Recuento S.aureus

Recuento Placa S.
aureus
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Investigacin y Recuento de Staphylococcus aureus. Mtodo de recuento en placa
Mtodo de recuento en placa
Staphylococcus aureus
Apartados del Ejercicio
A. Introduccin B. Material C. Medios de cultivo y reactivos D. Preparacin de la muestra E. Preparacin de las diluciones decimales F. Siembra por extensin en supercie G. Incubacin de las placas H. Lectura de las placas y recuentos de colonias I. Clculos y expresin de los resultados J. Conrmacin con la prueba de la coagulasa K. Adiestramiento en la distincin y recuento de colonias de Staphylococcus aureus L. Interpretacin de los resultados del supuesto prctico LL.- Contestacin a las preguntas M.- Envo al servidor de los resultados del ejercicio A. Introduccin
Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocceas de 0,8-1,0 mm de dimetro, que se dividen en ms de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmviles y no forman esporas. Son grampositivas. Es una especie muy sensible a la accin del calor y de los desinfectantes.
Ms del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, fornculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulacin. Adems algunas cepas de S.aureus son patgenas para el hombre porque producen enterotoxinas que dan lugar a la intoxicacin estaloccica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un nmero de al menos 106 ufc/g para producir cantidad suciente de enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor. En resumen, la presencia de un nmero elevado de Staphylococcus aureus en un alimento reeja higiene defectuosa por mala manipulacin. Si, adems, los S. aureus aislados son cepas enterotoxignicas, suponen un riesgo para la salud. Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el nmero detectado sea pequeo y que, sin embargo, exista cantidad detectable suciente de enterotoxina estaloccica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido descendiendo en nmero e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento. El mtodo de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene ms de 100 S. aureus por gramo. B. Material Pipetas de 1 estriles Estufa de cultivo Asa de vidrio estril Asa de cultivo Placas de Petri de 90 mm de dimetro C. Medios de cultivo y reactivos - Medio slido selectivo Baird Parker (B P) Ver composicin y preparacin - Caldo cerebro corazn (Brain Heart Infusin: BHI) Ver composicin y preparacin - Plasma de conejo con cido Etilen diamino tetraactico (EDTA) Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en la prueba de la coagulasa. Este producto se adquiere en casas comerciales.
D. Preparacin de la muestra (Ver videoclip de preparacin de muestra -requiere QuickTime-) Preparacin de la muestra
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Resultados Ejercicio Investigacin y Recuento de Staphylococcus aureus. Mtodo de recuento en placa
1.- Han dado valores superiores a 200 colonias por placa las diluciones: a) 10-1 b) 10-1 y 10-2 -> Esta es la correcta c) 10-1 2.-Para realizar el recuento he escogido las placas de la dilucin: a) 10-1 b) 10-2 c) 10-3 -> Esta es la correcta 3.- El factor de dilucin (D) de las placas que he escogido para realizar el recuento es de: a) 10 b) 100 c) 1000 -> Esta es la correcta 4.-El nmero de colonias que han crecido en la placa A de la dilucin 10-3 ha sido aproximadamente de: a) 25 b) 35< -> Esta es la correcta c) 45 5.- La confirmacin con la prueba de la coagulasa ha dado el resultado siguiente: a) Las 2 colonias confirmadas como coagulasa positiva -> Esta es la
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correcta
b) Las 2 colonias como coagulasa negativas y por lo tanto no confirmadas como S. aureus c) Una colonia coagulasa positiva y la otra colonia coagulasa negativa 6.- El nmero de unidades formadoras de colonia por gramo de muestra ha sido de: a) 3300 (3,3 x 103) UFC de S. aureus por gramo de muestra b) 33000 (3,3 x 104) UFC de S. aureus por gramo de muestra c)330000 (3,3 x 105) UFC de S. aureus por gramo de muestra ->
Esta es la correcta
Resultados Correctas: 0 Incorrectas: 0 Nota 0/10
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Recuento Placa S.aureus
Pesar en condiciones aspticas 10 gramos de muestra.
Aadir 90 ml de agua de triptona al 0,1%.
Homogenizar la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4 minutos, el tiempo vara segn el tipo de alimento. (Si no se dispone de stomacher puede homogenizarse en una trituradora de cuchillas -tipo batidora- a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos) Revivicacin; dejar reposar 1 hora a 20C.
E. Preparacin de las diluciones decimales Preparacin diluciones decimales A partir de esta, se preparan diluciones decimales sucesivas, tomando 1 mL de la primera dilucin y descargndolo en un tubo que contenga 9 mL de diluyente (agua de triptona al 0,1%) y as sucesivamente con las siguientes diluciones.
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Mezclar manualmente cada dilucin agitndola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ngulo de abertura aproximado de 60 entre brazo y antebrazo. O mezclar mecnicamente utilizando un agitador Vortex.
De esta forma obtenemos las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc (es decir 1/100, 1/1000, 1/10000, etc.) Por tanto, los nmeros 100, 1000 y 10000, etc. son los factores de dilucin D.
F. Siembra por extensin en supercie (Ver vdeoclip de la siembra -requiere QuickTime-) Siembra placas de agar Baird Parker En esta etapa, se utiliza un medio de cultivo selectivo Baird Parker en que las colonias de Staphylococcus aureus crecen con un aspecto caracterstico.
Partiendo de las diluciones decimales, sembrar, por diplicado, en placas Baird Parker, mediante extensin en supercie.
G. Incubacin de las placas (Ver vdeoclip de incubacin -requiere QuickTime-)
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Incubar a 37C durante 48 2 horas. Despus de la incubacin, examinar las placas para ver la presencia de colonias sospechosas de S. aureus
H. Lectura de las placas y recuentos de colonias (Ver vdeoclip del recuento -requiere QuickTime-)
El aspecto de las colonias tpicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker es el siguiente: redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de dimetro, hmedas, brillantes, negras, con un borde blanco no, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm. El cloruro de litio y el telurito potsico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la ora competitiva; el piruvato sdico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estalococos. El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsin de yema de huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se forma tambin una zona opaca como consecuencia de la formacin de un precipitado de sales de calcio y magnesio, insoluble en cidos grasos. Esta zona opaca se hace ms visible a partir de las 24 horas de incubacin. El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de las mismas, son las caracteristicas tpicas mas visibles de las colonias tpicas. Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atpicas y desechadas. Recuento de colonias sospechosas. Seleccionar para el recuento aquellas placas que contengan entre 20 y 200 colonias tpicas. Una vez contadas estas colonias en las placas elegidas se deben hacer pruebas conrmativas, en particular la prueba de la coagulasa. Si las colonias contadas son coagulasa positivas entonces expresaremos el recuento como ufc/g de S.aureus coagulasa positivo. Para ello la cifra obtenida en las placas se multiplica por el factor de dilucin de la placa, lo que da como resultado el recuento total de S. aureus coagulasa positivo en 0,1 gramo del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresa el recuento total de S. aureus por gramo o mililitro de muestra. Colonias tpicas
Colonias atpicas
I. Clculos y expresin de los resultados
Clculos: En las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la dilucin y expresar el resultado como Unidades Formadoras de Colonias por g de alimento (UFC/g). Expresin de los resultados: Media del nmero de colonias tpicas en las dos placas x inverso de la dilucin x 10 = UFC/g o UFC/mL N = C x D x 10 donde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL). C= Media del nmero de colonias en las dos placas. D= Factor o inverso de la dilucin.
J. Conrmacin con la prueba de la coagulasa (Ver vdeoclip de la prueba de la Coagulasa -requiere QuickTime-)
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Se seleccionan, como minino, dos colonias tpicas para su conrmacin. Con este n, se investiga la capacidad de la cepa en estudio para producir Coagulasa. La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la brina del plasma. La mayora de las cepas de Staphylococcus aureus patgenas (enterotoxignicas) producen esta enzima. Las colonias tpicas seleccionadas se siembran en caldo infusin cerebro-corazn, BHI (Brain Heart Infusion) contenido en tubos. Incubar a 37 C durante 18-24 horas.
Prueba de la coagulasa: En un tubo de 10 x 75 mm estril, se vierten 0,3 mL de plasma de conejo EDTA reconstituido. Se aade 0,1 mL del cultivo obtenido en caldo BHI. Mezclar suavemente
Incubar a 37C durante 6 horas Incubar a 37 C y examinar a las 6 horas de incubacin.
Coagulasa positiva La reaccin es positiva cuando el cogulo formado es rme.
Coagulasa negativa La reaccin es negativa cuando no se cuagula el plasma.
K. Entrenamiento en la distincin y recuento de colonias de Staphylococcus aureus

