Algunos agentes estabilizadores son:

PURIFICACIN Y CONCENTRACIN La eliminacin de los cidos nucleicos y los restos celulares presentes en los extractos, deja un lquido sobrenadante que contiene el enzima deseado. El siguiente paso del proceso consiste en la eliminacin de los contaminantes no deseados, molculas pequeas, orgnicas e inorgnicas, otras protenas y la mayor parte del agua, si no toda. Hay una serie de mt odos disponibles para purificar y concentrar el enzima deseado; algunos consiguen las dos cosas a la vez, otros slo una de ellas. La seleccin del mtodo de purificacin apropiado, en gran medida, suele ser fruto de una mezcla de empirismo, pragmatismo y experiencia, y es imposible hacer generalizaciones. La Tabla resume los procedimientos de extraccin y purificacin utilizados para varios enzimas. Examinando los datos de esta Tabla, puede verse que el proceso global de purificacin y concentracin consta de una serie de pasos individuales. Primero, una purificacin inicial, que puede conllevar algo de concentracin, seguida de otro paso de purificacin, a base normalmente de cromatografa y finalmente, una concentracin del enzima purificado; Tabla Enzima L-Asparagina sa Mtodos para la purificacin de enzimas Organismo de procedencia y mtodo usado Citrobacter spp. (55 kg de pasta) Homogenizador Mantn Gaulin Precipitacin de cidos nucleicos con MeCl2 Fraccionamiento con acetona Fraccionamiento con sulfato amnico Columna de DEAE-celulosa (8 dm3) con elucin en gradient Columna de hidroxiapatito (2 dm3) con elucin en gradiente 3 columnas de Sephadex G200 (1,4 dm3) en serie -GaIactosid asa Escherichia coli Homogenizador Mantn Gaulin Fraccionamiento con sulfato amnico Cromatografa de afinidad en una columna de p-aminofenil--D-tiogalactosido-agarosa (1,8 dm3) eluida con 0,05 M fosfato pH 7,0 y 0,1 M borato pH 10 Robinson et al. (1974) Referencia Bascomb et al. (1975)

Formaldehd o y formato deshidrogen asa

Candida boidini (1 kg de pasta) Dynomill, funcionando a 5 dm /hora Sulfato de estreptomicina para precipitar los cidos nucleicos Columna de DEAE-celulosa (7,8 dm3) eluida de modo discontinuo Columna de DEAE-celulosa (1 dm3) eluida en gradiente Columna de hidroxiapatito (1 dm3) eluida en gradiente
3

Schutte et al. (1976)

Pululanasa y 1,4-a-glucan fosforilasa

Klebsiella pneumoniae (5 kg de pasta) Extraccin de clulas con colato sdico Reparto en dos fases lquidas usando 9 % PEG y 2 % dextrano Fase superior: Eliminar PEG por diafiltracin. Precipitar PULULANASA con bromuro de cetil-trimetilamonio. Fase inferior: Homogenizador Gaulin. Aadir PEG al 12 % y separar la fase superior. Aadirle PEG hasta el 19 % y 1,22 M KCI. Tomar eliminar Adsorber 1,4FOSFORILASA fase el inferior PEG y por con -GLUCAN Mantn

Hustedt el al. (1978)

diafiltracin CM-Sephadex y eluir la

Renina

Rion de cerdo (100 kg) Triturar el tejido Fraccionamiento con sulfato amnico Cromatografa de afinidad en una columna (0,5 dm3) de pepstatin-Sepharosa Cromatografa en Ultrogel AcA 44

Hue et al. (1976)

PURIFICACIN Consideraciones Generales Necesidad de purificacin Prdida del enzima: prdida fsica inactivacin pH y temperatura formacin de espuma

Proteasas agentes quelantes.

FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIN Factor inactivante Fuente de enzima frecuencia Modo de contrarrestarlo

Calor Frio Proteasa

cualquiera cualquiera mayora

universal raro Comn

Enfriamiento Calentamiento Inhibidores de proteasas o fro

Productos oxidacin de fenoles oxidacin

Plantas y hongos

Bastante comn

Agentes reductores

cualquiera

comn

Agentes reductores

Dilucin protena Prdida de estabilidad Inhibidores especficos Metales pesados Cambios de fase

cualquiera cualquiera

Bastante comn Bastante comn

Concentracin rpida Restauracin de ese factor

Plantas y bacterias cualquiera cualquiera

Raro

Separacin del inhibidor

Raro comn

Agentes quelantes Mnima agitacin

CONCENTRACIN Y ENRIQUECIMIENTO 1er paso: Eliminacin de cidos nucleicos: pH alto, fuerza inica baja, nucleasas 2 paso:

