Documentos, 35

ISSN 0103-5797 Novembro, 1999

BACTRIAS DIAZOTRFICAS EM ABACAXIZEIROS E BANANEIRAS: TCNICAS DE INOCULAO E MONITORAMENTO

Olmar Baller Weber Jos Ivo Baldani Vera Lucia Divan Baldani Johanna Dbereiner

 Embrapa-CNPAT, 1999 Embrapa-CNPAT. Documentos, 35 Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Agroindstria Tropical Rua Dra. Sara Mesquita 2270 Planalto Pici Caixa Postal 3761 CEP 60511-110 Fortaleza, CE Tel. (085)299-1800 Fax: (085)299-1803 / 299-1833 Endereo eletrnico: marketing@cnpat.embrapa.br Tiragem: 500 exemplares Comit de Publicaes Presidente: Raimundo Braga Sobrinho Secretrio: Marco Aurlio da Rocha Melo Membros: Ervino Bleicher Francisco das Chagas Oliveira Freire Francisco Fbio de A. Paiva Janice Ribeiro Lima Jos Lus Mosca Tnia da Silveira Agostini Coordenao editorial: Marco Aurlio da Rocha Melo Diagramao: Arilo Nobre de Oliveira Normalizao bibliogrfica: Rita de Cssia Costa Cid Reviso: Mary Coeli Grangeiro Ferrer

WEBER, O.B.; BALDANI, J.I.; BALDANI, V.L.D.; DBEREINER, J. Bactrias diazotrficas em abacaxizeiros e bananeiras: tcnicas de inoculao e monitoramento.Fortaleza: Embrapa-CNPAT, 1999. 16p. (Embrapa-CNPAT. Documentos, 35). Te r m o s pa r a i n d e x a o : Endfito; Ecologia microbiana; Microbiologia.

CDD: 571.72

SUMRIO

1 INTRODUO ..................................................................................... 5 2 PROCESSO DE MICROPROPAGAO DE ABACAXIZEIROS E BANANEIRAS ................................................................................... 6 3 INOCULAO DE BACTRIAS DIAZOTRPICAS EM MUDAS MICROPROPAGADAS .................................................... 8 4 MONITORAMENTO DE BACTRIAS DIAZOTRPICAS NO AMBIENTE ................................................................................... 12 5 CONSIDERAES FINAIS ............................................................... 13 6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................. 13

BACTRIAS DIAZOTRFICAS EM ABACAXIZEIROS E BANANEIRAS: TCNICAS DE INOCULAO E MONITORAMENTO

Olmar Baller Weber1 2 Jos Ivo Baldani 3 Vera Lucia Divan Baldani 4 Johanna Dbereiner

1 INTRODUO
As bactrias diazotrficas tm sido isoladas de vrias culturas, alm de leguminosas e gramneas, que tm importncia econmica e social. De plantas de tubrculos como a mandioca foram isoladas bactrias do gnero Burkholderia, entre outras (Balota, 1994). J em plantas de batata-doce tm sido detectadas espcies de Azospirillum ( Hill et al., 1983) e Acetobacter diazotrophicus (Paula, 1992). Esta ltima espcie tambm tem sido isolada de plantas de caf (Jimnez- Salgado et al., 1998) Na rizosfera de fruteiras tropicais tm sido isoladas espcies de Azospirillum (Subba Rao, 1983; Ghai & Thomas, 1989). Espcies deste gnero e bactrias diazotrficas do tipo Herbaspirillum e Burkholderia foram tambm isoladas de razes e partes areas de abacaxizeiros e bananeiras (Weber, 1998). As bactrias do gnero Azospirillum tambm foram identificadas em razes de palmeiras (Ferreira et al., 1995). As bactrias diazotrficas podem estimular o crescimento de plantas, como, por exemplo, batata-doce (Paula, 1992), mandioca (Balota, 1994), abacaxi e banana (Weber, 1998). No existe, porm, evidncia da fixao biol-

Eng. Agr., D.Sc., Embrapa - Centro Nacional de Pesquisa de Agroindstria Tropical (CNPAT), Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Planalto Pici, Caixa Postal 3761, CEP 60511-110 Fortaleza, CE. Eng. Agr., Ph.D., Embrapa - Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia (CNPAB), Km 47, Caixa Postal 74505, CEP 23851-970 Seropdica, RJ. Biloga, Ph.D., Embrapa - CNPAB. Enga. Agra., D.Sc., Embrapa - CNPAB.

