LAS SEMAFORINAS: MOLCULAS IMPLICADAS EN EL GUIADO AXONAL

RESUMEN Los axones alcanzan sus dianas mediante seales atractivas o repulsivas del medio extracelular, que actan regulando la dinmica del citoesqueleto en el cono de crecimiento. Hay diversas molculas implicadas en el guiado axonal: netrinas, efrinas, slits y semaforinas. Las semaforinas actan principalmente como seales inhibitorias sobre el axn, y juegan un papel importante en la regulacin de la inmunorrespuesta, angiognesis y el cncer. Las plexinas, solas o en asociacin con las neuropilinas, constituyen los receptores de semaforinas de alta afinidad, sin embargo otras molculas transmembrana se han implicado en los complejos receptores de semaforinas, e interacciones entre plexinas, y una gama de efectores intracelulares. INTRODUCCIN Para que el sistema nervioso sea funcional, las neuronas extienden sus axones, a menudo, a largas distancias, hasta alcanzar sus dianas. En este proceso se ven implicadas seales moleculares especficas que guan los axones hacia sus objetivos y estas seales, son reconocidas por el cono de crecimiento. En funcin de las seales, el cono de crecimiento elabora una respuesta dentro de un determinado contexto celular, es decir, el ambiente que rodea las clulas proporciona un juego complejo de rdenes para el axn en vas de crecimiento. Los conos de crecimiento tienen tres regiones principales. El ncleo central es rico en microtbulos, mitocondrias y otras organelas. Del cuerpo proliferan largas y delgadas extensiones conocidas como filopodios. Entre los filopodios estn los lamelopodios, que son tambin mviles y dan al cono de crecimiento su caracterstico aspecto erizado. La capacidad sensitiva del cono de crecimiento depende en gran parte de sus filopodios. Estas estructuras en forma de cilindro, ricas en actina y con una membrana 1

limitadora, son muy mviles. Sus membranas poseen receptores para las molculas que sirven como seales de direccin para el axn. La longitud de los filopodios les permite tantear el terreno mucho antes que el ncleo central, sus rpidos movimientos les permite hacer un inventario detallado del ambiente y su flexibilidad les permite navegar a travs de clulas y de otros obstculos. Cuando los receptores de los filopodios encuentran seales en el medio ambiente, el cono es estimulado para avanzar, retraerse o girar. Para el guiado es particularmente importante, el acoplamiento entre las capacidades sensitiva y motora del cono de crecimiento. Es decir, que los receptores en los filopodios no intervengan simplemente en la adherencia sino ms bien sean receptores transmisores de seales acoplados a numerosas vas de segundos mensajeros. Los segundos mensajeros afectan a su vez a la organizacin del citoesqueleto, y regulan de esa manera la direccin y la velocidad a la que se mueve el cono de crecimiento. Varios motores con actina, miosina y componentes de la membrana impulsan estas reacciones y la contribucin de cada motor molecular al avance del cono de crecimiento probablemente vara de una situacin a otra. Con todos los motores, sin embargo, el paso final implica el flujo de microtbulos desde el ncleo central a la protusin recientemente creada, de forma que el cono de crecimiento se mueve hacia delante y deja atrs un nuevo fragmento axnico. El nuevo cono de crecimiento se forman otra vez lamelipodios y filopodios, y el proceso comienza de nuevo. (Kandel, 2001). Diversas molculas actan como seales en el guiado del axn. Las integrinas de los conos de crecimiento interactan con laminitas en la matriz extracelular. Molculas que intervienen en la adherencia intercelular tambin favorecen el crecimiento del axn.

Hace diez aos, muy pocas de las molculas de guiado axonal eran conocidas. Pero en los aos 70 y 80 aparecieron varios anlisis in vitro de gran importancia, para detectar actividades de gua en el desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados , y tambin por el inters, cada vez mayor, de los genetistas en relacin al problema de gua axonal en los invertebrados. El comienzo de los aos 90 condujo al descubrimiento de varias familias de molculas conservadas de guiado axonal . Entre stas estn las netrinas, slits, efrinas y semaforinas, todas ellas pertenecientes a familias de molculas altamente conservadas (Dickson B.J. 2002).

Las netrinas fueron descubiertas como resultado de la bsqueda de un quimioatrayente para axones comisurales en vertebrados y tras el anlisis de los genes requeridos para la gua circunferencial del axn en el gusano Caenorhabditis elegans. Estas molculas han conservado su funcin como factores quimiotcticos, atrayendo y rechazando axones hacia la lnea media. Sus receptores son el unc-5, que parece ser que acta slo en la repulsin, y el unc-40, que acta en la atraccin y repulsin y pertenece a la familia DCC.

