PRCTICA # 3 ESTUDIO MICROSCPICO DE LOS MICROORGANISMOS

INTRODUCCIN:
Una de las caractersticas ms importantes de los microorganismos es su tamao minsculo que los hace imperceptibles a simple vista y, aunado a su transparencia, obliga a utilizar (adems del microscopio) tcnicas especiales para observar y estudiar su morfologa y algunas de sus estructuras. Desde Leewenhoek, los pioneros de la microbiologa los observaban en gotas de algn fluido, pero el escaso contraste con el medio y el continuo movimiento impedan el estudio detallado o prolongado de los microorganismos. Koch fue el primero en fijar las preparaciones y teirlas como haba hecho Weigert en histologa. Hoy en da se dispone de una amplia variedad de tinciones microbiolgicas que constituyen herramientas muy importantes para la deteccin, identificacin y control de los microorganismos, que van desde tcnicas sencillas y rutinarias, hasta tinciones altamente sofisticadas para el diagnstico y la investigacin.

OBJETIVOS:
Mediante esta practica, el alumno lograra: Realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones ms utilizadas para el estudio microscpico de los microorganismos. Identificar y describir correctamente las caractersticas morfolgicas y de locomocin de algas y protozoarios. Identificar y describir correctamente las caractersticas microscpicas y tintoriales de las bacterias, tales como forma, agrupacin, cpsulas y si son Grampositivas o gramnegativas.

REPORTE: Tipos de preparaciones:

Preparaciones en fresco: La forma ms simple de preparar un espcimen para su examen microscpico es hacer una preparacin en fresco. Existen dos tcnicas, una preparacin en fresco simple que consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuacin cubrirla con un cubreobjetos. Una preparacin en gota pendiente; esta preparacin se realiza colocando una gota de la suspensin bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un crculo con vaselina (acta como sellador) o parafina; sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavacin central que queda adherido gracias a la vaselina. Se invierte la preparacin y se observa colocndola en la platina del microscopio. La ventaja de esta ltima tcnica, es que la preparacin no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y observar: la movilidad, el tamao y la forma de agrupacin de los microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; as como grnulos refrctiles, esporas si teir y cloroplastos dentro de las clulas vivas. Sin embargo, el inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin por la escasa diferencia entre los ndices de refraccin del medio y de los microorganismos; por otra parte, el movimiento continuo de los microorganismos, as como el causado por las corrientes de fluido, frecuentemente hacen difcil la observacin. Por tanto, su uso, con un microscopio ptico de campo claro, est bastante limitado. A este tipo de preparaciones se pueden agregar colorantes muy diluidos como el cristal violeta, rojo neutro, verde Janus, que aumentan el contraste de las clulas sin afectar su viabilidad. Preparaciones fijas y teidas: La preparacin consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Esta preparacin debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a travs de ella. El extendido o frote se puede hacer de varias maneras: Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequea gota de agua mediante el asa y distribuyndolo en el portaobjetos.

Por impronta, presionando el porta sobre la muestra. Con cinta adhesiva transparente Con hisopo Colocando una gota de la muestra fluida en el porta.

