Significacin biolgica y clnica de las enzimas proteolticas y sus inhibidores en los carcinomas humanos 471 F.J. Vizoso Pieiro.

A. Martnez Merino. J. Vzquez Rojo. M.L. Lamelas Surez-Pola. A. Rodil. J.L. Garca Muiz.

Las enzimas proteolticas han adquirido recientemente un gran inters en fisiopatologa tumoral debido a su papel potencial en la degradacin de los componentes principales de la matriz extracelular y membrana basal facilitando, de esa forma, la invasin tumoral y las metstasis. Las enzimas proteolticas que son expresadas por los carcinomas humanos se agrupan en cuatro grandes familias: metaloproteinasas, aspartilproteinasas, cisten-proteinasas y sern-proteinasas. La expresin tumoral de la mayora de estas enzimas ha sido asociada con un comportamiento ms agresivo de los carcinomas humanos y un pronstico desfavorable de los pacientes. Sin embargo, su expresin tumoral no siempre implica un pronstico adverso, ya que enzimas como el activador tisular del plasmingeno, el antgeno prosttico especfico y el pepsingeno C han sido asociadas con un pronstico favorable en pacientes con cncer de mama. Adems, existen datos que sugieren que estas expresiones tumorales pueden estar rela cionadas con una va especfica de respuesta hormonal, lo que resulta demostrativo del complejo papel que pueden desempear las enzimas proteolticas en la fisiopatologa tumoral. Por otra parte, el resultado final de la accin de las enzimas pro teolticas depender en gran medida del balance con sus inhibidores naturales, producidos por las propias clulas tumorales para coordinar su accin invasiva, o bien por las clulas estromales como mecanismo de defensa ante la progresin tumoral. Finalmente, existen datos recientes que indican que la utilizacin de inhibidores sintticos de las enzimas proteolticas puede representar una nueva y prometedora alternativa teraputica para los carcinomas humanos. Palabras clave: Metaloproteinasas. Aspartil-proteinasas. Sern-proteinasas. Cistenproteinasas. Inhibidores de las proteinasas. Invasin tumoral. Biological and clinical significance of proteolytic enzymes and their inhibitors in human carcinomas Proteolytic enzymes have recently become a subject of great interest in the study of tumor physiopathology owing to their potential role in the degradation of the major components of the extracellular matrix and basal membrane, thus facilitating tumor invasion and metastases. The proteolytic enzymes expressed by human carcinomas are grouped into four large families: metalloproteinases, aspartyl proteinases, cysteine proteinases and serine proteinases. Expression of most of these enzymes by human carcinomas is associated with a more aggressive behavior and a poor prognosis. However, some of them, such as tissue-type plasminogen activator, prostate-specific antigen and pepsinogen C, have been associated with a favorable prognosis in breast cancer patients. In addition, there are data suggesting that their expression by tumors may be related to a specific pathway of hormone responsiveness, which would demonstrate the complex role that proteolytic enzymes may play in tumor physiopathology. On the other hand, the final results of the action of these enzymes would depend to a great extent on their equilibrium with respect to their natural inhibitors, produced either by the tumor cells themselves to coordinate their invasive action or by stromal cells as a defense mechanism against tumor progression. Finally, recent findings indicate that the utilization of synthetic inhibitors of proteolytic enzymes may represent a promising, new therapeutic alternative for human carcinomas. Keywords: Metalloproteinases. Aspartyl proteinases. Serine proteinases. Cysteine proteinases. Proteinase inhibitors. Tumor in vasion. Cir Esp 2000; 68: 471-485 Introduccin

