio olefnico em 5,12 (H10, t, 1H, 7,2 Hz), que havia no -bisabolol, e o conseqente surgimento do sinal para H10 em 2,00 (m, 2H), alm do deslocamento dos sinais dos hidrognios H12 e H13 de 1,64 e 1,68 para 1,40, para ambos. No espectro de RMN
13
C/DEPT (figuras 13 e 14 e tabela 9), foram
observados sinais que possibilitaram identificar 16 carbonos, sendo 4CH3, 6CH2, 2CH e 4C. Houve o surgimento de mais um sinal de CH2 e o desaparecimento de um sinal de CH, em relao ao -bisabolol, alm da incorporao de mais um tomo
46
de carbono na molcula, o que evidencia-se pelo aparecimento do sinal em 130,5 (C16, C). Ainda ocorreu o deslocamento dos sinais em 124,7 (C10, CH) e 131,6 (C11, C) para 43,9 (C10, CH2) e 61,5 (C11, C); e dos sinais dos carbonos metlicos de 25,8 (C12, CH3) e17,7 (C13, CH3) para 29,0 (C12, CH3) e 29,2 (C13, CH3). No mapa de contornos COSY (figura 15 e tabela 9), foi possvel observar as correlaes entre: H1 H8 e H14; H2 H3; H3 H15. O mapa de contornos HMQC (figura 16) auxiliou a anlise dos espectros de RMN
1
H e
13
hidrognios metlicos. O
para o composto 17 (tabela 25), foi de -50,12. ,
Com base em todos os dados espectroscpicos e a propriedade fsica
todos em conformidade com os dados apresentados na literatura8, confirma-se que o composto sintetizado realmente o isotiocianato derivado do -bisabolol ou (-)-2(S)-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-6-isotiociano-heptan-2-ol.
47
15 4 5 6 H HO 14 1 7 3 2 13 8 9 10 11 12 16 N C S
Tabela 9: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 17 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 C (DEPT) H (mult.) COSY
43,2 (CH) 27,0 (CH2) 120,6 (CH) 134,4 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,3 (C) 40,1 (CH2) 18,5 (CH2) 43,9 (CH2) 61,6 (C) 29,0 (CH3) 29,2 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) 130,5 (C)
1,58 (s) 1,30 (m) 5,37 (m) --1,95 (m) 1,91 (m) --1,49 (m) 1,81 (m) 1,43 (m) --1,40 (s) 1,40 (s) 1,12 (s) 1,66 (s) ---
H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ---
48
49
50
51
52
53
54
55
4.2.2. Tiocianato
15 4 5 6 H HO 14 1 7 3 2 13 8 9 10 11 S 12 16 C N
A confirmao da estrutura do tiocianato derivado do -bisabolol (18) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H,
13 13
C,
C/DEPT, COSY e HMQC. No espectro no IV (figura 17), alm das bandas observadas para o -
bisabolol (j mencionadas), foram verificadas, em 2150cm-1, uma banda alargada caracterstica da dupla ligao cumulada do grupo SCN61. Esta informao tambm confirma que o HSCN foi incorporado molcula de -bisabolol. No espectro de massas de baixa resoluo (figura 18), observou-se o pico do on molecular em m/z 281 e o do fragmento correspondente a perda de SCN e OH em m/z 206. No espectro de RMN 1H (figura 19 e tabela 10), assim como no caso do isotiocianato, foram observadas, como mudanas mais significativas, o desaparecimento do sinal de hidrognio olefnico em 5,12 (H10, t, 1H, 7,2 Hz), que havia no -bisabolol, e o conseqente surgimento do sinal para H10 em 1,99 (m, 2H), alm do deslocamento dos sinais dos hidrognios H12 e H13 de 1,64 e 1,68 para 1,52, para ambos. No espectro de RMN
13
C/DEPT (figuras 20 e 21 e tabela 10), observou-se
sinais que possibilitaram identificar 16 carbonos, sendo 4CH3, 6CH2, 2CH e 4C. Como no isotiocianato, houve o surgimento de mais um sinal de CH2 e o desaparecimento de um sinal de CH, em relao ao -bisabolol, alm da incorporao de mais um tomo de carbono na molcula, o que se evidencia pelo aparecimento do sinal em 112,0 (C16, C). Ainda ocorreu o deslocamento do sinal
56
em 124,7 (C10, CH) para 43,8 (C10, CH2) e dos sinais dos carbonos metlicos de 25,8 (C12, CH3) e17,7 (C13, CH3) para 28,9 (C12, CH3) e 29,1 (C13, CH3). No mapa de contornos COSY (figura 23 e tabela 10), foi possvel observar as correlaes entre: H1 H8 e H14; H2 H3; H3 H15. O mapa de contornos HMQC (figura 24) auxiliou a anlise dos espectros de RMN
1
H e
13
hidrognios metlicos. O para o composto 18 (tabela 25) foi de -41,37. ,

8
Com base em todos os dados espectroscpicos e a propriedade fsica
todos em conformidade com os dados apresentados na literatura , confirma-se que o composto sintetizado o tiocianato derivado do (-)--bisabolol ou (-)-2-(S)-6-metil-2[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-6-tiociano-heptan-2-ol.
57