Los extendidos o frotes se dejan secar al are; para asegurar que las clulas queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante la tincin; la preparacin se fija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercrico, procediendo a hacer la tincin. Esta puede ser: Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio; utilizan colorantes. Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparacin y se observa la silueta incolora de los microorganismos. Colorantes: Los colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste; son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les confieren color. Estn formados por un grupo cromforo, que en la parte de la molcula responsable del color y un grupo auxcromo que, al formar sales, les permite disociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden aadirse directamente a una preparacin en fresco; por tanto, colorean clulas vivas. No obstante, la mayora de los colorantes son solamente efectivos despus de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijacin por calor, se realiza una fina extensin de una gota de muestra lquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuacin, se pasa la preparacin de Forma rpida sobre la llama de un mechero; El calor de la llama mata las clulas microbianas por desnaturalizacin de sus protenas. Las protenas coaguladas unen las clulas al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijacin qumica, que es menos agresiva que el calor. Para ello se aade una gota del fijador, por ejemplo, cido smico, formaldehdo, o glutaraldehdo, sobre la muestra lquida con los microorganismos. La fijacin posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de las clulas, lo cual dificulta la identificacin; adems, no permite la observacin del movimiento de los microorganismos. Despus de la fijacin, se aade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el espcimen, para que pueda ser absorbido. A continuacin, se retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua. Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Los colorantes bsicos son aquellos en los cuales el agente que tie es el ion cargado positivamente (el cromforo) y se combinan con los componentes cidos de la clula como ADN y ARN, mientras que en los cidos, el colorante es el ion cargado negativamente y se combinan con los componentes bsicos de la clula, como el citoplasma; es decir se combinan con los componentes celulares en funcin de sus respectivas cargas; por lo tanto, los factores como fuerza inica, composicin del medio, temperatura y pH afectan las tinciones. Los colorantes ms utilizados son los de tipo bsico, ya que la mayor parte de las clulas microbianas poseen cargas dbilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unin. Entre los colorantes bsicos ms comunes se encuentran la safranina, la fucsina bsica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los colorantes cidos se unen a las partes de las clulas cargadas positivamente. Se utilizan para teir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los ms frecuentes estn la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas tcnicas de tincin. Los mordientes intensifican la tincin porque aumentan la afinidad de la clula por el colorante. Se usa cuando la afinidad qumica entre el componente celular y el colorante es baja; tambin se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podran ser visualizados de otra forma. Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes celulares tales como el negro de Sudn, que es liposoluble y permite distinguir los glbulos de grasa. Tipos de tinciones: Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.

Tincin Tinciones simples

Tincin de Gram.

TCNICAS DE TINCIN PARA BACTERIAS Uso Tcnicas Un colorante; Se tie con un colorante bsico (azul de metileno, cristal proporciona contraste violeta, o fucsina bsica) durante unos 5 minutos. Aclarar para observar mejor un brevemente con agua. Se tien casi todas las bacterias; la organismo completo rnayora de los tejidos no se tien. Tinciones diferenciales Dos o ms colorantes; Se cubre la preparacin de bacterias fijadas con cristal distingue entre bacterias violeta y despus con una solucin de iodo (mordiente). Gram positivas y Gram Todas las clulas quedan tenidas de color violeta oscuro. negativas Se decolora con acetona al 95%. Las clulas Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tie con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve ms oscuro y las Gram negativas se tien de rosa. Dos colorantes; distingue Se tien las clulas con fucsina bsica y se calienta a entre las micobacterias emisin de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias (cido-alcohol se tien de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla resistentes) y el resto de de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen las bacterias teidas de rojo; todas las dems se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias cido-alcohol resistentes continan tenidas de rojo, las otras se tien de azul. Tinciones selectivas Tie selectivamente las Se cubre la preparacin con verde de malaquita y se endosporas calienta a emisin de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tie con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la clula toma el color rosa. Permite observar los A las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla flagelos de cido tnico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine. Revela la presencia de Se utiliza tinta china o nigrosina para teir una preparacin cpsulas en fresco del espcimen. Las partculas de colorante no pueden penetrar en la cpsula, que se observa como una regin clara alrededor de la clula.

Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)

Tincin de esporas de Wirtz-Cortitlin Tincin de flagelos de Leifson Tincin negativa

1) Tinciones simples En las tinciones simples se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico como safranina, azul de metileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que aadirlo justo antes del colorante. 2) Tinciones diferenciales Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial consta de dos etapas: una tincin primaria (siguiendo el mismo mtodo que en una tincin simple) seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa. Por ejemplo, la tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias. a) Tincin de Gram Mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin especfica. Desarrollado por el mdico dans Hans Christian Joachim Gram en 1884. Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los

bacilos

de

la

tos

ferina;

Gram

variables

son

los

bacilos

de

Koch

de

la

tuberculosis.