Eliminacin de restos celulares: Centrifugacin Filtracin 3er paso: Concentracin: Precipitacin Adsorcin Ultrafiltracin Secado Liofilizacin AISLAMIENTO Y PURIFICACIN: CONCENTRACIN Precipitacin Sulfato amnico Solventes orgnicos Polmeros de alto peso molecular Adsorcin Polisacridos aninicos Polisacridos catinicos Cromatografa de afinidad Otros Ultrafiltracin Secado Evaporacin rotatoria Secado en spray Liofilizacin. TCNICAS DE PURIFICACIN Cromatografa Intercambio inico Cromatoenfoque Afinidad Interaccin hidrofbica Filtracin en gel HPLC

TCNICAS DE PURIFICACIN Sistemas acuosos en dos fases: Solucin acuosa de dos polmeros PEG y dextrano Solucin acuosa de un polmero y una sal PEG y fosfato potsico Protenas hidrofbicas Protenas hidroflicas -*Aplicaciones: Separacin de restos celulares Enriquecimiento para posteriores pasos de purificacin Concentracin y purificacin de protenas en baja concentracin - Operacin: 1985 TCNICAS DE PURIFICACIN Diseo de enzimas: La fusin de un gen de inters a secuencias promotoras eficientes hace que una protena se sobreexprese. Dirigir la protena sintetizada de novo al periplasma de la clula. Mezcla y equilibrado separacin fase superior (rica en PEG) fase inferior

Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology, 3:6 (139-144)

 Adicin de colas de afinidad.

PRECIPITACIN . Principio general : Precipitacin (insolubilizacin) de un soluto mezcla. La solubilidad de una molcula : f (temperatura, fuerza inica, pH, constante dielctrica). por la

accin de un agente precipitante con el fin de concentrarlo o separarlo de una

Tericamente el soluto precipitado debe ser recuperado puro. La precipitacin se usa frecuentemente al inicio de las etapas de purificacin. El agente precipitante no debe desnaturalizar al soluto y en el mejor de los casos debe estabilizarlo. La precipitacin de las proteinas es una de las operaciones mas importantes en el proceso de purificacin. Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo ruptura de los puentes de hidrgeno

Esto ocurre porque se facilita la agregacin intermolecular.

Este es un mtodo de separacin de protenas con mucha tradicin, que est idealmente indicado para la purificacin inicial a partir de un extracto que contenga el enzima. La precipitacin puede ser de tipo negativo positivo, osea, que cabe precipitar las impurezas o el enzima. Esto ltimo puede ser preferible, porque as se puede resuspender el enzima precipitado en un pequeo volumen de lquido, consiguindose la concentracin adems, de la purificacin. Para la precipitacin, se pueden usar diversos agentes.

Ajustando el pH del extracto, de 7,0 hasta 4,0 o 5,0, se consigue muchas veces eliminar los componentes solubles de las paredes celulares y numerosas protenas no deseadas; esto ha sido aplicado por Marutzky et al. (1974), por ejemplo, para la purificacin inicial de nuclesido-5'-fosfotransferasa de zanahoria. Es evidente que este mtodo slo puede usarse en los casos en que el enzima deseado es estable y soluble a pH bajo. Quizs el agente de precipitacin ms ampliamente usado sea el sulfato amnico, cuyo efecto en los procedimientos de precipitacin fraccionada, puede considerarse un ejemplo de combinacin positiva y negat iva: la adicin gradual del sulfato amnico slido hace que precipiten primero las protenas no deseadas y despus la que interesa. Con procedimientos muy simples y baratos, se pueden obtener grados considerables de purificacin y concentracin, y esto puede servir para justificar lo extendido de esta prctica. Adems, las concentraciones altas de sulfato amnico pueden aumentar considerablemente la estabilidad de muchos enzimas.

Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 0.02 M) aumenta con la [ sales] Salting in Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contra iones ms soluble

por MAYOR interaccin prot-solv. La solubilidad a alta fuerza inica (mayor a 0.02 M) disminuye [sales] Salting out Capturan el H2O MAYOR interaccin entre enzimas con la

La alta [sal] elimina la esfera de solvatacin de la protena Las protenas en H 2 O tienden a formar COMPLEJOS electrostticos precipitan

