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EL MICROSCOPIO

1. RESEA HISTRICA DEL MICROSCOPIO La curiosidad innata al hombre ha hecho que este haya intentado saber ms acerca de los objetos ms lejanos, pero tambin de los ms prximos, la astronoma es una ciencia ligada al hombre desde antiguo y casi en la misma medida que se desarrolla el instrumental ptico para acercar los objetos lejanos lo hace el que permite aumentarlos objetos prximos El invento del microscopio parece remontarse al siglo XVI cuando en 1590 los hermanos Jansen en Holanda inventaron el microscopio compuesto, constaba de un tubo con dos lentes convexas en cada extremo y ampliaba ms que las lupas, que existan desde la Edad Media, aunque daba una imagen borrosa. Un importante microscopista fue el holands Anton Van Leewenhoek nacido en Delft en 1632) quien, sin ninguna preparacin cientfica, puede considerarse el fundador de la bacteriologa. Tallaba el mismo sus lupas sobre esferitas de cristal, cuyos dimetros no alcanzaban el milmetro (su campo de visin era muy limitado, de dcimas de milmetro). Con estas pequeas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observ los glbulos de la sangre, bacterias y protozoos; examin por primera vez los glbulos rojos y descubri que el semen est compuesto de espermatozoides. Durante su vida no revel sus mtodos secretos y a su muerte en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.

En 1665, Robert Hooke observ con un microscopio un delgado corte de corcho. Hooke not que el material era poroso. Esos poros, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de Anton Van Leewenhoek, inventor del microscopio cajas a las que llam clulas. Hooke haba observado clulas muertas. Unos aos ms tarde, Marcelo Malpighi, anatomista y bilogo italiano, observ clulas vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio. Durante el siglo XVIII continu el progreso y se lograron objetivos acromticos por asociacin de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por H.M. Hall y mejorados por Dollond. De esta poca son los estudios efectuados por Newton y Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersin y la refraccin se podan modificar con combinaciones adecuadas de dos o ms medios pticos, se lanzan al mercado objetivos acromticos excelentes. Los mtodos seguidos por los pticos eran totalmente empricos y hasta la llegada de Abbe un joven fsico de la Universidad de Jena que desarrolla la famosa teora del microscopio,
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segn la cual, los grandes aumentos son intiles si la imagen de difraccin no se reduce suficientemente a expensas de la apertura numrica del objetivo. 2. QU ES UN MICROSCOPIO? Un microscopio es un dispositivo encargado de hacer visibles objetos muy pequeos. El microscopio compuesto consta de dos lentes (o sistemas de lentes) llamados objetivo y ocular. El objetivo es un sistema de focal pequea que forma una imagen real e invertida del objeto (situado cerca de su foco) prxima al foco del ocular. ste se encarga de formar una imagen virtual de la anterior ampliada y situada en un punto en el que el ojo tenga fcil acomodacin (a 25cm o ms). Dada la reducida dimensin del objeto, se hace imperioso el recolectar la mayor cantidad de luz del mismo, utilizando sistemas de concentracin de la energa luminosa sobre el objeto y diseando sistemas que aprovechen al mximo la luz procedente del objeto.

2.2 Partes de un microscopio A. Lente ocular: Es donde coloca el ojo el observador. Esta lente aumenta entre 10 a 15 veces el tamao de la imagen. B. Can: Tubo largo de metal hueco cuyo interior es negro. Proporciona sostn al lente ocular y lentes objetivos C. Lentes objetivos: Grupo de lentes de 2 o3 ubicados en el revlver. D. Revlver: Sistema que contiene los lentes objetivos y que puede girar, permitiendo el intercambio de estos lentes. E. Tornillo macro mtrico: Perilla de gran tamao, que al girarla permite acercar o alejar el objeto que se est observando. F. Tornillo micromtrico: Permite afinar la imagen, enfocndola y hacindola ms clara. G. Platina: Plataforma provista de pinzas, donde se coloca el objeto o preparacin. H. Diafragma: Regula la cantidad de luz que pasa a travs del objeto en observacin I. Condensador: Concentra el Haz luminoso en la preparacin u objeto. J. Fuente luminosa: refleja la luz hacia la platina.