La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin de contraste: En un primer momento las bacterias se tien con violeta de genciana (derivado metilado anilnico) y despus se tratan con la solucin de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potsico y 300 partes de agua); por ltimo se lavan con alcohol etlico, o acetona y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo (en este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante). A veces se aade una contratincin con fucsina o eosina para teir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas ms visibles que tie de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta ms intenso. El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en sus superficies externas. Las clulas Gram negativas poseen una capa de peptidoglicano delgada y una membrana externa. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de membrana externa. b) Tincin de Ziel-Neelsen o para Bacilos cido Alcohol resistentes (BAAR) La tincin diferencial de cido-alcohol resistencia fue desarrollada por Paul Ehrlich en 1 882. Actualmente se utiliza una modificacin de la tcnica de Ehrlich que recibe el nombre de tincin de Ziehl-Neelsen. Esta tincin sirve para teir bacterias del gnero Mycobacterium, el resto de las bacterias se tien de azul por el colorante de contraste. M. tuberculosis, causante de la tuberculosis y M leprae, causante de la lepra o enfermedad de Hansen, se identifican mediante esta tincin. Las micobacterias son cido-alcohol resistentes porque poseen en sus cubiertas lpidos de cidos grasos complejos que forman en su pared celular un material de tipo creo resistente a la decoloracin. Una tincin cido-alcohol resistente se realiza segn los siguientes pasos: Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las clulas de rojo. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la penetracin del colorante en el interior de la clula. Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las clulas excepto de las micobacterias, que la retienen debido a su superficie crea. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de azul todas las clulas previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciacin entre las clulas de Mycobacterum, an teidas de rojo, y las clulas restantes del espcimen. Las micobacterias permanecen teidas de rojo, mientras que el resto de las bacterias toman el color azul del colorante de contraste. 3) Tinciones especficas Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre distintos tipos de microorganismos, las tinciones especficas incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y las cpsulas. *La tincin de esporas de Wirtz-Conklin: Algunas bacterias poseen endosporas, estructuras de resistencia que les permiten sobrevivir en condiciones ambientales extremas. Las endosporas poseen cubiertas gruesas e impermeables que no absorben la mayora de los colorantes. La tincin de esporas de WirtzConklin, sin embargo, es efectiva. Forma de tincin: Tincin con verde de malaquita. Calentamiento a emisin de vapores durante tres a seis minutos, para que el colorante penetre a travs de las paredes de la endospora. Lavado con agua del grifo, que elimina el colorante verde de todas las partes de la clula, con excepcin de las esporas. Tincin de contraste con el colorante rosa safranina. Al final del proceso, las endosporas bacterianas quedan teidas de verde y el resto de la clula (de rosa) Las bacterias Bacillus anthracis y Clostridium perfringens, agentes etiolgicos del carbunco y la gangrena, respectivamente, forman esporas y pueden ser identificadas mediante esta tincin. *La tincin de flagelos de Leifson: Los flagelos son largos y finos apndices de las clulas bacterianas que les permiten moverse, son tan delgados que resultan invisibles al microscopio ptico, si no se realiza una tcnica especial para su tincin. Los distintos mtodos de tincin utilizan combinaciones de mordientes y

metales para engrosar los flagelos, as como colorantes para teirlos. La tincin de flagelos de Leifson se realiza segn la siguiente tcnica: Se fija qumicamente la suspensin bacteriana, mediante formol, y se hace la extensin en un portaobjetos. Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno. Se cubre la preparacin con una mezcla de cido tnico y el colorante rosanilina, de preparacin extempornea. El cido tnico engruesa los flagelos y la rosanilina los tie. Se retira el exceso de colorante con agua. Por ltimo, se deja secar al aire, antes de su observacin al microscopio. Esta tincin permite determinar el nmero y la disposicin de los flagelos de las bacterias, lo que constituye una informacin esencial para la identificacin de muchas especies. La tincin de flagelos es un arte que se adquiere slo con la prctica. *Tincin negativa: Algunas bacterias estn rodeadas por una estructura protectora denominada cpsula. Para poner de manifiesto la presencia de una cpsula se utiliza una tcnica denominada tincin negativa: Se hace una preparacin en fresco del espcimen. Se aade tinta china. Las partculas de carbn de la tinta no pueden penetrar en la cpsula, de manera que solo se ennegrece el fondo. Al microscopio, se observan las clulas y sus capsulas, como zonas claras alrededor de las mismas. Se puede aplicar un colorante para hacer las clulas ms visibles (los colorantes habituales no tien las cpsulas). Tambin se puede usar nigrosina, en lugar de tinta china. *Tincin de ncleo de Feulgen o Giemsa-HCl: Los cromosomas se puede teir por estas tcnicas. En este caso, el HCl reduce la afinidad del citoplasma, especialmente la del ARN, por el colorante y aumenta la afinidad del ncleo por el mismo, de modo que el ncleo por el mismo, de modo que el ncleo se observa bien teido dentro de un citoplasma de coloracin clara. Para observar el ncleo de microorganismos eucariontes tambin se puede utilizar una solucin muy diluida de azul de metileno, que tiene afinidad por los cidos nucleicos combinndose con HgCl2 que precipita las protenas asociadas al ADN lo que determina que se coloreen ms intensamente que el resto de la clula; esta preparacin no debe fijare a la flama, pues precipitaran todas las protenas.

