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2.1.3 Preparacin.
En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una receta que deber respetarse estrictamente.
En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo. Primero se agrega la mitad del volumen de agua destilada o desionizada a un matraz Erlenmeyer o baln, luego se incorpora el medio deshidratado, se homogeniza el medio en el agua y se vierte la volumen faltante de agua tratando de remover el medio que se quedo sobre las paredes del matraz. Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. La disolucin de los medios puede requerir hervir por 3 a 5 min. Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N). Si la presentacin del medio ser en tubo es necesario transferir el volumen adecuado a cada tubo y despus realizar el proceso de esterilizacin. Si el medio se dispondr en cajas se esteriliza en el matraz y se transfiere a las cajas una vez esterilizado cuando se encuentre a 45 C, a esta temperatura el medio an se mantiene en estado lquido y se formara la menor cantidad de agua de condensacin en la tapa de la caja, recordemos que el agar se solidifica o gelifica a los 42 C.
indica que el factor inhibidor del medio esta fallando por lo cual no es conveniente utilizar este medio de cultivo. Esta prueba se realiza principalmente a los medios de cultivo selectivos. Es posible demostrar las caractersticas bioqumicas del medio de cultivo inoculando cepas de referencia que manifestaran los cambios caractersticos del medio cultivo los cuales se manifestaran la mayora de las ocasiones por un cambio o vire de color que se puede observar en las colonias o en la superficie del medio. Esto debe realizarse principalmente en medios de cultivo diferenciales.
- Agar sangre (no selectivo) - Agar chocolate - Caldo tioglicolato - Caldo BHI o TSB - Medios de hemocultivo - Agar sangre colistina
- Agar Salmonella- Shigella (SS) - Caldo Selenito o caldo GN - Agar CLED - Agar Levine o Agar EMB - Agar MacConkey - Agar para Legionella
nalidxico - Agar manitol-sal - Agar alcohol fenil etlico - Agar selectivo para enterococo - Agar TCBS - Agar Hektoen - Agar XLD - Agar CIN
CYE/BCY - Agar Brucella - Agar yema de huevo - Agar sangre lacada con kanamicina - Agar Sabouraud dextrosa - Agar cornmeal - Lowenstein-Jensen - Agar Middlebrook
Entre los medios no exentos se encuentran el agar Mueller-Hinton, los medios selectivos para cultivo de Neisseria spp. y Campylobacter spp., entre otros. El laboratorio debe repetir el control de esterilidad y funcionamiento en estos medios y en cualquiera de los relacionados anteriormente que demuestren alguna deficiencia en la recepcin o durante su uso, hasta que el problema quede resuelto. El laboratorio puede decidir incluir tambin en el control del funcionamiento a los medios de cultivo exentos, y segn la carga de trabajo, puede realizarlo nicamente en algunos lotes elegidos aleatoriamente. Si los medios comercializados proceden de empresas no certificadas por la norma ISO o no cumplen con las especificaciones de calidad recomendadas, el usuario debe realizar el control de todos los lotes que se reciben como si se tratase de medios preparados en el laboratorio. Cualquier deficiencia en el aspecto fsico, esterilidad, no crecimiento de la cepa deseada, o no inhibicin de la cepa no deseada, ser documentada y notificada a los fabricantes para que emprendan las medidas correctoras.
Para realizar el control de calidad del medio una vez preparado, se seguir el mismo procedimiento que para los medios comerciales no exentos.
El tiempo necesario para que se formen dos bacterias a partir de una se llama tiempo de generacin y el tiempo que se requiere para que una poblacin bacteriana se duplique se denomina tiempo medio de generacin, el cual, en la mayora de los documentos escritos se considera slo como el tiempo de generacin. El crecimiento microbiano siempre depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio, que son la composicin qumica del mismo, la tensin de oxgeno, de bixido de carbono, viscosidad, actividad de agua, presin osmtica, presencia de sustancias nocivas, temperatura, pH, entre otras. Los tiempos de generacin son caractersticos para cada microorganismo y dependen de la condicin del medio en el que se encuentren. Si se construye una grfica del crecimiento en funcin del tiempo, se obtendr lo que se conoce como curva de crecimiento bacteriano.