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TIPOS DE MICROSCOPIO MICROSCOPIO PTICO Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticos. Tambin se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una nica lente pequea y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espcimen). Este uso de una nica lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos pticos. 1. PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO Y SUS FUNCIONES:
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(1)* Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplia la imagen formada en los objetivos. (2)* Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta, lo que significa que es muy importante este elemento del microscopio, es un elemento vital que permite ver a travs de los oculares (3)* Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. (4)* Diafragma: Regula la cantidad de luz que llega al condensador. (5)* Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. (6)* Tubo: Es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. (7)* Revlver: Es un sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro. (8)* Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura. (9)* Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa. (10)* Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostn del mismo. 2. SISTEMA DE ILUMINACIN:

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La fuente de luz (1), con la ayuda de una lente (o sistema) (2), llamada colector, se representa en el plano del diafragma iris de abertura (5) del condensador (6). Este diagrama se instala en el plano focal anterior del condensador (6) y puede variar su abertura numrica. El diagrama iris (3) dispuesto junto al colector (2) es el diafragma de campo. La variacin del dimetro del diafragma de campo permite obtener su imagen igual al campo visual lineal del microscopio. La abertura numrica del condensador (6) supera, generalmente la de la abertura del objetivo microscpico. Es la iluminacin que permite ver mejor lo que queremos observar como las clulas o las membranas celulares entre otros. El microscopio ptico tiene un lmite resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m ). Este lmite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 m ). Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas.

MICROSCOPIO ELECTRNICO En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiacin de los electrones es mucho ms pequea que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, la resolucin obtenida con el microscopio electrnico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio ptico. Mientras que con el microscopio ptico ordinario o el de contraste de fases las estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 0,2 m, con el microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0,001 m.

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MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO El Microscopio electrnico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscope), es aquel que utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen. Tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. Tambin produce imgenes de alta resolucin, que significa que caractersticas espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificacin. La preparacin de las muestras es relativamente fcil pues la mayora de SEMs slo requieren que estas sean conductoras. En el microscopio electrnico de barrido la muestra generalmente es recubierta con una capa de carbn o una capa delgada de un metal como el oro para darle propiedades conductoras a la muestra. Posteriormente es barrida con los electrones acelerados que viajan a travs del can. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV o una imagen digital. Su resolucin est entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Inventado en 1931 por Ernst Ruska, permite
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una aproximacin profunda al mundo atmico. Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. FUNCIONAMIENTO: En el microscopio electrnico de barrido es necesario acelerar los electrones en un campo elctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000 voltios. Los electrones acelerados por un voltaje pequeo son utilizados para muestras muy sensibles, como podran ser las muestras biolgicas sin preparacin adicional, o muestras muy aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metlicas, ya que stas en general no sufren daos como las biolgicas, y de esta manera se aprovecha la menor longitud de onda para tener una mejor resolucin. Los electrones acelerados salen del can, y son enfocados por las lentes condensadora y objetiva, cuya funcin es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en la muestra un haz de electrones lo ms pequeo posible (para as tener una mejor resolucin). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre la muestra, punto por punto y lnea por lnea. Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre los electrones del mismo haz, y los tomos de la muestra; puede haber por ejemplo, electrones rebotados como las bolas de billar. Por otra parte, la energa que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra puede hacer que otros electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X, electrones Auger, etc. El ms comn de stos es el que detecta electrones secundarios, y es con el que se hacen la mayora de las imgenes de microscopios de barrido. Podemos tambin adquirir la seal de Rayos X que se produce cuando se desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un anlisis espectro grfico de la composicin de la muestra. MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN Un microscopio electrnico de transmisin (TEM, por sus siglas en ingls, o MET, en espaol) es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo caracterstico de este microscopio es el uso de una muestra ultra fina y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la muestra. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

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ESTRUCTURA: Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son:

Can de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espcimen (dependiendo que tipo de microscopio electrnico es), creando una imagen aumentada. Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que conecta el espcimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la