Las slits son protenas grandes con una funcin repulsiva altamente conservada en vertebrados. Sin embargo, puede afirmarse que las slits son multifuncionales puesto que, adems, estimulan la ramificacin sensorial y alargamiento de los axones. A travs de receptores de la familia Robo, cumplen funciones como el guiado de la lnea media en Drosophila y en la formacin del quiasma ptico en vertebrados.

Las efrinas actan de forma repulsiva mediante receptores de la familia Eph, dirigiendo los axones retinianos de los vertebrados hacia sus localizaciones topogrficas apropiadas en el techo ptico por un sistema ortogonal de gradientes moleculares en la retina y el techo.

En este trabajo nos centraremos en el papel de las semaforinas en el guiado axonal. Algunas estn unidas a la membrana y actan a corta distancia, pero otras son secretadas en forma soluble y pueden servir como quimiorrepelentes. Cada una de ellas tiene una distribucin nica y afecta a distintos tipos de neuronas, y muchas estn presentes y activas en tejidos de neuronas, y otras en tejidos no neuronales. Los receptores esenciales de las semaforinas son unas molculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas conocidas como neuropilinas y una familia de protenas, llamadas plexinas, que muestran algunos aspectos estructurales de las mismas semaforinas.

DISCUSIN SEMAFORINAS. FUNCION, ESTRUCTURA Y CLASES Las semaforinas se definen por la presencia de un dominio amino-terminal. Este se denomina sema, y es un dominio clave para la sealizacin debido a su conservacin (protenas que slo contienen el dominio sema son biolgicamente activas). Es una extensin de aproximadamente 500 aminocidos que contienen 17 cistenas conservada y una secuencia rica en cistenas denominada Met Related (MRS) que es la que confiere la especificad biolgica. ( Raper J. 2000, Artigiani S. et al 1999). Adems del dominio sema existen otros como el PSI (plexina semaforina y integrina), el dominio carboxi-terminal que contiene aminocidos bsicos con un dominio de inmunoglobulina adyacente ayuda a reafirmar la unin de la clase III de semaforinas a sus receptores, otro ejemplos pueden ser los de las clases II,III,IV y VII donde se ha encontrado un dominio IG-like, mientras que la clase V contiene siete dominios trombospondina. (Kruger R. et al, 2005. Raper J. 2000). Se ha descubierto recientemente que estas regiones MRS de los dominios extracelulares presentan homologas con protenas de la familia de las integrinas. (Artigiani S. et al, 1999). Las semaforinas han sido clasificadas segn sus dominios adicionales en ocho clases y estn localizadas cerca de las clulas que las originan (RaperJ. 2000): La clase I y II se encuentran en invertebrados. De las clases III a la VII se encuentran en vertebrados : De la clase IV a la VI son transmembranas, III y VII son secretadas.sta ltima se ancla a la superficie de la clula por acoplamiento fosfotidilinositol. La clase VIII est codificada por virus.

Fig 1: Representacin esquemtica de las distintas clases de semaforinas y plexinas, con los dominios que las componen.

Las semaforinas secretadas actan de forma inhibitoria sobre el axn. Lo que hacen es rodear la trayectoria del axn inhibiendo el que este tenga acceso a las zonas que son inadecuadas. Estas funciones no slo son cruciales durante el desarrollo del embrin sino tambin en el adulto, controlando la trayectoria del axn despus de una lesin ( Artigiani S. et al, 1999). Las semaforinas transmembranas (asociadas a glicoprotenas), pueden tambin lanzar una seal al dominio extracelular al revs, recibir una seal, funcionando como receptores. Los experimentos in vitro e in vivo han implicado a las semaforinas en la direccin de alargamiento de los axones y las dendritas, as como en la ramificacin del axn, acortamiento y degeneracin del axn (Raper J. 2000). Numerosos estudios han revelado que las semaforinas, plexinas y otros factores implicados poseen similitudes estructurales y, no solo eso, sino que tambin muestran similitud en su funcin biolgica (en el guiado de la clula), por lo que se cree que puedan tener un origen comn (Artigian i S. et al, 1999).