5 6 H HO 14 1 7 15 4 3 2 13 8 9 10 11 S 12 16 C N
Tabela 10: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 18 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 C (DEPT) H (mult.) COSY
43,1 (CH) 27,0 (CH2) 120,5 (CH) 134,2 (C) 31,1 (CH2) 23,4 (CH2) 74,2 (C) 40,1 (CH2) 18,4 (CH2) 43,8 (CH2) 56,3 (C) 28,9 (CH3) 29,1 (CH3) 23,5 (CH3) 23,4 (CH3) 112,0 (C)
1,58 (s) 1,30 (m) 5,37 (m) --1,92 (m) 1,88 (m) --1,48 (m) 1,82 (m) 1,48 (m) --1,52 (s) 1,52 (s) 1,12 (s) 1,65 (s) ---
H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ---
58
59
60
61
62
63
64
65
4.3. Tiossemicarbazida derivada do -Bisabolol
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 NH2 3 N H
A confirmao da estrutura da tiossemicarbazida derivada do -bisabolol (19) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H,
13
C, 13C/DEPT, COSY e HMQC. No espectro no IV (figura 24), alm das bandas j citadas para o -bisabolol,
foram observadas: bandas de deformao axial de C=S ligada a nitrognio em sobreposio com a banda de deformao angular de N-H de aminas secundrias em 1537cm-1; bandas de deformao axial de C-S e C-N na regio de 1380500cm1
; bandas alargadas e em sobreposio de deformao axial simtrica e assimtrica No espectro de massas de baixa resoluo (figura 25), observou-se o pico do
de N-H na regio de 33003200cm-1. on molecular em m/z 313 e o do fragmento correspondente a perda de HNCSNHNH2 em m/z 223. No espectro de RMN
1
H (figura 26 e tabela 11), foram observados
claramente os sinais de N-H caractersticos do grupo tiossemicarbazida, em 3,96 (H1, s, 2H), 7,49 (H2, s, 1H) e 7,75 (H4, s, 1H). Foi observada, tambm, como mudana mais significativa, alterao nos deslocamentos qumicos de H12 e H13, em relao ao isotiocianato, de 1,40 para 1,48, evidenciando sua maior desblindagem. No espectro de RMN
13
C/DEPT (figuras 27 e 28 e tabela 11), foi possvel
observar que o nmero de tomos de carbono no sofreu alterao em relao ao isotiocianato. No entanto, ocorreram mudanas em alguns deslocamentos qumicos. As mais significativas foram: No carbono 3, que passou de 130,5 para 180,4;
66
deslocamento qumico este caracterstico de tiocarbonila ligada a nitrognios; e no carbono 11, que passou de 61,5 para 55,5. Estas mudanas apresentadas so condizentes com a reao executada. No mapa de contornos COSY (figura 29 e tabela 11), foi possvel observar as correlaes entre: H1 H8 e H14; H2 H3; H3 H15. O mapa de contornos HMQC (figura 30) auxiliou a anlise dos espectros de RMN
1
H e
13
hidrognios metlicos. O para composto 19 (tabela 25) foi de -34,55. Com base em todos os dados espectroscpicos, evidencia-se que o composto sintetizado realmente a tiossemicarbazida derivada do -bisabolol ou (-)(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]tiossemicarbazida.
67
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 NH2 3 N H
Tabela 11: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 19 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 C (DEPT) H (mult.) COSY
43,3 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,3 (CH2) 17,7 (CH2) 40,6 (CH2) 55,5 (C) 27,8 (CH3) 27,8 (CH3) 23,5 (CH3) 23,3 (CH3) ----180,4 (C) ---
1,58 (s) 1,30 (m) 5,37 (m) --1,95 (m) 1,90 (m) --1,50 (m) 1,78 (m) 1,45 (m) --1,48 (s) 1,48 (s) 1,09 (s) 1,65 (s) 3,96 (s) 7,49 (s) --7,75 (s)
H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ---------
68
69
70
71
72
73
74
75
4.4. Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol
4.4.1. Benzaldedo-tiossemicarbazona
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' 4'' '
A confirmao da estrutura da benzaldedo-tiossemicarbazona derivada do bisabolol (20) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H, 13C, 13C/DEPT, COSY e HMQC. No espectro no IV (figura 31), alm das bandas observadas para a tiossemicarbazida, foram detectadas: bandas de deformao axial de C-H de sistemas aromticos em 33403150cm-1; bandas de deformaes fora do plano de C-H aromtico em 950670cm-1; bandas de deformao axial de C=N e C=S, em sobreposio, na regio de 13701050cm-1; ausncia de bandas provenientes de aminas primrias. No espectro de massas de baixa resoluo (figura 32), observou-se o pico do on molecular em m/z 401 e o do fragmento correspondente a perda de HNCSNHNCHPh em m/z 223. No espectro de RMN 1H (figura 33 e tabela 12), foram vistos: o sinal em 7,49 (H1, s, 1H) referente ao hidrognio imnico; os sinais para hidrognios de sistema aromtico em 7,40 (H4, H5 e H6, m, 3H) e 7,61 (H3 e H7, m, 2H); o desaparecimento do sinal de N-H em 3,96 (H1, s, 2H), presente na tiossemicarbazida; o deslocamento dos sinais caractersticos de N-H que, para a tiossemicarbazida, so em 7,49 (H2, s, 1H) e 7,75 (H4, s, 1H) para 9,33 (H2, s, 1H) e 7,79 (H4, s, 1H); alteraes nos deslocamentos qumicos de H12 e H13, em relao tiossemicarbazida, de 1,48 (para ambos) para 1,57 e 1,58 para H12 e
76
H13, respectivamente, evidenciando sua maior desblindagem. Os demais hidrognios da poro terpnica no sofreram alteraes relevantes. No espectro de RMN
13
observar sinais que caracterizaram 23 carbonos, sendo 4CH3, 6CH2, 8CH e 5C. Assim, confirmou-se a incorporao de mais 7 carbonos na molcula, sendo 6CH e 1C. Os sinais para estes carbonos so em 141,4 (C1, CH), 133,6 (C2, C), 127,4 (C3 e C7, CH), 129,1 (C4 e C6, CH) e 130,6 (C5, CH). Ainda ocorreu o deslocamento do sinal da tiocarbonila da tiossemicarbazida de 180,4 (C3, C) para 175,8 (C3, C). Os sinais dos carbonos da poro terpnica no sofreram alteraes significativas. Todas estas alteraes no espectro de RMN condizem com a reao efetuada. No mapa de contornos COSY (figura 36 e tabela 12), foi possvel observar as correlaes entre: H1 H8 e H14; H2 H3; H3 H15; H3 e H7 H4, H5 e H6. O mapa de contornos HMQC (figura 37) auxiliou a anlise dos espectros de RMN H e O
1 13 13
C/DEPT
C, confirmando, por exemplo, os deslocamentos qumicos do carbono
imnico e dos hidrognios metlicos. para o composto 20 (tabela 25), foi de -11,22. Tendo em vista todos os dados espectroscpicos, evidencia-se que o composto sintetizado a benzaldedo-tiossemicarbazona derivada do -bisabolol ou (-)-N1-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]heptanil]-tiossemicarbazona.
77
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' 4'' '
Tabela 12: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 20 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) H (mult.) COSY
43,2 (CH) 27,1 (CH2) 120,8 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 40,9 (CH2) 56,4 (C) 27,5 (CH3) 27,6 (CH3) 23,6 (CH3) 23,6 (CH3) ----175,8 (C) --141,4 (CH) 133,6 (C) 127,4 (CH) 129,1 (CH) 130,6 (CH) 129,1 (CH) 127,4 (CH)
1,60 (s) 1,28 (m) 5,34 (m) --1,95 (m) 1,90 (m) --1,50 (m) 1,78 (m) 1,55 (m) --1,57 (s) 1,58 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,33 (s) --7,79 (s) 7,49 (s) --7,61 (m) 7,40 (m) 7,40 (m) 7,40 (m) 7,61 (m)
H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4, H5 e H6 H3 e H7 H3 e H7 H3 e H7 H4, H5 e H6
78
79
80
81
82
83
84
85
4.4.2. Benzaldedo-tiossemicarbazonas Substitudas
A anlise dos espectros no IV, de Massas e de RMN das benzaldedotiossemicarbazonas substitudas derivadas do -bisabolol (21 30) mostrou que a diferena entre elas e a benzaldedo-tiossemicarbazona (20) est apenas na poro aromtica, variando de acordo com o substituinte do benzaldedo incorporado. Portanto, discutiremos apenas os dados espectroscpicos referentes aos sistemas aromticos destes compostos.
4.4.2.1.
(p-metil,
p-metxi,
p-hidrxi
p-dimetilamino)-
benzaldedo-tiossemicarbazonas
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' R
4''
R = CH3 (21), OCH3 (22), OH (23) e N(CH3)2 (24)
A confirmao das estruturas das benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol (21 24) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectro de Massas e de RMN de 1H, 13C, DEPT, COSY e HMQC. Nos espectros no IV (figuras 38, 45, 52 e 59), alm das bandas observadas para 20, foram observadas: uma banda forte em 1255cm-1, referente a deformao axial assimtrica C-O-C do grupo OCH3 em sobreposio com a banda referente a tiocarbonila para 22; uma banda intensa em 1160cm-1, caracterstica de deformao
86
assimtrica de C-O fenlico para 23; e uma banda forte em 1355cm-1, referente a deformao axial de C-N de amina terciria em 24. Nos espectros de massas de baixa resoluo (figuras 39, 46, 53 e 60), foram observados os picos dos ons moleculares em m/z: 415, para 21; 431, para 22; 417, para 23 e 444, para 24. Nos espectros de RMN 1H (figuras 40, 47, 54 e 61 e tabelas 13, 14, 15 e 16), observaram-se sinais semelhantes em 7,447,48 (H1, s, 1H) referentes aos hidrognios imnicos; os sinais para hidrognios dos sistemas aromticos em 7,377,55 (H3 e H7, d, 2H) e 6,677,20 (H4 e H6, d, 2H); e os sinais de hidrognios ligados a nitrognio em 9,159,48 (H2, s, 1H) e 7,407,82 (H4, s, 1H). As diferenas observadas foram paras os hidrognios referentes aos substituintes em cada caso. Para o composto 21, observou-se o sinal em 2,38 (H8, s, 3H), referente ao grupo metila; para o composto 22, em 3,85 (H8, s, 3H), referente ao grupo metoxila; e em 3,02 (H8 e H9, s, 6H), referente aos metilas ligadas a nitrognio do composto 24. Nos espectros de RMN
13
C/DEPT (figuras 41, 42, 48, 49, 55, 56, 62 e 63 e
tabelas 13, 14, 15 e 16), foi possvel observar os sinais que caracterizaram os
carbonos incorporados tiossemicarbazida, sendo 2C, 5CH e 1CH3, para os compostos 21 e 22; 2C e 5CH, para o composto 23; e 2C, 5CH e 2CH3, para o composto 24. Os sinais para estes carbonos so em 141,6142,6 (C1, CH), referentes aos carbonos imnicos; em 121,1130,9 (C2, C), 128,9129,8 (C3 e C7, CH) e 112,0127,4 (C4 e C6, CH), para os 4 compostos. O sinal para C5 foi o que apresentou maior variao em seu deslocamento qumico, dependendo do substituinte ligado a ele, e ocorreu em 140,9; 161,7; 158,8 e 151,9; para 21, 22, 23 e 24, respectivamente. Os sinais para os carbonos dos grupos substituintes ocorreram em 21,7 para 21, 55,6 para 22 e 40,3 para 24, estando coerentes com a vizinhana qumica em cada caso. Nos mapas de contornos COSY (figuras 43, 50, 57 e 64 e tabelas 13, 14, 15
e 16), foi possvel observar, em todos os casos, as correlaes de H3 e H7 com
H4 e H6, na poro aromtica. Os mapas de contornos HMQC (figuras 44, 51, 58 e 65) auxiliaram a anlise dos espectros de RMN 1H e Os valores de
13
C, confirmando, por exemplo, os deslocamentos
qumicos dos carbonos imnicos. medidos para os compostos 21, 22, 23 e 24 (tabela 25),
87
foram de -9,27; -6,01, -5,92 e -5,98, respectivamente.
Com base em todos os dados espectroscpicos analisados, os compostos 21,