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muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partculas ms pequeas que el poder separador del sistema ptico usado por transparencia. Los condensadores que se emplean en Microscopa de campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con una apertura numrica mayor al del objetivo. ESTRUCTURA: El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios pticos. Desde muchos aos atrs el microscopio ptico posibilito el descubrimiento de las clulas y la elaboracin de la teora de que todos los seres vivos estn constituidos por clulas. El microscopio ptico se compone de dos partes principalmente: 1. Parte Mecnica: Sirve de soporte. 2. Parte ptica: constituida por tres sistemas de lentes. *Condensador *Objetivo *Ocular MICROSCOPIO CONFOCAL El microscopio confocal combina fundamentalmente la microscopa de fluorescencia con la captura y digitalizacin de imgenes con un ordenador. La obtencin de imgenes digitalizadas en diferentes planos de profundidad de la muestra y su ulterior recombinacin permiten la reconstruccin y anlisis tridimensional de las estructuras. El microscopio de barrido confocal se usa para estudiar la estructura de los materiales biolgicos. Emplea un sistema de iluminacin con rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un
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sistema de espejos para mover el rayo lser a travs del espcimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolucin. Este mtodo tiene la ventaja de que se pueden tomar imgenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definicin mxima a la imagen. Es posible tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA Microscopa de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Khler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayas luminosos. Siendo escasas las molculas autofluorecentes, su aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos. Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o directamente en clulas y usarlas como marcadores.
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Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas molculas u orgnulos. Pero lo ms habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras molculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo especfico a estructuras concretas de la clula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energa) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). Problema: La utilizacin de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparicin de la fluorescencia. Fluorescencia: A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiacin excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usado. Epifluorescencia: Hoy da se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio acta como lente iluminadora y de imagen.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE Para poder observar una clula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla y hacerle una tincin, lo que implica, la muerte de la clula en cuestin. Esto siempre ha sido una preocupacin para los expertos en el campo del estudio celular, debido que al pasar por todos estos procesos, algunas estructuras pueden daarse o cambiar su forma. Para esto se utiliza el microscopio de contraste de fase (entre otros mtodos ms modernos), que permite realizar exmenes inmediatos y observar clulas vivas. La microscopa de contraste de fase, fue desarrollada fundamentalmente por Zernike en 1932. Se basa fundamentalmente en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar objetos de distintos ndices de refraccin, aprovechando y amplificando dichos retrasos. El microscopio de contraste de fase permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas. Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

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Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. CONSTIRUCION DEL MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE: Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio ptico de campo claro con algunas modificaciones, como objetivos y condensadores especiales. El condensador presenta un disco que proyecta un haz de luz con forma anular, y en la lente de salida de los objetivos, se agregan unos anillos de fase, que son discos transparentes con un diseo en relieve, cabe destacar que existen dos tipos diferentes de anillos de fase, denominados positivo y negativo, los cuales tienen distintos efectos sobre la luz y por lo tanto, las imgenes se ven diferentes en cada uno, esto se explicar ms adelante.

En la figura superior se muestra la ubicacin del anillo de fase y el condensador anular en el microscopio. Adems en la de la derecha, se muestra un corte de un objetivo, mostrando el disco de fase. Hay que considerar adems que cada una de estas parte no es nica, sino que existen varios juegos de condensadores y de objetivos, dependiendo de la ocasin y el zoom que se necesite.