COMPLEJOS RECEPTORES Se han identificado los receptores de alta afinidad de las semaforinas. Entre ellos

estn las plexinas, que son una gran familia de molculas transmembranas que se conservan de invertebrados a humanos, y las neuropilinas (NP1 y NP2) que se encuentran solamente en vertebrados. En el lmite de la membrana de vertebrados las semaforinas se unen directamente a las plexinas, mientras que las semaforinas secretadas (clase 3) tambin requieren neuropilinas como correceptores obligatorios. Varias evidencias indican que el dominio citoplsmico de las plexinas es requerido en la sealizacin por semaforinas, mientras que el lado citoslico de las neuropilinas es prescindible (Tamagnone L. & Comoglio P. 2004).

Fig. 2 Representacin esquemtica de los complejos receptores de membrana de las semaforinas.

La neuropilina-1 une a SEMA-3A, pero no a SEMA-3F, ya que lo hace la neuropilina-2 con una afinidad ms alta que a SEMA-3A. Algunos estudios concluyeron que las neuropilinas eran producidas como dmeros, estos son independientes, as la neuropilina-1 y-2 pueden formar heterodmeros cuando son coexpresados. Estas conclusiones sugieren que un modelo homodimrico confiere respuesta a SEMA-3A, la neuropilina-2 homodimrica confieren respuesta a SEMA-3F, y una cooperacin de neuropilinas-1 y-2, quizs por la formacin de un heterodmero, confiera respuesta a SEMA-3C. Las neuropilinas son importantes en la determinacin de la especificidad en la actividad de la clase III de semaforinas hasta en el contexto de transformacin de la

seal por

las plexinas. SEMA-3A inicia la desestructuracin

celular cuando

la

neuropilina-1 y plexina-A1 son coexpresadas, pero no cuando neuropilina-2 y plexinaA1 son coexpresadas. A la inversa, SEMA-3F inicia el desestructurado celular cuando neuropilina-2 y plexina-A1 son coexpresadas, pero no cuando neuropilina-1 y plexinaA1 son coexpresadas (Raper J. 2000). Las plexinas se pueden agrupar en 4 subfamilias: A, B, C, D y son los receptores especficos de las semaforinas. El dominio citoplsmico de las plexinas es grande (600 aa) y esta muy conservado en todos los miembro de la familia (semejanza del 57-97%) y en la evolucin (semejanza mayor del 50% entre invertebrados y seres humanos). Aunque este dominio de la plexina no tenga homologa con ninguna otra protena, ni posea actividad tiroxina-kinasa, el hecho de que este muy conservado sugiere que ser importante para la funcin biolgica (papel crucial en la transduccin de la seal). Los dominios de las plexinas, tienen alfa hlices, que sirven para la interaccin protenaprotena y mediar la interaccin con una molcula citoslica. Las Plexinas estn implicadas en el guiado axonal especfico durante el desarrollo. Hay pruebas evidentes de que las plexinas transforman las seales de la clase III de semaforinas cuando el complejo con neuropilinas es muy fuerte (Artigian i S. et al, 1999).

Fig. 3 Representacin esquemtica de las distintas plexinas y semaforinas de vertebrados e invertebrados.

Recientemente, dos molculas que no tienen relacin con las plexinas o con las neuropilinas, CD72 y Tim2, se encontraron para interactuar funcionalmente (aunque en afinidad baja) con las semaforinas transmembranas en el sistema inmune. Los receptores en la membrana plasmtica a menudo se oligomerizan en complejos, lo cul 7

permite escoger entre diversos caminos de sealizacin. Los complejos receptores de semaforinas parecen ser buenos ejemplos de estos centros de interaccin. De hecho, as como plexinas y neuropilinas, otras molculas transmembranas se unen funcionalmente a los receptores de semaforinas, incluyendo la molcula de adhesin celular L1, el receptor tiroxina-kinasa OTK, y el factor de dispersin Met. Evidencias indican que las semaforinas pueden inducir diversas respuestas funcionales, dependiendo de las molculas sealizadoras que se encuentran en el complejo receptor. Por ejemplo, Sema 4D puede mediar la atraccin a travs de la activacin de Met, mientras que inhibe la adherencia y migracin de la clula a travs de la sealizacin por plexinas especficas y Met independientes. Por analoga, en respuesta a su nuevo ligando identificado, la plexina-A1, Sema 6D puede mediar alternativamente seales atractivas o repulsivas en diversas poblaciones de clulas, dependiendo de su asociacin con receptores tiroxina-quinasa de los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGFs) o con OTK. Las neuropilinas son correceptores de VEGF, sin embargo, los mecanismos por los cuales las neuropilinas cambian entre semaforinas y VEGF en la sealizacin son confusos. Se ha demostrado que Sema3A compite con VEGF165 para unir a NP1 y que ello inhibe la funcin de VEGF en las clulas endoteliales (Tamagnone L. & Comoglio P. 2004). IMPLICACIONES TERAPUTICAS DE LAS SEMAFORNAS Las semaforinas no se expresan exclusivamente en tejido nervioso en desarrollo, sino tambin en tejidos adultos donde cumplen una variedad de funciones. Recientes estudios demuestran que SEMA-3A puede inhibir la movilidad de clulas endoteliales, ramificacin de capilares y la formacin de microvellosidades. Estos resultados in vitro sugieren que SEMA-3A acte como un repelente. Estudios recientes indican, sin embargo, que SEMA-3A y otras seales de guiado, pueden actuar como repelente o atrayente dependiendo de los niveles de cGMP en las neuronas que acten (Raper J. 2000). Se ha visto que en el sistema nervioso central de mamferos adultos se produce una inhibicin de la regeneracin de los axones tras una lesin. Recientemente se ha demostrado que Sema 3 A es un potente inhibidor de la regeneracin axonal. Estos resultados sugieren la posibilidad de usar a Sema 3 A en las lesiones medulares en humanos. (Kaneco et al, 2007) 8

