Manual Bac Term Um

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ASIGNATURA:
BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO
ELABORARON: M.C. MARIA DEL ROCIO VILLA GONZALEZ MVZ. ERICK CECILIO FERNANDEZ MENESES. M.C. CARLOS GERARDO CASTILLO SOSA
OTOO 2012
Tecamachalco, Pue.
Bacteriologa y Micologa Veterinaria - Prcticas
CONTENIDO
Pag I. Plan institucional de desarrollo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia II. III. IV. V. VI. Introduccin Ubicacin de la asignatura en el mapa curricular Nivel de desempeo Mapa del sistema de practicas Practicas generales de seguridad, reglamentos y 6 10 15 24 28 33 37 44 53 62 68 76 81 90 91 1 2 3 4 5
procedimientos generales Practica 1: Conocimiento, manejo del material y aparatos del laboratorio Prctica 2: Tincin de Gram Prctica 3: Tincin de Bacterias cido alcohol Resistente Prctica 4: Tincin de cpsula Prctica 5: Tincin de esporas Practica 6: Esterilizacin y Desinfeccin Prctica 7: Preparacin de medios de cultivo Prctica 8: Siembra en medios de Cultivo Prctica 9: Metabolismo Bacteriano Prctica 10: Morfologa celular Prctica 11: Susceptibilidad a Quimioteraputicos Prctica 12: Toma y Envo de Muestras Prctica 13: Diagnstico Bacteriolgico Bibliografa
VII.
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I.
PLAN INSTITUCIONAL DE DESARROLLO DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MISIN
Formar Mdicos Veterinarios Zootecnistas que coadyuven a la sustentabilidad de los sistemas de produccin, bienestar, salud animal y salud pblica, con un enfoque integral, innovador y humanista basado en el desarrollo de conocimientos, habilidades, actitudes y valores adquiridos con base en las necesidades del contexto en el que se desarrolla.
VISIN
Ser un programa educativo acreditado y reconocido que de respuesta a las necesidades del entorno regional, nacional e internacional. Tener una planta acadmica con postgrado, especializada o certificada, lneas de investigacin pertinentes, intercambios que fortalezcan la movilidad estudiantil y docente, adems de contar con infraestructura y tecnologa de punta. El programa ser ampliamente aceptado y reconocido socialmente, evidencia dada por la aceptacin de los egresados en el mbito laboral, y su insercin en procesos de desarrollo comunitario.
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II.
INTRODUCCION
El presente Manual de Prcticas de Bacteriologa surge como una necesidad de contar con un material didctico que sirva de apoyo para el estudiante de la licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla y pretende ser una gua prctica en su Trabajo de Laboratorio, cabe mencionar que las prcticas aqu propuestas fueron revisadas, analizadas, modificadas y adaptadas a las condiciones que exige nuestro programa de estudios y a la infraestructura propia de nuestra Universidad. En este Manual se han diseado una serie de prcticas, las cuales sern realizadas en el transcurso del cuatrimestre y obedeciendo al programa de estudios vigente de la materia en la Unidad Acadmica, que abarcan desde la morfologa bacteriana hasta las pruebas bioqumicas caractersticas que permiten dar un diagnstico confirmativo, vinculando as la Teora con la Prctica. Queremos puntualizar que cualquier material didctico por s solo no representa un medio eficaz para la adquisicin, comprensin y aplicacin de los conocimientos, sino que mucho depende de la forma, el orden y la disciplina con el que sea manejado. Entonces invitamos a ALUMNOS-PROFESOR DE LA MATERIA, PROFESOR DE LABORATORIO Y TODOS LOS QUE LABORAN EN ESTE DEPARTAMENTO a que con juntemos nuestros esfuerzos para que este Manual cumpla con el objetivo para el cual fue creado. Esperamos que despus de haber trabajado con este manual realicemos las crticas constructivas pertinentes que permitan mejorarlo. PONGAMOS NUESTRO MAYOR ESFUERZO PARA CONJUNTEMOS UN MISMO OBJETIVO TRABAJO QUE TODOS
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III.
UBICACIN CURRICULAR.
DE
LA
ASIGNATURA UNA HOJA
EN EN
EL
MAPA Y
DEJAR
BLANCO
NOSOTROS (SECRETARIA ACADMICA LA INCLUYE)

Periodo Escolar No CODIGO NOMBRE DE LA ASIGNATURA HT/HP por periodo NIVEL BSICO 2) rea de: Bsicas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HT/HP por semana Total de Crditos por rea Requisitos
MVZM-001 MVZM-002 MVZM-003 MVZM-004 MVZM-005 MVZM-006 MVZM-007 MVZM-008 MVZM-009 MVZM-010 MVZM-011 MVZM-012 MVZM-013 MVZM-014 MVZM-015
Biologa Celular Veterinaria Etologa y Manejo Animal Anatoma Veterinaria Comparada Metodologa de la Investigacin Veterinaria Fisiologa Aplicada Veterinaria Bioqumica Aplicada Veterinaria Morfologa Veterinaria Inmunologa Veterinaria Biologa Tisular Veterinaria Bacteriologa y Micologa Veterinaria Parasitologa Veterinaria Virologa Veterinaria Farmacologa y Toxicologa Veterinaria Bioestadstica Veterinaria Endocrinologa de la Reproduccin Veterinaria
80 80 80 32 80 64 80 64 80 80 80 64 80 64 64
5 5 5 2 5 4 5 4 5 5 5 4 5 4 4
5 5 5 2 5 4 5 4 5 5 5 4 5 4 4
SR SR SR SR SR SR Anatoma Veterinaria Comparada SR SR SR SR SR SR SR SR
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IV.
NIVEL 1 NIVEL 2
NIVEL DE DESEMPEO
Se realizan funciones rutinarias de baja complejidad. Se reciben instrucciones. Se requiere de baja autonoma Se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo, variadas y aplicadas en diversos contextos. Algunas actividades son complejas y no rutinarias. Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonoma en las decisiones. A menudo requiere de colaboracin con otros y trabajo en equipo.
NIVEL 3
Se requiere un importante nivel de toma de decisiones. Tiene bajo su responsabilidad recursos materiales con los que opera su rea, as como control de recursos financieros para adquisicin de insumos.
NIVEL 4
Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses.
NIVEL 5
Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo. Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar un alto nivel de creatividad, as como buscar y lograr la cooperacin entre grupos e individuos que participan en la implantacin de un problema de magnitud institucional.
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V.
MAPA DEL SISTEMA DE PRCTICAS

Tema Prctica
CONOCIMIENTO Y MANEJO DEL MATERIAL TINCION DE GRAM TINCION DE BACTERIAS ACIDO ALCOHOL RESISTENTE TINCION DE DE CAPSULA TINCION DE ESPORAS PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO MORFOLOGIA COLONIAL METABOLISMO BACTERIANO SUSCEPTIBILIDAD QUIMIOTERAPEUTICOS A
mbito de desarrollo Laboratorio
Semana 3
UNIDAD I GENERALIDADES
UNIDAD II MORFOLOGA Y TAXONOMA.
Laboratorio
4y5
UNIDAD III NUTRICION Y CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO
7,8y9 Laboratorio
UNIDAD V ACCION AGENTES ANTIMICROBIANOS UNIDAD VI. DE LOS
Laboratorio
10
ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN UNIDAD COLECCIN ENVIO MUESTRAS. UNIDAD GNEROS BACTERIANOS MICTICOS INTERS VETERINARIO Y DE VIII. Y DE IX.
ESTERILIZACON DESINFECCION
Laboratorio
TOMA Y MUESTRAS
ENVIO
DE
Laboratorio Y Posta Zootcnica
11
DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO
Laboratorio
12
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VI.
PRACTICAS GENERALES DE SEGURIDAD, REGLAMENTOS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES
REGLAMENTO INTERNO PARA LOS PARTICIPANTES

1. 2. Se prohbe estrictamente la entrada al laboratorio sin bata. Portar el protocolo de la prctica y conocer el tema as como el procedimiento de la misma. 3. 4. No se permitir la entrada 10 minutos despus de iniciada la prctica. El equipo que no traiga material que se solicit para la prctica, NO la podr realizar. 5. 6. 7. 8. 9. Una vez iniciada la practica, no se permitir la salida del laboratorio. Se prohbe ingerir alimentos, fumar y hacer desorden. Se prohbe usar telfono celular durante la prctica. Solamente se prestara material con vale y credencial de la Facultad. Todos los integrantes de cada equipo de trabajo, se harn responsables del material que se les entregue para la prctica. 10. Todo material deteriorado o destruido por descuido o intransigencia, deber ser reemplazado a la mayor brevedad posible (durante el periodo escolar que se este cursando), de lo contrario se le suspender el desarrollo a prcticas en el Laboratorio hasta su reposicin. 11. Al trmino de la prctica, se deber dejar el material y la mesa limpia para que sea devuelto el vale y la credencial de prstamo de material. 12. El reporte de la prctica se entregar 8 das despus de su realizacin. 13. Cada prctica, ser realizada en hora y fecha preestablecida, salvo previo aviso para su suspensin. 14. No se repondrn prcticas. 15. No ingresar a personas ajenas al grupo y a la prctica. 16. Toda actividad y actitud estar sujeta a evaluacin por parte del profesor y/o personal de apoyo acadmico.
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17. De no apegarse a las disposiciones y reglas del presente reglamento puede ser motivo de sancin. El incumplimiento y la reincidencia puede ser motivo de expulsin temporal o definitiva del laboratorio.
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. El alumno ingresar al laboratorio con bata, la cual deber ser blanca y de manga larga. Es indispensable portar la bata abotonada y guardar el comportamiento apropiado durante la estancia. 2. El alumno se familiarizar con los sitios en donde se encuentran localizadas las regaderas, extinguidores, botes de basura. 3. En ningn momento se permitir la aplicacin de cosmticos, fumar, ingerir alimentos o ambos dentro del laboratorio. 4. Limpiar con desinfectante las mesas de trabajo antes y despus de cada
prctica, as tambin durante la prctica si se ha derramado un reactivo o muestra biolgica. 5. Para evitar quemaduras se debern apagar mecheros, planchas calientes o ambos, cuando stos no se utilicen. As tambin se debern emplear gradillas o pinzas para sostener o transportar tubos calientes. 6. Mantener las sustancias qumicas inflamables alejadas del fuego, planchas calientes o ambos. 7. No deber olfatear, probar reactivos o ambos, o las soluciones, no se debe mirar nunca el interior de un tubo de ensaye que se est calentando, ni apuntar hacia alguna persona porque el contenido podra proyectarse en cualquier momento. La misma precaucin debe tomarse cuando se mezclan reactivos o se agiten vigorosamente los tubos. 8. Utilizar gafas de seguridad cuando se manejen cidos, hielo seco o sustancias desconocidas. 9. Utilizar pipetores o perillas de goma para la medicin de los lquidos corrosivos, cidos, bases, sustancias voltiles, venenos, entre otros. No aspirar con la boca.
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10. Evitar agregar agua sobre cidos para evitar quemaduras por proyeccin. Para diluir cualquier cido, se vierte el cido sobre el agua y NUNCA agua sobre cido. Emplear bao de hielo o bao de agua fra para preparar diluciones diluidas de cidos. 11. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames. 12. Lavarse las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio. 13. Reportar inmediatamente el profesor del laboratorio cualquier accidente o lesin que suceda para que se tomen las medidas apropiadas.
ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE

1. En caso de que exista contacto de cidos o bases con la piel, ojo o boca, se recomienda enjuagar el rea con abundante agua con el propsito de disminuir su accin por dilucin, para ello existen en el laboratorio las tarjas, regaderas y lavaojos. 2. En caso de ingestin de corrosivos, NUNCA provocar vmito. Si existe ingestin de cidos hacer beber inmediatamente una solucin de bicarbonato de sodio (dos cucharadas soperas en dos vasos de agua); en caso de soluciones custicas (hidrxido de sodio p potasio), ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml. De jugo de limn en agua. 3. Si existe derramamiento de un cido, neutralizar agregar bicarbonato de sodio y en caso de bases agregar cido actico (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza. 4. Al ingerir otras sustancias qumicas, hacer vomitar a la persona accidentada, vigilar que exista una ventilacin adecuada y mantener las vas areas permeables mientras se traslada al hospital. 5. En caso necesario llamar a los telfonos de emergencia 066.
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RECOMENDACIONES PARA TENER XITO EN LAS PRCTICAS