MATERIAL: Microscopio
Mechero Asa y portasa Portaobjetos excavador y normales Cubreobjetos Palillos Pipetas pasteur Vaselina Muestras de pulque, agua de lago cultivos de microorganismos proporcionados por el profesor

Colorantes: safranina, azul de metileno, cristal violeta, solucin de Gram., lugol, alcohol, acetona, nigrosina

PROCEDIMIENTOS y RESULTADOS:
Elaborar preparaciones en fresco: En gota pendiente con muestras de agua de lago. Enfocar y esquematizar a 40x En porta normal, enfocar y esquematizar a 40x Localizar protozoarios y algas microscpicas.

Elaborar tincin negativa: Con una muestra de pulque; teir con nigrosina Colocar una gota de pulque y una de nigrosina paralelamente sobre el porta y mezclar con el asa Realizar un extendido con otro portaobjetos Dejar secar esquematizar a 40x

Preparacin de frotis: 1. 2. 3. Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo. Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de una asa o escobilln Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado 4. Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia (Si la muestra no es lquida, colocar una pequea gota de solucin salina sobre el portaobjetos antes de realizar el frotis y disolver en ella la muestra ) Calentar nuevamente el asa para desinfectarla. Dejar secar el frotis al medio ambiente.

5. 6.

7. Fijarlo pasndolo tres veces a travs de la llama con la muestra hacia arriba. 8. Dejar enfriar el frotis antes de colorearlo

Tincin simple: Cubrir con safranina (1min) Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de decolorante Observar al microscopio

Tincin de Gram.: Cubrir con violeta de genciana (1min) Cubrir con lugol (1min) Decolorar con alcohol-acetona gota a gota Cubrir con fascina bsica (1min) Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de decolorante Observar al microscopio Entre cada paso lavar con agua

DISCUSIN DE RESULTADOS:
Se realizaron 2 tipos de preparaciones con agua del lago de chapultepec en fresco: en gota pendiente, donde se observaron muy pocos protozoarios y algunas algas y en porta normal en donde e logr observar tambin algas y protozoarios pero en mayor cantidad, ms definidos y con mayor claridad. En ambas preparaciones, se logr observar la movilidad, el tamao y la forma de los microorganismos; sin embargo no se lograba observar muy definidamente sus caractersticas esenciales (conformacin) y adems el lquido haca que se movilizaran en el, lo que no permita un estudio adecuado. Se realizaron 3 tipos de tinciones; la primera fue la tincin negativa con muestra de pulque, en la que se observaron cadenas de levaduras, cadenas de levaduras, bacilos, cocos, diplococos. Se observ que el fondo era prpura y las bacterias y levaduras quedaban en blanco muy brillante lograron observar las cpsulas, que estaban rodeadas de negro pero no se tean las cpsulas, esto debido a que las partculas de colorante no pueden penetrar la cpsula debido a que es una estructura protectora de las bacterias que las protege. En la tincin simple (que se realiz con safranina), se observaron levaduras, levaduras en cadena, bacilos y cocos; Se colorearon todos de rojo incrementando as el contraste al ser observadas por el microcopio y as dejando observar ms claramente sus partes. En la tincin de Gram., se observaron cocos grampositivo de color morado en el centro en cadena, solos y como diplococos y levaduras, que se tieron de rosa, pero ya que no son bacterias, por lo tanto no son gram. Algunos cocos no se tieron de morado, sino de rosa, o ni siquiera se tieron, lo que indica que son gramnegativos, esto debido a que las gramnegativos poseen una membrana externa que las protege del colorante, en cambio las grampositivas no tienen membrana, lo que permite que se tian de esta manera diferenciarlas. CONCLUSIONES: Con esta prctica se aprendi a realizar adecuadamente los tipos preparaciones que se utilizan en microbiologa, adems de la correcta preparacin de un frotis para poder realizar posteriormente las tinciones ms utilizadas para el laboratorio de microbiologa que son indispensables para el correcto estudio de los microorganismos; as mismo mediante la realizacin de estas tinciones y preparaciones se logr observar la forma, agrupacin y cpsula, adems de caractersticas de locomocin de algas y protozoarios, as como de algunos tipos de levaduras, que aunque no son bacterias algunas de esta preparaciones y tinciones nos ayudan tambin a observar algunas de sus caractersticas. Con lo estudiado y observado anteriormente se lleg a la conclusin de que conocer las tcnicas de preparacin de frotis y tinciones son indispensables para la microbiologa ya que facilitan el estudio de los microorganismos, as como el estudio de su conformacin, agrupacin y caractersticas fundamentales.