Como se ve en la figura, la curva de crecimiento bacteriano consta de cuatro fases principales; 1) Fase de adaptacin o latencia, tambin llamada fase Lag por ser sta su designacin en ingls, durante esta fase los bacterias se adaptan a las condiciones del medio de cultivo, se disponen a expresar su capacidad de utilizar los componentes del medio en las condiciones del cultivo. Las bacterias utilizan los nutrientes del medio de cultivo, los transforman e incorporan para obtener la energa necesaria para su reproduccin. En esta fase no se observa un incremento en el nmero de bacterias, pero si se observa un incremento en el tamao y en la actividad metablica de cada bacteria, observndose un incremento en la produccin de macromolculas (RNA, DNA y Protenas), lo cual se conoce como crecimiento desbalanceado. La duracin de esta fase depende del tipo de microorganismo, de la edad y la composicin del medio de cultivo del que proviene el inculo. 2) Fase exponencial. Esta fase tambin es llamada de crecimiento exponencial o logartmico, se caracteriza por que las bacterias despliegan todo su potencial metablico, todos los componentes bacterianos se sintetizan en equilibrio, a esto se denomina crecimiento balanceado. Durante esta fase las bacterias transforman los nutrientes a la mxima velocidad y la obtencin de energa es ptima. La poblacin se duplica cada tiempo de generacin provocando un incremente en exponencial en el nmero de bacterias, aqu es donde se producen los llamados metabolitos primarios, por ejemplo los aminocidos y cidos orgnicos. 3) Fase estacionaria. Es en esta fase donde la concentracin uno o ms componentes del medio de cultivo, se ha reducido hasta producir una disminucin en la velocidad de las reacciones metablicas. Esto tambin puede deberse a la acumulacin de sustancias txicas para las propias bacterias o los cambios en el pH del medio de cultivo. En esta fase el nmero de bacterias se mantiene constante, ya no hay incremento en el nmero de bacterias pero se puede observar un incremento en el tamao de cada bacteria. En esta fase las bacterias
liberan al medio de cultivo los llamados metabolitos secundarios como los antibiticos y los pigmentos. 4) Fase de muerte. En esta fase la poblacin disminuye en una alta proporcin cada cierto tiempo por lo que tambin es llamada fase de muerte exponencial. Esta fase refleja un deterioro metablico de las bacterias lo cual causa que los individuos ms susceptibles mueran, esto ocasiona una disminucin en el nmero de bacterias del cultivo.
Esterilizacin. Es el proceso de destruccin o eliminacin completa de toda forma de vida existente en el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del calor, radiaciones, filtracin, etc. Por lo tanto, la esterilizacin es un trmino absoluto e incluye la destruccin de las esporas y formas vegetativas, los virus, etc. Desinfeccin. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos ms comunes pero no las esporas. Generalmente los desinfectantes son productos qumicos excesivamente txicos para ser usados directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes llegan a esterilizar. Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos patgenos ms comunes, pero no necesariamente esporas, presentes sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente empleado se denomina antisptico. Asepsia. Se refiere a la condicin de ausencia de microorganismos de un objeto o rea. Por ejemplo, las tcnicas aspticas son las que evitan la contaminacin propia de otros o de los materiales durante el trabajo. Microbiostasis. Es una condicin por la que el crecimiento o la multiplicacin de los microorganismos estn inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos. Si el agente microbiosttico es eliminado, el crecimiento microbiano puede resurgir. De igual definicin pero de aplicacin a la correspondiente categora de microorganismos son los fungistticos y los bacteriostticos. Microbiocida. Es el agente que destruye las formas viables de los microorganismos. De igual significado pero con mbito ms restringido son los trminos fungicida y bactericida. Sepsis. Es un trmino que proviene de un vocablo griego que significa putrefaccin. El concepto se utiliza como sinnimo de septicemia, que es la afeccin generalizada que se produce por la presencia de microorganismos patgenos o de sus toxinas en la sangre. Estril. Condicin que significa libre de toda seal de vida. Pasteurizacin. Proceso de exponer un objeto a agua caliente a 77C, durante 30 minutos. Su propsito: destruir todos los microorganismos patgenos, excepto esporas bacterianas. Liofilizacin. Es una tcnica de deshidratacin por frio, un proceso comn en la industria alimentaria conocido como deshidrocongelacin (secado por congelacin suena ms sencillo) el cual tiene la virtud de mantener al mximo las propiedades organolpticas de los alimentos, permitiendo la eliminacin de bacterias al eliminar el agua de los alimentos.