1. El alumno leer la prctica completa y la discutir con el profesor entes de la realizacin de la misma. 2. Los tiles y aspectos personales debern ser colocados en el lugar indicado. 3. El asa bacteriolgica deber estar estril antes y despus de la prctica. 4. Antes de preparar las mezclas de reaccin, etiquetar apropiadamente cada uno de los tubos con marcador indeleble. 5. Por ningn motivo alterar el orden de adicin de reactivos de la prctica. 6. Utilizar agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar agua. 7. Mantener los frascos de reactivos tapados, para evitar contaminacin, evaporacin de los mismos o ambos. 8. Utilizar solo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los mismos. 9. Evitar regresar excedentes de reactivos al frasco de donde se extrajo el mismo.
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PRCTICA No. 1
CONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO Y MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno conocer el material bsico y su empleo en el laboratorio de bacteriologa. Conocer las medidas de seguridad que se deben de guardar al trabajar en un laboratorio de bacteriologa, para evitar accidentes.
INTRODUCCIN El xito de los procedimientos de laboratorio para proporcionar datos que conduzcan al diagnstico exacto de una enfermedad depende de muchos factores. Los tres mas importantes son: 1) seleccin y conservacin de un nmero adecuado de muestras tomadas aspticamente de los sitios anatmicos ms convenientes durante el estadio adecuado de la enfermedad, para el aislamiento o demostracin del o de los patgenos, 2) toma de muestras de suero sanguneo al tiempo en que el ttulo de anticuerpos es adecuado para el diagnstico y 3). el conocimiento y la habilidad de los laboratoristas quienes deben seleccionar los procedimientos adecuados por su experiencia en enfermedades similares bajo sospecha y el poderlos aplicar con las precauciones y controles adecuados. Los laboratoristas debern tener plena confianza en sus equipos. medios de cultivo, cultivos celulares, animales de laboratorio y embriones de pollo, as como en sus reactivos, soluciones, antgenos, antisueros y colorantes. Para que esta confianza sea permanente, es necesario que se ejerza un estricto control de calidad y de esterilidad microbiolgica Adems el laboratorio como institucin deber actualizar frecuentemente a su personal, mantener un inventario
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fcilmente disponible de materiales y probar regularmente todo el equipo. El viejo adagio Lo que bien comienza bien acaba se aplica perfectamente al trabajo de laboratorio. Sin embargo, el precio que hay que pagar por el xito es una constante preparacin y atencin a los pequeos detalles. Existen muchas trampas, en la que caen los incautos. Se pueden obtener resultados falsos e intiles si los materiales y equipos no han sido esterilizados adecuadamente. Los cultivos celulares y de microorganismos, pueden inhibirse o destruirse si la cristalera, los tapones y los medios de cultivo se contaminan con detergentes o restos de compuestos txicos; las placas y los efectos citopticos observados en los cultivos celulares pueden deberse a las infecciones latentes que pueden reactivarse, los cultivos puros se pueden contaminar y en los pases subsecuentes se pueden perder por el crecimiento de los microorganismos contaminantes, cuando los antisueros para diagnstico se preparan en animales que no han sido convenientemente probados, pueden contener anticuerpos contra otros antgenos que no fueron inoculados y dar reacciones que resultan en diagnsticos equivocados. Cuando se hacen tinciones pueden aparecer artificios que se confunden con bacterias, hongos o cuerpos de inclusin. Verdaderos desastres ocurren por accidentes o por descuido en las medidas de seguridad en el laboratorio de bacteriologa, as pues, se pueden infectar los propios laboratoristas, se pueden escapar los agentes infecciosos e infectar a los animales de la vecindad y las enfermedades se pueden diseminar por medio de productos biolgicos contaminados. Otro desastre potencial puede ocurrir por la incapacidad de reconocer o sospechar de una enfermedad extica a tiempo para evitar su diseminacin. Para el clnico de campo y el laboratorista, una historia clnica adecuada y la informacin acerca de las enfermedades que afectan a la poblacin animal bajo estudio, son de gran ayuda en la evaluacin primaria de la enfermedad que se trata de diagnosticar.
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MEDIDAS DE SEGURIDAD
Todos los laboratorios de microbiologa deben extremar las precauciones al trabajar con agentes infecciosos para evitar una o ms de las siguientes eventualidades: 1) infeccin accidental o contaminacin cruzada dentro del laboratorio que nulificara o confundira los resultados experimentales. 2) contaminacin o diseminacin de la infeccin a granjas adyacentes, comunidades o zonas amplias 3) infeccin del personal del laboratorio; y 4) difusin de la infeccin a travs de la liberacin de productos biolgicos. Probablemente todos los laboratorios de microbiologa han sufrido contaminacin cruzada, ya sea como contaminaciones mezcladas en los cultivos bacterianos, o como infecciones indeseadas o mixtas en animales y cultivos celulares. Los reajustes para corregir estas faltas son muy costosos y causan prdidas de tiempo. Centraremos nuestra atencin a las medidas de seguridad que se aplican en un laboratorio por las necesidades presentes. La desinfeccin de las mesas o rea de laboratorio pueden incluir todas o algunas de las medidas siguientes, de acuerdo al agente infeccioso involucrado: 1. Lavado con agua corriente para desechar excretas, restos de alimento y polvo; 2. Cepillado de toda el rea con solucin detergente; 3. Enjuague del detergente; 4. Aplicacin de aerosoles de un desinfectante adecuado para el germen o inundacin del piso con desinfectante si se considera necesario; 5. Desinfeccin y desalojo de objetos innecesarios; 6. Enjuague del desinfectante
En el caso de agentes infecciosos de gran peligro para la salud humana, se puede iniciar el procedimiento con la esterilizacin gaseosa. El vapor de formaldehdo es un desinfectante econmico y prctico que puede usarse en habitaciones y gabinetes cerrados.
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Las manipulaciones de las agujas para inoculacin, las asas bacteriolgicas, las pipetas, las jeringas, las centrfugas, producen partculas de aerosoles cargadas con virus y bacterias que pueden ser inhaladas e infectarte, por lo que antes y despus de su uso deben de ser esterilizadas. Por lo que se recomiendan las siguientes tcnicas generales para todos los microorganismos. Mantener el rea de trabajo limpia y ordenada y que ofrezca proteccin si hay derrames o goteo de microorganismos. Desinfectar el rea de trabajo y desinfectar o esterilizar todos los equipos que entraron en contacto con microorganismos o que potencialmente estn contaminados. Es una buena prctica al volver a esterilizar los objetos que estuvieron en el rea de trabajo, aun cuando no se hayan utilizado, antes de colocarlos en el rea de materiales estriles. Etiquetar claramente todas las preparaciones. El material que se va a congelar deber guardarse en envases que resistan la congelacin y descongelacin ya que es difcil desinfectar los congeladores. Siempre que sea posible, los tubos o matraces que contengan material infeccioso debern ser trasladados de tal forma que el fondo descanse sobre la palma de la mano. El traslado de material infeccioso hacia las reas de depsito deber ser con mucho cuidado. Utilizar bata y guantes de hule cuando se manipule material infeccioso. Desinfectar todas las partes expuestas al final de la operacin. Evitar pipetear directamente con la boca cualquier material infeccioso o txico. Se usarn slo pipetas con tapn de algodn. Nunca soplar lquidos contaminados que queden como remanentes en las pipetas. Antes de centrifugar, revisar los tubos para detectar cualquier fisura en ellos. Utilizar nicamente jeringas que sellen sobre la cabeza de la aguja.
PARTICULARIDADES La bata ser la vestimenta de proteccin que utilizars en ste laboratorio