A muy gran escala, sin embargo, el uso del sulfato amnico puede presentar problemas de manejo y eliminacin, pues altas concentraciones d e esta sal pueden corroer el cemento e incluso el acero de alta calidad utilizado en las instalaciones a gran escala. El sulfato sdico no es corrosivo, pero su menor solubilidad requiere que se suba la temperatura por encima de los 35 C, para conseguir el mismo grado de precipitacin fraccionada. Aunque los disolventes orgnicos son agentes de precipitacin eficaces y adecuados para el trabajo de laboratorio, rara vez son empleados a gran escala, a causa de su inflamabilidad. Diversos polmeros han sido utilizados como agentes de precipitacin. El polietilenglicol (PEG), que no es ni txico ni inflamable, es utilizado para el fraccionamiento del suero, pero su uso se ve iimitado por su alta viscosidad en solucin. El cido poliacrlico, que tampoco es txico, ha sido empleado en la purificacin parcial de la amiloglucosidasa de Aspergillus niger. Un problema de los mtodos de precipitacin es que hay que realizarlos por tandas y esto resulta difcil de integrar denstro de un proceso continuo global. PRECIPITACIN CON SALES: Sulfato amnico. Durante muchos anos se ha utilizado el mtodo de salado de las protenas con objeto de lograr el doble propsito de purificar y concentrar algunas protenas especificas. La sal utiliza da con ms frecuencia es el sulfato amnico, por su gran solubilidad, ausencia de efectos perjudiciales para la mayora de los enzimas, no ser cara y, en algunos casos, por su efecto estabilizante de ciertos enzimas (Dixon y Wcbb, 1979).

PROCEDIMIENTO

SUFALTO DE AMONIO: Altamente soluble en agua, muy pura, barata,no tiene efecto sobre la estructura de las protenas. Despus de la adicin de sal, protenas precipitadas se centrifugan y se redisuelven en buffer . Protenas solubles pueden precipitarse con una concentracin mayor de la misma sal. Protena precipitada es salted out. Sal retira la capa de molculas de agua que rodea a la superficie de la protena. Grupos hidrofbicos permiten que la protena se agregue y precipite .

La teora del fraccionamiento enzimtico mediante salado ha sido discutida por Grcen y Hughes (1955) y Dixon y Wcbb (1961). En soluciones concentradas de electrlitos el logaritmo de la disminucin de la solubilidad de las protenas es una funcin lineal del aumento de concentracin de sal (fuerza inica). La ecuacin general que describe el proceso de salado es:

Donde es la solubilidad de la protena en g/L de solucin, es una constante, (pendiente de la lnea) es la constante de salado y la fuerza inica en moles/litro.

El valor de la

depende de la sal usada, y puede variar con el pH, la es

temperatura y la naturaleza de la protena en solucin. Por otro lado la sal usada (Charm y Matteo, 1971).

independente del pH y la temperatura pero puede variar con la proten a y con Una solucin proteica de concentracin conocida (s) puede precipitar a una fuerza inica dada segn la ecuacin:

Como apuntan Charm y Matteo (1917), slo se pueden obtener resultados reprodceles cuando el pH, la temperatura y la concentracin de protena son constantes, y en estas condiciones la concentracin de sal requerida para precipitar un enzima variar con la concentracin del enzima (Dixon y Webb, 1961). EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE SATURACIN ESPECFICO:

Hay una serie de aspectos a tener en cuenta cuando varan el pH, la temperatura y el tipo de electrlito. A fuerza inica constante, la solubilidad de la protena aumenta cuando est en zonas cidas o alcalinas respecto a su punto isoelctrico. En soluciones diluidas las protenas son ms solubles a temperatura por encima de ; sin embargo, en soluciones concentradas el efecto puede ser el contrario. Las sales con valencia alta producen fuerzas inicas ms altas producen fuerzas inicas ms altas que las que tienen valencias bajas y por tanto son ms eficaces en la precipitacin de protenas. El uso del sulfato amnico en la purificacin enzimtica ha sido descrito por muchos autores. La extraccin de penicilinasa de E. coli W3310 (Melling y Scott 1972) es un ejemplo tpico. La precipitacin con sulfato amnico (20 % peso/volumen) de protenas no deseadas mejora la actividad especfica cuatro veces, y el aumento de la concentracin de sulfato amnico hasta un 56 % (p/v) para precipitar la penicilinasa da lugar a una purificacin global cinco veces superior, a la vez que reduce el volumen desde unos 60 litros a un peso de pasta de 2,4 kg. Solventes orgnicos . La adicin de solventes orgnicos a soluciones acuosas de protenas reduce la solubilidad de stas al reducir la constante dielctrica del medio. Cuando se van aadiendo cantidades crecientes de solventes orgnicos, las molculas de protena interaccionan ms con otras molculas de proteina que con el agua. La formacin de complejos entre molculas de protena de distinta carga contina hasta que se alcanza un punto en el que la proteina precipita, debido al decrecimiento de la constante dielctrica y por tanto al aumer de las fuerzas atractivas electrostticas entre las molculas de proteina de distinta carga (Green y Hughes, 1955). La adicin de sal a un medio acuso as que se ha aadido un solvente orgnico soluble aumenta la solubilidad de la protena. En presencia de solventes orgnicos, las temperaturas superiores a 4 C pueden dar lugar a la desnaturalizacin de las protenas, por lo que es deseable trabajar a una temperatura inferior a 0 C, lo que es factible por la depresin del punto de congelacin producida por los solventes orgnicos. Segn Green y Hughes (1955) los efectos de tos solventes orgnicos parecen deberse a otros factores distintos adems de a la modificacin de la constare dielctrica, y sugieren que el cambio del agua ligada a la por cma por molculas de los solventes orgnicos puede dar lugar a la solvatacin de la proteina. Como los solventes orgnicos utilizados deben ser miscibles con el agua se ha sugerido tambin que la protena pueda precipitar debido a la deshidratacin. Sin embargo, estos efectos son impredecibles y