REFERENCIAS:
http://aulavirtual.usal.es/ http://www.ucbcba.edu.bo/

Manual de microbiologa general de la UNAM: Velsquez, M. O.; Vierna, G. L. y Luna, M. B. : Manejo y cuidado de los microorganismos. Pp.25-32

Que diferencias tienen las preparaciones en fresco con las preparaciones fijadas?
PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO. Entendemos por preparaciones en fresco sin modificar o simplemente preparaciones en fresco aquellas en las que la muestra se examina directamente, sin modificar o, como mucho, se diluye o concentra. Presentan las ventajas siguientes: Algunos elementos que queremos observar (microorganismos, clulas humanas, cristales, etc.) se observan suficientemente bien en fresco, ya sea utilizando el microscopio de campo claro o el de contraste de fases. Permiten observar la movilidad de los microorganismos vivos, dato que en ocasiones tiene inters analtico. Algunas son preparaciones que se elaboran de forma rpida, simple y econmica. Observacin de determinados fenmenos microscpicos, tales como divisin celular (clulas animales, levaduras, etc.) o formacin de esporas. Sus inconvenientes son estos: No tienen validez universal: muchos microorganismos no son observables de este modo. Hay caractersticas interesantes de los microorganismos que no son observables de este modo. PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO LIGERAMENTE MODIFICADAS Nos referimos a preparaciones en fresco en las que a la muestra se le ha agregado una sustancia que facilita o mejora la observacin de los microorganismos. Son principalmente montajes hmedos tratados con un solo colorante o reactivo. Suelen usarse colorantes, aunque no siempre es as. Tincin vital. La tincin vital, tambin llamada tincin o coloracin supravital, es un procedimiento intermedio entre el examen en fresco sin modificacin y las tcnicas de fijacin seguida de tincin. Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales o de movilidad de los microorganismos que no es posible observar en fresco ni tras realizar modificaciones fsicas y qumicas profundas, como sucede con la fijacin seguida de tincin. 8

 Se prepara del mismo modo que un montaje hmedo, pero antes de cubrir la gota de muestra con el cubreobjetos se agrega una gota de un colorante que no mate los microorganismos, se mezcla con el asa y se cubre con el cubreobjetos. Los microorganismos que nos interesa observar absorbern el colorante ms que el medio y que los otros elementos formes (si el colorante est bien elegido). Al observarlos en campo claro absorbern ms la luz y aparecern coloreados ms intensamente que otros elementos formes y que el medio que los rodea. Los colorantes usados suelen ser los mismos que se utilizan para las tinciones simples (se vern ms adelante) aunque muy diludos (diluciones de 1/10.000). Esto se hace porque los colorantes son txicos para las clulas. La superior dilucin disminuye su toxicidad y esto permite observar microorganismos teidos y vivos. No hay que olvidar, sin embargo, que la superior dilucin del colorante no anular su toxicidad; tan slo retrasar la muerte de los microorganismos. PREPARACIONES FIJADAS Y TEIDAS. Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias y tambin de otras clulas las preparaciones fijadas y teidas son las que se emplean con mayor frecuencia. Las ventajas de este procedimiento son: Las clulas son ms fcilmente visibles despus de teidas. Pueden diferenciarse especies bacterianas diferentes mediante procedimientos de tincin diferencial. Consideraciones al proceso de tincin En la tincin es imprescindible utilizar colorantes de alta calidad. La presencia de impurezas puede hacer que varen las caractersticas del colorante y con ello las caractersticas de la tincin. Tambin es relativamente frecuente que aparezcan partculas slidas que se depositan sobre la extensin y son confundidas con grmenes u otros elementos formes. Tanto a los colores anormales como a los elementos formes observados que no proceden de la muestra se les llama artefactos. Su concentracin debe ser la adecuada. En algunos procedimientos es necesario calentar y en otros aadir reactivos adicionales, como el lugol en la tincin de Gram. Controlar el tiempo de tincin es fundamental. En general oscila entre 30 segundos y 10 minutos. Si nos pasamos la muestra se tie en exceso, y si el tiempo es insuficiente, no conseguiremos suficiente contraste Tincin simple Los pasos esenciales son: c) Obtener una extensin de la muestra: A esta extensin tambin se le llama frote, frotis o pelcula. Debe ser suficientemente delgada y los ms homognea posible. d) Fijar la extensin e) Tincin: Que puede ser por inmersin o por vertido. f) Lavado g) Secado Tincin diferencial Se llama as a los procedimientos de tincin que ponen de manifiesto diferencias entre distintas clulas, o bien entre las distintas partes de una clula. Estas diferencias pueden observarse gracias no slo a diferencias de forma sino 9