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gica de nitrognio (FBN) nessas plantas, em contraste ao que ocorre com gramneas. A contribuio principal das bactrias parece estar relacionada com a produo de substncias reguladoras de crescimento. As bactrias do gnero Azospirillum so capazes de produzir hormnios de crescimento (Fayez & Daw, 1987; Bashan & Levanony, 1990; Bric et al., 1991; Okon & Landera Gonzalez, 1994), bem como outras bactrias diazotrficas (Balota, 1994; Bevivino et al., 1994; Malik et al., 1997). A aplicao das bactrias diazotrficas em mudas de abacaxi e banana torna-se bastante facilitada, uma vez que as plantas so propagadas vegetativamente. A inoculao de mudas das fruteiras particularmente importante com a micropropagao, sendo que as plantas podem ser colonizadas no laboratrio pelas bactrias livres da concorrncia com a microbiota indesejvel do solo.

2 PROCESSO DE MICROPROPAGAO DE ABACAXIZEIROS E BANANEIRAS

As mudas de bananeiras cv. Prata An (grupo AAB) e cv. Yangambi (grupo AAA) e de abacaxizeiros cv. Prola (grupo Pernambuco) e cv. Perolera (grupo Maipor) podem ser obtidas pelo cultivo de meristemas caulinares in vitro. O estabelecimento dos meristemas das plantas pode ser realizado no meio MS (Murashige & Skoog 1962), modificado pela suplementao com 30 g .L-1 de acar, ajustando-se o pH final para 5,8 (Tabela 1). O perodo de adaptao dos explantes de aproximadamente 30 dias, e os frascos, no primeiro dia, devem ser colocados em ambiente sem luz para evitar o escurecimento e a oxidao dos meristemas. A proliferao do material de banana ocorre com este meio acrescido de 2,5 mg . L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP) e do de abacaxi, com o meio suplementado de 0,5 mg de BAP . L-1 + 0,5 mg de cido naftalenoactico (ANA) . L-1. Nessa fase, os meristemas so inicialmente seccionados na posio longitudinal e, posteriormente, passam por at seis subcultivos sucessivos. O enraizamento de plntulas d-se com 30 dias no meio de adaptao, quando as bactrias diazotrficas podem ser inoculadas. Os aspectos relacionados propagao in vitro de bananeiras foram apresentados por Souza et al. (1997), e de abacaxizeiros por Fitchet (1990).

TABELA 1. Composio do meio de cultura utilizado para a micropropagao de abacaxizeiros e bananeiras.

Meio de cultura1 Ingredientes Adaptao Proliferao 2 Concentrao (mg . L )
-1

Enraizamento

NH4NO3 KNO3 CaCl2 . 2H2O MgSO4 . 7H2O KH2HPO4 FeSO4 . 7H2O NaEDTA . 2H2O KI H3BO3 MnSO4 . 4H2O ZnSO4 . 7H2O NaMoO4 . 2H2O CuSO4 . 5H2O CoCl2 . 6H2O Tiamina HCl Piridoxina HCl cido nicotnico Glicina Inositol Sacarose Agar Faixas de pH
1 2

1650 1900 440 370 170 27,8 37,3 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,1 0,5 0,5 2 100 30000 -

1650 1900 440 370 170 27,8 37,3 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,1 0,5 0,5 2 100 30000 7000 5,7 a 5,9

1650 1900 440 370 170 27,8 37,3 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 0,1 0,5 0,5 2 100 30000 7000

Meio MS (Murashige & Skoog, 1962). Meio de proliferao de bananeiras: acrescentar 2,5 mg/L de 6-benzilaminopurina no meio MS e, na multiplicao de abacaxizeiros, 0,5 mg/L de cido naftaleno-actico + 0,5 mg/L de 6-benzil-aminopurina.