probablemente dependan del grado de ionizacin de la protena, de tal forma que la presencia de muchos grupos cargados pudiera dar lugar posiblemente a la deshidratacin y la de pocos a lasolvatacin. Para precipitar las protenas pueden utilizarse varios solventes orgnicos, como el metanol, etanol y 2-propanol, que son los ms utilizados, aunque tambin se emplean la acetona o incluso el ter etlico. Estos ltimos tienen la grava desventaja de su gran inflamabilidad. Para trabajos de gran escala, la precipitacin y concentracin d e enzimas con solventes orgnicos no se utilizan ampliamente, porque aunque el grado de precisin en la precipitacin de protena sea alto, la naturaleza inflamable de los materiales junto con su costo relativamente elevado hacen este mtodo menos atractivo que otros. Una notable excepcin es el fraccionamiento del suero sanguneo, en el que a pesar de la introduccin de otras tcnicas, la precipitacin con etanol ha sido dominante desde su introduccin por Cohn et al. (1946), desarrollndose hasta alcanzar un alto grado de automatizacin (Foster y Watt, 1980). Polmeros de peso molecular elevado. Para el fraccionamiento de las protenas pueden utilizarse otros precipitantes orgnicos, como los polmeros solubles en agua, entre los que destaca el polietilenglicol por ser el ms usado, que tiene la ventaja de no ser txico, ni inflamable, y que no desnaturaliza a las protenas. Su modo de acin y aplicacin ha sido descrito por Kula et al. (1980), aunque no se utiliza mucho, excepto en la obtencin de hemo-derivados.

ADSORCIN. La adsorcin sobre materiales insolubles, por tandas, ha sido muy utili zada en los pasos preliminares de purificacin y concentracin de protenas. Se pueden usar para esto, tres tipos de materiales: resin as, dextranos sustituidos o agarosa y celulosas sustituidas. El principio de adsorcin que se aplica es habitualmente el del intercambio inico, pero con algunos materiales, como la celita o el hidroxiapatito, la adsorcin es inespecfica. Las resinas de intercambio inico, tales como los poliestirenos sulfonados, resultan en la prctica de poca utilidad para la adsorcin de protenas, porque su alto grado de sustitucin puede causar la desnaturalizacin. La excepcin a esto es su uso con protenas de punto isoelctrico particularmente alto, como el citocromo c. Se usan muchos materiales para intercambi o inico las celulosas sustituidas, los dextranos y las agarosas, aunque a gran escala tienden a resultar caras. Los materiales como la celita y el hidroxiapatito, aunque