22, 23 e 24 foram caracterizados como sendo as p-substitudas-benzaldedo-
tiossemicarbazonas
derivadas
do
-bisabolol,
ou
seja,
(-)-N1-p-metil-
benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]tiossemicarbazona (21); (-)-N1-p-metxi-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (22); (-)-N1-p-hidrxi-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex3-enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (23); e (-)-N1-p-dimetilamino-benzaldedo-(N4-6)[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (24).
88

5' 6'
15' 4' 3' 1' H HO 14' 7' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 6'' 5''
8'' CH3
4'' 3''
Tabela 13: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 21 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 C (DEPT) 43,2 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 40,9 (CH2) 56,3 (C) 27,5 (CH3) 27,5 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,6 (C) --141,8 (CH) 130,9 (C) 129,8 (CH) 127,4 (CH) 140,9 (C) 127,4 (CH) 129,8 (CH) 21,7 (CH3) H (mult., J em Hz) 1,60 (s) 1,29 (m) 5,34 (m) --1,92 (m) 1,88 (m) --1,51 (m) 1,78 (m) 1,54 (m) --1,56 (s) 1,57 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,48 (s) --7,82 (s) 7,48 (s) --7,50 (d, 8,0) 7,20 (d, 8,0) --7,20 (d, 8,0) 7,50 (d, 8,0) 2,38 (s) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4 e H6 H3 e H7 --H3 e H7 H4 e H6 ---
89
90
91
92
93
94
95
96
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' 8'' OCH3
4''
Tabela 14: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 22 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 40,9 (CH2) 56,4 (C) 27,5 (CH3) 27,5 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,4 (C) --141,6 (CH) 126,2 (C) 129,0 (CH) 114,6 (CH) 161,7 (C) 114,6 (CH) 129,0 (CH) 55,6 (CH3) H (mult., J em Hz) 1,61 (s) 1,30 (m) 5,34 (m) --1,95 (m) 1,90 (m) --1,53 (m) 1,80 (m) 1,54 (m) --1,56 (s) 1,57 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,20 (s) --7,74 (s) 7,45 (s) --7,55 (d, 8,7) 6,92 (d, 8,7) --6,92 (d, 8,7) 7,55 (d, 8,7) 3,85 (s) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4 e H6 H3 e H7 --H3 e H7 H4 e H6 ---
97
98
99
100
101
102
103
104
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' OH
4''
Tabela 15: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT COSY para 23 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,5 (CH) 27,2 (CH2) 120,6 (CH) 134,4 (C) 31,1 (CH2) 23,1 (CH2) 75,4 (C) 40,4 (CH2) 17,8 (CH2) 40,5 (CH2) 56,3 (C) 27,8 (CH3) 27,8 (CH3) 23,6 (CH3) 23,6 (CH3) ----175,2 (C) --142,1 (CH) 125,5 (C) 129,3 (CH) 116,3 (CH) 158,8 (C) 116,3 (CH) 129,3 (CH) H (mult., J em Hz) 1,61 (s) 1,30 (m) 5,34 (m) --1,97 (m) 1,91 (m) --1,50 (m) 1,79 (m) 1,52 (m) --1,54 (s) 1,54 (s) 1,10 (s) 1,61 (s) --9,15 (s) --7,40 (s) 7,47 (s) --7,37 (d, 8,5) 6,85 (d, 8,5) --6,85 (d, 8,5) 7,37 (d, 8,5) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4 e H6 H3 e H7 --H3 e H7 H4 e H6
105
106
107
108
109
110
111
112
9'' H3C 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5''
15'
8'' N CH3
4''
Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 24 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C (DEPT) 43,2 (CH) 27,1 (CH2) 120,8 (CH) 134,2 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 40,9 (CH2) 56,1 (C) 27,5 (CH3) 27,5 (CH3) 23,6 (CH3) 23,6 (CH3) ----175,1 (C) --142,6 (CH) 121,1 (C) 128,9 (CH) 112,0 (CH) 151,9 (C) 112,0 (CH) 128,9 (CH) 40,3 (CH3) 40,3 (CH3) H (mult., J em Hz) 1,62 (s) 1,28 (m) 5,34 (m) --1,98 (m) 1,87 (m) --1,52 (m) 1,79 (m) 1,54 (m) --1,56 (s) 1,57 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,15 (s) --7,40 (s) 7,44 (s) --7,48 (d, 9,0) 6,67 (d, 9,0) --6,67 (d, 9,0) 7,48 (d, 9,0) 3,02 (s) 3,02 (s) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4 e H6 H3 e H7 --H3 e H7 H4 e H6 -----
113
114
115
116
117
118
119
120
4.4.2.2. (o, m e p)-nitro-benzaldedo-tiossemicarbazonas

15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 3 1 2 N N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' NO 2 4''
NO2 = orto (25), meta (26) e para (27).
A confirmao das estruturas das nitro-benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol (25 27) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H, 13C, DEPT, COSY e HMQC. Nos espectros no IV (figuras 66, 74 e 82), alm das bandas observadas para
20, foram observadas: uma banda forte em 13401350cm-1, referente a deformao
axial assimtrica de N-O e uma banda intensa em 11501500cm-1, caracterstica de deformao assimtrica de N-O em sobreposio com as bandas de C=C e C=N. Nos espectros de massas de baixa resoluo (figuras 67, 75 e 83), foram observados os picos dos ons moleculares em m/z 446 para os compostos 25 27. Nos espectros de RMN 1H (figuras 68, 73, 76 e 84 e tabelas 17, 18 e 19), observaram-se sinais semelhantes em 7,878,46 (H1, s, 1H), referentes aos hidrognios imnicos, e os sinais de hidrognios ligados a nitrognio em 9,309,96 (H2, s, 1H) e 7,407,48 (H4, s, 1H). As diferenas observadas foram paras os hidrognios dos sistemas aromticos, dependendo, em cada caso, da posio do grupo nitro. Para o composto 25, foram detectados os sinais: em 8,00 (H4, dd, 8,0 e 1,2Hz); 7,66 (H5, td, 8,0 e 1,2Hz); 7,54 (H6, td, 8,0 e 1,2Hz) e 7,89 (H7, dd, 8,0 e 1,2Hz) (figura 73). Estes sinais so coerentes com a substituio em orto. Para o composto 26, foram observados os sinais: em 7,91 (H3, s); 8,23 (H5, ddd; 8,3; 2,4 e 0,9 Hz); 7,60 (H6, t; 8,3Hz) e 7,94 (H7, d, 8,3Hz). Estes sinais so coerentes com a substituio em meta. Para o composto 27, foram vistos os sinais: em 7,77 (H3 e H7, d, 9,0Hz) e 8,26 (H4 e H6, d, 9,0Hz). Estes sinais so coerentes com a substituio em para. Nos espectros de RMN
13
C/DEPT (figuras 69, 70, 77, 78, 85 e 86 e tabelas

121
17, 18 e 19), foi possvel observar os sinais que caracterizaram os carbonos
incorporados tiossemicarbazida, sendo 2C e 5CH para os 3 compostos. Os sinais para os carbonos imnicos ocorreram em 136,2138,6 (C1, CH). Os sinais para os carbonos dos sistemas aromticos variaram de acordo com a posio do grupo nitro, ocorrendo em: 128,4 (C2, C); 148,3 (C3, C); 133,4 (C4, CH); 128,8 (C5, CH); 130,5 (C6, CH) e 125,1(C7, CH), para o composto 25; em 135,6 (C2, C); 132,9 (C3, C); 148,9 (C4, C); 130,1 (C5, CH); 121,8 (C6, CH) e 124,6 (C7, CH), para o composto 26; e em 139,7 (C2, C); 124,4 (C3 e C7, C); 127,8 (C4 e C6, CH) e 148,6 (C5, CH), para o composto 25. Nos mapas de contornos COSY (figuras 71, 79 e 87 e tabelas 17, 18 e 19), foi possvel observar as correlaes: H4 H5; H5 H6; e H6 H7; para 25; H5 H6; e H6 H7; para 26; H3 e H7 H4 e H6, para 26. Os mapas de contornos HMQC (figuras 72, 80 e 88) auxiliaram a anlise dos espectros de RMN 1H e dos carbonos imnicos. Os valores de medidos para os compostos 25, 26 e 27 (tabela 25), foram de -12,84; -18,48, e -3,99, respectivamente. Os pontos de fuso dos compostos 26 e 27, determinados por DSC (tabela
26), foram de 160C e 167C, respectivamente. Foi possvel observar que os
13
C, confirmando, por exemplo, os deslocamentos qumicos
compostos sofreram degradao imediatamente aps o processo de fuso (figuras