3 INOCULAO DE BACTRIAS DIAZOTRFICAS EM MUDAS MICROPROPAGADAS

As mudas de abacaxizeiros e bananeiras micropropagadas podem ser inoculadas na fase de enraizamento in vitro no laboratrio ou na fase de adaptao na casa de vegetao. A seguir so apresentadas as etapas que envolvem o preparo e a inoculao das bactrias diazotrficas, sob condies asspticas no laboratrio. 1) Escolher estirpes eficientes na promoo do crescimento das plantas. 2) Ativar as estirpes selecionadas em meio semi-slido e semi-especfico (Tabela 2), incubando-as durante dois a trs dias temperatura de 30 C. 3) Riscar as culturas, crescidas na forma de pelculas subsuperficiais no meio semi-slido, sobre o meio slido rico (Tabela 3), em placas. 4) Incubar as placas durante dois dias a 30 C, para avaliar a morfologia das colnias e certificar-se das caractersticas morfolgicas das estirpes selecionadas. 5) Repicar colnias isoladas de bactrias diazotrficas das placas para frascos contendo meio lquido Dygs modificado (Tabela 3) ou meio com sais de NFb, LGI ou JMV, acrescidos de 1 g . L-1 de cloreto de amnio (Tabela 2), incubando-os durante um a dois dias a 30 C sob agitao constante a 100 rpm. 6) Medir a densidade tica das culturas crescidas no meio lquido em espectrofotmetro a 550 - 600 nm de comprimento de onda, para uniformizar as populaes de bactrias diazotrficas a serem inoculadas. 7) Transferir alquotas ( 108 clulas) da cultura bacteriana para frascos com capacidade para 80 a 100 mL (tampados com rolhas de algodo), contendo 5 a 10 mL da soluo Hoagland sem nitrognio (Tabela 4) autoclavada, ou a soluo composta de da concentrao dos sais de NFb (Tabela 3) esterilizada. 8) Transferir plntulas das fruteiras micropropagadas sadias e uniformes em tamanho e peso para os frascos com inculos bacterianos. 9) Incubar durante cinco a sete dias os frascos com as mudas nas mesmas condies do cultivo de explantes no laboratrio.

10) Proceder a transferncia das mudas colonizadas pelas bactrias diazotrficas para sacos ou vasos de plstico, contendo um substrato desinfestado de solo e areia ou vermiculita na casa de vegetao ou telado. 11) Adequar os nutrientes e equilibrar a umidade do substrato para prximo da capacidade de campo, durante a fase de aclimatao das mudas na casa de vegetao. Na fase de pr-inoculao das mudas de abacaxizeiros e bananeiras (etapa 6), tambm pode ser utilizado um substrato agarizado (7 g/L) com 40 mL da soluo Hoagland sem nitrognio (Weber, 1998). Este procedimento de inoculao foi inicialmente desenvolvido para inocular bactrias diazotrficas em plantas de arroz (Baldani, 1996). Por sua vez, a inoculao de mudas de abacaxizeiros e bananeiras micropropagadas durante sua fase de aclimatao na casa de vegetao envolve as etapas apresentadas a seguir. 1) Seguir os procedimentos apresentados at a etapa 5. 2) Misturar a cultura lquida ou as populaes de bactrias diazotrficas suspensas em soluo contendo dos sais de NFb (Tabela 3) com turfa esterilizada. Esta ltima suspenso de bactrias pode ser obtida com uma centrifugao da cultura lquida durante 30 min ou mais a 5.000 rpm e o descarte do meio lquido. 3) Aplicar as amostras de turfa contendo as bactrias diazotrficas (108 clulas/planta) nos vasos, em camada subsuperficial do substrato desinfestado ou esterilizado. 4) Repicar mudas das fruteiras micropropagadas sadias e uniformes em tamanho e peso para pequenas covas nos vasos. 5) Adequar os nutrientes e equilibrar a umidade do substrato para prximo da capacidade de campo, durante a fase de aclimatao das mudas na casa de vegetao. A inoculao das mudas na casa de vegetao requer maior controle das condies do ambiente, uma vez que o estabelecimento de bactrias diazotrficas na rizosfera ou parte area das plantas tem influncia direta de fatores biticos, como a competio, a predao, o antagonismo e a planta hospedeira, e fatores abiticos, a exemplo de umidade, oxignio, temperatura, pH, nutrientes inorgnicos e presena de altos nveis de nitrognio no substrato.