interaccionan con las protenas de modo relativamente inespecfico son muy utilizadas debido a su bajo coste. El hidroxiapatito hace particularmente un buen servicio porque permite eluir de manera diferencial las muchas protenas que retiene, aumentando progresivamente la concentracin de fosfato. Adems, como el cloruro no interviene en el intercambio inico, s e puede realizar la adsorcin y la elucin a concentraciones de cloruro de hasta 1,0 M. Rara vez se utilizan en estos estadios del proceso los materiales que actan por afinidad, por razones de precio. Con la mayora de los materiales que hemos mencionado, las operaciones de adsorcin y elucin se suelen desarrollar por tandas, en vez de en columnas de cromatografa. Hay varias razones para hacerlo as y tienen que ver con la magnitud del volumen de extracto turbio que hay que procesar. Para empezar, est e l problema de la compresibilidad del material de adsorcin. La mayora de los materiales hechos a base de celulosa o agarosa y usados para intercambio inico, o p ara filtracin en geles en general, suelen ser geles poco rgidos, que se aplastan fcilmente. Por eso, cuando se ponen en una columna y se aplica una presin demasiado alta al tampn que corre a travs del gel, este puede llegar a comprimirse; esto har que el flujo transcurra de forma no uniforme, formndose canales, o lo que es peor, se bloquee. El nico mtodo efectivo de reducir la presin es reducir la velocidad de flujo, construir columnas muy cortas y gruesas, o bien operar con varias columnas cortas dispuestas en serie. Las columnas cortas y gruesas no suelen tener el mismo poder de resolucin que las columnas largas y estrechas, pero el mximo flujo que se puede conseguir con equipos de cromatografa como los que se usan en el laboratorio, es del orden de 30 mL/hora, lo que realmente no es suficientemente rpido para procesar volmenes de varios cientos de litros. El bajo grado de clarificacin que suelen tener los extractos, tampoco facilita el uso de las columnas de cromatografa, porque la capa superior del material de la columna se comporta como un filtro muy eficaz y muy fcil de atasca r. Por todo esto, cuando hay que tratar volmenes grandes de lquido con partculas en suspensin, no queda ms remedio que recurrir a un proceso por tandas, como solucin ms realista, a pesar del relativamente bajo grado de resolucin obtenible. Los materiales adsorbentes tpicos se aaden al extracto y despus de remover durante un rato, se sedimentan en una centrfuga basculante (o incluso en la secadora centrfuga domstica). El material adsorbente se resuspende a continuacin en un medio de fuerza inica mayor o de pH distinto, o las dos cosas, y se vuelve a centrifugar de nuevo. Con una centrfuga con capacidad para 40 litros, es factible el

procesado diario de hasta 2.000 litros. Durante el proceso de elucin, es ms eficaz dividir la cantidad total de lquido eluyente en dos o tres lotes, en vez de usarlo todo de una vez. A modo de compromiso, se puede realizar la adsorcin por tandas, y la elucin en columna. En resumen, la ganancia neta en este caso sera el tiempo que se ahorra y el inconveniente, una prdida en poder de resolucin.

Adsorbentes no especficos. El hidroxiapatito (HA) se ha usado durante muchos tiempos en tcnicas discontinuas para la purificacin de enzimas (Levin, 1959), y ya Swingle y Tiselius (1951) desarrollaron una columna cromatogrfica de HA. El mtodo ha ido ganando aceptacin lentamente entre los qumicos de las protenas, debido segn Bernardi (1971) a las razones siguientes: (a) La laboriosa preparacin del hidroxilapatito. (b) El desconocimiento de los mecanismos de interaccin entre las protenas y esta substancia. (c) La introduccin en 1956 por Petersen y Sober de intercambiadores basados en la celulosa. La preparacin a escala de laboratorio del hidroxilapatito cristalino ha sido descrita por varios autores (Tiselius et al. 1956, Main et al. 1959, Bernardi 1970, Arkinson et al. (1973) publicaron un mtodo sencillo y barato para producir hidroxilapatito a gran escala, con un tamao de cristal uniforme y que tena buenas velocidades de flujo y gran capacidad de adsorcin. Estos ltimos autores han comentado que el hidroxilapatito comercial es caro y frecuentemente poco fiable en lo que respecta a la estructura de cristales, la velocidad de flujo y la capacidad de adsorcin. Bernardi y Kawasaki propusieron un mecanismo de interaccin enter las protenas y el hidroxilapatito en 1968, en el que se relaciona la influencia de las estructuras secundaria y terciaria de las protenas con su comportamiento cromatogrfico. En Kawasaki y Bernardi (1970a,b) y Kawasaki (1970a,b), los parmetros que determinan la resolucin de las columnas de hidroxilapatito y las bases tericas de la cromatografa de macromolculas con estructura rgida. Bernardi (1971) considerra que la cromatografa en hidroxilapatito debera usarse como una herramienta adicional en la purificacin de protenas, puesto que la base de la separacin es diferente de la de los cambiadores de iones o de la filtracin en gel.