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Desinfectars cada da de prctica la cubierta de las mesas. El espacio fsico y todo lo utilizado durante la prctica lo dejarn LIMPIO (en el caso de cultivos bacterianos los depositars en el rea de material y medios contaminados) y ORDENADO.
Con el propsito de evitar accidentes en este Laboratorio todo alumno que conscientemente o por negligencia no acate la normatividad estipulada ser sancionado con la suspensin de la entrada al mismo.
CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participacin en la practica Puntualidad Presentacin (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________
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PRCTICA No. 2 TINCIN DE GRAM RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRCTICA: 20 ALUMNOS
En equipos de 3 a 4 alumnos.
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno realizar la tcnica de tincin de Gram con la modificacin de Reed. Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. Explicar las diferencias estructurales de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
INTRODUCCIN En 1884 el mdico Dans, Christian Gram, desarroll un mtodo de tincin que lleva su nombre y que es de valiosa utilidad en cualquier Laboratorio de Bacteriologa. La tcnica, adems de revelar detalles referentes a la forma y agrupacin bacterianas como cualquier otra tcnica de tincin, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS. Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de peptidoglicano responsable de la rigidez caracterstica de la pared. Sin embargo, existen diferencias estructurales en lo que respecta a las capas ms externas. As en las Gram Negativas, existe una membrana externa cuya constitucin qumica es similar a la de cualquier otra membrana biolgica (fosfolpidos y protenas) pero que posee adems un alto contenido de lipopolisacridos (endotoxina). Durante el proceso de tincin, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas, toman el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las bacterias Gram positivas sufren una deshidratacin
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que impide la salida del colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la membrana externa, incrementando as su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario. Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fcilmente en las bacterias Gram positivas debido a la deshidratacin de su pared; adems de que estas bacterias quedaron previamente teidas con el colorante primario. Por el contrario las bacterias GRAM (-) se tien fcilmente con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram (+) se tien de color violeta y las Gram (-) de rojo. La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificacin de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de Gram no es de utilidad taxonmica, por ejemplo: las espiroquetas, los micoplasmas, las micobacterias, las clamidias y las riquetsias. El mtodo de la tincin de Gram ha sufrido varias modificaciones y algunas de estas son incluso mejores que el mtodo original. Los objetivos principales para modificar la tincin han sido: 1. Obtener un colorante primario ms estable que el original, ya que este se deteriora rpidamente. 2. Reducir el tiempo requerido para completar la tcnica. En esta prctica se utilizar la tcnica de tincin de Gram modificada por Reed, la cual cumple con los objetivos antes sealados. MATERIAL. Laminillas Lpiz graso Asa bacteriolgica (Asa) Microscopio Mechero Bunsen Aceite de Inmersin Cultivo de bacterias en medio lquido y slido Agua destilada Colorantes para la tincin de Gram.
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PREPARACIN DE UN FROTIS FIJO PARA TINCIN. Antes de teir, se debe fijar el material que se va a observar. Los portaobjetos o laminillas que se empleen para realizar las extensiones deben estar limpios y bien marcados para su identificacin y para la delimitacin del rea en que hay que colocar la muestra, el portaobjetos puede dividirse en varias secciones con un lpiz graso y colocar varias extensiones en una misma laminilla, a condicin de que todas se vayan a teir de la misma manera. PROCEDIMIENTO: La tcnica para realiza el frotis bacteriano es variable, si el cultivo se encuentra en medio slido se proceder a colocar una gota de agua destilada en el portaobjetos y con el asa se tomar una asada del cultivo, se mezclar bien. Si el cultivo se encuentra en medio lquido, tomar con el asa una pequea gota de este cultivo, colocarlo en el portaobjetos y se extiende. Al extender la gota sobre el portaobjetos formar una capa fina, frotis demasiado gruesos NO SIRVEN. Secar los portaobjetos al aire o mantenindolos sobre la llama del mechero de Bunsen. Cuando se haya secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama del mechero con la cepa hacia arriba, teniendo cuidado de no aplicar el calor en forma excesiva ya que estropeara la morfologa normal y la estructura de los microorganismos que se van a teir. (Ver la figura 2) No es el nico mtodo de fijacin, pero este ser el utilizado en el transcurso de estas prcticas. NOTA: Es importante recordar que la fijacin por calor puede no matar las bacterias, por lo que todas las laminillas deben de ser tratadas con el respeto y precaucin inherentes a todo objeto presuntamente patgeno. Existen algunas variantes que pueden afectar los resultados de la tincin de Gram, por ejemplo: a) Las bacterias en los cultivos viejos (ms de 24 Horas de incubacin) liberan enzimas por auto lisis. Estas atacan a la pared celular de las bacterias y
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modifican sus propiedades estructurales, propiciando que las bacterias Gram positivas se tian de rojo. Esta misma situacin se puede presentar al observar frotis directo de los tejidos de animales infectados. b) Una decoloracin excesiva puede ocasionar que las bacterias Gram positivas se tian de rojo. c) Una decoloracin deficiente puede ocasionar que las bacterias Gram (-) se tian de violeta. d) Los frotis gruesos pueden teirse irregularmente.
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Medio slido
Medio lquido
Fig. 2 Preparacin de un frotis fijo para tincin.
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1 Cubre el frotis con la solucin de cristal violeta (colorante primario). Cubrir el rea del frotis, una o dos gotas son suficientes. Agregar una cantidad igual bicarbonato de de la solucin de sodio, la cual
alcaliniza y acelera la tincin de las clulas. Deja actuar esta mezcla por 15 segundos
Lava con agua corriente (de la llave) a chorro de agua. Sacude la laminilla para eliminar las gotas gruesas de agua.
2 Aplicar la solucin de Iodo (Lugol, mordente) y djala actuar durante 15 segundos
Lava con agua corriente de la llave. Sacude el frotis
Procedimiento para la tcnica de GRAM
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3 Aplicar el Alcohol-Acetona (Agente decolorante) segundos durante 3 a 5
Lava nuevamente con agua de la llave. Sacude la laminilla
4 Agrega
la
Fucsina
bsica
(colorante de contraste) y djala actuar durante 15 segundos.
Lava con agua corriente de la llave
Seca el frotis por presin con una toalla absorbente o al aire, y observa al microscopio con el objetivo de inmersin (100X)
RECUERDA!, las bacterias Gram (+) se tien de color violeta mientras que las Gram (-) de rojo .
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PRUEBA DE HIDRXIDO DE POTASIO (KOH) AL 3% La prueba de KOH al 3% nos permite ratificar los resultados de la tincin de Gram. Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3% y con el asa hacer en ella una suspensin de colonias de la bacteria problema, mezclando con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos. Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, esto indica que se trata de bacterias Gram (-). Si la hebra no se forma, se trata entonces de bacterias Gram (+). (Ver la siguiente figura)
Gram Negativas; al separar el asa de la mezcla queda entre ellas una hebra viscosa dentro de los 60 segundos a 3 minutos.
Gram positivas no existe dicha viscosidad
Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente: 1) Cul fue la reaccin al mtodo de Gram de cada uno de los microorganismos con que trabajaste? 2) Qu morfologa presentaban? 3) Cul es la utilidad diagnostica de la tcnica de Gram? 4) Comparar los tamaos levaduras. 5) Identificar las formas y agrupaciones de las bacterias 6) Dibuja y colorea tus observaciones de diferentes bacterias entre s y con las
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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
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PRCTICA No. 3 TINCIN PARA BACTERIAS CIDO-ALCOHOL RESISTENTES (B A A R)
RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRCTICA: 20 ALUMNOS
PROPOSITOS ESPECIFICOS: Realizar la tcnica de tincin de Zielhl-Neelsen para teir frotis fijos a partir de cultivos bacterianos. Distinguir las bacterias cido-alcohol resistentes de las no cidoalcohol resistentes. Conocer las caractersticas estructurales de la pared celular de las bacterias cido alcohol resistentes.
INTRODUCCIN: Las bacterias
cido
alcohol
resistentes
forman
un
grupo
de
microorganismos se definen con base en sus propiedades tintoriales. Son relativamente impermeables a los colorantes bsicos, pero una vez teidos retienen el colorante con tenacidad, resistiendo la decoloracin con solventes orgnicos acidificados (por ejemplo alcohol-cido). La cido-alcohol resistencia est determinada por la composicin de la pared celular, la cual adems de contener peptidoglicano est constituda por un alto porcentaje de glucolpidos hidrofbicos. Un componente importante de estos, son los cidos miclicos. La presencia de estas capas hidrofbicas previenen la penetracin de soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos microorganismos no pueden teirse con los mtodos convencionales (tincin de Gram).
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Uno de los mtodos de tincin mas comnmente usados para demostrar la cido-alcohol resistencia es el mtodo de Ziehl-Neelsen. En este mtodo la penetracin del colorante primario se facilita debido a que este se encuentra disuelto en fenol ya que es aplicado en presencia de calor. Una vez que el colorante penetra a la clula bacteriana, este se combina con las mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria (cidos nucleicos, protenas, etc.) y adems reacciona con cidos miclicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva aun ms hidrofbica. Con la tincin de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias cido-alcohol resistentes como las no cido-alcohol resistentes se tien con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcoholcido, este no solubiliza los lpidos de la pared de las bacterias cido-alcohol resistentes se decoloran fcilmente, por lo que se vuelven a teir al aplicar el colorante de contraste. El grupo de bacterias cido-alcohol resistentes est representado principalmente por el gnero Mycobacterium. Algunas especies de este gnero juegan un papel muy importante como agentes etiolgicos de la tuberculosis y otras enfermedades crnicas granulomatosas tanto en el hombre como en los animales. En el anlisis de un frotis de material clnico sospechoso de contener bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo cido- alcohol resistente puede tener valor diagnstico, ya que en la mayora de los casos no son abundantes. Sin embargo, la interpretacin del hallazgo de un solo bacilo cido-alcohol resistente debe hacerse con cautela y con base en la historia clnica y otras pruebas de laboratorio, ya que la presencia de especies saprofitas de Mycobacterium podra conducir a un diagnstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como bacterias cido-alcohol resistente. MATERIAL. Laminillas Lpiz graso Asa bacteriolgica (Asa)
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Microscopio Platina caliente Trozos de papel filtro Aceite de Inmersin Cultivo de bacterias Agua destilada Colorantes para la tincin de Ziehl-Neelsen. PROCEDIMIENTO: Utilizando una laminilla, prepara un frotis fijo (ya se te indic el procedimiento anteriormente) a partir del cultivo que vas a trabajar. Telos siguiendo la tcnica de Ziehl-Neelsen, que a continuacin ser descrita. TCNICA DE LA TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN. a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra solo el frotis y no toda la laminilla. b) Humedece el papel con la Fucsina Fenicada (colorante primario). El frotis no deber secarse, as que aade continuamente colorante para evitar esto. c) Permite la emisin de vapores durante 5 minutos. Retira el frotis de la platina, qutale el papel, djalo enfriar y lava con agua corriente de la llave. d) Decolora con el Alcohol-cido, permitindole actuar durante 2 minutos. Es importante realizar la decoloracin perfectamente, ya que de no ser as se corre el riesgo de observar reacciones falsas positivas. Lava con agua corriente de la llave. e) Contrasta con azul de metileno de Loeffler durante un minuto. Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo de inmersin. RECUERDA: Los microorganismos cido -Alcohol-Resistentes se tien de color ROJO. Los no cido-Alcohol-Resistentes de color AZUL. Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente:
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1. Escribe la composicin qumica de la pared celular de bacterias Gram positivas, negativas y cido alcohol resistentes. 2. En que tipo de muestras clnicas es recomendable realizar frotis
directos y teirlos mediante la tcnica de Ziehl- Neelsen? 3. Dibuja y colorea tus observaciones. 4. Cul de las dos cepas bacterianas result ser cido alcohol
resistente? CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participacin en la practica Puntualidad Presentacin (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
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PRCTICA No. 4
TINCIN PARA ESPORAS
PROPOSITOS ESPECIFICOS: Realizar La tcnica de tincin de Schaeffer y Fulton para teir frotis fijos a partir de cultivos bacterianos. Mencionar las principales caractersticas estructurales de la espora bacteriana, as como su funcin. Distinguir y clasificar a las esporas bacterianas por su
localizacin en la clula bacteriana.
INTRODUCCIN: La espora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rgida, que es formada por algunos gneros bacterianos. Los gneros bacterianos de inters en Medicina Veterinaria que son capaces de esporular son Bacillus y Clostridium. Estos responden de manera diferente al efecto que las condiciones ambientales tienen sobre la formacin de la espora. Por ejemplo; el B. anthracis, microorganismo aerobio estricto, solamente puede formar esporas en condiciones de aerobiosis, de manera similar, los bacilos del gnero Clostridium anaerobios, no forman esporas en aerobiosis. La esporulacin es un mecanismo especializado cuya funcin es encerrar un genoma en un vehculo aislante que le permita la germinacin posterior en un medio adecuado. Las esporas bacterianas mantienen un estado de criptobiosis o vida latente, con escasa actividad metablica.
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As mismo, muestran una marcada resistencia al calor, a la desecacin, a la congelacin, a diversos agentes qumicos y radiaciones. La espora bacteriana est compuesta por seis capas de afuera hacia adentro: a) Exosporium b) Capa c) Corteza d) Pared e) Membrana interna f) Centro (Protoplasma) La capa est constituida por protenas parecidas a la queratina, las cuales vuelven impermeable a la espora y la protegen de la accin de substancias qumicas. El centro contiene dipicolinato de calcio, el cual aunado al alto estado de deshidratacin del protoplasma, es responsable de la marcada resistencia que muestra la espora al calor y a la desecacin. Las esporas son estructuras ovales o esfricas que pueden encontrarse tanto intracelularmente, como fuera de la bacteria (clula vegetativa). Por su localizacin dentro de la clula pueden ser centrales, subterminales o terminales (como lo representa la Fig. 4) y presentan adems variacin en su tamao. Estas caractersticas son de utilidad taxonmica para la identificacin de algunas especies de los gneros capaces de esporular. En una preparacin teida con la tcnica de Gram las esporas aparecen como cuerpos refringentes sin teir. Para teirlas se utiliza la tincin de Schaeffer y Fulton en la que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del colorante primario (verde de malaquita) y una ves que este ha penetrado, al lavar la preparacin y agregar un colorante de contraste (safranina), las clulas vegetativas se tien de rojo y la espora permanece teida de VERDE.
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Fig. 4 tipos de esporas bacterianas: terminal, subterminal, central, esfrica y oval
MATERIAL. Laminillas Lpiz graso Asa bacteriolgica (Asa) Microscopio Platina caliente Mechero Aceite de Inmersin Cultivo de bacterias esporuladas Agua destilada Colorantes para la tincin de esporas PROCEDIMIENTO: Prepara dos frotis fijos a partir del cultivo que tienes en la mesa de trabajo. Uno de los frotis ser teido utilizando la tincin de Gram y el otro ser teido con el mtodo de Schaeffer y Fulton como se describe a continuacin: a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra solo el frotis y no toda la laminilla. b) Aplica Fulton A (verde malaquita) y calienta en la platina, hasta la emisin de vapores, durante un minuto (recuerda que el colorante no debe
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evaporarse, por lo tanto a aadirs continuamente colorante para evitar esto). c) Lava con agua corriente de la llave. d) Contrasta con Fulton B (safranina) durante 15 segundos. e) Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo de inmersin (100X). f) El mtodo de tincin de Schaeffer y Fulton puede practicarse en fro, permitiendo actuar al Fulton A durante 10 minutos.