2.4.2.1.1. El Calor.
Fundamento de la esterilizacin por calor. El calor acta desnaturalizando (coagulando) las protenas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta accin se ve disminuida por la presencia de lpidos formando parte de su estructura qumica, que acta protegiendo las uniones peptdicas de las protenas. El calor es uno de los agentes fsicos ms usados. Su accin depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de aplicacin. De la consideracin de stos dos aspectos surgen las siguientes expresiones: Punto trmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensin bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable). Tiempo trmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensin bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante). Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o esporuladas (de resistencia). Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la mayora se destruye a los 50 y 70C, especialmente las patgenas. Las bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100C. Adems de la temperatura y el tiempo de exposicin es importante tener en cuenta la humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace ms efectivo el poder de penetracin del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullicin. FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE El calor puede ser aplicado para la esterilizacin de tres maneras diferentes: Calor Seco. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos: a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se logra por oxidacin violenta. Este mtodo se utiliza para asas, agujas, flameado de bocas de tubos u otros recipientes y destruccin de material contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas superiores a los 2.500C, por lo que una breve exposicin es suficiente. Sin embargo, cuando las asas de siembra estn muy cargadas con microorganismos, la aplicacin directa de la llama provoca la dispersin irregular del contenido de aqullas, con el consiguiente peligro de la contaminacin. Un sistema alternativo a los mecheros son los incineradores elctricos bacterianos, en los que el riesgo de contaminacin no existe, ya que la dispersin es recogida en el tubo del aparato. b) Incineracin en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los que no importa su destruccin, como apsitos, cadveres de animales infectados o material plstico contaminado (RPBI). Se utiliza la combustin directa o el horno crematorio. c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco, en las que el aire caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo as el calor a los objetos que se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidacin de sus estructuras previa deshidratacin, pudindose llegar a una ligera carbonizacin.
Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180C. El tiempo se mide desde el momento en que se alcanz la temperatura indicada y est condicionado por la cantidad de material y su distribucin dentro de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de penetracin, por esta razn es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros mtodos. Aplicacin: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio. Descripcin de la estufa: La estufa de esterilizacin a seco es una caja metlica de paredes triples. La pared interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre circulacin del aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una resistencia elctrica aunque tambin existen estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la temperatura deseada. En la cara superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir otro para la colocacin de un termmetro en caso de no traerlo incorporado. En el interior posee rejillas metlicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas el material a esterilizar. Uso: Esterilizacin de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas metlicas, de modo tal que una vez retirado de la estufa, permanezca estril hasta el momento de ser usado.
Calor Hmedo. El vapor de agua es uno de los mtodos ms eficaces para destruir microorganismos, es mucho ms eficaz que el calor seco (aire). Hay varias formas de emplear el calor hmedo. a) Vapor a presin: Es uno de los mtodos ms utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos qumicos utilizados en el laboratorio de microbiologa. Este mtodo tiene gran poder de penetracin, razn por la cual la esterilizacin se puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa (calor seco) y est especialmente recomendado para la eliminacin de formas esporuladas. Descripcin de la autoclave: El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por pestillos o cerrojos quedando hermticamente cerrado. Adems, posee en la parte superior una llave de vapor (o espita), un manmetro y una vlvula de seguridad. En el interior de la autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir, ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte inferior del aparato, o mediante calentadores elctricos de inmersin. Se cierra luego la tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el aire del interior haya sido desplazado por el vapor. Debe dejarse que el vapor salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla. Es muy importante que la eliminacin del aire ya que, de lo contrario, la presin marcada por el manmetro indicar la temperatura a la que se encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la esperada para el vapor saturado a esa presin. Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita), comienza a elevarse la presin en el interior del autoclave; usualmente se fija la vlvula de seguridad para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 121C. La presin se mantiene durante unos 20 minutos, no deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta que el manmetro indique 0 (cero). Si la presin se libera violentamente los lquidos en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo an reventar los elementos de vidrio. Una vez que el manmetro indique que no hay sobrepresin en el interior del aparato, se abre primero la llave de vapor y luego de algunos minutos se puede levantar la tapa de la autoclave. No se debe retirar el contenido inmediatamente.