El mtodo (Arkinson et l. 1973) se basa en la conversin del fosfato de calcio (brushita) en hidroxilapatito por ebullicin en medio alcalino

No se conoce totalmente el mecanismo por el cual el hidroxilapatito separa las macromolculas. Sin embargo, se cree que los iones Ca 2+ y de la superficie de los cristales de hidroxilapatito contribuyen al fraccionamiento. Las protenas cidas y neutras podran unirse a los iones Ca 2+ del hidroxilapatito, aunque parece que ni los enlaces ni la elucin se ven afectados por la presencia de altas concentraciones de NaCl, KCl o CaCl 2 (Bernardi, 1971; Bernardi et al, 1972). La elucin de las protenas se lleva a cabo generalmente a bajas concentraciones de fosfato (30-120 mM) y a un pH de 6,8. Sin embargo, la adsorcin y elucin de las protenas b sicas, unidas a los grupos de los cristales de hidroxilapatito se ve muy afectada por la presencia de NaCl, KCl y CaCl 2 , y su elucin se realiza generalmente con estas sales y tampones fosfato cuya concentracin oscila entre 120 y 230 mM. Hay algunas excepciones a estas reglas, ya que por ejemplo, las fosfoprotenas requieren normalmente para su elucin altas concentraciones de fosfato (Bernardi et al. 1972), mientras que algunas protenas bsicas no se cluyen con CaCl 2 , incluso a concentraciones muy altas (Bernardi el al. 1982). Tambin Bernardi (1971) indic que las protenas bsicas se unan fuertemente a pH 6,8, mientras que los aminocidos bsicos se unan a pH 7,5. Atkinson el al. (1973) sealaron las propiedades de elucin impredecibles de las protenas cidas capaces de unirse a grupos fosfato, como por ejemplo las triptofanil-tRNA sintetasas de B. siearothermophilus y E. Coli. Estas protenas cidas, que no contenan grupos fosfato, podan adsorberse en hidroxilapatito en una solucin 1,0 M de NaCI y requeran 400 mM de fosfato a pH 6,8 para su elucin, condiciones comparables a las n ecesarias para eluir las protenas bsicas. Tambin se observ que la presencia de los cola dores unidos al enzima cambiaban el patrn de elucin en hidroxilapatito de la hidrofolato reductasa. El uso del hidroxilapatito a gran escala pra el aislamiento y purificacin de enzimas da buenos resultados, demostrando su utilidad para los qumicos de protenas. En una columna de 16 litros de hidroxilapatito cargada con 500 g de extracto de protenas de B. siearothermophilus , se separan sucesivamente seis enzimas: triosa fosfato isomerasa, gliceraldehido-3-fosfato

deshidrogenasa, NADH deshidrogenasa, y valil-, metionil- y triptofanil-tRNA sintetasas. La metionil-tRNA sintetasa presente en E coli EM 20031 (20 kg de bacterias, con 3,6 x 10 6 unidades de enzima) tambin se ha purificado en hidroxilapatito. con un rendimiento del 85 % y un aumento de la pureza de 12 veces (Bruton et al. 1975). Las valil- y tirosil-tRNA sintetasas, la rodanasa y la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de 1979). Celila. La celita es una tierra de diatomeas constituida principalmente por carbonato de calcio con algo de silicato. Este material se ha usado con xito en la purificacin de dos lactamasas de B. cereus (Davies et al., 1974). Los enzimas se adsorban directamente del sobrenadante del cultivo a p H 7 y se eluan al mismo pH con un tampn al mismo pH con un tampn tris-zinc-citrato-NaCl de fuerza inica elevada. Anteriormente se habia utilizado celita o polvo de vidrio (Miller et al, 1960, Kuwabarra, 1970) separndose slo la (pH 8,5). No est claro si la celita se puede utiliazar para purificar otros enzimas, aunque la purificacin de 20 veces obtenida con las penicilinasas sugiere que este material barato y fcilmente disponible merecera nuevas investigaciones. lactamasas, debido posiblemente al bajo pH usado en la adsorcin (pH 4,5) o al mayor pH utilizado en la elucin B. siearothermophilus tambin pueden separarse mediante cromatografa en hidroxilapatito (Atkinson el ai,

CROMATOGRAFA DE INTERACCIN HIDROFBICA (HIC) La cromatografa hidrofbica fue desarrollada a raz de la observacin de que algunas protenas eran retenidas inesperadamente en geles de afinidad que contenan brazos espaciadores hidrofbicos (Er-el et al., 1972, Shaltiel y Er-el 1973). Este hallazgo se aplic a la preparacin de familias de adsorbentes hidrofbicas utilizando cadenas hidrocarbonadas de series homologas de diferentes longitudes (Shaltiel, 1974). En la prct ica, la mayora de las protenas pueden purificarse satisfactoriamente utiliazando subsituyente C-8 o fenilo. La fase estacionaria son generalmente compuestos alifticos de distinta longitud de cadena (C4, C8, C16 etc) Elucin por gradiente (usando mezclas de agua y solventes orgnicos) Muy alta capacidad resolutiva (mezclando distintas propiedades fisicoquimicas)