81 e 89).
Analisando-se todos os dados espectroscpicos, os compostos 25, 26 e 27 foram caracterizados como sendo as nitro-benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do -(-)-bisabolol, ou seja, a (-)-N1-o-nitro-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (25); a (-)N1-m-nitro-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (27). (26); e a (-)-N1-p-nitro-benzaldedo-(N4-6)[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]-tiossemicarbazona
122
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 10' 11' 4 N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 6'' 5'' 4'' 3'' NO2
Tabela 17: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 25 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 40,8 (CH2) 56,7 (C) 27,3 (CH3) 27,4 (CH3) 23,6 (CH3) 23,6 (CH3) ----176,1 (C) --136,2 (CH) 128,4 (C) 148,3 (C) 133,4 (CH) 128,8 (CH) 130,5 (CH) 125,1 (CH) H (mult., J em Hz) 1,60 (s) 1,29 (m) 5,34 (m) --1,91 (m) 1,88 (m) --1,51 (m) 1,77 (m) 1,53 (m) --1,56 (s) 1,57 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,30 (s) --7,40 (s) 8,26 (s) ----8,00 (dd, 8,0 e 1,2) 7,66 (td, 8,0 e 1,2) 7,54 (td, 8,0 e 1,2) 7,89 (dd, 8,0 e 1,2) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 --------------H5 H4 e H6 H5 e H7 H6
123
124
125
126
127
128
129
130
131
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' 4'' NO2
Tabela 18: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 26 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,4 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,8 (CH2) 41,0 (CH2) 56,7 (C) 27,3 (CH3) 27,3 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,7 (C) --138,6 (CH) 135,6 (C) 132,9 (CH) 148,9 (C) 130,1 (CH) 121,8 (CH) 124,6 (CH) H (mult., J em Hz) 1,58 (s) 1,28 (m) 5,33 (m) --1,91 (m) 1,89 (m) --1,52 (m) 1,78 (m) 1,57 (m) --1,59 (s) 1,60 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,96 (s) --7,48 (s) 8,46 (t, 1,8) --7,91 (s) --8,23 (ddd, 8,3; 2,4 e 0,9) 7,60 (t, 8,3) 7,94 (d, 8,3) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ----------------H6 H5 e H7 H6
132
133
134
135
136
137
138
139
140
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' NO2
4''
Tabela 19: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 27 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,2 (CH2) 120,7 (CH) 134,4 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,5 (CH2) 17,8 (CH2) 40,9 (CH2) 56,8 (C) 27,3 (CH3) 27,3 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,8 (C) --138,2 (CH) 139,7 (C) 124,4 (CH) 127,8 (CH) 148,6 (C) 127,8 (CH) 124,4 (CH) H (mult., J em Hz) 1,59 (s) 1,27 (m) 5,34 (m) --1,90 (m) 1,87 (m) --1,51 (m) 1,79 (m) 1,55 (m) --1,59 (s) 1,60 (s) 1,11 (s) 1,62 (s) --9,69 (s) --7,48 (s) 7,87 (s) --7,77 (d, 9,0) 8,26 (d, 9,0) --8,26 (d, 9,0) 7,77 (d, 9,0) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4 e H6 H3 e H7 --H3 e H7 H4 e H6
141
142
143
144
145
146
147
148
149
4.4.2.3. (o, m e p)-cloro-benzaldedo-tiossemicarbazonas
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' Cl 4''
C l = orto (28), meta (29) e para (30).
A confirmao das estruturas das cloro-benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol (28 30) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H, 13C, DEPT, COSY e HMQC. Nos espectros no IV (figuras 90, 97 e 104), foi observada uma banda alargada em 10751095cm-1, referente a deformao axial de C-Cl aromtico. Nos espectros de massas de baixa resoluo (figuras 91, 98 e 105), foram observados os picos dos ons moleculares em m/z 435 para os compostos 25 27. Nos espectros de RMN 1H (figuras 92, 99 e 106 e tabelas 20, 21 e 22), foram detectados sinais semelhantes em 7,748,21 (H1, s, 1H) referentes aos hidrognios imnicos; e os sinais de hidrognios ligados a nitrognio em 9,319,59 (H2, s, 1H) e 7,447,60 (H4, s, 1H). As diferenas observadas foram paras os hidrognios dos sistemas aromticos, dependendo, em cada caso, da posio do grupo cloro. Para o composto 28, foram vistos os sinais: em 7,84 (H4, dd; 7,8 e 1,0Hz); 7,34 (H5, dd; 7,8 e 1,0Hz); =7,31 (H6, t; 7,8Hz); e 7,39 (H7, dd; 7,8 e 1,0Hz). Estes sinais so coerentes com a substituio em orto. Para o composto 29, foram verificados os sinais: em 7,45 (H3, m); 7,48 (H5, m); =7,33 (H6, t; 8,0Hz); e 7,37 (H7, dd; 8,0 e 0,7Hz). Estes sinais so coerentes com a substituio em meta. Para o composto 30, foram detectados os sinais: em 7,55 (H3 e H7, d; 8,8Hz) e 7,37 (H4 e H6, d; 8,8Hz). Estes sinais so coerentes com a substituio em para.
150
Nos espectros de RMN
13
C/DEPT (figuras 93, 94, 100, 101, 107 e 108 e
tabelas 20, 21 e 22), foi possvel observar os sinais que caracterizaram os carbonos
incorporados tiossemicarbazida, sendo 2C e 5CH para os 3 compostos. Os sinais para os carbonos imnicos ocorreram em 137,9140,0 (C1, CH). Os sinais para os carbonos dos sistemas aromticos variaram de acordo com a posio do grupo cloro, ocorrendo em: 134,6 (C2, C); 137,9 (C3, C); 131,2 (C4, CH); 127,2 (C5, CH); 130,3 (C6, CH) e 127,1(C7, CH), para o composto 28; em 135,5 (C2, C); 130,4 (C3, C); 135,1 (C4, C); 130,3 (C5, CH); 125,8 (C6, CH) e 126,8 (C7, CH), para o composto 29; e em 136,4 (C2, C); 128,5 (C3 e C7, C); 129,4 (C4 e C6, CH) e 132,1 (C5, CH), para o composto 30. Nos mapas de contornos COSY (figuras 95, 102 e 109 e tabelas 20, 21 e
22), foi possvel observar as correlaes: H4 H5; H5 H6; e H6 H7; para 28; H5 H6; e H6 H7; para 29; H3 e H7 H4 e H6, para 30.
Os mapas de contornos HMQC (figuras 96, 103 e 110) auxiliaram a anlise dos espectros de RMN 1H e Os valores de
13
C, confirmando, por exemplo, os deslocamentos
qumicos dos carbonos imnicos. medidos para os compostos 28, 29 e 30 (tabela 25), foram de -6,00; -15,17 e -21,30, respectivamente. Analisando-se todos os dados espectroscpicos, os compostos 28, 29 e 30 foram caracterizados como sendo as cloro-benzaldedo-tiossemicarbazonas derivadas do -(-)-bisabolol, ou seja, a (-)-N1-o-cloro-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (28); a (-)N1-m-cloro-benzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3enil]-heptanil]-tiossemicarbazona (29); tiossemicarbazona (30). e a (-)-N1-p-clorobenzaldedo-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3-enil]-heptanil]-
151
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 10' 11' 4 N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 6'' 5'' 4'' 3'' Cl
Tabela 20: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 28 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,2 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 40,8 (CH2) 56,5 (C) 27,4 (CH3) 27,4 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,9 (C) --137,9 (CH) 134,6 (C) 137,9 (C) 131,2 (CH) 127,2 (CH) 130,3 (CH) 127,1 (CH) H (mult., J em Hz) 1,61 (s) 1,30 (m) 5,34 (m) --1,90 (m) 1,87 (m) --1,50 (m) 1,75 (m) 1,54 (m) --1,56 (s) 1,57 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,41 (s) --7,47 (s) 8,21 (s) ----7,84 (dd, 7,8 e 1,0) 7,34 (dd, 7,8 e 1,0) 7,31 (t, 7,8) 7,39 (dd, 7,8 e 1,0) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 --------------H5 e H6 H4 e H6 H5 e H7 H4 e H6
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5' 6' H HO 14' 1' 7' 15' 4' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' 4'' Cl
Tabela 21: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 29 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,1 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,8 (CH2) 41,0 (CH2) 56,5 (C) 27,3 (CH3) 27,4 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,7 (C) --139,9 (CH) 135,5 (C) 130,4 (CH) 135,1 (C) 130,3 (CH) 125,8 (CH) 126,8 (CH) H (mult., J em Hz) 1,60 (s) 1,30 (m) 5,33 (m) --1,90 (m) 1,87 (m) --1,51 (m) 1,80 (m) 1,55 (m) --1,58 (s) 1,58 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --9,59 (s) --7,60 (s) 7,78 (s) --7,45 (m) --7,48 (m) 7,33 (t, 8,0) 7,37 (dd, 8,0 e 0,7) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ----------------H6 H5 e H7 H6
160
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5' 6' H HO 14' 1' 7' 15' 4' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' H 3'' 6'' 5'' Cl
4''
Tabela 22: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 30 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,2 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,2 (CH2) 23,5 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,8 (CH2) 40,9 (CH2) 56,5 (C) 27,4 (CH3) 27,4 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----175,8 (C) --140,0 (CH) 136,4 (C) 128,5 (CH) 129,4 (CH) 132,1 (C) 129,4 (CH) 128,5 (CH) H (mult., J em Hz) 1,60 (s) 1,28 (m) 5,33 (m) --1,92 (m) 1,88 (m) --1,53 (m) 1,81 (m) 1,55 (m) --1,57 (s) 1,58 (s) 1,09 (s) 1,61 (s) --9,31 (s) --7,44 (s) 7,74 (s) --7,37 (d, 8,8) 7,55 (d, 8,8) --7,55 (d, 8,8) 7,37 (d, 8,8) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4 e H6 H3 e H7 --H3 e H7 H4 e H6
168
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173
174
175
4.4.3. Acetofenona-tiossemicarbazona
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 10' 11' 4 N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' CH3 8'' 3'' 6'' 5'' 4''
A confirmao da estrutura da acetofenona-tiossemicarbazona derivada do bisabolol (31) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H, 13C, DEPT, COSY e HMQC. O espectro no IV (figura 111) mostrou-se bastante semelhante ao da benzaldedo-tiossemicarbazona. Alm das bandas observadas para a tiossemicarbazida, foram verificadas: bandas de deformao axial de C-H de sistemas aromticos em 33403150cm-1; bandas de deformaes fora do plano de C-H aromtico em 950670cm-1; bandas de deformao axial de C=N e C=S, em sobreposio, na regio de 13701050cm-1; ausncia de bandas provenientes de aminas primrias. No espectro de massas de baixa resoluo (figura 112), observou-se o pico do on molecular em m/z 415 e o fragmento correspondente a perda de HNCSNHNCCH3Ph em m/z 223. No espectro de RMN 1H (figura 113 e tabela 23), foram observados: o sinal em 2,26 (H8, s, 3H) referente ao metil imnico; os sinais para os hidrognios do sistema aromtico em 7,39 (H5, t; 8,1Hz); 7,40 (H4 e H6, t; 8,1Hz) e 7,67 (H3 e H7, dd; 8,1 e 2,1Hz); o desaparecimento do sinal de N-H em 3,96 (H1, s, 2H), presente na tiossemicarbazida; o deslocamento dos sinais caractersticos de N-H que, para a tiossemicarbazida, so em 7,49 (H2, s, 1H) e 7,75 (H4, s, 1H) para 8,41 (H2, s, 1H) e 7,70 (H4, s, 1H); alteraes nos deslocamentos qumicos de H12 e H13, em relao tiossemicarbazida, de 1,48 (para ambos) para 1,56 e 1,57 para H12 e H13, respectivamente, evidenciando sua maior desblindagem. Os