RECUERDA: Con la tincin de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes SIN TEIR, mientras que con el mtodo de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color VERDE y las formas vegetativas se ven ROJAS.
CUESTIONARIO 1. Qu diferencias encontraste entre el frotis teido por el mtodo de Gram y el frotis teido por el mtodo de Schaeffer y Fulton? 2. Qu posicin tena la espora dentro del cuerpo bacteriano y qu forma tena sta? 3. Cul es la importancia de las esporas bacterianas? 4. Cuando se forman las esporas bacterianas?
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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
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PRCTICA No. 5 TINCIN DE CPSULAS
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno realizar las tcnicas de tincin de Maneval y tinta china para poner de manifiesto la presencia de cpsula bacteriana. Distinguir la presencia de cpsula en un frotis teido con la tcnica de Maneval y con Tinta China. Describir la composicin qumica y funcin de la cpsula bacteriana. INTRODUCCIN: Muchas bacterias estn rodeadas por compuestos qumicos superficiales que se ties con mucha dificultad y que ha sido denominada cpsula. La mayora de las cpsulas bacterianas estn constituidas qumicamente por polisacridos, aunque en el gnero Bacillus consiste en un polipptido del cido D-Glutmico. La cpsula desempea un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patgenas, ya que les confiere propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos de defensa del organismo. El grosor de la cpsula vara no solo de una especie de microorganismos a otra, sino que tambin entre las diferentes cepas de la misma especie y dependiendo de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentra el cultivo. El dimetro de la cpsula puede ser varias veces mayor al dimetro del cuerpo celular, como en el caso de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae. Por el contrario, en otras bacterias su dimetro puede ser mucho menor,
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ponindose de manifiesto solamente mediante procesos bioqumicos y serolgicos como en el caso de algunas cepas de Pasteurella spp. Las bacterias con cpsula, en los medios de cultivo, forman colonias lisas y mucoides mientras que las bacterias no capsuladas producen colonias rugosas. Las cpsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teidos con las tcnicas usuales porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijacin al calor y lavado las disuelven. Por lo tanto l mejor mtodo para observarlas es el de las tinciones negativas. La Fig. 5 nos pone de manifiesto la presencia de cpsula bacteriana mediante la tincin negativa con tinta china.
Frotis grueso
Frotis delgado
Fig. 5 China.
Demostracin de cpsula bacteriana, utilizando el mtodo de Tinta
Los siguientes ejemplos son gneros bacterianos y micticos que pueden presentar cpsula. a) b) c) d) e) Klebsiella Pasteurella Bacillus Escherichia Yersinia a) b) c) d) e) Streptococcus Haemophilus Neisseria Moraxella Cryptococcus
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MATERIAL. Laminillas Cubreobjetos Lpiz graso Asa bacteriolgica (Asa) Microscopio Mechero de Bunsen Aceite de Inmersin Pulque Tinta China filtrada Colorantes para la tincin de Maneval
PROCEDIMIENTO: Determina la presencia de cpsula bacteriana utilizando el pulque que has trado, con los mtodos de tincin negativa que a continuacin se describen: TINCIN NEGATIVA CON EL MTODO DE MANEVAL MODIFICADO. Coloca una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla. Toma un poco de pulque y mzclalo con la gota de Maneval A, haciendo movimientos giratorios con el asa. Extiende la suspensin de manera que quede una pelcula delgada. Deja secar la preparacin a temperatura ambiente. NO FIJES EL FROTIS AL CALOR. Cubre la preparacin con Maneval B (Fucsina cida) y deja que acte durante un minuto. Lava suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis mediante un ligero contacto con una toalla de papel. Observa al microscopio Con el objetivo de inmersin. Las cpsulas se observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa de un color oscuro y las clulas bacterianas de color rojo. TINCIN NEGATIVA CON TINTA CHINA. En una laminilla coloca una gota de tinta china y una gota de pulque, suspndelo homogneamente. Coloca un cubreobjetos sobre la suspensin y observa al microscopio.
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La cpsula se observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos, gracias al contraste proporcionado por la coloracin negra tanto del espacio intercelular como de las clulas microbianas
Cuestionario Anota tus observaciones tomando en consideracin lo siguiente: 1) Por qu este tipo de preparaciones no deben fijarse al calor? 2) Cul de los dos mtodos puso mejor de manifiesto la cpsula bacteriana? 3) Comparar el grosor de la cpsula con el dimetro de la clula. 4) Relacionar el tamao de la cpsula con la viscosidad del medio. 5) Cul es la funcin de la cpsula en una infeccin bacteriana? CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participacin en la practica Puntualidad Presentacin (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO
OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
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PRCTICA No. 6 MTODOS DE ESTERILIZACIN
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno explicar el proceso de esterilizacin mediante el mtodo de calor seco y calor hmedo. El alumno aplicar los conocimientos tericos seleccionando el o los mtodos de esterilizacin mas adecuados para esterilizar cada uno de los materiales que se le presentan. INTRODUCCIN: La esterilizacin es un proceso que destruye todo tipo de vida en el material o sustancia de que se trate. Esto puede realizarse por mtodos fsicos o qumicos. MTODOS FSICOS. Dentro de los mtodos fsicos de esterilizacin pueden mencionarse: Calor Hmedo A 100 C por 1015 minutos. Vapor a presin A 121 C a 15 lb. (autoclave) de presin por 15 minutos. Flameado Incineracin Aire caliente A 160-170 C, de (Horno Pasteur) 60-120 minutos II. FILTRACIN Filtros de columna Filtros de membrana Con poros de 0.8, 0.6, 0.45, 0.2 y 0.1 m de dimetro.
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Ebullicin
I.- CALOR
Calor seco
III. RADIACIN
Radiaciones ionizantes Rayos , y X Radiaciones ionizantes no Rayos ultravioleta infrarrojos. e
A continuacin se describirn cada uno de estos mtodos.
I. CALOR. El efecto esterilizante del calor se debe a que se desnaturaliza (coagula) las protenas. El factor que ms influye cuando s esteriliza por ste mtodo es la presencia o ausencia de humedad, ya que es sta la que determina la temperatura exacta a la que mueren los microorganismos. En trminos generales, la esterilizacin por calor hmedo es ms eficaz. Ebullicin: Por este proceso las formas vegetativas de la mayora de las bacterias mueren en 10-15 minutos a una temperatura de 90-100 C. Sin embargo, las bacterias esporuladas requieren de mayor tiempo de exposicin. La ebullicin puede utilizarse para esterilizar material de cristalera, instrumental de ciruga, jeringas, recipientes, etc. Vapor a Presin. La esterilizacin por medio de vapor a presin se realiza en un recipiente hermticamente cerrado (autoclave) (ver figura 6) en el que se produce presin de vapor de agua, lo cual permite lograr temperaturas mayores a las que se obtienen en la ebullicin. Durante este procedimiento es importante una completa evacuacin del aire del recipiente, ya que la temperatura de la mezcla de Aire-Vapor es ms baja que la del vapor puro. A este proceso de eliminacin del aire se le denomina purga del autoclave y se realiza a travs de una vlvula de escape que puede variar de acuerdo con las especificaciones del modelo de autoclave que se utilice. Las autoclaves deben de tener un manmetro que indique la presin interna. La presin que debe alcanzarse es de 15 libras /1.1 Kg/cm2), y a esta presin la temperatura alcanzada es de 121 C. Para lograr un efecto esterilizante deben mantenerse la presin y temperatura mencionada durante 15 minutos por
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lo
menos, debiendo aumentarse el tiempo cuando el volumen de material es grande. Despus de este periodo, el autoclave debe dejarse enfriar hasta que la presin en el manmetro marque cero libras. El autoclave es de utilidad para destruir tanto formas vegetativas como esporas bacterianas presentes en substancias termoestables, material de ciruga y curacin, ropa, material de cristalera, filtros, etc. Flameado. Consiste en la aplicacin directa de la flama sobre el material a esterilizar. El material puede calentarse al rojo blanco o sumergirse en alcohol y pasarlo por la flama para que ste se consuma. Es utilizado para asas microbiolgicas, esptulas, pinzas, tijeras, etc. La Fig. 6 muestra el flameado como mtodo de esterilizacin. Incineracin. Es la forma ms eficaz y rpida para la destruccin de hisopos contaminados, material de curacin, muestras de desecho, as como cadveres de animales infectados. Aire caliente. La esterilizacin por medio de aire caliente se realiza en una cmara (horno Pasteur) (Ver figura 6) que puede compararse con un horno domstico. En el debe alcanzarse una temperatura mnima de 160 C durante l Hr. por lo menos. Es un requisito indispensable que el aire caliente circule para que cada objeto a esterilizar alcance la temperatura deseada y sta destruya a todos los microorganismos tanto esporulados como no esporulados. El Horno Pasteur es ampliamente usado en la esterilizacin de material de cristalera y material de ciruga. NO ES RECOMENDABLE para substancias lquidas, algodn, telas y plsticos, ya que estos materiales tienden a deteriorarse por deshidratacin a inclusive pueden carbonizarse. II. FILTRACIN. Es la remocin mecnica de los microorganismos presentes en una substancia lquida. Para esto se utiliza un tamiz con poros de un dimetro de menor tamao al de los microorganismos que se desean remover. Los filtros, deben ser esterilizados previamente a su uso y generalmente en el autoclave. La filtracin es particularmente til para la esterilizacin de soluciones de antibiticos y lquidos termolbiles.
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III. RADIACIONES De las radiaciones que se utilizan con fines de esterilizacin existen dos grupos: a) Ionizante (alta energa) b) No ionizantes (baja energa) Radiaciones ionizantes: este tipo de radiaciones son de corta longitud de onda y actan ionizando molculas a su paso. Son altamente letales a su efecto sobre al ADN. Ejemplo de este tipo de radiaciones son los rayos alfa ( gamma ( ) y equis ( X ). ), beta ( ),
Radiaciones no ionizantes: Dentro de esta categora se incluyen los rayos infrarrojos y los rayos ultravioleta. Los primeros son de longitud de onda ms larga que la luz visible y se absorben en forma de calor. Su accin esterilizante se debe a la desnaturalizacin de protenas generada por el calor. Los rayos ultravioleta tienen una longitud de onda ms corta que la luz visible y provocan la muerte de los microorganismos debido a que al ser absorbidos ocasionan lesiones en el ADN y en algunas protenas de la clula microbiana. Las radiaciones, tanto ionizantes como no ionizantes, se utilizan para esterilizar recintos cerrados, materiales plsticos, materias primas para alimentos de animales, papel, hojas delgadas de metal y algodn, entre otros. MTODOS QUMICOS. Los mtodos qumicos par esterilizacin utilizan agentes como el xido de etileno y l formaldehdo, ambos son gases y se les usa para esterilizar recintos cerrados como quirfanos, laboratorios, incubadoras y nacedoras. El xido de etileno es tambin utilizado en la esterilizacin de materiales slidos termolbiles (materiales plsticos). Desinfeccin. La desinfeccin involucra agentes qumicos que generalmente no tienen efecto esterilizante, aunque destruyen virtualmente todos los microorganismos
patgenos. Solo algunos desinfectantes pueden tener efecto esterilizante cuando se usan apropiadamente, tal es el caso del formaldehdo, el fenol, el glutaraldehdo, el xido de etileno, el perxido de hidrgeno y el cido paractico.
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Hay desinfectantes que, debido a que no produce dao celular, pueden aplicarse sobre superficies corporales. A estos desinfectantes se les conoce como antispticos, por ejemplo el alcohol etlico, el iodo, la tintura de benzalconio, el cloruro de benzalconio, el mercurocromo, etc. Los desinfectantes pueden clasificarse segn su mecanismo de accin en: 1. Detergentes catinicos 2. Alcoholes 3. Fenoles 4. Halgenos 5. Agentes alquilantes 6. Agentes oxidantes 7. Colorantes 8. Metales pesados Ejemplo: Cloruro de benzalconio Alcohol etlico Fenol Cloro, Iodo Formaldehdo, xido de etileno Perxido de hidrgeno, cido paractico Violeta de genciana, azul de metileno Soluciones de cobre, plata y mercurio.
Flameado
Vapor a presin
Autoclave Flameado Aire caliente
Horno Pasteur
Fig. 6 Equipo que puede ser utilizado para la esterilizacin de materiales.
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MATERIAL: Autoclave Horno Pasteur Jeringas Hisopos contaminados Cultivos bacterianos en medio slido y lquido Asa microbiolgica Esptulas Alcohol Tijeras Guantes de latex Cajas de Petri Tubos de ensaye Pipetas Hisopos Mortero PROCEDIMIETOS: 1. En tu mesa de trabajo encontrars material para esterilizar, observa, clasifica y selecciona el mtodo a utilizar para la esterilizacin de dicho material. 2. Espera la explicacin del profesor sobre algunas particularidades previas a la aplicacin del mtodo de esterilizacin.
CUESTIONARIO 1. Con base en su bibliografa y el trabajo realizado, indicar si aplic los
mtodos de esterilizacin adecuados para el material y medios de cultivo que prepar 2 Indicar si el proceso de esterilizacin aplicado a los medios de cultivo fue eficiente. 3 Comparar la eficacia del calor seco y del calor hmedo como medios de esterilizacin. 4 Comparar la resistencia al calor de las clulas vegetativas de las bacterias con la de las esporas bacterianas.
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5 Qu clase de materiales se esterilizan por lo general por filtracin? 6 En que se fundamenta la esterilizacin por tindalizacin?
OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
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PRCTICA No. 7 CLASIFICACIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
PROPOSITOS ESPECIFICOS: Conocer la importancia del cultivo de bacterias in vitro. Enunciar la utilidad prctica de los medios segn sus caractersticas fsicas. Preparar y clasificar los medios de cultivo problema. INTRODUCCIN: Para realizar el estudio de los microorganismos es necesarios recuperarlos del habitad natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que proporcionen sus requerimientos nutricionales, a este
procedimiento se conoce como cultivo in vitro. La proliferacin de bacterias es el resultado de una interaccin compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos en la cual intervienen factores fsicos como la temperatura, el pH, el factor redox. Para su crecimiento todos los microorganismos requieren agua, adems deben estar presentes en forma utilizable el carbono, oxgeno, nitrgeno, hidrgeno, calcio, fsforo y el fierro, muchos microorganismos dependen adems de oligoelementos como el magnesio, molibdeno, zinc, cobre. Los microorganismos exigentes tienen necesidad adems de factores de crecimiento como aminocidos, vitaminas, purinas u otras sustancias que no pueden sintetizar ellos mismos. El carbono se necesita en la mayor parte de las veces en forma e compuestos orgnicos, que luego sirven como fuente de energa, el oxgeno se toma principalmente de la atmsfera, las necesidades de hidrgeno se cubren con compuestos orgnicos y, en casos particulares, tambin a partir de compuestos
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inorgnicos. El nitrgeno proviene de sales en forma de nitratos, nitritos o compuestos amnicos, o de componentes ms complejos como aminocidos, peptonas o protenas. Los otros elementos se toman principalmente de sales. Los medios de cultivo sintticos estn compuestos de una serie de substancias qumicas definidas exactamente, los medios de cultivo complejos contienen diferentes extractos, hidrolizados u otros aditivos. CARACTERSTICAS FSICAS DE LOS MEDIOS a) Medios lquidos Son medios que no contienen agar (agente solidificante), son envasados en tubos, botellas y matraces. b) Medios semislidos Son medios que contienen 0.5 a 0.75% de agar. Son envasados en tubo. c) Medios slidos Existen dos tipos, los que contienen 1.5% de agar y los que contienen 3 a 7% de agar llamados medios duros. Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos.
El agar-agar es un extracto seco gelificante, obtenido de algunas especies de algas rojas, particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Adanthopeltis. En el medio de cultivo pueden estar presentes colorantes e indicadores cuyo cambio de color ser caracterstico para un determinado intervalo de pH. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Como es lgico suponer no todos los medios de cultivo son utilizados para el aislamiento de todas las cepas bacterianas, utilizados para el aislamiento de todas las cepas bacterianas, en ocasiones no solo son aptos para el aislamiento de microorganismos en general, sino que adems poseen la capacidad de inhibir a algunos y favorecer el desarrollo de otros. Basados en el propsito para el cual son fabricados los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:
MEDIOS DE CULTIVO BSICOS.