Se ha encontrado sobreexpresin de semaforinas asociadas a la invasin y metstasis en la produccin de tumores. Sema 3C est sobreexpresada en clulas cancerosas resistentes a radiacin y drogas citostticas, en algunos tipos de cancer, por ejemplo el adenoma de pulmn. Otras semaforinas secretadas, (sema3E) se encuentran sobreexpresadas en lineas celulares metastsicas en comparacin con otras lineas celulares emparentdas pero no metastsicas. La sema 3A tiene una funcin antagnica a sema 3C y sema 3B, (tambin implicada en la proliferacin del cncer) implicada en la seal apopttica de la clula (Artigian i S. et al, 1999). Las semaforinas virales son expresadas en las clulas infectadas para impedir la respuesta inmunolgica, por lo tanto su descubrimiento ha sido de vital importancia en la funcin de las semaforinas en el sistema inmune. Las semaforinas virales tiene homologa con semaforinas del sistema inmune endgeno(sema 7A), que es expresada por clulas T. El papel de sema 7A en el sistema inmune es confuso, pero teniendo en cuenta lo que se conoce sobre las semaforinas virales, es probable que tenga una funcin importante en la interaccin clulas T-antgeno ( Kruger R. et al, 2005).

ALGUNAS TCNICAS UTILIZADAS EN NEUROFISIOLOGA Tcnica de hibridacin in situ La hibridacin consiste en la formacin de dplex entre secuencias de DNADNA, DNA-RNA o RNA-RNA, que normalmente no se encuentran asociadas. Cuando esta tcnica se realiza sobre cortes histolgicos se denomina Hibridizacin in situ (ISH). La ISH es una tcnica relativamente reciente (1969) que permite la demostracin de secuencias de cidos nucleicos en su propio entorno (es decir en su localizacin en el interior de la clula) Para realizar una ISH es preciso contar en primer lugar con la sonda adecuada. Esta sonda consiste en una secuencia de cidos nucleicos complementaria a la secuencia diana que queremos demostrar. Tras realizar un pretratamiento adecuado de las muestras, se procede a la hibridacin propiamente dicha, es decir a que la sonda y la diana se unan. Se concluye la tcnica detectando (visualizando) la sonda hibridada. 9

Previamente, la sonda se sintetizar de forma especfica mediante la tcnica PCR (oligonucletidos de unas 20 bases) y se marcar , para poder detectarla posteriormente, bien con un fluorocromo (como por ejemplo fluorescena) o bien con una molcula que pueda detectarse como la biotina o digoxigenina. Se secciona el cerebro fresco y se congela rpidamente. Posteriormente se secciona mediante un criostato el rea del cerebro donde se va a aplicar la tcnica. Las secciones de cerebro se fijan con paraformaldehdo al 4%. Seguidamente, las secciones se aclaran durante toda la noche en PBS a 4 C, se deshidratan en una bateria de alcoholes de gradacin creciente y se permeabilizan en PBS ms 1 % Tritn X-100. Entonces se procede a la hibridacin con la sonda durante toda la noche a 37 C. Al da siguiente, las secciones se aclaran con SSC y se lavan con PBS. A continuacin, se realizar un tratamiento distinto, en funcin del marcaje, para detectar la sonda. Si se trata de una sonda fluorescente, tras la hibridacin, las muestras se someten a microscopia de fluorescencia. Cuando las sondas utilizadas estn marcadas con biotina, el mtodo de deteccin exige tratar los cortes con un complejo avidina-biotinaperoxidasa que se une a la biotina de la sonda. Seguidamente se revela la peroxidasa mediante agua oxigenada y diaminobenzidina. Si la sonda utilizada estaba marca con digoxigenina, la deteccin se realiza mediante una tcnica inmunocitoqumica utilizando anticuerpos contra la digoxigenina, conjugados con un marcador fluorescente, enzimtico o metlico (Shepherd I. et al, 1996). Cultivos de clulas nerviosas.