176
demais hidrognios, pertencentes poro terpnica, no sofreram alteraes relevantes. No espectro de RMN
13
observar sinais que caracterizaram 24 carbonos, sendo 5CH3, 6CH2, 7CH e 6C. Assim, confirmou-se a incorporao de mais 8 carbonos na molcula, sendo 1CH3, 5CH e 2C. Os sinais para estes carbonos so em 145,5 (C1, C); 137,7 (C2, C); 126,3 (C3 e C7, CH); 128,8 (C4 e C6, CH) e 129,8 (C5, CH). Ainda ocorreu o deslocamento do sinal da tiocarbonila de 180,4 (C3, C), na tiossemicarbazida, para 176,3 (C3, C). Os sinais dos carbonos da poro terpnica no sofreram alteraes significativas. No mapa de contornos COSY (figura 116 e tabela 23), foi possvel observar as correlaes entre: H1 H8 e H14; H2 H3; H3 H15; H3 e H7 H4, H5 e H6. O mapa de contornos HMQC (figura 117) auxiliou a anlise dos espectros de RMN
1
H e
13
hidrognios metlicos e a ausncia de hidrognio imnico. O para o composto 31 (tabela 25), foi de -25,66. Tendo em vista todos os dados espectroscpicos, evidencia-se que o composto sintetizado a acetofenona-tiossemicarbazona derivada do -bisabolol ou (-)-N1-metil-fenil-cetona-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3enil]-heptanil]-tiossemicarbazona.
177
5' 6' H HO 14' 1' 7' 15' 4' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 7'' 2'' 1'' CH3 8'' 3'' 6'' 5'' 4''
Tabela 23: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 31 em CDCl3. C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 C (DEPT) 43,2 (CH) 27,0 (CH2) 120,7 (CH) 134,3 (C) 31,3 (CH2) 23,4 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,8 (CH2) 41,0 (CH2) 56,3 (C) 27,4 (CH3) 27,4 (CH3) 23,5 (CH3) 23,5 (CH3) ----176,3 (C) --145,5 (C) 137,7 (C) 126,3 (CH) 128,8 (CH) 129,8 (CH) 128,8 (CH) 126,3 (CH) 13,6 (CH3) H (mult., J em Hz) 1,60 (s) 1,28 (m) 5,34 (m) --1,97 (m) 1,89 (m) --1,51 (m) 1,80 (m) 1,54 (m) --1,56 (s) 1,57 (s) 1,10 (s) 1,62 (s) --8,41 (s) --7,70 (s) ----7,67 (dd, 8,1 e 2,1) 7,40 (t, 8,1) 7,39 (t, 8,1) 7,40 (t, 8,1) 7,67 (dd, 8,1 e 2,1) 2,26 (s) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4, H5 e H6 H3 e H7 H3 e H7 H3 e H7 H4, H5 e H6 ---
178
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4.4.4. Benzofenona-tiossemicarbazona
15' 4' 5' 6' H HO 14' 1' 7' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 13'' 12'' 10'' 11'' 7'' 2'' 1'' 8'' 3'' 9'' 6'' 5'' 4''
A confirmao da estrutura da benzofenona-tiossemicarbazona derivada do bisabolol (32) foi feita por meio das tcnicas de FTIR, Espectrometria de Massas e de RMN de 1H, 13C, DEPT, COSY e HMQC. O espectro no IV (figura 118) tambm se mostrou bastante semelhante ao da benzaldedo-tiossemicarbazona. Alm das bandas observadas para a tiossemicarbazida, foram verficadas: bandas de deformao axial de C-H de sistemas aromticos em 33403150cm-1; bandas de deformaes fora do plano de C-H aromtico em 950670cm-1; bandas de deformao axial de C=N e C=S, em sobreposio, na regio de 13701050cm-1; ausncia de bandas provenientes de aminas primrias. No espectro de massas de baixa resoluo (figura 119), observou-se o pico on molecular em m/z 477 e o fragmento correspondente a perda de HNCSNHNCPh2 em m/z 223. No espectro de RMN 1H (figura 120 e tabela 24), foram verificados: ausncia de sinal de hidrognios ligados ao carbono imnico ou vizinhos diretos deste; os sinais para os hidrognios dos sistemas aromticos em 7,28 (H9 e H13, m, 2H); 7,37 (H10, H11 e H12, m, 3H); 7,48 (H3 e H7, m, 2H) e 7,55 (H4, H5 e H6, m, 3H); o desaparecimento do sinal de N-H em 3,96 (H1, s, 2H), presente na tiossemicarbazida; o deslocamento dos sinais caractersticos de N-H que, para a tiossemicarbazida, so em 7,49 (H2, s, 1H) e 7,75 (H4, s, 1H) para 8,41 (H2, s, 1H) e 7,78 (H4, s, 1H); alteraes nos deslocamentos qumicos de H12 e H13, em
186
relao tiossemicarbazida, de 1,48 (para ambos) para 1,59. Os demais hidrognios, pertencentes poro terpnica, no sofreram alteraes relevantes. No espectro de RMN
13
observar sinais que caracterizaram 29 carbonos, sendo 4CH3, 6CH2, 13CH e 6C. Assim, confirmou-se a incorporao de mais 13 carbonos na molcula, em relao tiossemicarbazida, sendo 10CH e 3C. Os sinais para estes carbonos so em 148,5 (C1, C); 137,1 (C2, C); 127,8 (C3 e C7, CH); 130,0 (C4, C6 e C11 CH); 130,4 (C5, CH); 131,7 (C8, C); 128,7 (C9 e C13, CH); e 128,8 (C10 e C12, CH). Ainda ocorreu o deslocamento do sinal da tiocarbonila de 180,4 (C3, C), na tiossemicarbazida, para 175,9 (C3, C). Os sinais dos carbonos da poro terpnica no sofreram alteraes significativas. No mapa de contornos COSY (figura 123 e tabela 24), foi possvel observar as correlaes entre: H1 H8 e H14; H2 H3; H3 H15; H3 e H7 H4, H5 e H6; H9 e H13 H10, H11 e H12. O mapa de contornos HMQC (figura 124) auxiliou a anlise dos espectros de RMN
1
H e
13
hidrognios metlicos e a ausncia de hidrognio imnico. O para o composto 32 (tabela 25), foi de -21,28. Tendo em vista todos os dados espectroscpicos, evidencia-se que o composto sintetizado a benzofenona-tiossemicarbazona derivada do -bisabolol ou (-)-N1-difenil-cetona-(N4-6)-[2-(S)-2-hidrxi-6-metil-2-[1-(S)-4-metilciclohex-3enil]-heptanil]-tiossemicarbazona.
187
5' 6' H HO 14' 1' 7' 15' 4' 3' 2' 13' 8' 9' 11' 4 10' N 12' H S 1 2 N 3 N H 13'' 12'' 10'' 11'' 7'' 2'' 1'' 8'' 3'' 9'' 6'' 5'' 4''
Tabela 24: Dados de RMN de 1H, 13C, DEPT e COSY para 32 em CDCl3.
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 C (DEPT) 43,3 (CH) 27,2 (CH2) 120,8 (CH) 134,4 (C) 31,0 (CH2) 23,6 (CH2) 74,5 (C) 40,6 (CH2) 17,9 (CH2) 41,1 (CH2) 56,4 (C) 27,4 (CH3) 27,4 (CH3) 23,7 (CH3) 23,7 (CH3) ----175,9 (C) --148,5 (C) 137,1 (C) 127,8 (CH) 130,0 (CH) 130,4 (CH) 130,0 (CH) 127,8 (CH) 131,7 (C) 128,7 (CH) 128,8 (CH) 130,0 (CH) 128,8 (CH) 128,7 (CH) H (mult.) 1,60 (s) 1,29 (m) 5,35 (m) --1,98 (m) 1,91 (m) --1,50 (m) 1,82 (m) 1,55 (m) --1,59 (s) 1,59 (s) 1,12 (s) 1,64 (s) --8,41 (s) --7,78 (s) ----7,48 (m) 7,55 (m) 7,55 (m) 7,55 (m) 7,48 (m) --7,28 (m) 7,37 (m) 7,37 (m) 7,37 (m) 7,28 (m) COSY H8 e H14 H3 H2 e H15 --------H1 ----------H1 H3 ------------H4, H5 e H6 H3 e H7 H3 e H7 H3 e H7 H4, H5 e H6 --H10, H11 e H12 H9 e H13 H9 e H13 H9 e H13 H10, H11 e H12 188
189
190
191
192
193
194
195
5. CONCLUSES
5. CONCLUSES
realizao
deste
trabalho
possibilitou
sntese
de
novas
tiossemicarbazonas derivadas de sesquiterpenos naturais, utilizando como substrato o lcool sesquiterpnico -(-)-bisabolol (16). A sntese do isotiocianato (17) e do tiocianato (18) derivados do -bisabolol reportada na literatura8. No entanto, atravs deste trabalho, foi possvel desenvolver uma nova metodologia na qual se obtm o dobro de rendimento para esta reao em um tempo trs vezes menor, o que viabilizou a seqncia da rota sinttica. Os demais compostos sintetizados, a tiossemicarbazida (19) e as treze tiossemicarbazonas (20 32), so derivados inditos do -bisabolol. A avaliao das propriedades antitumorais do -(-)-bisabolol e dos compostos sintetizados frente s clulas tumorais de leucemia linfide (K-562), melanoma (UACC-62), pulmo tipo no-pequenas clulas (NCI-460), mama (MCF-7), mama que expressa o fentipo de resistncia MDR (NCI-ADR), clon (HT-29), ovrio (OVCAR-3), Rim (786-0) e prstata (PCO-3), mostrou que, apesar de o -bisabolol ser ativo apenas contra clulas tumorais de leucemia linfide (K-562) com seletividade moderada, a maioria dos seus derivados sintetizados so ativos contra todas as linhagens celulares avaliadas, mas com seletividade para clulas de leucemia, na maioria dos casos. Quanto atividade inibitria de crescimento tumoral, 14 dos 16 derivados do -bisabolol se mostraram ativos contra todas as linhagens celulares avaliadas, com destaque para os compostos 19, 24, 26, 28, 29, 30 e 31, que apresentaram elevada seletividade para clulas de leucemia linfide (K-562) e potente atividade contra esta linhagem celular, e os compostos 20, 21, 22 e 25, que apresentaram moderada seletividade e potente atividade contra clulas de leucemia. O composto 23 apresentou potente atividade contra clulas de leucemia, mas com baixa seletividade. Os compostos 16 e 32 apresentaram seletividade moderada para clulas de leucemia, mas com atividade tambm moderada. Os compostos 19 e 31 apresentaram potente atividade contra clulas de mama com resistncia (NCI-ADR), mas com baixa seletividade. No que se refere atividade citosttica, apenas os compostos 23 e 26 se apresentaram ativos contra todas as linhagens celulares testadas. Alguns compostos se destacaram contra clulas de leucemia linfide (K-562): os compostos 19 e 31,
196
5. CONCLUSES
que apresentaram elevada seletividade e potente atividade, e os compostos 26 e 30, que apresentaram moderada seletividade e potente atividade. Contra esta linhagem celular, os compostos 28, 29 e 32 apresentaram seletividade moderada, mas com atividade tambm moderada. Quanto atividade citotxica, nenhum composto se apresentou ativo contra todas as linhagens celulares testadas. Alguns compostos se destacaram contra clulas de leucemia linfide (K-562): o composto 31, que apresentou seletividade moderada e atividade tambm moderada, e os compostos 19 e 28, que apresentaram atividade moderada, mas com baixa seletividade. Contra esta linhagem celular, tambm os compostos 26 e 30 apresentaram considervel atividade, mas com baixa seletividade. Entre todos os compostos sintetizados, os que apresentaram melhores propriedades antitumorais foram a tiossemicarbazida (19), a m-nitro-benzaldedotiossemicarbazona (26), a o-cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona (28), a m-clorobenzaldedo-tiossemicarbazona (29), a p-cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona (30) e a acetofenona-tiossemicarbazona (31). Com base em todos os resultados apresentados por este trabalho, podemos concluir que os derivados do -(-)-bisabolol sintetizados apresentaram uma grande potencializao de suas propriedades antitumorais frente s oito linhagens de clulas avaliadas, mas mantiveram sua seletividade para clulas tumorais de leucemia linfide (K-562).
197
6. PARTE EXPERIMENTAL
6.1. Instrumentao
Os espectros de RMN 1H e
13
C foram obtidos em espectrmetro VARIAN,