Tiempo requerido: usualmente, para esterilizar medios de cultivo son necesarias temperaturas de 121C durante 15 a 20 minutos. Limitaciones: en funcin de la termolabilidad de ciertos materiales y componentes de medios de cultivo. Adems es inadecuado para sustancias que son insolubles en agua, como las grasas, en las que la penetracin del vapor es muy limitada. b) Tyndalizacin: Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por Tyndall, que permite esterilizar, a bajas temperaturas, aquellas sustancias que se alteran a altas temperaturas como algunos azcares. Se puede realizar a bao Mara o autoclave abierta. La temperatura utilizada es generalmente de 60-80 C; a esta temperatura se eliminan las formas vegetativas pero no las esporuladas. Por esta razn es que despus de un perodo de calentamiento de 30 minutos, se deja el material a 30-37C hasta el da siguiente, y se lo somete nuevamente al tratamiento inicial. Esta operacin se repite despus de 24 horas (esterilizacin fraccionada). La discontinuidad de calor- reposo permite a las bacterias desarrollar nuevas clulas vegetativas a partir de sus esporas, hasta que por ltimo, en el tercer calentamiento, ya no quedarn formas esporuladas. c) Pasteurizacin: Debe su nombre a Pasteur quien fue el primero en utilizar este mtodo que actualmente presenta una serie de modificaciones. Tiene muy poca aplicacin en bacteriologa y es usada especialmente en leche, ya que destruye la totalidad de los grmenes patgenos y la mayora de la microbiota asociada, respetando la estructura fsica y composicin qumica de la misma (otros ejemplos son la nata, bebidas alcohlicas, mosto, etc.). Consiste en someter el lquido a un calentamiento rpido seguido de un enfriamiento posterior. La temperatura aplicada es de 63C, durante 30 minutos con lo que se consigue la destruccin de las formas vegetativas, excepto las termfilas. Existe una pasteurizacin denominada alta o instantnea, en las que mantienen delgadas pelculas de leche vaporizada sobre tubos o placas a 71C, con lo que se requiere una exposicin de slo quince segundos.
2.4.2.1.2 Filtracin.
Las bacterias pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos termolbiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden esterilizar por filtracin, si previamente se disuelven en un lquido. Tcnicamente, la filtracin no esteriliza porque los virus pueden pasar a travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. Filtros de membrana. Estas membranas estn compuestas de nitrocelulosa, con un poro de dimetro constante. La nitrocelulosa es un derivado qumico de la celulosa, El dimetro de poro es aproximadamente de 0,45 a 4.0 m; este tamao es lo suficientemente pequeo como para eliminar todos los microorganismos, con excepcin de los virus y algunas bacterias muy pequeas. Un lquido se filtra hacindolo pasar a travs de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el lquido por el filtro se utiliza una bomba de vaco; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtracin es el mtodo de eleccin para esterilizar soluciones de vitaminas, antibiticos v otros compuestos termolbiles, que son aadidos a los medios. Filtros HEPA: Son filtros de vidrio empleados para esterilizar el aire que penetra en habitaciones especiales como quirfanos, etc. Tambin se emplean en cmaras de flujo laminar aparatos con forma cbica (urna). Tienen una superficie donde se hacen las operaciones microbiolgicas. El aire que penetra en la cmara pasa por los filtros HEPA, de manera que la superficie queda estril.
