ESTRATEGIAS GENERALES PARA LA PURIFICACION E IDENTIFICACIN DE PROTEINAS EN FISIOLOGIA VEGETAL

Para qu purificar protenas? - Para entender que est pasando en la clula y entre las clulas. Reconstruccin de rutas metablicas. Son necesarios enzimas puros para estudiar la cintica, regulacin de la reaccin etc. - Para estudiar desviaciones del metabolismo normal. - Purificacin de enzimas para su uso como biotacalizadores (lipasas, proteasas, glucosa isomerasa), uso en terapeutica (insulina, interleukinas) - Purificacin de proteina recombinante, ensayos de transformacin genetica. - Y muchas otras razones La purificacin de una protena que no ha sido previamente purificada es un proceso casi emprico que ha de guiarse tanto por protocolos previamente establecidos como por el sentido comn. El grado de pureza requerido depende de la finalidad de la protena purificada. Los procesos de purificacin se caracterizan por comenzar con una primera etapa de extraccin de proteinas, seguida de unas fases de purificacin y comprobacin de la actividad enzimtica/protena buscada. 1.- EXTRACCIN DE PROTENAS No debemos olvidar que el propsito final es purificar una protena u obtener una actividad enzimtica especfica, por que en todo momento deberemos procurar trabajar en condiciones que preserven las protenas. Durante todo el proceso deberemos de trabajar con las muestras en hielo para conservarlas y a la vez inhibir proteasas. El primer paso, obligado para cualquier purificacin, es la liberacin de protenas. Para ello deberemos homogeneizar el tejido (mecnicamente, enzimaticamente, choque osmtico, sonicacin, etc.) en un tampn de extraccin adecuado. La funcin de este tampn es estabilizar las protenas y evitar la accin de proteasas. En un primer paso separaremos las protenas hidrosolubles de las liposolubles mediante centrifugacin: Protenas hidrosolubles: permanecen en solucin en solventes acuosos y se pueden separar de la parte no soluble mediante centrifugacin. Protenas liposolubles: en el extracto crudo suelen encontrarse asociadas a restos de membranas de las que se pueden liberar mediante extraccin con agua, con detergentes o mediante la rotura ultrasnica de la membrana. Al tampn de extraccin con las protenas sin ningn paso de purificacin se le denomina extracto crudo. Realizaremos un primer ensayo de actividad.

2.- METODOS GENERALES DE SEPARACIN 2.1.- Inmunoprecipitacin Proceso rpido y especfico de separacin proteica mediante precipitacin. Requiere la utilizacin de anticuerpos contra esa protena, por lo que no suele ser aplicable en la purificacin de protenas nuevas. La unin Ag-Ac causa la precipitacin del complejo, separndolo del extracto crudo.

Abbas, Litchman & Pober, Cellular and Molecular Inmunology, W.B. Saunders, 1999. Figure A-2

2.2.- Purificacin de protenas asociadas a membrana Protenas adheridas: se emplean altas concentraciones salinas, que desestabilizan las uniones no covalentes. Protenas asociadas a membrana: pueden liberarse mediante el empleo de fosfatasas, aunque muy probablemente perderemos la actividad en la purificacin. Para evitar esto podemos emplear detergentes, siendo complicada la purificacin posterior.

3.- SEPARACIN POR TCNICAS CROMATOGRAFICAS La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los compuestos a separar se distribuyen entre dos fases: Fase estacionaria, de gran rea superficial, que puede ser slida o lquida, estando en este caso dispuesta sobre un slido que le sirva de soporte. Fase mvil, fluido que pasa a travs de la fase estacionaria. Puede ser liquida o gaseosa. Los compuestos eluidos (que han atravesado la fase estacionaria) son transportados por la fase mvil a un detector que los registra en forma de curvas gausianas (forma de campana). Se utiliza un detector UV seleccionado a 280 nm ya que las protenas poseen un mximo de absorcin aproximadamente a esta longitud de onda debido a la presencia de aminocidos aromticos (fundamentalmente Trp y Tyr). Dichas seales se denominan picos y el conjunto de picos y lnea base registrado se denomina cromatograma. Las fracciones eluidas se van recogiendo independientemente, ya que las protenas que contienen son distintas. Los picos dan informacin cualitativa y cuantitativa de la mezcla en cuestin. Cualitativa: el tiempo de retencin TR es siempre constante bajo condiciones cromatogrficas idnticas. Por tanto un pico puede ser identificado por comparacin de tiempos de retencin. Cuantitativa: el rea de un pico es proporcional a la cantidad de muestra inyectada. En funcin de las fases estacionaria y mvil empleadas existen numerosos tipos de cromatografa. A modo de ejemplo citaremos algunas clases de cromatografa lquida: Tipos de cromatografa lquida De Exclusin Molecular (tambin denominada de Filtracin en Gel) De Afinidad De Intercambio inico Separacin por Tamao Unin a grupos funcionales Carga elctrica

4.- SEGUIMIENTO DEL PROCESO No debemos olvidar que el fin ltimo es recuperar una protena o actividad enzimtica especfica. A medida que vamos realizando la purificacin debemos ir rellenando una tabla descriptiva del proceso (ver ejemplo)
Etapa EC SA CII FG Volumen (ml) 500 100 45 50 Actividad Total (U) 3,000 2,400 1,440 1,000 Protena Total (mg) 15,000 4,000 500 125 Act. Espec. (U/mg) 0,2 0,6 2,9 8.0 Cantidad (%) 100 80 48 33 Factor de Purificacin 3,0 14,5 40,0

EC: Extracto crudo. SA: Precipitacin con sulfato de amonio. CII: Cromatografa de intercambio inico. FG: Filtracin en gel.

Esta tabla nos permite realizar un seguimiento de la purificacin de nuestra protena. En cada paso perdemos actividad enzimtica, las enzimas son frgiles y por mucho cuidado que tengamos se degradan, adems que la purificacin no es 100% sensible. Pese a las perdidas, en cada paso de purificacin la relacin entre la actividad enzimtica y la cantidad de protena total (cociente denominado actividad especfica) es mayor. La purificacin ideal es aquella en la que al final solo nos queda nuestra protena. Esto lo comprobaremos mediante un SDS-PAGE. Para identificar en que fraccin obtenida por cromatografa est la protena problema deberemos realizar ensayos de actividad enzimtica o mediante la unin a sustratos o marcadores especficos. 5.- IDENTIFICACIN DE LA PROTENA Para identificar la protena es necesario conocer la secuencia de aminocidos, para ello podemos emplear una serie de tcnicas: Degradacin de Edman: Se basa en la escisin y posterior identificacin del aminocido del extremo amino terminal. Este proceso se realiza reiterativamente, por lo que puede automatizarse. Existen mquinas llamadas secuenciadores de protenas. La cantidad de protena necesaria es mnima, pudiendo obtenerla incluso a partir de una banda de un gel. Es un mtodo lento que no puede analizar fragmentos mayores de 50 aminocidos. Para evitar esto se suelen cortar las protenas en fragmentos pequeos y luego ordenarlos. Analisis peptdico por MALDI-TOF: La protena purificada se degrada, obteniendo peptidos cortos correspondientes a toda su secuencia. Posteriormente, se analizan mediante espectrometria de masas, pudiendo reconstruirse as parte de la secuencia. Con esta secuencia uno recurre a las bases de datos para poder identificarla. Mtodo no til en el descubrimiento de nuevas protenas. Anlisis del mRNA: Conociendo el mensajero podremos saber la secuencia de aminocidos de la protena. Muy til para simplificar su purificacin, en caso de proteina recombinante siempre sabemos la secuencia.