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Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Reciben tambin el nombre de medios generales y pueden ser utilizados en anlisis cuantitativos, para muestreo de medio ambiente, superficies y para conservar cepas. Ejemplos: Caldo nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar nutritivo. Agar soya tripticasa.
MEDIOS ENRIQUECIDOS. Son medios que se suplen con factores de crecimiento para el desarrollo de bacterias y hongos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios generalmente contienen uno o ms de los siguientes ingredientes: sangre, suero, lquido asctico, huevo, carne, vitaminas y aminocidos especficos, entre otros. Ejemplos: Agar sangre, agar Sabouraud con cido nicotnico, agar LowesteinJensen, caldo infusin cerebro corazn.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son muy utilizados, sobre todo en cultivos entricos, estos medios se utilizan para aumentar la propagacin de ciertos organismos sin favorecer a otros. Son muy eficaces en el aislamiento de Salmonella a partir de heces. Ejemplos: Caldo selenito de sodio, caldo selenito y cistina, caldo tetrationato, caldo-sal-colistina, agar sangre + levadura de cerveza, agar yema de huevo con leche. MEDIOS SELECTIVOS. Son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de reas del cuerpo que poseen una flora normal abundante (faringe, boca, piel nariz, vagina, etc.). En estos se incorporan substancias inhibidoras de la propagacin de un grupo de bacterias, pero permiten en cambio el crecimiento de otros grupos. As para el cultivo entrico, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben los organismos Gram positivos y permiten la propagacin de los bacilos entricos Gram negativos.
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Ejemplos: Agar verde brillante (VB), agar Salmonella Shigella (SS), que son medios selectivos para Salmonella, agar Mac Conkey (Mac C), agar ENDO y agar Eosina azul de metileno (EMB), que son selectivos para enterobacterias, agar manitol sal (MSA), agar Staphylococcus 110 y Chapman Stone, selectivos para Staphylococcus. MEDIOS DIFERENCIALES. Este tipo de medios, debido a los componentes qumicos e indicadores que contienen, permiten identificar con cierta facilidad algunos gneros o especies bacterianas, por el aspecto caracterstico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son tambin diferenciales. Ejemplos: Agar verde brillante, agar Salmonella-Shigella, agar Mac Conkey, agar ENDO, agar eosina azul de metileno. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras de la lactosa (coliformes) de las no fermentadoras de la lactosa (no coliformes). MEDIOS PARA EL ESTUDIO DE CARBOHIDRATOS. En los medios de cultivo, los carbohidratos y glucsidos son muy utilizados como fuente de energa por las bacterias, y particularmente para diferenciar gneros e identificar especies se utiliza generalmente agua peptonada como base para el estudio de los azcares, las soluciones de carbohidratos empleados para estas pruebas, deben esterilizarse por filtracin, ya que al calentarse los azcares sufren varios fenmenos, como la formacin de productos de oxidacin y reaccionar con algunos otros componentes de los medios de cultivo como aminocidos. Ejemplos: Medio basal OF de Hugh y Leifson, medio para MR-VP y todos aquellos en los cuales se pruebe algn azcar en particular (agua peptonada + glucosa, manitol, sucrosa, sorbitol, galactosa, etc.). MEDIOS DE TRANSPORTE. Son medios utilizados en el envo de muestras de laboratorio, algunos contienen sustancias reductoras, o nutrientes que permiten a los microorganismos conservarse viables hasta llegar al laboratorio. Ejemplos: Medio de transporte de Stuart, caldo tioglicolato, medio de Carry-Blair. MATERIAL: Diferentes medios de cultivo sintticos
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Matraces Erlenmeyer Mechero Esptulas Cajas de Petri Autoclave Balanza granataria Papel aluminio Tubos de ensaye PROCEDIMIENTO: Los fundamentos de preparacin, distribucin y esterilizacin de los medios de cultivo son esencialmente iguales, utilizando las formas deshidratadas o bien aadiendo los distintos ingredientes por separado. Casi todos los medios de cultivo utilizables se encuentran en el comercio en forma deshidratada y se determina simplemente la cantidad necesaria de polvo, segn las instrucciones y se aade al agua destilada necesaria. Es importante utilizar un frasco o matraz Erlenmeyer lo suficientemente grande para que se pueda remover o agitar bien para disolver el medio. Una vez preparado el medio, se distribuyen recipientes adecuados mientras estn todava calientes, los mtodos de distribucin de los medios disueltos en cajas de Petri, tubos o frascos, dependen del tipo de medio y de la finalidad de su empleo. PREPARACIN DE UN MEDIO DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIN CAJAS DE PETRI. Ver Fig. 7
Fig. 7
Preparacin de un medio de cultivo. Material necesario para la reconstruccin de los medios de cultivo.
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Pesar la cantidad requerida del medio deshidratado utilizando un papel o papel aluminio, evitando con ste prdidas del polvo sobre la balanza.
El medio se aade a una pequea cantidad de agua destilada o desmineralizada, fra y se distribuye uniformemente por agitacin, enseguida aadir la cantidad restante de agua y se homogeniza.
Se deja reposar la solucin durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, para que el agar pueda hincharse. Para disolver
completamente los medios deben calentarse a ms de 95C.
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Los medios de cultivo clarificados, se esterilizan en autoclave utilizando la forma convencional de 121C por 15 y a 15 lb de presin, estas constantes van a depender del tipo de medio a esterilizar.
El medio agarificado, todava lquido se vierte en las cajas de Petri. El volumen es variable y depende del tamao de las cajas; se recomienda 15 a 20 ml para las cajas de 31/2 plg. y de 20 a 35 ml para las cajas de 4 plg.
Si aparecen burbujas de aire en las cajas, se eliminan pasando la llama del mechero de Bunsen por la superficie. Las cajas se pasan por una prueba de esterilidad que consiste en incubarlas por 24 horas a 37 C.
Una
vez
transcurrido
el
tiempo
de
incubacin, las cajas y los tubos son revisados. Aquellos que muestren
contaminacin se desechan; por el contrario, los libres de contaminacin se refrigeran entre 4-15 C hasta su utilizacin.
NOTA: Para preparar las cajas de Petri, se tendrn que esterilizar primero y a continuacin se llenan con el medio, hasta una altura de 3 mm. Hay que dejar
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enfriar el medio a unos 50-55 C con el objetivo de prevenir la condensacin de humedad en las paredes del recipiente.
1.- En tu mesa encontrars diferentes medios de cultivo deshidratados (comerciales). 2.- Clasifcalos de acuerdo a su uso. 3.- Lee las instrucciones de cada uno de los medios. 4.- Procede a prepararlos segn las indicaciones de cada uno de ellos y con base al procedimiento antes mencionado; tu profesor te matemticos que realizaste. revisara los clculos
CUESTIONARIO: 1. Menciona la clasificacin de los medios de cultivo segn sus caractersticas fsicas. 2. De acuerdo a la composicin qumica. menciona la clasificacin de los medios de cultivo 3. Menciona dos ejemplos de medios selectivos y de transporte. 4. Por que es importante saber que medio de cultivo utilizar para la siembra de bacterias y la siembra de hongos. 5. Que puntos debes de seguir para la preparacin de un medio de cultivo. 6. Una vez preparados los medios en que tipo de recipientes se pueden distribuir y por que. CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participacin en la practica Puntualidad Presentacin (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO
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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
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PRACTICA No. 8 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno aplicar las tcnicas de sembrado en medios de cultivo lquidos, semislidos y slidos. INTRODUCCCION La mayora de las bacterias pueden multiplicarse formando colonias visibles en medios de cultivo artificiales, los cuales, una vez preparados y listos para ser inoculados con bacterias, pueden tener varias presentaciones en cuanto a su consistencia, la cual est determinada por la concentracin de agar presente en el medio o la ausencia del mismo. El instrumento ms utilizado para la inoculacin (sembrado) de bacterias es el asa bacteriolgica, la cual puede ser de alambre de platino, nicromo u otro material parecido el cual se inserta en un mango. Existen en el mercado asas microbiolgicas calibradas para tomar un volumen constante de inculo, las ms utilizadas con este fin son las de 0.01 y 0.001 ml, las cuales son utilizadas para el anlisis bacteriolgico cuantitativo de agua y orina sin diluir. El sembrado de cada uno de los medios de cultivo, se realiza de manera diferente de acuerdo al fin que se persigue, el aislamiento de las bacterias de las muestras remitidas al laboratorio, se realiza casi siempre por sembrado en la superficie de una placa de agar en lneas paralelas por medio de un asa este procedimiento asegura la suficiente dilucin, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas que pueden emplearse para la obtencin de cultivos puros, en los que se puede realizar la identificacin. A partir del inculo se realizan una serie de estras como lo muestra la Fig. 8., donde se explica el procedimiento para el sembrado de medio slido en caja
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de Petri. Es indispensable que se emplee una tcnica adecuada para la siembra ya que la mayor parte de estas colonias aisladas sern cultivos puros. - Con un asa esterilizada, se colocan dos asadas del material cerca del borde de la placa y se realiza una estra inicial
- Se esteriliza es asa en la llama del mechero y se deja enfriar.
- Despus, se emplea el asa para distribuir la muestra en la placa en estras, presionando ligeramente sin romper el agar.
- Recordar que el esterilizarse entre
asa de inoculacin deber cada cambio de estra
utilizando la flama del mechero de Bunsen.
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Fig. 8 Procedimiento para el sembrado en medio slido.
- A partir del extremo de la primera estra se realiza una segunda y as sucesivamente hasta completar las cuatro estras.
- Al concluir el sembrado en la placa, esterilizamos nuevamente el asa, evitando con esto, posibles contaminaciones a otros medios.
- Aspecto final de la placa sembrada, utilizando la tcnica descrita anteriormente.
Las placas una vez inoculadas se incuban en posicin invertida con los medios hacia arriba a 37 C y se examinan a intervalos de 24-48 horas. Despus de que la placa ha sido incubada y para la obtencin de cultivos puros, cualquier colonia bien aislada es removida con un asa, pero tal vez sea ms conveniente emplear el asa recta sobre todo si las colonias estn muy juntas. La colonia es suspendida en
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un medio lquido, o bien sembrada directamente en otra caja conteniendo algn medio especfico dependiendo del agente que se sospeche. Para cierto tipo de muestras, por ejemplo, las de orina o sangre, se coloca una cantidad determinada de la muestra en una placa de Petri estril y se vierta encima del agar derretido (enfriado a 50 C), luego se hace rotar la placa para mezclar minuciosamente el material con el medio. Una vez que se haya solidificado a temperatura ambiente de invierte la placa, se incuba a 37 y se examinan las colonias, esta tcnica ofrece la ventaja de dar una determinacin cuantitativa de las bacterias. Si las muestra estn muy contaminadas, es necesario realizar una dilucin. El resembrado de las colonias obtenidas en el aislamiento primario, asegura la purificacin de las diversas cepas bacterianas y por lo tanto, la obtencin de cultivos puros. INOCULACIN DE TUBOS CON AGAR INCLINADO. Los cultivos en una superficie de agar inclinado, se realizan con frecuencia para mantener las cepas puras y para efectuar ciertos estudios bioqumicos. La inoculacin, se realiza a partir de una colonia aislada, tomada de una placa con el asa, se traslada el inculo a la superficie del medio que se siembra enteramente por estras (Ver Fig. 9), a veces es necesario practicar una incisin en la superficie del agar, por ejemplo en el agar TSI para organismos entricos, la incisin nunca llega hasta el fondo. La Fig. 10 nos muestra diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado
Fig. 9 Sembrado agar inclinado en
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1.ARBORECENTE 2. DIFUSO 3. ESPINOSO 4. RIZOIDE 5.ARROSARIADO 6.- PILIFORME 1 2 3 4 5 6
Fig. 10 Diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado
INOCULACIN DE TUBOS CON MEDIO SLIDO HORIZONTAL. La inoculacin de algn medio slido presentado en tubo de ensayo con
superficie horizontal, se realiza utilizando es asa recta. El mtodo de sembrado consiste en quitar la tapa con el dedo meique, flamear la boca del tubo e inocular por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio ( Ver Fig. 11).
Fig. 11 Inoculacin de un medio slido por picadura.
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INOCULACIN DE MEDIOS SEMISLIDOS. Los medios semislidos se emplean para los estudios de movilidad (medio de SIM), carbohidratos (medio basal OF) o bioqumicos (gelatina) se inoculan
utilizando un alambre recto, tratando de que la incisin no llegue al fondo del tubo. (Ver Fig. 12)
Fig. 12 Sembrado por picadura de un medio semislido
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INOCULACIN EN MEDIOS LQUIDOS La inoculacin de los caldos de cultivo, se efecta con asa recta, a partir de la muestra u otros cultivos, agitndola dentro del medio como lo muestra la Fig. 13. El crecimiento en estos medios se manifiesta de tres formas: 1. enturbiamiento, una opacidad ms o menos densa 2. Formacin de velo: pequea masa de clulas que flota en la parte superior del cultivo, 3. Sedimento: deposito celular que permanece en cultivo. la parte inferior del Fig. 13 Sembrado en medios lquidos