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MICOROSCOPIO DE POLARIZACIN Los microscopios de luz polarizada son microscopios a los que se les han aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador), el material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol dejando pasar nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada). Algunos compuestos orgnicos responden al efecto de la luz, stos tienen un alto grado de orientacin molecular (sustancias anistropas), que hace que la luz que lo atraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios atmicos. El prisma de Nicol permite el paso de luz en un solo plano, as el cuarzo gira la posicin de polarizacin, facilitando la identificacin de sustancias que extinguen la luz. Al fenmeno de extincin de luz causado por estos planos atmicos y orientaciones moleculares se llama birrefringencia. Este tipo de microscopio se usa para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto), sustancia amiloide, asbesto, colgeno, cristales de uratos, queratina, slice, y otras de origen exgeno. El microscopio de polarizacin se basa en el empleo de dos filtros polarizadores. El primero de ellos, el polarizador propiamente dicho, sirve para generar un haz de ondas luminosas que oscilan en un solo plano y que se hace incidir en la muestra. El segundo, denominado analizador, se encuentra entre la muestra y el ocular. Cuando ambos polarizadores se encuentran cruzados, se extingue la luz generada por el primer polarizador. Sin embargo, si la muestra contiene sustancias que presentan anisotropa, se produce birrefringencia y esta puede detectarse. QU SIGNIFICA ANISOTROPA Y BIRREFRINGENCIA? Cuando las ondas luminosas, que son radiaciones electromagnticas que oscilan en diferentes planos, atraviesan un cuerpo cuyo ndice de refraccin es el mismo en cualquier direccin, la velocidad de la luz es la misma en cualquier direccin, y se dice que ese cuerpo es istropo. El vidrio, los gases y lquidos son istropos. Pero cuando al atravesar un cuerpo, la velocidad de propagacin de la luz no es la misma en todas las direcciones, entonces se dice que dicho cuerpo presenta anisotropa. Cuando un rayo de luz incide en un cuerpo anistropo, el rayo original se divide en dos rayos diferentes y se produce birrefringencia. Cuando se produce birrefringencia aparece un rayo
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regular rpido que vibra en una direccin y otro paralelo llamado irregular con velocidad de propagacin ms lenta y que vibra ortogonalmente con respecto al primero. El microscopio de polarizacin es una simple modificacin del microscopio ptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador. Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ngulos de rotacin se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia. Exhiben birrefringencia el msculo estriado o esqueltico y las inclusiones cristaloides de las clulas intersticiales testiculares. MICROSCOPIO DE FUERZA ATMICA El Microscopio de Fuerza Atmica (AFM) es un instrumento mecano-ptico que detecta fuerzas a nivel atmico (del orden de los nanoNewton) a travs de la medicin ptica del movimiento sobre la superficie de un cantilever muy sensible terminado en una punta con un cristal de forma piramidal, usualmente duro. A sido crucial en el desarrollo de la nanotecnologia y para una precisa interpretacin y apreciacin de dimensiones manomtricas, posndose en la cspide de la microscopia poderosa.

CONSTITUCIN FUNDAMENTAL DEL EQUIPO: La longitud del cantilever es de 200um, y tiene una punta muy aguda de cristal en el extremo. La muestra es movida en el barrido en las tres direcciones, mientras el cantilever traza la superficie de la muestra en detalle. Todos los movimientos son controlados por una computadora. La resolucin del instrumento es de menos de 1nm, y la pantalla de

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visualizacin permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificacin de varios millones. Micro palanca o cantilever: es obtenida mediante micro fabricacin alcanzando dimensiones cercanas a los 200 um, esta es recubierta en la punta con materiales que ayuden a la refraccin del lser. Censores de flexin: el sistema ms utilizado es el de ptica en el que la flexin de la micro palanca (cantilever) es registrado mediante un haz lser que refleja en su parte posterior para po9steriormente alcanzar un fotodetector. Punta: suelen obtenerse mediante la disposicin de vapor de algn materia idneo sobre la superficie de a palanca ya fabricada, o bien mediante tcnicas de grabado anistropo en direcciones cristalogrficas. Sus dimensiones bordean los 5 nm. 1. FUNDAMENTOS: La obtencin de imgenes en el ordenador es posible mediante la interpretacin del movimiento del cantilever producto del equilibrio de la fuerza del cantilever, las fuerzas de van der waals y la tensin superficial generada por la humedad, al momento del barrido sobre la muestra. La resolucin vertical del instrumento es de menos de 1 nm, y permite distinguir detalles tridimensionales en la superficie de la muestra con una amplificacin de varios millones de veces. Las fuerzas involucradas mencionadas anteriormente se detallan a continuacin: *Fuerza de van der waals: es la fuerza estabilizadora de los tomos que forma uniones no covalentes en las que estn involucradas tanto las fuerzas de atraccin como de repulsin. *Fuerza de capilaridad ejercida por una delgada capa de humedad que esta a menudo presente en el ambiente y muestra. *Fuerza ejercida por el cantilver La fuerza total ejercida sobre la muestra vara entre 10 8 y 10 -6 N. 2. FORMAS DE USO: Modo de contacto: la punta del cantilever realiza un barrido en contacto con la muestra manteniendo una fuerza constante, usando la deflexin de la punta esttica como seal. Su principal problema es la generacin de friccin y el consecuente desgaste tanto de la muestra como de la puta del microscopio
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Modo de no-contacto: el barrido se efecta a una distancia manomtrica de la muestra valindose de las fuerzas e van der waals para la cartografa de la superficie. Modo de repiqueteo (tapping mode): se hace vibrar la punta en s punto de resonancia produciendo un contacto intermitente con la muestra.