TABELA 2. Composio de meios semi-slidos e semi-especficos utilizados para o cultivo de bactrias diazotrficas associadas s plantas no leguminosas.
Meio de cultura1 NFb 5 500 200 20 100 JNFb 5 600 1.800 200 20 100 JMV 5 600 1.800 200 20 100 LGI 5 200 600 200 20 2 10 LGI-P 100 200 600 200 20 2 10

Ingredientes Sacarose Malato Manitol K2HPO4 KH2PO4 MgSO4. 7H2O CaCl. 2H2O NaCl NaMoO4. 2H2O FeCl3. 6H2O Azul de bromotimol (soluo 0,5% em 0,2N de KOH) Soluo de micronutrientes2 Soluo de ferro KOH Soluo de vitaminas4 Agar Faixa de pH5
1 2

Concentrao g . L-1 g.L g.L

-1 -1 -1

mg . L

mg . L-1 mg . L-1 mg . L mg . L
-1 -1

mg . L-1 mg . L-1

mL . L-1 mL . L-1
3

2 2 4 4,5 1 1,8 6,5

2 2 4 4,5 1 1,8 5,8

2 2 4 1 2,1 4,2 - 4,5

5 1 1,8 6,0 - 6,2

5 1 1,8 5,5

mL . L

-1

g . L-1 mL . L-1 g.L -1

Meios JMV (Baldani, 1996), NFb, JNFb, LGI e LGI-P (Dbereiner et al., 1995). Soluo de micronutrientes: pesar 1.000 mg de Na 2MoO4. 2H2O + 1.175 mg de MnSO 4. H 2O + 1.400 mg de H3BO3 + 40 mg de CuSO 4. 5H2O + 120 mg de ZnSO4. 7H2O e completar para 1.000 mL. Soluo de FeEDTA: pesar 1.210 mg de Na2H2EDTA + 600 mg de FeCl3. 6H2O e completar para 100 mL. Soluo de vitaminas: pesar 10 mg de biotina + 20 mg de piridoxina - HCl e completar para 100 mL. Ajuste de pH: utilizar cido actico (10%) para o meio LGI-P e solues de KOH (10%) ou H 2SO4 (5%) para os demais meios de cultura.

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TABELA 3. Composio de meios ricos slidos utilizados para o cultivo de bactrias diazotrficas isoladas de plantas no leguminosas.

Meio de cultura Ingredientes Concentrao Batata Peptona bacteriolgica Glucose Glicerina Sacarose cido mlico Extrato de levedura cido glutmico K2HPO4 MgSO4. 7H2O Soluo de micronutrientes Soluo de vitaminas Agar Faixa de pH
1

Batata1 200 2.500 2.500 2 1 15 6,5 a 7,0

Dygs 2 1.500 2.000 2.000 2.000 1.500 500 500 15 6,0 a 6,5

King B3 10.000 10 1.500 1.500 15 6,8 a 7,0

g . L -1 mg . L mg . L mg . L mg . L mg . L mg . L mg . L mg . L mg . L
4 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1

mL . L mL . L g.L -

-1

Meio batata: pesar a batata inglesa, lavar e ferver durante 30 min. Em seguida, filtrar em funil com algodo. Misturar as quantidades de sais em 50 mL, ajustando com KOH o pH para 6,5 a 7,0. Misturar o filtrado, as solues e o agar e completar para 1.000 mL (Dbereiner et al., 1995). Meio Dygs modificado (Rodrigues Neto et al., 1986). Meio B de King et al. (1954) modificado. Soluo de micronutrientes: pesar 1.000 mg de Na2MoO4. 2H2O + 1.175 mg de MnSO4. H2O + 1.400 mg de H3BO 3 + 40 mg de CuSO4. 5H 2O + 120 mg de ZnSO4. 7H2O e completar para 1.000 mL.