Las cras son anestesiadas con fluotano antes de ser degolladas y proceder con la diseccin del cerebro. Se localiza la zona a diseccionar estereotaxicamente y es sumergida en una solucin de diseccin que contiene : NaCl, KCl, CaCl, Mg Cl2, 25mM HEPES a pH7,4, glucosa y sorbitol a 37 C. Dependiendo de la zona a diseccionar se procede de distinta manera. Los fragmentos de tejido son transferidos a un frasco de cultivo con una solucin enzimtica, para eliminar las posibles uniones entre clulas. El frasco se coloca bajo un bao de agua a 37 C y se agita suavemente durante un tiempo. Con una pipeta Pasteur tubo con el medio de cultivo en el que se ha hecho la diseccin. de punta fina, se transfieren los fragmentos de tejido a un tubo estril. Se aclara (se aspira y suelta) el

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Se coge una alcuota, y se tritura el tejido, despus se centrifuga y retira el sobrenadante, repitiendo la operacin segn el estudio a realizar, triturando cada vez ms vigorosamente. El resultado es una cantidad determinada de suspensin de clulas, que se cuentan con un hemocitmetro. Se preparan placas con una determinada cantidad de suspensin y se incuban a 37 C con CO2 del 5%. Una vez que tenemos conservadas las clulas en suspensin, las cultivamos en un medio que permite su crecimiento. Suele utilizarse suero ( factores de crecimiento, hormonas y protenas, factores de adhesin e inhibidores de proteasas, antibitico y antifngico). El medio de cultivo es un preparado comercial, que contiene aminocidos , oligoelementos, vitaminas, carbohidratos, glucosa, soluciones salinas, bicarbonato sdico e indicador de pH. (Matthews C. et al, 2007).

Tcnica inmunocitoqumica.

Las tcnicas inmunocitoqumicas, son aquellas en las que se emplean anticuerpos, el tipo IgG es el comnmente utilizado en inmunocitoqumica. En ocasiones se utilizan tambin IgM marcados, para detectar sustancias especficas, antgenos o inmungenos, contenidas en las clulas. Para desarrollar las tcnicas inmunocitoqumicas en el laboratorio se recurre a la adquisicin de anticuerpos. En funcin del mtodo utilizado para su produccin se distingue entre los anticuerpos monoclonales, clones de linfocitos B que reconocen un nico eptopo, y los policlonales, que reconocen varios eptopos. Para detectar el antgeno del estudio se marcan los anticuerpos bien por mtodos directos (conjugado directamente con fluorocromo o enzimas como la peroxidasa de rabano o el complejo ABC) o indirectos (muy utilizado para amplificar la seal, donde un anticuerpo secundario marcado reconoce a uno primario): El procedimiento convencional en: que se realiza se para el tcnicas animal de en

inmunohistoqumica

consiste

Generalmente

perfunde

paraformaldehdo al 4%. Seguidamente, se secciona el cerebro ya fijado en un criotomo o criostato en secciones del grosor que nos interese, normalmente 30-50 micras, se recogen en PBS, se permeabilizan en PBS que contiene Tritn X-100 1% y se bloquean

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con BSA o suero de animales Despus las secciones se lavan en buffer fosfato salino (PBS). La inhibicin de la peroxidasa endgena tisular se hace con perxido de hidrgeno al 0.3% dando un producto con una coloracin marrn, insoluble y estable. Luego se lavan las muestran en PBS, se incuban con suero bloqueante o BSA durante 1 hora. La incubacin con el anticuerpo primario es a temperatura ambiente durante toda la noche. Tras dos lavados en PBS se incuban con el anticuerpo secundario biotinilado o con fluorocromo durante 1-2 horas. Se procede a nuevos lavados en PBS y se incuban durante 45' con el complejo ABC kit para finalmente exponer las muestran al revelado durante 5' con diaminobencidina y 0.2 % de perxido de hidrgeno en 50mM buffer Tris, ph 8. (Shepherd I. et al, 1996).

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