MICROSCOPIO DE EFECTO TNEL El microscopio de efecto tnel, como su nombre lo indica, se aprovecha del efecto tnel, uno de los ms encantadores (y sorprendentes) resultados de la mecnica cuntica. Para sta, una partcula como un electrn no est ubicada exactamente en un lugar, sino que puede interpretarse como una onda ms o menos extendida: no se le puede atribuir una posicin puntual, sino una nube de posiciones en las cuales la partcula podra encontrarse. Semejante ubicuidad permite cosas que hubieran horrorizado a cualquier fsico (y seguramente a cualquier partcula) precuntico, por ejemplo, que un electrn pueda - con cierta probabilidad - escapar de un tomo, remontando las poderosas cadenas electromagnticas que lo amarran a l, como si hubiera practicado un tnel a travs de la barrera de potencial que lo tiene confinado. Insidiosa pero deliberadamente, el microscopio de efecto tnel se aprovecha de estas habilidades escapatorias de los electrones. Una sonda (un electrn extremadamente fino) se acerca a una distancia muy corta (unos diez millonsimos de milmetro) de la superficie del metal a observar: entre la punta de la superficie reina el ms estricto vaco y una pequea diferencia de potencial elctrico. Los electrones de la superficie del metal, debido a su ubicuidad cuntica, pueden, con cierta probabilidad, abandonar los tomos de origen para rendirse a los encantos de la sonda intrusa, cavando un tnel cuntico a travs del vaco que los separa de ella, y estableciendo as una "corriente tnel", que la sonda, ni corta ni perezosa, se ocupa de registrar. Ahora, como la intensidad de esa "corriente tnel" depende de la distancia entre la sonda y la superficie, sabiendo una, se sabe la otra, y a medida que la sonda barre la superficie, la intensidad de la "corriente tnel" va informando sobre el relieve y la topografa del metal, y brinda una imagen muy clara de los valles y montaas producidos por la estructura atmica ultrafina de ste. La resolucin del microscopio de efecto tnel es espectacular: menos de un dcimo del radio promedio de un tomo, y ha permitido obtener mapas muy precisos de superficies de metales o de semiconductores, en los que cada tomo puede distinguirse de su vecino (ayuda inapreciable para las necesidades de la microelectrnica moderna), y ha proporcionado tambin imgenes atmicas de molculas de ADN.

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MICROSCOPIO PETROGRFICO El microscopio petrogrfico utiliza luz polarizada (producida por una lamina polaroides llamada polarizador), a este tipo de luz se le denomina PPL (luz polarizada plana). Para determinadas propiedades se emplea una segunda lamina polaroides (llamada analizador), se representa como XPL (luz polarizada cruzada). El tipo de iluminacin tambin varia dependiendo de las propiedades a analizar. Cuando el condensador no esta incorporado los rayos recorren todos caminos paralelos y se habla de iluminacin ortoscpica, por el contrario cuando el condensador se encuentra incorporado la iluminacin es convergente y se la denomina conoscpica. 1. PARTES DEL MICROSCOPIO: El tamao lmite para que los cristales sean visibles en este microscopio es del orden de 10 micras. Por debajo de este lmite la identificacin de materiales se realiza por las tcnicas submicroscpicas, tales como los microscopios electrnicos. A) ESTATIVO: Sirve como soporte fsico al microscopio. Tiene acoplados todos los dems elementos del microscopio.

B) SISTEMA DE ILUMINACIN: El sistema de iluminacin est en la base de los microscopios. En los equipos ms modestos se trata simplemente de una bombilla, mientras que en los microscopios de investigacin la fuente de iluminacin conlleva un complejo sistema de filtros y lentes.

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Un sistema de este tipo se reproduce en la siguiente figura. La luz procedente de una bombilla (1) pasa a travs de un sistema de filtros (2) que concentran la luz en un haz de rayos paralelos. Un filtro anticalorfico (3) evita que el calor se propague a travs del microscopio. La correcta coloracin se consigue por unos filtros cromticos (4). Finalmente mediante un espejo (5) se conduce a los rayos en la direccin correcta. La intensidad del haz luminoso se regula mediante un diafragma de tipo iris (6), llamada diafragma de campo luminoso.