13
modelo Mercury Plus, operando a 300,06MHz para 1H e 75,45MHz para
C, tendo
como referncia interna o tetrametilsilano (TMS) ou o prprio solvente. Os deslocamentos qumicos foram dados em ppm e o solvente utilizado foi o CDCl3. Os espectros de absoro na regio do infravermelho foram registrados em um espectrmetro BOMEM, modelo MB100, em pastilha de KBr, na regio de 400 a 4000cm-1. As medidas de desvio da luz plano-polarizada ( comprimento de 10,00mm. Os espectros de massas de baixa resoluo foram obtidos em um espectrmetro SHIMADZU, modelo CG/MS QP 2000A, com uso de feixe eletrnico de 70eV equipado com sonda para slidos. As curvas de determinao de ponto de fuso foram obtidas em um calormetro diferencial de varredura (DSC) SHIMADZU, modelo DSC-50, em atmosfera dinmica de nitrognio com fluxo de 50mL min-1, com razo de aquecimento de 10C min-1, em cpsula de alumnio. ) foram obtidas em um polarmetro PERKIN ELMER, modelo 343, a 20C e 589nm, em tubo de
6.2. Mtodos Cromatogrficos

As cromatografias em coluna (CC) foram realizadas em coluna de vidro, utilizando-se slica gel 60 (0,063 0,200mm), da Merck, como fase estacionria. O dimetro interno e a altura da coluna variaram de acordo com a quantidade de material a ser cromatografado. As eluies foram realizadas com solventes orgnicos (destilados) puros ou combinados em ordem crescente de polaridade e as fraes coletadas foram evaporadas presso reduzida em evaporador rotativo. As cromatografias em coluna delgada analtica (CCDA) foram realizadas em placas de vidro de 5,0 x 20,0cm com espessura da camada de slica gel de
198
aproximadamente 0,25mm, utilizando-se slica gel 60G e 60GF254, da Merck, na proporo 1:1. As revelaes das placas foram feitas com iodo ressublimado ou com a mistura anisaldedo, metanol e H2SO4 na proporo 1:1:1 (revelador de terpenos).
6.3. Solventes e Reagentes