MATERIAL: Medios de cultivo lquidos (Caldo nutritivo). Medios de cultivo slido. Asa. Mechero. Cepas bacterianas. Portaobjetos. Juego de colorantes para la tincin de Gram.
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PROCEDIMIENTO: 1. En tu mesa de trabajo encontrars medios de cultivo lquidos, semislidos y slidos, los cuales inoculars segn la tcnica descrita anteriormente, segn corresponde. 2. Espera la instruccin del profesor para saber que cepas inoculars en cada uno de los medios 3. Realiza la tincin de GRAM de cada cepa inoculada. 4. Marca perfectamente los tubos y cajas inoculadas para evitar confusiones con las dems. 5. Inocula los medios de cultivo (Todos) a 37 C en la estufa bacteriolgica, durante 24 horas. 6. Despus de las 24 horas, sacars tus cultivos y los guardars en el refrigerador, para utilizarlos en la siguiente prctica. CUESTIONARIO: 1. Menciona los calibres de las asas mas utilizados para el anlisis bacteriolgico cuantitativo. 2. Cuales son los diferentes tipos de sembrado de acuerdo al fin que se persigue. 3. Despus de sembrar las placas que se debe realizar con ellas. 4. Como debe ser la inoculacin de medios de cultivo semislidos. 5. Como se puede manifestar el crecimiento de bacterias en los medios lquidos.
CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participacin en practica Puntualidad SI la NO
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Presentacin (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje
OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________
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PRACTICA No. 9
MORFOLOGA COLONIAL Y OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS.
PROPOSITOS ESPECIFICOS: Definir el concepto de colonia bacteriana Describir la morfologa de diferentes colonias bacterianas y mencionar la utilidad diagnstica que sta representa.
INTRODUCCIN: El estudio de la morfologa de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a sta puede iniciarse una identificacin preliminar de microorganismos aislados. Cuando una clula bacteriana prolifera sobre una superficie slida, sta da lugar a la formacin de un acumulo de millones de bacterias que pueden observarse a simple vista y reciben el nombre de colonia Las colonias bacterianas presentan caractersticas morfolgicas muy
variadas, mismas que son constantes para cada especie de bacteria en idnticas condiciones de cultivo. Estas caractersticas pueden modificarse cuando factores tales como humedad relativa, medio de cultivo, temperatura y atmsfera de incubacin varan. La descripcin de las colonias bacterianas debe realizarse cuando stas
se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes caractersticas: tamao, color, superficie, borde, opacidad, elevacin
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y estructura interna. La bacterianas en cuanto a
Fig. 14 nos presenta
el aspecto de las colonias
su forma, borde y elevacin (para ms detalle
clasificaremos posteriormente de acuerdo a estos criterios a las colonias bacterianas). Tamao. El tamao de una colonia bacteriana puede variar desde unos cuantos milmetros hasta varios centmetros. Los micoplasmas, por ejemplo, forman colonias tan pequeas que para poder observarlas es preciso utilizar el microscopio estereoscpico. Estas colonias no aumentan su tamao en forma significativa an despus de varios das de incubacin. Por otra parte grmenes como Brucella, E. coli y otros, forman colonias pequeas cuando el cultivo es joven, pero aumentan considerablemente su tamao cuando la incubacin se prolonga. Existen casos extremos como en el caso de Mycobacterium
paratuberculosis, donde debido a la baja velocidad de crecimiento las colonias no son visibles sino hasta despus de varias semanas de incubacin. Asimismo, existen algunas especies de los gneros Proteus, Bacillus y Clostridium que invaden todo el medio de cultivo dando el aspecto de una colonia nica de varios centmetros de dimetro.
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A)Plana, B) Elevada, C) Convexa, D) Pulvinada, E) Umbilicada, F) Bajo la superficie
Fig. 14 aspectos de colonias bacterianas en cuanto a su forma, borde y elevacin. Color: Hay especies bacterianas capaces de sintetizar pigmentos muy diversos, los cuales son detectados fcilmente debido al color caracterstico que le imparten a las colonias o por la difusin de dichos pigmentos en los medios de cultivo ( slido y lquido) que no poseen colorantes o indicadores de pH. Algunos
ejemplos de bacterias productores de pigmento son: 2. Pseudomonas aeruginosa: pigmento verde amarillento. 3. Micrococcus roseus: Pigmento rosa- anaranjado. 4. Serrara marcescens: pigmento anaranjado- rojo. 5. Staphylococcus equi: pigmento rosa. 6. Mycobacterium spp:pigmento amarillo- rojo .
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En el caso de las bacterias del gnero Mycobacterium, la produccin de pigmento tiene un valor taxonmico. Las caractersticas de la superficie, borde, opacidad, elevacin y estructura interna, estn sujetas a la interpretacin subjetiva del observador. Para describirlas es necesario el uso del microscopio estereoscpico, por lo que su valor descriptivo es menos relevante. De acuerdo a estos criterios, las colonias pueden clasificarse de la siguiente manera:
Lisas Superficie Estructura interna Rugosas
Granular Mucoide
Filamentosa
Translcidas Opacidad Opacas Brillantes
Enteras Onduladas Borde Lobuladas Erizadas Filamentosas Elevacin Umbilicadas Difusas Planas Convexas
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Otro dato til en la identificacin preliminar de colonias bacterianas
es la
produccin de hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, donde la produccin de hemolisinas conduce a la formacin de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de la colonia. Al hacer la identificacin de las colonias bacterianas aisladas no siempre ser necesario detallar todas las caractersticas morfolgicas mencionadas,
generalmente se toman en cuneta aquellas que son ms relevantes. MATERIAL 1. Diferentes cultivos bacterianos ( trabajos en la prctica 7) 2. Asa 3. Mechero 4. Portaobjetos colorantes para la tincin de GRAM.
PROCEDIMIENTO: 1. Realiza la descripcin morfolgica de las colonias que crecieron en el medio de cultivo slido y elabora un cuadro de comparacin de stas caractersticas, el cual te permita hacer la diferenciacin morfolgica entre ellos. 2. Realiza la tincin de Gram, de una colonia de cada uno de los medios de cultivo que trabajaste y compara este resultado con el que hiciste en la prctica 7 (en cuanto a tincin de Gram se refiere).
CUESTIONARIO 1. Qu es un cultivo puro? 2. Qu es un cultivo mixto? 3. Describe como obtienes un cultivo puro 4. Cual es la importancia de determinar la morfologa colonial
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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________
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PRACTICA No. 10
METABOLISMO E IDENTIFICACIN BACTERIANA
INTRODUCCIN. El inters de la bacteriologa mdica se centra alrededor de la identificacin de microorganismos aislados de muestras clnicas, con el fin de poder relacionarlos con grupos previamente clasificados. Para la identificacin de las bacterias, el laboratorio de bacteriologa necesita conocer las caractersticas fsicas y metablicas de las mismas. Dentro de las caractersticas fsicas, se toman en cuenta: agrupacin, reaccin a la tincin de Gram y algunas otras particularidades estructurales que se pueden apreciar con tinciones especficas as como la morfologa de las colonias observadas en placas de agar. Conocidas las caractersticas fsicas de la bacteria, se analizan sus reacciones metablicas tales como produccin de enzimas, metabolitos
intermedios, oxidacin, oxidacin y fermentacin, entre otras. Esto se logra a travs de pruebas estandarizadas que se elaboran a partir de preparados comerciales que son medios de cultivo conteniendo el compuesto sobre el cual las enzimas bacterianas actan e indicadores que ponen de manifiesto la reaccin que se llev a cabo. Una vez determinadas estas caractersticas se deben consultar esquemas, cuadros o tablas de identificacin, los cuales son variados, pero en todos los casos conducen de una manera ordenada al conocimiento del gnero y especie bacteriana que se desea identificar
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La tendencia actual es la de utilizar una serie de complementos tales como : pruebas biolgicas, fagotipificacin, anlisis cromatogrfico, serologa. Nosotros nos auxiliaremos de las pruebas bioqumicas: A continuacin se explicarn algunas de las pruebas ms usadas en el laboratorio 1. ACIDO SULFHIDRICO. INDOL. MOVILIDAD. (S.I.M.) MEDIO: Semislido en tubo y debe sembrarse por picadura con asa recta hasta que las 2/3 partes del medio queden inoculadas. La siembra en un solo tubo sirve para las 3 pruebas. PRINCIPIO. Este medio sirve para realizar tres pruebas a la vez que deben ser ledas y reportadas por separado, ejemplo: S.I.M. +/-/- indica: cido sulfhdrico positivo, indol negativo y motilidad negativa. S.- Produccin de cido sulfhdrico: algunas bacterias son capaces de degradas la cistina y otros compuestos que contienen azufre, dando como resultado
la formacin de cido sulfhdrico (H2S). Para la deteccin de dicho cido el medio contiene sales de metales pesados (sulfato ferroso) que al combinarse con el cido sulfhdrico forman respectivos sulfuros. RESULTADOS: Positivo. Formacin de zonas negras. Negativo. El medio permanece del color inicial. I.- Produccin de indol. Se trata de detectar la produccin de indol a partir del triptofano del medio, por medio de la triptofanasa de la bacteria, que hidroliza dicho cido. Para detectar la liberacin del anillo indlico del triptofano, que es el nico aminocido que lo contiene, se agrega al medio despus de la
incubacin, una o dos gotas del reactivo de Kovacs, la reaccin es inmediata. RESULTADOS: Positivo. El reactivo se torna rojo. Negativo. Cuando no hay cambio en el reactivo que es amarillo. M. Motilidad: la motilidad de las bacterias est dada por flagelos, misma que puede apreciarse por una sola picadura con asa recta en un medio
semislido como ste.
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Algunas veces la produccin excesiva apreciacin
de cido sulfhdrico impide la
de la motilidad, por lo tanto es necesario realizar una
preparacin hmeda a partir de un cultivo en caldo. RESULTADOS: Positivo. Se manifiesta por una zona nebulosa ms all de la lnea de inoculacin por picadura, se debe a la invasin del medio (dada a su baja concentracin de agar) por las bacterias flageladas. Negativo. Solo se observa crecimiento en la lnea de inoculacin. INCUBACIN: De 24 a 48 horas a 37 C. 2.- UREASA. MEDIO. Urea que es medio de color amarillo muy claro, slido inclinado en un tubo que se siembra por estra continua; contiene urea y rojo de fenol como indicador de pH, PRINCIPIO: Detectar la produccin de ureasa por parte de la bacteria con el consiguiente desdoblamiento de la urea en amoniaco y nitrgeno. INCUBACIN: De 24 horas a siete das a 37 C. El citrato como nica fuente de carbono y a la sal de amonio como fuente de nitrgeno. INCUBACIN: De 24 horas a siete das a 37 C. RESULTADOS: Positivo. Una marcada alcalinidad del medio debida a la produccin de amoniaco (NH3), hace que el rojo de fenol se ponga de manifiesto con un intenso color rosa mexicano Negativo. El medio permanece con un color original. 3.- CITRATO. MEDIO: Citrato de Simmos. Es un medio de color verde oscuro de superficie inclinada en tubo. Se siembra por estra contina en la superficie. Contiene citrato de sodio, una sal de amonio y un indicador de pH que es el azul de bromotimol. PRINCIPIO: Saber si la bacteria utiliza RESULTADOS: Positivo. Color azul en el medio (pH alcalino) Negativo. Permanece color original.
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4.-CARBOHIDRATOS (azcares) MEDIO: Es un medio lquido de color rojo se siembra por agitacin del asa. Contiene solo uno de los carbohidratos ( solo el que desea probarse) que se mencionan despus y un indicador de pH, el rojo de fenol. Los azcares que pueden probarse son los siguientes: adonitol, arabinosa, celobiosa, dextrosa (glucosa), dulcitol, galactosa, glicerol, inositol, inulina, lactosa, fructosa, maltosa, manitol, manosa, rafinosa, rhamnosa (isoducitol), salicn, sorbitol. sucrosa, trealosa y xilosa. PRINCIPIO: Detectar si la bacteria problema es capaz de utilizar los carbohidratos con o sin produccin de gas. Es necesario que el tubo ya inoculado se incuba con el tapn flojo. Si la bacteria utiliza el azcar puede producirse cidos y gas, en algunos casos solo se produce cidos. INCUBACIN: De 24 horas a seis das a 37 C. RESULTADOS: Positivo. Esta indicado por un cambio de color del medio de rojo a amarillo. Se recomienda incubar un tubo testigo: es decir sin inocular, para verificar pequeas variaciones en el color del medio. Negativo. El color del medio permanece sin variaciones. 5.- CATALASA. REACTIVO: Agua oxigenada (H2O2). PRINCIPIO: Detectar si la bacteria problema produce la catalasa, que es una enzima que desdobla el agua oxigenada (perxido de hidrgeno) en agua y oxgeno libre, que se aprecia en el reactivo como formacin de burbujas. TCNICA: en un portaobjetos limpio y seco se coloca una gota del reactivo y sobre sta una asada de la colonia problema. RESULTADOS: Positivo. Est indicado por una efervescencia o burbujeo inmediatamente.
Negativo. No hay formacin de burbujas.
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Nota: Cuando la colonia problema se encuentra cultivada en gelosa sangre, el asa no debe enfriarse en el espesor del medio, como se hace rutinariamente, ni debe tocar la superficie del agar ya que las clulas sanguneas contenidas en la gelosa sangre, producen peroxidasas que pueden provocar reacciones positivas falsas. El siguiente diagrama puede ser utilizado como una gua general para la identificacin de los principales gneros bacterianos de inters veterinario:
CARACTERSTICAS GENERALES
PRUEBAS PRIMARIAS
GNERO
ALGUNAS
PRUEBAS
COMPLEMENTARIAS + Staphylococcus Coagulasa, manitol, Micrococcus urea. O-F, pigmento,
Cocos Gram Positivos. Aerobios
Catalasa
- Streptococcus
Utilizacin de carbohidratos; CAMPesculina, NaCl 6.5%
Bacillus (aerobio) + Bacilos y cocobacilos. Gram positivos Aerobios y anaerobios Esporas Clostridium (anaerobio) Listeria - Erysipelothrix Corynebacterium
Motilidad, hemolisis, pruebas biolgicas, Anlisis cromatogrfico
Catalasa, hemolisis, utilizacin de carbohidratos, H2S
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Bacilos y cocobacilos
Oxidasa
Moraxella Brucella + Bordetella Pasteurella Pseudomonas
TSI, SIM, urea, citrato, reduccin de nitratos, utilizacin de carbohidratos, H2S, fagotipificacin
Gram negativos. Aerobios y anaerobios Enterobacterias - Haemophilus Fusobacterium (anaerobio) TSI, SIM, urea, citrato, utilizacin de carbohidratos, requerimientos de factores X y Y
Crecimiento +Actinomyces microaerobiosis, catalasa. Filamentos Gram positivos Crecimiento en anaerobiosis
en
Nocardia
Tincin de Kinyoun, hidrlisis de casena, xantina y tirosina
Bacilos cido alcohol resistente
Velocidad de crecimiento, morfologa de colonias y produccin de pigmento
Sntesis de niacina, produccin de Mycobacterium pirazinamidasa
Espiroquetas y Vibrios
Crecimiento en aerobiosis
+ Leptospira Treponema
Campylobacter
Micro aglutinacin Crecimiento en micro aerobiosis, susceptibilidad a quimioteraputicos, serologa.
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Sntesis de pared Formas L pleomrficas celular en ausencia de antibiticos
+ formas L Micoplasma - Ureaplasma Acholeplasma
Segn morfologa y tincin de Gram, filtrabilidad (0.45 nm, Digitonina, urea, Inhibicin de crecimiento y de metabolismo mediante antisueros especficos Produccin de glucgeno, susceptibilidad a sulfas inmunofluorescencia Morfologa microscpica, inmunofluorescencia
+ Chlamydia Bacterias Intracelulares Inclusiones citoplasmticas basoflicas - Riquetsias
MATERIAL: Diferentes pruebas bioqumicas Asa Mechero Estufa bacteriolgica Portaobjetos.
PROCEDIMIENTO. 1. En tu mesa de trabajo encontrars diferentes pruebas bioqumicas. 2. Tu profesor te dar una explicacin de cmo debes realizarlas 3. Anota tus resultados para identificar tu bacteria problema.
CUESTIONARIO: 1. Cual es la importancia de sembrar las pruebas bioqumicas 2. Investiga el fundamento de las siguientes pruebas bioqumicas OF, TSI ( agar hierro triple azcar), LIA, Gelatina nutritiva
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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________
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PRCTICA No. 11
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA A QUIMIOTERAPUTICOS
En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno realizar la prueba de difusin en agar segn el mtodo de Bauer et al. Interpretar la susceptibilidad a los quimioteraputicos mediante la observacin de los halos de inhibicin.
INTRODUCCIN: Se piensa que los quimioteraputicos actan de forma similar en las en las infecciones; Sin embargo, existe diversidad tanto en los grupos de antibiticos y sus mecanismos de accin, como en los microorganismos causantes de infeccin y susceptibilidad a aquellos, as como tambin debe considerarse al individuo afectado y su estado inmunitario, sitio de infeccin de cronicidad y sensibilidad a la droga. Por esto es necesario realizar la prueba de susceptibilidad a los
quimioteraputicos para tratar adecuadamente un caso problema. El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la seleccin de cepas
bacterianas multirresistentes, por lo que resulta difcil predecir la susceptibilidad con base en la sola experiencia clnica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles a ciertos
antibiticos, son ahora resistentes, principalmente debido a la amplia distribucin de plsmidos de resistencia mltiple (plsmidos R).
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La susceptibilidad de microorganismos in vitro
a los antimicrobianos puede
medirse en el laboratorio, ya sea por pruebas de difusin en agar o de dilucin en caldo. Tambin puede efectuarse mediante pruebas qumicas sensibles para pone de manifiesto algunas de las enzimas bacterianas como la penicilinasa que
inactiva a las penicilinas. Las pruebas in vitro de susceptibilidad bacteriana por dilucin en agar o en caldo son pruebas cuantitativas que permiten conocer la concentracin mnima inhibitoria para un determinado microorganismo. En estas pruebas se hacen diluciones de un quimioteraputico en un medio de cultivo apropiado al que se agrega una concentracin constante de bacterias. Despus de la incubacin se determina la dilucin mxima del quimioteraputico en la que hay desarrollo bacteriano, correspondiendo la concentracin del antibitico en
esta dilucin a la concentracin mnima inhibitoria o MIC (Minimal Inhibitory Concentration). Este resultado nos permite determinar la concentracin necesaria del quimiteraputico en los tejidos afectados y por tanto ofrece al clnico una base de objetividad de decisin teraputica. Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el mtodo de difusin en agar son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes quimioteraputicos. Estos discos se colocan sobre la superficie de las cajas de agar previamente inoculadas con la cepa problema. Despus de la incubacin se observan halos de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos con quimioteraputicos a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la bacteria es resistente hay crecimiento alrededor del disco. Dentro de las pruebas de difusin en agar se encuentra el mtodo de Bauer et a., en el cual, adems de estandarizar el inculo, se toma en cuenta el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento bacteriano para determinar el grado de susceptibilidad del microorganismo (RESISTENTE, INTERMEDIO O
SUSCEPTIBLE), por lo tanto la lectura del dimetro de inhibicin del crecimiento en mm debe interpretarse de acuerdo a una tabla de referencia, ver figuras (15,
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Fig. 15. tcnica de difusin del disco en agar mostrando la zona de inhibicin.
Para poder evaluar epidemiolgicamente este tipo de interpretacin se tomaron en cuenta los valores de los MICS de cientos de cepas de cada especie bacteriana clnicamente importante en humanos. Estos valores fueron correlacionados con el dimetro de los halos de inhibicin y con los niveles sricos alcanzados por cada droga a dosis teraputicas, otro factor Sensible considerado fue la experiencia clnica obtenida durante muchos aos en la teraputica, otro factor considerado fue la experiencia clnica obtenida durante muchos aos en la teraputica antimicrobiana de infecciones bacterianas. En Medicina Veterinaria no existen mtodos similares estandarizados para cada una de las especies animales por lo que la aplicacin de los estndares establecidos por Bauer et al. deben interpretarse con cautela. El clnico
debe estar consciente de las limitaciones de las pruebas de susceptibilidad in vitro y, por lo tanto el resultado del laboratorio deber ser solo uno de los muchos criterios a considerar en la eleccin de un quimioteraputico clnicamente til. MATERIAL. Cultivo bacteriano en medio lquido. Hisopos estriles Medio de cultivo lquido
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Caja de agar Meller Hinton (MH) Pipeta Pasteur Estndar de turbidez 0.5 de Mac Farland Tarjeta para comparacin de turbidez Discos de papel filtro impregnados con quimioteraputicos (sensidiscos) Pinzas Frasco con alcohol
PROCEDIMIENTO. 1. En tu mesa de trabajo encontrars un cultivo bacteriano en medio lquido. 2. Estandariza el inculo agregando unas gotas del cultivo en el tubo que contiene medio lquido, hasta alcanzar una turbidez igual a la el tubo de 0.5 de Mac Farland. Compare la turbidez de ambos tubos auxilindose con la tarjeta que te fue proporcionada para este fin. La suspensin estandarizada debe ser inoculada en la caja de agar antes de que transcurran 15 minutos, de lo contrario puede alterarse la cuenta bacteriana. 3. Sembrar el microorganismo de Meller- Hinton usando un hisopo. 4. Humedecer el hisopo con la suspensin bacteriana, quitando el exceso del caldo presionndolo y girndolo sobre la pared interna del tubo por arriba del nivel del caldo. 5. Sembrar en tres direcciones para obtener un sembrado uniforme. Dejar reposar la placa de 2-5 minutos para que se seque el inculo. 6. Flamea las pinzas en alcohol y con ellas coloca los sensidiscos. 7. Incuba las cajas de agar en posicin invertida a 37 C y durante 24 horas Determina el patrn de sensibilidad y resistencia de la cepa observando los halos de inhibicin alrededor de los sensidiscos
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CUESTIONARIO: 1.- Investiga cuales son los mecanismos, por los cuales las bacterias crean resistencia a los quimioteraputicos. 2.- Solicita al auxiliar de laboratorio o a tu profesor la tabla quimioteruticos para realizar de los
la lectura correspondiente de los halos de
inhibicin. Interpreta y discute tus resultados.
OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
RECOMENDACIONES:_____________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________
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PRACTICA No. 12
TOMA,
ENVIO
MANEJO
DE
MUESTRAS
PARA
EL
ANLISIS
BACTERIOLGICO Y MICOLGICO.
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno aplicar los procedimientos generales para la toma, envo y manejo de muestras clnicas al laboratorio para el diagnstico
bacteriolgico y micolgico, mediante la coleccin de una muestra problema.
INTRODUCCIN: La bacteriologa y micologa diagnstica es el estudio de las muestras tomadas a partir de pacientes de los cuales se sospecha de una infeccin que involucre a estos agentes. El laboratorio puede apoyar al clnico de la siguiente manera: - Confirmar el diagnstico presuntivo. - Sugiere la quimioterapia de la enfermedad. - Colabora en el conocimiento epidemiolgico de las enfermedades. - Permite la elaboracin de autobacterinas. Los resultados del examen bacteriolgico y micolgico, as como la rapidez con que stos sean obtenidos, no dependen solo de los mtodos de laboratorio empleados, sino tambin de la forma en que sean colectadas y enviadas las muestras clnicas. Dichos resultados pueden verse influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la microflora normal, por la migracin bacteriana post-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes
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del envo de la muestra. El clnico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretacin de los resultados emitidos por el laboratorio.
TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS. Los problemas ms frecuentes para la identificacin bacteriana y micolgica en el laboratorio son: 3. Envo de muestras en condiciones inadecuadas (sangre hemolizada, suero turbio contaminado, orina de ms de 4 horas, hisopos sin medio de
transporte, muestras no refrigeradas). 4. Envo de muestras en condiciones inadecuadas (sangre hemolizada, suero turbio contaminado 5. Envo de muestras no representativas de la lesin en cuestin 6. Toma de muestras sin antisepsia. 7. Falta de una historia clnica completa y de un diagnstico presuntivo. Por lo anterior, es indispensable que el clnico tenga un conocimiento sobre la correcta obtencin y envo de muestras al laboratorio.
A continuacin se menciona algunas normas generales a considerar. 1.- Tomar la muestra del sitio anatmico ms representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad. 2.- Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern tomarse dentro de las primeras 3 horas de ocurrida la muerte o el sacrificio. 3.- Las muestras deben colocarse bajo estrictas condiciones de antisepsia (limpiar la piel con alcohol al 70 % y posteriormente iodo por un minuto). Tanto el material de coleccin como el recipiente en el que la muestra sea transportada debern ser estriles. Este ltimo preferentemente debe tener un tapn de rosca 4.Los especimenes colectados no deben entrar en contacto con
desinfectantes. 5.- Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza,
edad, sexo, arete o nombre del animal a partir del cual fueron identificadas,
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as como direccin, telfono y nombre del propietario del animal. (Etiqueta de identificacin). 6.- Una vez colectadas las muestras deben enviarse dentro de las siguientes 424 horas al laboratorio en condiciones de refrigeracin ( 4 C). Esto puede lograrse utilizando hielo o refrigerantes en cajas de poliuretano.
7.- Cuando sea necesario el uso de hisopos para la coleccin de las muestras hay peligro de desecacin por ello estos deben enviarse en medios de transporte, que ayudan a la preservacin de la bacteria pero no a la multiplicacin. 8.- Debe anexarse una historia clnica, que incluya la hora de la muerte del animal, nmero de animales afectados, si el animal del que proviene la muestra fue tratado con antimicrobianos, cuales y durante cuanto tiempo y un diagnstico presuntivo con base en signos clnicos y epidemiolgicos. 9.- Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clnicas deben realizarse con precaucin debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clnico y bacterilogo. 10.- Si no son consideradas estas normas, el laboratorio podr rechazar la muestra para el anlisis bacteriolgico y micolgico.
En las siguientes pginas aparecen las recomendaciones en forma de cuadros para la toma y envo de muestras, de acuerdo a las condiciones patolgicas especficas.
MATERIAL: - Ser el que se requiera, en funcin a la muestra que se va a trabajar y ser solicitado por el equipo de trabajo al profesor de laboratorio.
PROCEDIMIENTO: 1.- De acuerdo a la informacin anterior, realiza correctamente tu toma de