2.4.2.1.3 Radiaciones.
Se denominan tambin esterilizacin fra. Se usa con material sensible al calor, ya que no produce calentamiento del material. Radiaciones no ionizantes: Luz UV, muta el DNA (dmeros de timina), tiene bajo poder de penetracin, se usa en superficies o ambientes como quirfanos o plantas de envasados. Radiaciones ionizantes: Son los rayos X y los rayos gamma, tienen mucha energa y poder de penetracin. Inducen la ionizacin de molculas celulares tanto de organismos eucariotas como procariotas, provocando la muerte celular. Forman radicales hidroxilo y perxidos que oxidan cualquier material daando al ADN. Los rayos X no se suelen utilizar porque son caros, pero s los rayos gamma, y se obtienen fcilmente a partir del cobalto (60Co). Se emplean en procesos de enlatado y esterilizacin de material quirrgico (bistur, gasas...) Esto requiere altas medidas de seguridad deben practicarse en zonas especiales y las personas que los realicen deben ir protegidas.
Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos. Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo. pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentracin del agente sobre la clula. El pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad.
Recordar: 1. Al utilizar cualquiera de stos productos se debe tener en cuenta que la piel del paciente puede ser sensible a ellos. 2. Es conveniente que el antisptico de eleccin sea el mismo en todas las reas geogrficas del hospital. Su uso debe estar previamente determinado, excepto reas especiales donde el espectro del antisptico que se elige debe ser amplio para eliminar el mayor nmero posible de grmenes, tambin se tendr en cuenta que no dae las manos del personal. 3. Los antispticos deben, una vez que llegan a los distintos servicios, fraccionarse en frascos pequeos, opacos y con tapa. El antisptico que se coloca en estos frascos debe recambiarse diariamente, previo lavado y escurrido del frasco antes de proceder a su rellenado. 4. El alcohol al 70% puede colocarse en frascos comunes de vidrio blanco, pero stos debern tener tapa hermtica. 5. Es importante mantener tapados los antispticos ya que, por ejemplo, en el alcohol yodado, puede alterarse la concentracin de cualquiera de sus componentes por evaporacin. 6. La Iodopovodona jabonosa puede reemplazarse por gluconato de clorhexidina (Hibiscrub M.R.) segn la evaluacin que, en determinadas situaciones, realice la institucin. IODO-POVIDONA: (Pervinox M.R.) (Fada M.R.). Es un iodforo que resulta de la combinacin de iodo con un agente solubilizador (PVP o povidona) que mantiene la eficacia germicida del iodo y resulta en un antisptico relativamente libre de toxicidad e irritacin. Est disponible en forma de solucin jabonosa y como solucin tpica. Esta forma de iodo no irrita ni mancha y ha sido ampliamente aceptada en los ltimos aos para una gran variedad de aplicaciones preventivas, de limpieza (solucin jabonosa para lavado de manos y bao previo prequirrgico) y teraputicas, incluyendo su uso en curacin de heridas. La ms comnmente empleada es la solucin al 10%. Hay otros compuestos que estn sometidos a investigacin. Se cree que es microbicida, no meramente bactericida, lo que significa que adems de las bacterias Gram (+) y Gram (-), eliminan virus, hongos, protozoos y levaduras. Se recomienda usarla sin diluir. GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 4% (Hibiscrub M.R., Butyl M.R.). Es un agente bactericida tpico eficaz contra grmenes Gram (+) y Gram (-), pero de mayor eficacia sobre los primeros. Es tambin efectivo contra hongos y virus, pero su accin es muy baja sobre el Mycobacterium tuberculosis. Presentacin: Clorhexidina jabonosa y Clorhexidina alcohlica (no est en el mercado comn). Se recomienda para: Bao del paciente (preferentemente no en cama ya que mancha las sbanas) y para el lavado de manos. La ventaja de ste antisptico es una importante accin residual sobre la piel (entre 3 y 6 horas).