FUNDAMENTO Las protenas se unen reversiblemente a ligandos hidrofbicos que se encuentran inmovilizados en el soporte cromatogrfico, debido a la presencia de una elevada concentracin de sal. La elucin se logra disminuyendo la fuerza inica en la fase mvil, formando un gradiente decreciente (Fausnaugh y Regnier, 1986). Las interacciones hidrofbicas son tanto mayores cuanto mayor sea la fuerza inica, por lo que la adsorcin a la matriz hidrofbica puede llevarse a cabo de forma adecuada despus de haber precipitado con sales o de haber realizado una cromatografa de intercambio inico. La elucin se puede corregir alterando la fuerza inica del solvente, el pH y la composicin, o usando un modificador de la constante dielctrica, com el etanodiol. La eficacia de las diferentes sales para promover la interaccin hidrofbica vara, y tanto los aniones como los cationes se pueden ordenar en series solubicas dependiendo de si promueven las interacciones hidrofbicas (efecto de salado) o rompen la estructura del agua (efecto caotrpico) y dan lugar a un debilitamiento de las interacciones hidrofbicas (Hjer ten et al., 1974)

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA Uno de los avances ms significativos de estos ltimos aos en el campo de la cromatografa ha sido el de la introduccin de la cromatofrafa lquida de alta eficacia. Originalmente esta tcnica se dise para separar pequeas molculas orgnicas solubles en solventes no acuosos, aunque rpidamente se adeciu para la separacin de compuestos biolgicos de mayor tamao, solubles en agua. En los ltimos aos, y debido al desarrollo de los soportes ms porosos, la tcnica se puede aplicar a molculas grandes como las protenas y los cidos nucleicos (Hancok y Sparrow, 1983; Hearb, 1982; Scobe, 1983). La alta eficacia de las columnas de HPLC se deriva del pequeo tamao de sus partculas, cuyos dimetros oscilan entre 5 y 50 , una dcima parte del

dimetro de las de los geles blandos elsticos. Este pequeo tamao necesita presiones altas para obtener velocidades de flujo adecuadas, por lo que las partculas deben ser muy rgidas. Inicialmente se utilizaba slice pero la superficie de sus partculas no interacciona adecuadamente con las protenas. Sin embargo, la slice puede derivatizarse por reaccin con monocloro - o monoalcoxisila-nos para dar superficies hidrofilicas ms afines para las protenas. La qumica de los soportes de slice con superficie modifica da ha sido extensamente revisada (por ejemplo por Majors. 1981 y Unger. 1978). La fase mvil es lquida. Particin o reparto Adsorcin Intercambio inico Exclusin molecular CARACTERSTICAS Y VENTAJAS DE HPLC Trabaja con partculas muy pequeas (< 10 mm). Presiones de 1000 - 6000 psi ( pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7). Rpida. Picos angostos (alta eficiencia). Separa compuestos no-voltiles o trmicamente inestables.

ESQUEMA DEL EQUIPO DE HPLC

Una de las principales desventajas de la slice es que es inestable a un pH por encima de 7-8, lo que ha dado lugar al desarrollo de soportes polimricos rgidos, que tienen un mayor rango de estabilidad frente al pH (por ejemplo Mono Q, Pharmacia; TSK-PW, Toyo Soda Co. Ltd) y que han demostrado ser particularmente tiles en la cromatografa de intercambio inico de alta eficacia. Todas las tcnicas cromatogrficas habituales, filtracin en gel. intercambio inico, cromatografa de afinidad o hidrofbica existen tambin en versiones HPLC (Regnier y Gooding, 1980; Regnier. 1982; Pearson et al, 1982; Larsson et al, 1983). Sin embargo, la mayora de las aplicaciones de la HPLC descritas para purificar protenas se limitan a trabajar a pequea escala. As. se pueden separar y purificar cantidades del orden de de angiotensinasa mediante cromatografa de intercambio inico de alta eficacia (Dizdaroglu et al, 1982). o incluso en la leche, cantidades de ng de hormona liberadora de la hormona luteinizante mediante cromatografa en fase reversa (Amarani et al, 1982). Sin embargo, se han aislado mg de hexoquinasa de cerebro mediante cromatografa de intercambio inico de alta eficacia (Polakis y Wilson, 1982). y se ha purificado la lactato deshidrogenasa mediante cromatografa liquida de alta eficacia, aunque en escala de mg (Small et al. 1983). La HPLC tiene un considerable potencial de aumento de escala, puesto que adems de usar columnas ms largas, la tcnica puede

automatizarse fcilmente, repitiendo la inyeccin de la muestra en la misma columna.