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muestra segn corresponda. 2.-Una vez tomada la muestra transprtala al laboratorio para que puedas procesarla. CUESTIONARIO: 1. Cundo tomar ese tipo de muestra? 2. Cantidad de muestra a utilizar? 3. Materiales requeridos para la toma de muestra. 4. Tcnica sealando paso a paso en la toma de la muestra 5. Cuidados que se deben guardar en la toma de la muestra para que sta sea de calidad. 6. Medio o medios de transporte a utilizar para la muestra ( en caso necesario) 7. 8. Cuidados a guardar en el envo de la muestra, Microorganismos ms frecuentes encontrados en la muestra.
9. Nombre de la enfermedad
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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________
RECOMENDACIONES:_____________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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RECOMENDACIONES PARA LA TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS DE ACUERDO A CONDICIONES PATOLGICAS ESPECIFICAS CONDICIN PATOLGICA. TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD RECOMENDA -FETO COMPLETO O CONTENIDO ABOMASAL (1 ML) -PULMN, BAZO, HGADO Y ABORTOS RIN FETAL. (6 CM POR LADO). -PLACENTA Y PLACENTOMAS -SECRECIN VAGINAL (1 ML) -LECHE (15 ML) -ALIMENTO (100 G) ABSCESOS, GRANULOMAS Y EXUDADOS -EXUDADO PURULENTO (1 ML) -ABSCESO COMPLETO -BIOPSIA JERINGAS HISOPOS FRASCOS BOLSAS DE PLSTICO. EN CASO DE DE GRANULOMAS TUBERCULOSIS FORMA DE COLECCIN Y OBSERVACIONES ENVIO FRASCOS. BOLSAS DE PLSTICO HISOPOS JERINGAS EL FETO Y RGANOS EN SE PUEDEN
ENVIARSE CUANDO CLAMIDIASIS
CONGELACIN. SOSPECHA HGADO DE EN
ENVIAR
MEDIO DE TRANSPORTE ESPECIAL. ALIMENTO EN CASO DE
AFLATOXICOSIS.
SOSPECHOSOS
DEBEN EXTREMARSE PRECAUCIONES.
- LQUIDO SINOVIAL (1 ML) ARTRITIS - ARTICULACIN COMPLETA.
JERINGAS HISOPOS BOLSAS DE PLSTICO.
DESINFECTAR
PIEL ANTES
DE
LA
ARTROCENTESIS.
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OBSERVACIONES CONDICIN PATOLGICA. CLOSTRIDIASIS INVASIVA (MIOSITIS NECRTICA, HEPATITIS NECRTICA). -INTESTINO ENTERO TOXEMIA -RGANOS AFECTADOS, NDULOS LINFTICOS, RIN, HGADO Y BAZO SEGMENTO LIGADO DE INTESTINO EN FRASCO ENVIAR EN REFRIGERACIN. TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD RECOMENDA -MSCULO NECRTICO (10 CM POR LADO). FORMA DE COLECCIN Y ENVIO FRASCOS BOLSAS DE PLSTICO. ENVIAR RPIDAMENTE AL LABORATORIO EN ATMSFERA ANAEROBIA. EN ESTE CASO NO ES RECOMENDABLE LA REFRIGERACIN.
-TEJIDO SUBCUTNEO EDEMATOSO (10 CM POR LADO). -HGADO (10 CM POR LADO)
-PELOS. -ESCAMAS. DERMATOFITOSIS
FRASCOS SOBRES DE PAPEL NUEVOS PORTAOBJETOS
NO
ES
NECESARIO
QUE
LOS
RECIPIENTES ESTN ESTRILES. LAS MUESTRAS DEBEN TOMARSE DE LA PERIFERIA DE LA LESIN.
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-ORINA (6 ML) INFECCIONES URINARIAS -RIN COMPLETO 6 CM POR LADO
CATTER, JERINGA, FRASCO ESTRIL.
LAS
MUESTRAS
DEBEN
ENVIARSE
DENTRO DE LAS SIGUIENTES 2 HORAS A SU COLECCIN.
CONDICIN PATOLGICA.
TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD RECOMENDA -INTESTINO
FORMA DE COLECCIN Y ENVIO SEGMENTO LIGADO DE INTESTINO EN FRASCO ESTRIL, FRASCOS, BOLSAS, HISOPOS Y GUANTES DE PALPACIN
OBSERVACIONES
EN GRANDES ESPECIES TOMAR LAS HECES DIRECTAMENTE DEL RECTO Y EN PEQUEAS ESPECIES CON HISOPO. EN CASO SOSPECHOSO A PARATUBERCULOSIS ENVIAR RASPADO Y MUCOSA INTESTINAL.
DIARREAS
-HECES (1 G). -N. LINFTICOS MESENTRICOS. -VESCULA BILIAR, -ALIMENTO (100G) Y AGUA (100 ML).
-EXUDADOS (1ML) -LAVADOS PREPUCIALES O INFECCIONES GENITALES VAGINALES (10 ML) -RGANOS: TESTCULO, EPIDDIMO, TERO ETC. (COMPLETOS 10 CM POR LADO)
HISOPOS, JERINGAS, FRASCOS O BOLSAS DE PLSTICO (EN EL CASO DE LOS RGANOS)
SI SE SOSPECHA DE CAMPILOBACTERIOSIS, LEPTOSPIROSIS O MICOPLASMOSIS, LAS MUESTRAS DEBEN ENVIARSE DENTRO DE LAS SIGUIENTES 3 HORAS A SU COLECCIN Y EN REFRIGERACIN.
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_____________________________________
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PRACTICA No. 13.
SEGUIMIENTO BACTERIOLGICO PARA EL DIAGNSTICO EN UNA MUESTRA PROBLEMA.
PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno investigar el procedimiento que le permitir hacer el aislamiento e bacterias presentes en su muestra. El alumno aplicar los conocimientos adquiridos durante las diferentes sesiones de laboratorio y pondr en prctica desde la toma de muestra hasta la identificacin de bacterias presentes en su muestra problema y poder emitir el identificacin de las
diagnstico confirmativo de su muestra problema
MATERIAL :El necesario, en funcin a la muestra que se va a trabajar y ser laboratorio. solicitado por el equipo de trabajo al profesor de
PROCEDIMIENTO: 1. Habrs notado que no existe una introduccin en lo que respecta a esta prctica, por lo que realizars una investigacin sobre el procedimiento a seguir y poder identificar las bacterias que estn presentes en tu muestra problema. 2. Elabora un cronograma del procedimiento que seguirs, que incluya desde la toma de muestra hasta la susceptibilidad a quimioteraputicos.
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3. Presenta al profesor de la materia este cronograma, antes de empezar tu trabajo en el laboratorio.
OBSERVACIONES:_______________________________________________ _______________________________________________________________ __________________________________________
RECOMENDACIONES:____________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________
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BIBLIOGRAFA.
1. Difco: Manual de medios de cultivo y reactivos para microbiologa 10. Ed. Laboratorio Difco, Michigan, USA. 2. Garca, T. R., Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriologa y Micologa Veterinaria. Instituto Interamericano de Cooperacin para la Agricultura. Mxico D. F. 1988. 3. Lpez, A. J. Barajas, R. J. A.: Manual de Laboratorio para Bacteriologa y Micologa Veterinaria. Departamento de Bacteriologa. FMVZ-UNAM. 1982. 4. Mac Faddin, J. F.: Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Mdica Panamericana. Mxico, D. F. 1984. 5. Miranda, M. R. E.: Material didctico para Laboratorio de Bacteriologa Y Micologa. Departamento de Bacteriologa. FMVZ_ UNAM. 1994. 6. Prez; M, J. A.: procedimientos de Laboratorio para bacteriologa y Micologa Veterinarias. Departamento de Bacteriologa. FMVZ_ UNAM. 1994.
- 92 -Pag -

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BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

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CONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO Y MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA

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PARTICULARIDADES La bata ser la vestimenta de proteccin que utilizars en ste laboratorio

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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________

RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________

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Fig. 2 Preparacin de un frotis fijo para tincin.

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2 Aplicar la solucin de Iodo (Lugol, mordente) y djala actuar durante 15 segundos

Lava con agua corriente de la llave. Sacude el frotis

Procedimiento para la tcnica de GRAM

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3 Aplicar el Alcohol-Acetona (Agente decolorante) segundos durante 3 a 5

Lava nuevamente con agua de la llave. Sacude la laminilla

(colorante de contraste) y djala actuar durante 15 segundos.

Lava con agua corriente de la llave

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Gram positivas no existe dicha viscosidad

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OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________

RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________

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PRCTICA No. 3 TINCIN PARA BACTERIAS CIDO-ALCOHOL RESISTENTES (B A A R)

RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRCTICA: 20 ALUMNOS

INTRODUCCIN: Las bacterias

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RECOMENDACIONES:_ ____ _

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RECOMENDACIONES:_ ____ _