No se lo debe usar para desinfeccin de elementos o superficies, puesto que se inactiva en presencia de materia orgnica y materiales como corcho, algodn o goma. HEXACLOROFENO (FISOHEX M.R.). Es un agente bacteriosttico ms eficaz contra los grmenes Gram (+) que contra los Gram (-), especialmente los estafilococos. Las materias orgnicas interfieren en su accin. Aunque una sola aplicacin apenas modifica la flora cutnea, tiene efectos, acumulativos. Por lo tanto, puede usarse en duchas preoperatorias durante dos a cuatro das. Cuando se ingiere o absorbe a travs de una grieta en la piel o membranas mucosas (o incluso a travs de piel intacta de algunos nios), el hexaclorofeno provoca una neurotoxicidad potencialmente cuando existen erupciones cutneas, quemaduras o heridas abiertas. Se lo considera como a otros fenlicos, como desinfectante de nivel intermedio o bajo. Puede usarse en materiales no crticos y limpieza del ambiente hospitalario. PERXIDO DE HIDROGENO (Agua oxigenada). Ha sido empleado durante aos para promover la limpieza de las heridas. Tiene un dbil efecto germicida y fcilmente se degrada a oxgeno molecular y agua. Es muy importante su estabilidad, (610%), lo que es muy difcil de garantizar en nuestros mercados en relacin al tiempo de almacenamiento. Su accin es mecnica, las burbujas de oxgeno desprenden tejido muerto y las bolsas de bacterias ayudan a eliminarlas de la herida. Tiene inconvenientes, puede crear ampollas llenas de aire en los nuevos epitelios, separndolos del tejido subyacente. Por consiguiente, el perxido de hidrgeno no debe utilizarse cuando la herida est adecuadamente cicatrizada y se est formando epitelio nuevo. Tras su aplicacin, debe eliminarse de la herida con solucin fisiolgica. Tampoco debe emplearse en ciertas heridas profundas ni en la cavidad peritoneal, pues podra provocar un mbolo gaseoso en los capilares y vasos linfticos. Se ha demostrado que es bactericida, virucida y fungicida. La inmersin de material limpio en una solucin estabilizada al 6% proporcionara una desinfeccin de alto nivel en treinta minutos. Su estabilidad no est garantizada en nuestro medio, por lo que no se la recomienda. Corroe metales como el cobre, aluminio y zinc. Debe mantenerse al abrigo de la luz. ALCOHOL. El alcohol etlico al 96% (etanol) es el que ms comnmente se encuentra en el ambiente hospitalario. Se recomienda para: Antisepsia de la piel en pacientes alrgicos al Iodo (debe dejarse actuar entre uno y dos minutos), desinfeccin de termmetros y desinfeccin de endoscopios fibropticos. Es eficaz contra la mayora de las bacterias patgenas, pero de accin imprevisible contra los hongos y virus. Algo ms potente es el alcohol isoproplico al 70% (Isopropanol). Ambos resecan la piel, lesionan el epitelio nuevo y provocan ardor cuando se aplican sobre heridas abiertas. El isopropanol tambin provoca vasodilatacin bajo la superficie cutnea, de modo que las punciones con aguja sangran ms que cuando se utiliza etanol. El uso de isopropanol al 70% en las manos es un excelente mtodo que reemplazara en situaciones de emergencia el lavado con soluciones jabonosas, dada su alta eficacia. No tiene accin residual, pero varios estudios demostraron que es capaz de reducir en un 99,7% la concentracin microbiana de la piel de las manos.