Soluo de vitaminas: pesar 10 mg de biotina + 20 mg de piridoxina - HCl e completar para 100 mL.

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TABELA 4. Composio de soluo nutritiva1 utilizada para a nutrio de plantas colonizadas pelas bactrias diazotrficas.

Ingredientes

Concentrao

KH2PO4 K2HPO4 CaSO4 . 2H2O MgSO4 . 7H2O Micronutrientes2 Soluo de ferro3 Faixa de pH
1 2

136 mg . L-1 174 mg . L-1 172 mg . L-1 250 mg . L-1 1 mL . L-1 1 mL . L-1 6,0 - 6,2

Soluo nutritiva de Hoagland & Arnon (1950), sem nitrognio. Soluo de micronutrientes: pesar 2,86 mg de H3BO3 + 1,81 mg de MnSO4. 4H2O + 0,22 mg de ZnSO4 . 7H 2O + 0,08 mg de CuSO4 . 5H 2O + 0,02 mg de Na2MoO4 . 2H2O e completar para 1.000 mL. Soluo de ferro: pesar 1.210 mg de Na2H2EDTA + 600 mg de FeCl 3 . 6H2O e completar com gua destilada para 100 mL.

4 MONITORAMENTO DE BACTRIAS DIAZOTRFICAS NO AMBIENTE

Nos trabalhos de inoculao das plantas com bactrias diazotrficas h necessidade de discriminar as bactrias introduzidas para se conhecer a sua disperso e a sua funo, bem como identificar as mudanas provocadas sobre as amostras inoculadas. As espcies de bactrias podem ser diferenciadas com base na morfologia das clulas e na fisiologia de crescimento em meios semi-slidos e semi-especficos (Dbereiner et al., 1995), meio com sais de JNFb (Tabela 3), acrescido de diferentes fontes de carbono (Weber,

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1998). Os aspectos fisiolgicos, ecolgicos, genticos, moleculares e de ultraestrutura das interaes de bactrias diazotrficas com as plantas constituem-se num requisito bsico para a manipulao dessas associaes. O uso de sondas oligonucleotdicas direcionadas para acoplamento em regies definidas nas subunidades 16S ou 23S de rRNA tambm tem sido enfatizado na identificao das espcies de bactrias diazotrficas associadas s plantas. As sondas podem ser marcadas com corantes fluorescentes, o que permite a deteco in vivo das bactrias nas amostras (Manz et al., 1992; Hartmann et al., 1995), o estabelecimento das relaes entre grupos e espcies (Amann et al., 1995), bem como a identificao das espcies de bactrias diazotrficas (Kirchhof et al., 1997 a e b; Weber, 1998).

5 CONSIDERAES FINAIS
As bactrias diazotrficas tm amplo espectro de ocorrncia, sendo detectadas tambm em culturas no leguminosas e no gramneas. Em associao com fruteiras como bananeiras e abacaxizeiros tm sido identificadas espcies de Azospirillum, bactrias do tipo Herbaspirillum e Burkholderia. Contudo, estirpes dos ltimos gneros de bactrias diferem na promoo do crescimento de mudas micropropagadas. Isso sugere que as bactrias devem passar por um processo seletivo antes da sua aplicao nas fruteiras. No presente trabalho so apresentadas tcnicas de inoculao de bactrias diazotrficas em mudas de abacaxizeiros e bananeiras micropropagadas, e discutidas as formas de monitoramento delas no ambiente. Neste contexto, a aplicao prtica das bactrias promotoras de crescimento pode ser aliada preservao dos sistemas de cultivo.

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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