C) POLARIZADOR: Se encuentra situado inmediatamente encima del sistema de iluminacin y por debajo del condensador. Est rgidamente unido al condensador y a la platina del microscopio. Su funcin es convertir la luz que sale del sistema de iluminacin en luz polarizada plana. El plano de vibracin de la luz dentro del polarizador puede ser girado en algunos microscopios, pero su posicin de trabajo est fijada a 0 grados, casi siempre coincidiendo con la direccin este-oeste (en los modelos ms antiguos era norte-sur). Es importante recordar que en el microscopio petrogrfico el polarizador est siempre incorporado en el camino de los rayos luminosos. En los actuales microscopios el polarizador est constituido por una simple lmina polaroides, pero en los primitivos equipos la polarizacin se consegua por un ingenioso sistema de prismas de calcita descrito por W. Nicol y conocido como nicoles.

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D) CONDENSADOR: Se encuentra situado entre el polarizador y la platina. En su parte superior tiene una lente removible (1) que puede ser intercalada o no en el camino de los rayos luminosos. Cuando la lente frontal se encuentra retirada (2) de la marcha de los rayos luminosos, estos salen recorriendo caminos paralelos y se habla de iluminacin ortoscpica. Cuando la lente se encuentra incorporada (3) los rayos convergen en el plano de la preparacin microscpica y a esta iluminacin se le denomina conoscpica. Un diafragma iris, conocido como diafragma de apertura, permite regular la intensidad del haz luminoso.

E) PLATINA: Sirve como soporte para las preparaciones microscpicas, o lminas delgadas, (1) que van a ser estudiadas. Est dotada de un carro para sujetar las lminas y frecuentemente dispone de unos tornillos (T) para desplazarlas gradualmente. Mediante unos anillos (2) se puede subir y bajar para buscar el foco (en los microscopios antiguos la platina permanece fija, siendo los objetivos los que se desplazan).

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En el microscopio petrogrfico es siempre de forma circular y puede rotar sobre su punto central. Su borde est graduado con una escala y dispone de un nonius fijo (3) para medir angulos con precisin.

F) OBJETIVOS: Son unas lentes diseadas para ampliar la imagen de los objetos situados en la platina del microscopio. La imagen real (e invertida) que forman se ampla con el sistema ptico del ocular. Normalmente se usa una combinacin de cuatro (x4, x10, x25, x50) o cinco objetivos (x 2,5, x5, x10, x25, x50). Para un fcil intercambio de aumento los objetivos se montan muy frecuentemente en un tambor (1). Para que no se produzca el desplazamiento de los objetos fuera del campo de observacin al girar la platina del microscopio, es necesario que el eje de giro coincida con el eje ptico del objetivo. Para conseguirlo cada objetivo est montado sobre unas piezas excntricas de manera que estos pueden ser desplazados al girar unos anillos o unos tornillos de centrado situado en sus monturas externas (2). La luz polarizada los atraviesa sin sufrir ninguna deformacin.

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G) ENFOQUE: El enfoque de la imagen en el microscopio se realiza separando el objeto a estudiar de los objetivos. Mediante unos anillos (1 y 2) se puede subir y bajar la platina para buscar el foco (en los microscopios antiguos la platina permanece fija, siendo los objetivos los que se desplazan). En este microscopio existe un amilla "macro" de desplazamiento brusco (1), para aproximar el enfoque, y uno, llamado "micro" (2), para ajustarlo.

La operacin de enfoque requiere seguir unos determinados pasos para realizarla con seguridad. El procedimiento correcto es el siguiente. Mirando por fuera del microscopio se lleva el objetivo junto a la preparacin y mirando luego por el ocular se va separando lentamente hasta obtener la imagen. Si se busca el enfoque acercando el objetivo a la preparacin se corre el riego de producir fracturas (en la preparacin o, en lo que es mucho peor, en la lente frontal del objetivo) si nos pasamos del plano de foco.