Actualmente el uso del isopropanol al 70% se recomienda para la sanitizacin de mesas de trabajo y equipo automatizado de laboratorio y para inactivar en caso de derrame accidental de RPBI. ALCOHOL IODADO Es una combinacin de iodo con alcohol al 70%. Se debe utilizar en concentraciones al 2%. Acta sobre bacterias Gram (+), Gram (-), Mycobacterium tuberculosis y hongos. Se lo utiliza como antisptico de eleccin para la preparacin de la zona operatoria de la piel. Debe mantenerse en recipientes opacos y tapados para evitar que por evaporacin se alteren las concentraciones iniciales con que el producto llega proveniente de la farmacia del hospital. AMONIOS CUATERNARIOS (Cl. de Benzalconio: Tersotyl M.R.) (DG6 M.R.) Estos compuestos tuvieron amplio uso desde su inicio como germicida, son buenos agentes de limpieza, pero actualmente no se recomiendan como antispticos de piel y tejidos, ya que diversos estudios han documentado que en ellos sobreviven y desarrollan bacterias Gram (-), que han podido relacionarse con brotes de infecciones hospitalarias. Materiales como el algodn y las gasas disminuyen su actividad, porque absorben los ingredientes activos. No se los debe utilizar para la desinfeccin de elementos crticos o semicrticos. Solamente para el tratamiento de materiales no crticos. No eliminan esporas ni determinados virus, como por ejemplo el de la Hepatitis B. Debe usarse con cuidado, ya que se ha visto que algunas soluciones permiten el crecimiento de Pseudomonas sp. HIPOCLORITO DE SODIO. El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fcilmente en la clula a travs de la membrana citoplasmtica. En cambio, el cido hipocloroso es neutro y penetra fcilmente en la clula, mientras que el Cl2 ingresa como gas. El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo), a pH alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A causa de sto, es que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente cido), con el objeto de obtener cido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una concentracin del 0.1-0.5% de Cloro activo. FORMALDEHDO Inactiva microorganismos a travs de la alcalinizacin de las protenas. Se presenta en concentraciones del 40%. La solucin acuosa es bactericida, fungicida, esporicida y viricida.
Segn su dilucin actuar como esterilizante, luego de un tiempo prolongado o como desinfectante de alto nivel. Se lo utiliza para la inactivacin de bacterias en los sistemas de distribucin de agua tratada de los servicios de Hemodilisis. Los vapores de formaldehdo tienen efectos txicos e irritantes, por lo que es necesaria la utilizacin de elementos protectores durante su manipulacin. (Mscaras respiratorias, protectores oculares, guantes resistentes y delantales impermeables). El ambiente de trabajo debe contar con un adecuado sistema de recambio de aire. Concentraciones ambientales de 2 p.p.m. han ocasionado efectos txicos. Las pastillas de formalina no deben utilizarse en cajas de instrumental, guantes, etc. Su accin germicida solo se produce en la vaporizacin por calor. Actualmente se desaconseja su uso en quirfanos o habitaciones de pacientes, por ser no solo un procedimiento riesgoso (efecto carcinognico) sino tambin ineficaz. Por las razones expuestas, su uso queda limitado a los servicios de Hemodilisis. OXIDO DE ETILENO. Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancergeno.
Algunas autoclaves modernas estn equipadas con termmetros que producen un registro continuo y permanente de las temperaturas en el interior del aparato.
El mtodo de las diluciones. Este mtodo consiste en realizar una serie de diluciones decimales de las cuales se toman alcuotas que se siembran en medios de cultivo slido en placas o cajas Petr, ya sea mediante la tcnica de vertido en placa o por dispersin con la esptula de Drigalsky.
El mtodo de las diluciones nos permite determinar las UFC/mL, presentes en la muestra por analizada.
2.5.2 Mtodo de siembra. Vertido en placa. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en la placa o caja Petr. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Espatulado. Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de una esptula de Drigalsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las colonias microbianas sobre la superficie.
Picadura: El medio de cultivo que se emplea semislido en tubo y la siembra se realiza con asa recta, la
que se introduce con el inculo rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio.
Picadura y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce el asa recta en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta.
Consistencia. Dura o suave, esta ltima puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto de ser la ultima en describirse. Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles alrededor de la colonia, como la hemolisis en la gelosa sangre, acidificacin que se manifiesta con un indicador de pH incorporado al medio de cultivo. Con al experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa colonial vienen a constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales grupos de bacterias y tambin permite corroborar en muchos casos la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminacin La certeza de tener un cultivo puro as como el reconocimiento de un cultivo mixto o impuro permite la caracterizacin e identificacin correcta de un microorganismo patgeno.
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