tambin de color. Habitualmente implican el uso de ms de un colorante en etapas sucesivas. Tincin de Gram. Esta coloracin, ideada por Hans Christian Gram a fines del sigl

ADN Y ARN
El ADN es el material gentico de casi todos los organismos vivos que controla la herencia y se localiza en el ncleo de las clulas. Es un cido nucleico compuesto de dos tiras llamadas nucletidos. Las dos tiras se disponen en espiral formando una doble hlice y unidas entre s por enlaces de hidrgeno entre las bases de nucletidos. La informacin gentica est contenida en secuencia a lo largo de la molcula; la cual puede hacer copias exactas de s misma por un proceso denominado replicacin, pasando de este modo la informacin gentica a las clulas hijas, cuando las clulas se dividen. El ARN es uno de los dos tipos de cido nucleico que elaboran las clulas. El ARN contiene informacin copiada del ADN (el otro tipo de cido nucleico). Las clulas elaboran varias formas diferentes de ARN y cada forma cumple una funcin especfica en la clula. Muchas formas de ARN cumplen funciones relacionadas con las protenas. El ARN tambin es el material gentico de algunos virus en lugar del ADN. El ARN se puede producir en el laboratorio y se usa en estudios de investigacin. Tambin se llama cido ribonucleico.

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DIFERENCIAS ENTRE ADN Y ARN: a) Diferencias estructurales La estructura del ADN es de doble cadena, lo que confiere una mayor proteccin a la informacin contenida en l. La estructura de los ARN es monocatenaria aunque, puede presentarse en forma lineal como el ARNm o en forma plegada cruciforme como ARNt y ARNr

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Coloracin simple: la coloracin de las bacterias por la aplicacin de una solucin colorante simple en preparaciones fijas o teidas se conoce como coloracin simple. El frote fijo se inunda con la solucin colorante durante un perodo establecido, despus de lo cual el colorante se arrastra con agua y la lmina se seca con papel secante.

Coloracin diferencial: los procedimientos de coloracin que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas se conocen como tcnica de coloracin diferencial.

Coloracin de gram: esta tcnica diferencial es una de las de uso ms comn en microbiologa. En este procedimiento, el frote bacteriano teido se somete a las soluciones siguientes: a) b) Cristal violeta Solucin de yodo, alcohol.

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c)

Y safranina otra solucin colorante de contraste conveniente.

Las bacterias sometidas al mtodo de gram pertenecen a dos grupo:bacterias gram positivas que retienen el cristal violeta y a parecen color violeta profundo; las bacterias gram negativas que pierden el cristal violeta y por el contraste de la safranina aparecen rojas.(tabla 4.2 coloracin de gram)

Soluciones aplicadas por Gram positivas su orden Cristal violeta Solucin yodo yodurada

Gram negativas

Las bacterias se tien en Las bacterias se tien en violeta violeta Complejo CV-1 se forma dentro de las bacterias, las bacterias permanecen violeta. Las paredes celulares de deshidratan, hay retraccin de los poros, la permeabilidad disminuye, el CV-i no puede salir y queda violeta. Complejo CV-i se forma dentro de las bacterias, las bacterias permanecen violeta. Extraccin de lpidos de las paredes celulares, aumento de porosidad, CV-I sale de la bacteria.

Alcohol

Safranina

Las bacterias no afectadas Las bacterias toman este permanecen violeta. colorante y se tien de rojo.

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