Os solventes utilizados, aps terem sido previamente evaporados sob presso reduzida e/ou destilados, foram: hexano P. A. (Nuclear), acetato de etila P. A. A. C. S. (Nuclear), clorofrmio P. A. A. C. S., estabilizado com amileno (Nuclear, 99,8%) e lcool etlico P. A. A. C. S. (Dinmica, 95%). Os reagentes empregados nas reaes foram: bissulfato de potssio P. A. (Vetec), tiocianato de potssio P. A. (Vetec, 99%), dicloridrato de hidrazina (Carlos Erba, 99%), bicarbonato de sdio P. A. (Labsynth; 99,7100,3%), benzaldedo (Acros Organics, 99%), p-anisaldedo (Acros Organics, 98%), p-tolualdedo (Acros Organics, +99%), p-hidrxi-benzaldedo (Acros Organics, 99%), p-dimetilaminobenzaldedo (Merck; 98,5%), o-cloro-benzaldedo (Acros Organics, 99%), m-clorobenzaldedo (Acros Organics, 99%), p-cloro-benzaldedo (Acros Organics; +98,5%),
o-nitro-benzaldedo (Acros Organics, +99%), m-nitro-benzaldedo (Acros Organics,
99%), p-nitro-benzaldedo (Acros Organics, 99%), acetofenona P. A. (Vetec), benzofenona P. A. (Carlos Erba) e cido sulfrico P. A. (Nuclear, +98%).
6.4. Separao do -Bisabolol a Partir do leo de Candeia

A separao do -bisabolol (16), a partir do leo de candeia, foi feita atravs de CC em slica gel usando-se hexano como eluente. Utilizou-se, por processo, 300g de slica gel, em coluna de 6cm de dimetro, para cada 10g de leo de candeia.
6.5. Sntese e Purificao do Isotiocianato Derivado do Bisabolol

Seguindo as melhores condies reacionais obtidas no processo de otimizao (Tabela 1), 5g de -bisabolol, 10mL de CHCl3 e um excesso de uma mistura (1:2 molar) de KSCN e KHSO4, previamente secos e triturados, foram
199
colocados em um balo de fundo redondo sob agitao vigorosa durante 48h ao abrigo da luz. A reao foi acompanhada por CCDA utilizando-se uma mistura de acetato de etila (15%) e hexano como eluente e iodo como revelador. Encerrada a reao, a mistura reacional foi filtrada, para eliminar os resduos slidos, e concentrada atravs da evaporao do clorofrmio sob presso reduzida. A purificao dos produtos foi feita por CC em slica gel usando-se uma mistura de hexano e acetato de etila (0 30%) como eluente. A coluna utilizada foi de 3cm de dimetro e a massa de slica foi de 200g. O isotiocianato (17) foi obtido na frao hexano acetato de etila 15%, com um rendimento de 46%, e o tiocianato (18) foi obtido na frao hexano acetato de etila 20%, com um rendimento de 22%. Todo o processo foi repetido por mais duas vezes utilizando-se 10g e 20g de -bisabolol e quantidades equivalentes dos demais reagentes.
6.6. Sntese e Purificao da Tiossemicarbazida Derivada do -Bisabolol

Seguindo as melhores condies reacionais obtidas no processo de otimizao (Tabela 2), dissolveu-se 300mg de isotiocianato derivado do -bisabolol em pequena quantidade de etanol, deixando-se sob agitao. Paralelamente, dissolveu-se 280mg de cloridrato de hidrazina e 320mg de bicarbonato de sdio em pequena quantidade de gua. Em seguida, adicionou-se esta primeira soluo deixando-se sob agitao e em refluxo por 2h. A reao foi acompanhada por CCDA utilizando-se uma mistura de acetato de etila (50%) e hexano como eluente e iodo como revelador. Encerrada a reao, a mistura reacional foi evaporada, sob presso reduzida, para se eliminar o etanol. Em seguida, foi submetida partio em clorofrmio/gua. A fase orgnica foi evaporada novamente, sob presso reduzida, e submetida a CC em slica gel, usando-se uma mistura de hexano e acetato de etila (0 75%) como eluente. A coluna utilizada foi de 1cm de dimetro com 90g de slica gel. A tiossemicarbazida (19) foi obtida na frao hexano acetato de etila 50 60%, com 71% de rendimento.
200
O processo foi repetido por mais duas vezes utilizando-se 5g e 10g de isotiocianato derivado do -bisabolol e quantidades correspondentes de cloridrato de hidrazina e bicarbonato de sdio.
6.7. Sntese e Purificao da Srie de Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol

Seguindo as melhores condies reacionais obtidas no processo de otimizao (Tabela 4), para a sntese de cada tiossemicarbazona, dissolveu-se
300mg de tiossemicarbazida em pequena quantidade de etanol deixando-se sob agitao temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 2 equivalentes molares de benzaldedo, de um dos seus correspondentes derivados substitudos, de acetofenona ou de benzofenona, mantendo-se sob agitao. Ento, colocou-se 5 gotas de soluo aquosa de cido sulfrico a 30% e manteve-se agitao por, no mximo, 2h. As reaes foram
acompanhadas por CCDA utilizando-se uma mistura de acetato de etila (40%) e hexano como eluente e iodo como revelador. Encerradas as reaes, cada mistura reacional foi evaporada, sob presso reduzida, para se eliminar o etanol. Em seguida, cada mistura foi submetida partio em clorofrmio/gua. As fases orgnicas foram evaporadas novamente, sob presso reduzida, e submetidas a CC em slica gel, usando-se uma mistura de hexano e acetato de etila (0 40%) como eluente. A coluna utilizada foi a de 0,5cm de dimetro com 40g de slica, em cada caso. As tiossemicarbazonas (20 32) foram obtidas nas fraes hexano acetato de etila 2030%, dependendo do aldedo ou cetona utilizados na reao, com rendimentos que variaram de 82 a 98%.
6.8. Determinao do D do -Bisabolol e dos Compostos Sintetizados

Solues de concentraes conhecidas do -bisabolol e de todos os seus derivados sintetizados foram preparadas e submetidas anlise em polarmetro, com caminho tico de 0,10dm.
201
Para a determinao do encontram-se na Tabela 25.
foi utilizada a equao abaixo e os dados obtidos
Tabela 25: Dados de
para o -bisabolol e seus derivados sintetizados

Conc. (mg mL-1)
(16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32)
Compostos
-(-)-Bisabolol Isotiocianato Tiocianato Tiossemicarbazida Benzaldedo-tiossemicarbazona p-CH3-benzaldedo-tiossemicarbazona p-CH3O-benzaldedo-tiossemicarbazona p-OH-benzaldedo-tiossemicarbazona p-(CH3)2N-benzaldedo-tiossemicarbazona o-NO2-benzaldedo-tiossemicarbazona m-NO2-benzaldedo-tiossemicarbazona p-NO2-benzaldedo-tiossemicarbazona o-Cl-benzaldedo-tiossemicarbazona m-Cl-benzaldedo-tiossemicarbazona p-Cl-benzaldedo-tiossemicarbazona Acetofenona-tiossemicarbazona Benzofenona-tiossemicarbazona
( 0,05)
50,2 50,1 49,7 49,9 48,9 49,9 49,2 50,0 50,3 49,1 49,7 50,9 49,5 49,3 49,8 51,3 48,7
-48,52 -50,12 -41,37 -34,55 -11,22 -9,27 -6,01 -5,92 -5,98 -12,84 -18,48 -3,99 -6,00 -15,17 -21,30 -25,66 -21,28
6.9. Determinao do Ponto de Fuso dos Compostos 26 e 27

A m-NO2-benzaldedo-tiossemicarbazona (26) e a p-NO2-benzaldedotiossemicarbazona (27) foram liofilizadas, pastilhadas em cpsula de alumnio e levadas para anlise de DSC. Os dados obtidos encontram-se na Tabela 26.
202
Tabela 26: Ponto de Fuso para os compostos 26 e 27. Compostos

m-NO2-benzaldedo-tiossemicarbazona p-NO2-benzaldedo-tiossemicarbazona
Faixa de Fuso (C)

(26) (27)
P.F. (C)
147 170 151 179
160 167
6.10. Avaliao de Atividade Biolgica Antitumoral