Analice cada placa, y conteste a la pregunta, en la columna de la derecha, haciendo clic sobre la letra (en azul), que precede a la contestacin u opcin que crea correcta
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Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) caractersticas tpicas de S. aureus b ) caractersticas atpicas de S. aureus
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En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias tpicas de S. aureus b ) no aparecen colonias tpicas de S. aureus
L. Interpretacin de los resultados del supuesto prctico

Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto prctico han sido los siguientes Placas de Baird Parker(Haga clic sobre la placa para verla a ms aumento) Duplicado A Duplicado B
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10-1
10-2
10-3
Prueba de la coagulasa
Colonia #1
Colonia #2
LL.- Contestacin a las preguntas
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Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opcin correcta.
1.- Han dado valores superiores a 200 colonias por placa las diluciones: a) 10-1 b) 10-1 y 10-2 c) 10-1, 10-2 y 10-3
2.-Para realizar el recuento he escogido las placas de la dilucin: a) 10-1 b) 10-2 c) 10-3
3.- El factor de dilucin (D) de las placas que he escogido para realizar el recuento es de: a) 10 b) 100 c) 1000
4.-El nmero de colonias que han crecido en la placa A de la dilucin 10-3 ha sido aproximadamente de: a) 25 b) 35 c) 45
5.- La conrmacin con la prueba de la coagulasa ha dado el resultado siguiente: a) Las 2 colonias conrmadas como coagulasa positiva b) Las 2 colonias como coagulasa negativas y por lo tanto no conrmadas como S. aureus c) Una colonia coagulasa positiva y la otra colonia coagulasa negativa
6.- El nmero de unidades formadoras de colonia por gramo de muestra ha sido de: a) 3300 (3,3 x 103) UFC de S. aureus por gramo de muestra b) 33000 (3,3 x 104) UFC de S. aureus por gramo de muestra c)330000 (3,3 x 105) UFC de S. aureus por gramo de muestra I.-Comprobar resultados
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Laboratorio de Tecnologa Educativa. Departamento de Microbiologa y Gentica. Universidad de Salamanca.
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Pesar en condiciones aspticas 10 gramos de muestra.

Aadir 90 ml de agua de triptona al 0,1%.

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G. Incubacin de las placas (Ver vdeoclip de incubacin -requiere QuickTime-)

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I. Clculos y expresin de los resultados

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Incubar a 37C durante 6 horas Incubar a 37 C y examinar a las 6 horas de incubacin.

Coagulasa positiva La reaccin es positiva cuando el cogulo formado es rme.

Coagulasa negativa La reaccin es negativa cuando no se cuagula el plasma.

K. Entrenamiento en la distincin y recuento de colonias de Staphylococcus aureus

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LL.- Contestacin a las preguntas

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