H) RANURA: Est situada inmediatamente encima del objetivo y por debajo del analizador. Forma un ngulo de 45 grados con las direcciones de vibracin del polarizador y del analizador. Sirve para introducir las lminas auxiliares y los compensadores.

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I)

LMINAS AUXILIARES Y COMPENSADORES:

Las lminas auxiliares y compensadores estn construidas de sustancias transparentes, incoloras y anistropas (generalmente se trata de tallas de minerales) incluidas en un marco metlico. Estn montadas de tal manera que sus dos direcciones de vibracin son paralelas a los dos lados de la lmina. El componente rpido coincide con la direccin ms larga y el lento con la corta.

Su espesor est calculado para que al introducirlo en el microscopio bajo iluminacin XPL (nicoles cruzados, es decir con el analizador incorporado) produzcan una determinado retardo entre sus ondas (lo que se traducir en un determinado color de interferencia). Unas lminas presentan espesor constante (igual retardo en todo el campo) mientras que otras estn talladas en forma de cua (al irla introduciendo se va metiendo cada vez ms retardo; el color ir variando).

Los efectos que estos compensadores introducen se superponen a los debidos al mineral que se est estudiando. Se usan para analizar el color de interferencia y la figura de interferencia. J) ANALIZADOR: Est situado encima de los objetivos y de la ranura para introducir las lminas auxiliares o compensadoras.

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Es una lmina polaroides que produce luz polarizada plana, similar al polarizador pero colocado con su direccin de vibracin perpendicular.

Esta es la posicin normal de trabajo, con las direcciones de vibracin de polarizador y analizador perpendiculares (este-oeste y norte-sur, respectivamente), no obstante, la direccin de vibracin de la luz en el analizador puede girarse mediante un anillo graduado con una escala (1).

A diferencia del polarizador, el analizador no est siempre incorporado, pudindose poner o quitar de la marcha de los rayos (unas propiedades lo necesitan mientras que otras no).

Cuando est incorporado produce en los minerales unos colores anormales (3) producidos por una interferencia de las ondas polarizadas a la salida de los cristales anistropos, que no guardan relacin con los colores que aparecen al trabajar slo con el polarizador (en este caso el color se debe a una absorcin selectiva de las ondas) (1).
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Si en el campo microscpico no existe ningn mineral que descomponga la luz esta no puede pasar a travs del analizador (viene del polarizador vibrando en direccin perpendicular a la permitida en el analizador) y se ve oscuridad (2), se dice que hay extincin.

K) LENTE DE BERTRAND AMICI: Se encuentra situada inmediatamente debajo del ocular. Puede estar incorporada (1) o removida (2). Se utiliza slo para ver la propiedad llamada Figura de Interferencia (3). La lente de Bertrand-Amici no produce la figura de interferencia, slo mejora su visin. Con el ocular forma un sistema ptico que enfoca la imagen producida por el objetivo y la amplia. La figura de interferencia tambin puede observarse sin la lente de Bertrand, quitando el ocular del microscopio.

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L) OCULARES: Son un sistema de lentes, acopladas en la parte superior del tubo del microscopio, cuya funcin es formar una imagen virtual y amplificada de la imagen real creada por el objetivo. El ocular contiene dos hilos reticulares, orientados en las direcciones norte-sur y este-oeste, que coinciden con las direcciones de vibracin de la luz en el polarizador y el analizador. La mayora de los oculares son de x8 y x10 aumentos.

2. MANEJO DEL MICROSCOPO PETROGRAFICO: a. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. b. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. c. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. d. Para realizar el enfoque: - Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. - Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.
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e. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. f. Empleo del objetivo de inmersin: - Bajar totalmente la platina. - Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. - Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. - Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. - Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. - Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. - Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. - Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. - Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin.
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- Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. 3. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES:

- Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. - Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. - Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. - No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. - Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcoholacetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. - No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). - El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. - Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. - Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.
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4. FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO: - Limpieza de las muestras: Las secciones pulidas se deben limpiar con almina de 005 mm y agua, y secarse con papel suave. No se deben apilar ni tienen que estar en contacto entre ellas. - Montaje de las muestras: Montar las secciones ya limpias sobre un vidrio portaobjetos con plastilina, mediante una prensa manual para obtener una superficie perfectamente horizontal. - Sistema de iluminacin: para evitar el desgaste excesivo de las bombillas, nicamente hay que trabajar con la mxima intensidad cuando se realizan observaciones con analizador. En el resto del tiempo es conveniente realizar las observaciones siempre con la misma intensidad de luz - Diafragma de apertura: Con este diafragma regularemos la luminosidad global del campo. Al cerrarlo se acentan la sensacin de relieve y las sombras. Normalmente debe estar abierto al mximo. - Diafragma de campo: Regula la superficie iluminada. Esta debe coincidir con el campo visual, para evitar al mximo los rayos externos no paralelos. - Objetivos: Observaremos las muestras con los objetivos ms corrientes, con el aire como medio de incidencia. Comparar la variacin de resolucin, nitidez, profundidad de campo y distancia de trabajo para los diferentes objetivos. - Analizador: Para observar con el analizador intercalado habr que aumentar la intensidad de luz. Reducir la intensidad de luz antes de desintercalar el analizador. Al descruzar ligeramente el analizador se acenta el contraste entre los minerales. Sin embargo, para una correcta observacin de la extincin y de los colores de interferencia es imprescindible asegurarse de que el analizador est perfectamente cruzado, es decir que las direcciones de vibracin del polarizador y del analizador sean perfectamente perpendiculares. 5. PREPARACIONES MICROSCOPICAS: Para poder estudiar una muestra en el microscopio petrogrfico es necesario hacer previamente una preparacin. El procedimiento a seguir es distinto segn que se trate de una muestra de material coherente (roca) o suelto (suelo o arena).

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5.1. Preparacin de una roca El proceso se desarrolla en una serie de etapas. Corte

En primer lugar el trozo de roca ha de ser cortado con una sierra de borde de diamante para obtener una superficie plana con el tamao de la preparacin microscpica que se quiera obtener.

Pulido

Una vez obtenida una superficie plana esta se pulimenta para eliminar las huellas del corte y obtener un plano lo ms suave posible.

Pegado

La superficie pulida se pega sobre un portaobjetos de vidrio con un agente cementante incoloro e istropo (Blsamo de Canada, Eukit, resinas de poliester, etc).

Corte final

Una vez pegado el trozo de roca al portaobjetos se corta para obtener una rodaja lo ms fina posible.

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Desgaste

La muestra se desgasta hasta que alcance un espesor de unas 30 micras.

Cubrir

Finalmente la muestra se recubre con un cubreobjetos pegandolo con un cemento similar al usado para pegar la roca al portaobjetos.

5.2. Preparacin de un suelo El proceso es similar al descrito para las rocas con la particularidad que antes de proceder se ha de dar coherencia a la muestra de suelo. Para ello la muestra de suelo se coloca en un recipiente y se incluye al vacio en una resina de poliester. Al polimerizar la resina se endurece produciendo un bloque compacto que engloba a la muestra de suelo conservando imperturbable su estructura natural. A partir de este momento ya se puede seguir todo el proceso descrito para las muestras de rocas. 5.3 Preparacin de arenas La preparacin de una muestra de arena es diferente segn se trate de arenas finas o de arenas gruesas. Arenas finas Las arenas finas por su pequeo tamao (<200 micras) pueden ser montadas directamente sobre un portaobjetos de vidrio. Un portaobjetos se recubre de un fina capa de agente cementante (Blsamo de Canada, o cualquier otro). Se dejan caer cuidadosamente los granos de arena y se recubre la preparacin con un cubreobjetos (evitando la formacin de burbujas).

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Arenas Gruesas Las arenas gruesas tienen un tamao (>200 micras) que las hace opacas si se montan directamente (1), por lo que es necesario incluirlas en una resina para darle coherencia. Para ello se colocan en un pequeo recipiente de fondo plano y se incluyen al vacio como se hace con las muestras de suelos (2).

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MINERALES PETROGRAFICOS VISTOS EN SECCIONES DELGADAS HORNBLENDA TREMOLITA

AUGITA

BIOTITA

MICROCLINA FELDESPATO POTASICO

PLAGIOCLASA

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HIPERSTENO

MOSCOVITA

OLIVINO

TURMLINA

ANDALUCITA

CUARZO

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ORTOPIROXENO

ORTOCLASA

ZIRCON

SERPENTINA

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