A avaliao da atividade antitumoral foi realizada pelo Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas, Biolgicas e Agrcolas CPQBA da Unicamp, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Joo Ernesto de Carvalho. Foi utilizado o mtodo colorimtrico com sulforrodamina B, de acordo com as normas do National Cancer Institute (NCI), dos Estados Unidos da Amrica55,56,57. As clulas tumorais utilizadas, cedidas pelo NCI, esto listadas na Tabela 27.
Tabela 27: Linhagens de clulas utilizadas na avaliao de atividade antitumoral
Cdigo
UACC-62 MCF-7 NCI-ADR NCI-H460 PCO-3 OVCAR-3 HT-29 K-562
Tipo de clula tumoral

Melanoma Mama Mama que expressa o fentipo de resistncia MDR Pulmo tipo no pequenas clulas Prstata Ovrio Clon Leucemia linfide
As linhagens celulares utilizadas no teste foram diludas em DMSO, na concentrao de 1g mL-1, resultando em solues-estoque para a triagem de atividade antitumoral.
203
Para o teste de atividade, foram plaqueados 100L de clulas em meio RPMI/SFB/gentamicina, nas suas respectivas densidades de inoculao, em placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24h a 37C, em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente mido, para readaptao ao ambiente. Aps este perodo, uma placa controle foi fixada atravs da adio de cido tricloroactico (TCA) para a determinao da quantidade de clulas no momento da adio das drogas. Nas demais placas foram adicionadas as drogas nas concentraes de 0,25; 2,5; 25 e 250g mL-1, sendo estas incubadas por 48h, centrifugadas por 3min a 2000rpm, e fixadas com 50L de TCA a 50%, para as clulas aderidas, e 80% para as clulas em suspenso (leucemia). Para completar a fixao celular, as placas foram incubadas por 1h a 4C, submetidas a 4 lavagens com gua destilada para a remoo dos resduos de TCA, meio, SFB e metablitos secundrios, e mantidas em temperatura ambiente at a secagem completa. As placas foram coradas pela adio de 50L do corante protico sulforrodamina B (SRB) a 0,4% (m/v), dissolvido em cido actico a 1%, incubadas a 4C, durante 30min, e lavadas por 4 vezes com uma soluo de cido actico 1%. O resduo da soluo de lavagem foi removido das placas, as quais foram secas temperatura ambiente. O corante ligado s protenas celulares foi solubilizado com uma soluo de Trizma Base, na concentrao de 10M e pH 10,5, por 5min em ultrassom. A leitura espectrofotomtrica da absorbncia foi realizada em um leitor de microplacas a 560nm. Para a anlise dos resultados, foram calculadas as mdias das absorbncias, descontadas de seus respectivos brancos, e calculada a porcentagem de inibio de crescimento. Com os dados obtidos, foram construdos grficos relacionando a porcentagem de inibio de crescimento com a concentrao da substncia teste (figuras 125 142). Como controle positivo foi padronizado o quimioterpico doxorrubicina. Os testes foram realizados com o -bisabolol e todos os seus derivados sintetizados neste trabalho. Para a anlise dos resultados, foram calculados 3 parmetros de resposta a avaliao, o GI50 (concentrao que inibe 50% do crescimento celular), o TGI (concentrao que inibe totalmente o crescimento celular) e o LC50 (concentrao que mata 50% das clulas), a partir dos grficos, por regresso no linear do tipo sigmoidal, utilizando-se o software Origin 7.5 (OriginLab). Os resultados encontram-se nas Tabelas 5, 6 e 7.
204
Doxorrubicina
125 100
Porcentagem de Crescimento
75 50 25 0 -25 -50 -75 -100 -125
UACC62 MCF7 NCIADR NCI460 PCO3 OVCAR03 HT29 K562 0

10
-3
10
-2
10
-1
10
0,025
0,25
2,5
10
25
Concentrao (g/mL)
Figura 125: Grfico de % de crescimento x concentrao para DR.
-Bisabolol
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3
UACC62 MCF7 NCIADR NCI460 PCO3 OVCAR03 HT29 K562

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
Figura 126: Grfico de % de crescimento x concentrao para 16.
205
Isotiocianato
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
Tiocianato
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3
UACC62 MCF7 NCIADR NCI460 PCO3 OVCAR03 HT29 K562

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
206
Tiossemicarbazida
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
Benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
207
p-Metil-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
p-Metxi-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
208
p-Hidrxi-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
0,25
2,5
10
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
p-Dimetilamino-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
0,25
10
2,5
10
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
209
o-Nitro-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
m-Nitro-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
210
p-Nitro-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
o-Cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
211
m-Cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
p-Cloro-benzaldedo-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
212
Acetofenona-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
Benzofenona-tiossemicarbazona
100 75
50 25 0 -25 -50 -75 -100

10
-3

10
-2
10
-1
10
10
0,25
2,5
25
10
250
10
Concentrao (g/mL)
213
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220

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

CENTRO DE CINCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

SNTESE E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO -(-)-BISABOLOL

Alan Patrick da Silva

SNTESE E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

Maring Paran Brasil

ALAN PATRICK DA SILVA

SNTESE E AVALIAO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DO -()-BISABOLOL

rea de Concentrao: Sntese Orgnica

Orientadora: Profa. Dra. Cleuza Conceio da Silva

Maring PR, junho de 2009

6.6. Sntese e Purificao da Tiossemicarbazida Derivada do - 207

60 64 65 66 67 68 69 70 74 75 76 77 78 79 80 84 85 86 87 88 89 90 95 96 97 98 99 100 101 103 104 105 106 107

para o -bisabolol e seus derivados sintetizados

209 209 210

CC CCDA Conc. COSY d dd DEPT DMSO DSC eV E FTIR GI50

determinados aldedos e cetonas chegando-se s tiossemicarbazonas, tambm como descrito na literatura12,15.

1.1.1. Aspectos Qumicos

R1, R2, R3 e R4 = H, alquil ou aril

Figura 1: Numerao da cadeia principal das tiossemicarbazonas.

H (2) s y n R1, R2, R3 e R4 = H, alquil ou aril.

1.1.2. Aspectos Biolgicos

1.1.3. Tiossemicarbazonas Derivadas de Terpenos Naturais

H HSCN NCS NH2NH2 N S

1.2.1. Aspectos Qumicos

1.2.2. Aspectos Biolgicos

correspondentes terpenos constitudos apenas de carbono e hidrognio

1.3. Proposta Sinttica do Trabalho:

H KHSO4 + KSCN H HO (16) CHCl3 HO (17) NCS NH2NH2 Etanol

R RPhC(R)O/H H HO (19) N H S N H NH2 Etanol

H HO R' = H, CH3 ou Ph. N H

R = H, CH3, OCH3, OH, N(CH3)2, NO2, Cl.

Esquema 3: Rota Sinttica para a obteno das tiossemicarbazonas derivadas do -bisabolol

2.1. Objetivos Gerais

2.2. Objetivos Especficos:

3.2. Rota Sinttica

bisabolol realizada em 3 etapas, conforme j descrito no esquema 3.

3.2.1. 1 Etapa: Sntese do Isotiocianato e do Tiocianato Derivados do -Bisabolol

3.2.1.1. Condies Experimentais

Tabela 1: Dados experimentais para a obteno de 17 e 18.

3.2.1.2. Intermedirios de Reao

3.2.2. 2 Etapa: Sntese da Tiossemicarbazida Derivada do Bisabolol

3.2.2.1. Condies Experimentais

Tabela 2: Dados experimentais para a obteno de 19.

0,040 + 0,064 1:1:2 70 80 24 0,037 32,0

0,039 + 0,129 1:1:4 70 80 24 0,065 55,6

0,080 + 0,130 1:2:4 80 90 12 0,071 60,1

0,081 + 0,191 1:2:6 70 80 6 0,075 64,1

0,079 + 0,195 1:2:6 80 90 2 0,083 70,9

3.2.2.2. Intermedirios de Reao

Etanol H HO N C H2N S NH2 H HO N S

Esquema 6: Proposta de intermedirios de reao para a formao de 19.

3.2.3. 3 Etapa: Sntese das Tiossemicarbazonas Derivadas do -Bisabolol

3.2.3.1. Condies Experimentais

Figura 3: Efeito de ressonncia retirador de eltrons do grupo nitro-fenil sobre a

3.2.3.2. Intermedirios de Reao

Esquema 7: Mecanismo de reao para a formao de 20 32.

3.3. Avaliao de Atividade Antitumoral

parnteses) para os compostos DR e 16 32.

parnteses) para os compostos DR e 16 32.

densidade eletrnica, ligados em para na poro aromtica, provocou pequena

C/DEPT (figuras 6 e 7 e tabela 8) foram observados

C apresentados na literatura59 para o 13