SEPARACIN EN DOS FASES LQUIDAS. Esta es una reciente adquisicin dentro de la coleccin de recursos con que cuenta el qumico de protenas. Tiene dos grandes ventajas potenciales, la fcil separacin de protenas por un lado y paredes celulares y residuos semisolubles por otro, y la posibilidad de funcionar en continuo. El principio de esta tcnica se fundamenta en la observacin de que al poner en contacto una solucin de protenas con una mezcla de dos polmeros inmiscibles, los dos polmeros se separan en fases distintas y las protenas quedan selectivamente repartidas entre una fase y la otra. La razn de esta separacin de los polmeros en fases y de la adsorcin selectiva de las protenas, est en las caractersticas fsicas de las molculas implicadas; las molculas idnticas o similares tienen mayor tendencia a agregarse entre s, que a hacerlo con molculas diferentes. Un sistema de dos fases tpico podra estar constituido por una mezcla de polietilenglicol (PEG) y dextrano, o quizs, polietilen-glicol y sulfato amnico. La fase en la que se localice una determinada protena depender de su propio peso molecular, del peso molecular y concentracin de los polmeros, as como de la temperatura, et pH y la fuerza inica. La seleccin de las condiciones apropiadas se hace de forma totalmente emprica. Una vez mezclados los ingredientes, la separacin en fases se realiza por decantacin o centrifugacin (posib lemente en continuo). Varios casos de aplicacin de esta tcnica han sido citados. Uno de ellos es el de la separacin y purificacin de pululanasa (pululan -6-glucan hidrolasa) y de 1,4- -glucan fosforilasa a partir de Klebsiella pneumoniae (Hustedt et ai, 1978, ver tambin Kula, 1979). Los restos celulares fueron separados de la pululanasa en una mezcla de polietilen-glicol y dextrano, siendo despus eliminados los polmeros mediante una combinacin de dilisis y filtracin; el enzima fue precipitado con bromuro de N-cetil N,N,N-trimetil amonio para dar una preparacin con el 80 % de pureza y un 70 % de rendimiento. Los restos celulares y la fosforilasa, que quedan en la fase de dextrano inicial, pasan a separarse en un nuevo sistema de polietilen-glicol y dextrano. Los sistemas en dos fases acuosas pueden formarse mezcland o soluciones de polietilenglicol y dextrano o polietilenglicol y ciertas sales, especialmente sulfato amnico o fosfato potsico. Las protenas y los restos celulares se

reparten entre las dos fases, de tal manera que la localizacin exacta de una protena en particular depende de parmetros tales como su peso molecular, el pH y la fuerza inica de la mezcla y la presencia de iones polivalentes (Kula, 1979). Desgraciadamente las condiciones ptimas de reparto de cada protena deben establecerse empricamente. Los sistemas en dos fases pueden aplicarse para eliminar eficazmente los restos de clulas de homogeneizados purificacin. En algunos casos las dos fases pueden separarse en un tanque de sedimentacin, aunque se puede conseguir una separacin ms rpida y eficaz mediante centrifugacin. Como con frecuencia es ms fcil separar lquidos de diferente densidad que slidos de lquidos, parti cularmente a gran escala, esta tcnica puede ser ventajosa en la preparacin de enzimas a gran escala (Kroner et ai, 1978). Sin embargo, a pesar de las aparentes ventajas del reparto en fase acuosa, rara vez se utiliza, debido quizs al costo del dextrano y del polietilenglicol (no recuperables) empleados, aunque un reciente informe sugiere que se puede emplear dextrano bruto, con un considerable ahorro en los costos (Kroner et al, 1982). La separacin en dos fases se ha utilizado para separar y purificar a gran escala pululan-6-glucan hidrolasa y 1,4- -glucan fosforilasa a partir de pasta (5 kg) de clulas de Klebsiella pneumoniae (Hustedt et al., 1978), y RNA poli-merasa y glutamina sintetasa de E . coli (Takahashi y Adachi, 1982). Acoplando un ligando al polietilenglicol se puede aumentar el coeficiente de reparto de una protena en favor de la fase polietilenglicol. As, utilizando azul de Cibacrn se puede conseguir una purificacin 58 veces superior en dos etapas de la fosfofructoquinasa de levadura (Koperschalager y Johansson, 1982). consiguiendo al mismo tiempo un cierto grado de

PRODUCCION DE ENZIMAS