El cncer se ha definido como una serie progresiva de alteraciones genticas que ocurren en un nico clon de clulas a causa de alteraciones en un nmero limitado de genes: los oncogenes y los genes supresores tumorales1. Sin embargo, podemos tambin considerar al cncer como una forma aberrante de vida, de extraordinaria complejidad, y que no puede explicarse nicamente por lesiones genticas aisladas2. As, tras el proceso de transformacin de la clula normal en cancerosa, la evolucin secuencial de las clulas transformadas hacia la invasin tumoral y la metastatizacin implican una serie de acontecimientos celulares y moleculares relacionados con las clulas tumorales mismas y con la estroma adyacente al tejido lesionado3,4. De esa concepcin ms global del proceso canceroso, han surgido un buen nmero de parmetros biolgicos que nos permiten conocer mejor la historia natural del cncer. Uno de esos nuevos aspectos de la biologa molecular de los carcinomas humanos son las enzimas proteolticas que, producidas por las propias clulas tumorales, o bien por las de la estroma peritumoral, han adquirido en la presente dcada un inters especial. Esto es debido a su papel potencial en la degradacin de la matriz extracelular y la membrana basal, facilitando as la invasin tumoral y las metstasis, que son aspectos absolutamente claves en la historia natural del cncer5,6. La matriz extracelular est compuesta de una amplia variedad de molculas cuyos componentes principales son: fibronectina, laminina, vitronectina, colgeno tipo IV, trombospondina, elastina, cido hialurnico, factor de von Willebrand y heparansulfato de proteoglicano. Pues bien, para cada uno de esos componentes estructurales existen enzimas degradativas especficas, pero cuya participacin en el proceso tumoral es muy diversa. As, observaciones recientes han permitido concluir que los diversos tipos de tumores utilizan distintas proteinasas o combinaciones de ellas para penetrar en el tejido adyacente y desencadenar la aparicin de metstasis. Sin embargo, tambin hay que considerar que la degradacin de la matriz extracelular y membrana basal en el contexto tumoral es, adems, un proceso dinmico que depende, en buena medida, del balance entre las propias proteinasas y sus inhibidores naturales especficos. Estos ltimos pueden ser producidos por las propias clulas tumorales con el fin de coordinar su accin invasiva, o bien por las clulas de la estroma tumoral con el objeto de delimitar la lesin tumoral 7. A todo ello podemos aadir que las enzimas proteolticas pueden actuar a travs de otros mecanismos que tambin tienen importancia en la patologa tumoral. As, estas enzimas pueden estimular la proliferacin y diferenciacin celular, activar hormonas y factores de crecimiento, reducir la adhesividad de las clulas malignas, alterar la membrana celular, promover la migracin celular o estimular la secrecin y activacin de otras proteinasas8. En aos recientes, se han multiplicado los esfuerzos de diferentes grupos de investigadores sobre el papel de las enzimas proteolticas en la patologa tumoral. Estas investigaciones han generado mucha informacin clnica acerca de la significacin pronstica de la expresin de estas protenas en los carcinomas humanos y, quiz lo ms importante, tambin han permitido abrir nuevas posibilidades para su tratamiento mediante el bloqueo o inhibicin de su accin degradativa. Las enzimas proteolticas que estn implicadas en los carcinomas humanos pertenecen a cuatro diferentes grandes familias: metaloproteinasas, aspartil-proteinasas, sern-proteinasas y cisten-proteinasas. Adems, tambin cabe destacar el papel de sus inhibidores naturales, cuya implicacin en la fisiopatologa tumoral trasciende en algunos casos, incluso, la de mera inhibicin de las proteinasas. Metaloproteinasas de la matriz extracelular Las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMP) pertenecen a una familia de al menos 19 miembros que son el producto de genes relacionados entre s 9. Estas enzimas pueden ser clasificadas, de acuerdo con criterios estructurales y funcionales, en cuatro grandes familias de diferente especificidad de sustrato: colagenasas, gelatinasas, estromalisinas y metaloproteinasas de membrana (tabla 1). Adems, tambin hay algunos miembros de la familia de MMP, como la macrfago metalo elastasa10, la estromalisina-311, la MMP-1912 y la enamelisina13, que poseen caractersticas especiales que impiden su clasificacin en alguno de los citados grupos.

Todas la MMP tienen unas caractersticas comunes, incluyendo la presencia de dos tomos de cinc en el sitio activo de la molcula y un residuo caracterstico de cistena, esencial para el mantenimiento de su latencia enzimtica14. Adems, todas las MMP son secretadas como proenzimas que requieren un pH neutro para poder actuar y son inhibidas por una familia especfica de protenas, que se denominan inhibidores tisulares de MMP (TIMP) 15. Las MMP estn ampliamente distribuidas en el organismo humano, donde desempean una serie de funciones fisiolgicas como la cicatrizacin16, la reabsorcin sea17, la involucin mamaria18 y otras funciones fisiolgicas asociadas al embarazo y al parto 19. Adems, ms recientemente se ha demostrado que estas enzimas tambin estn implica dos en multitud de variados procesos patolgicos como la artritis reumatoide20, enfermedad periodontal21, la esclerosis mltiple22, las enfermedades cardiovasculares23 o ciertas alteraciones hematolgicas24. El mecanismo fisiopatolgico por el que las MMP y los TIMP estn implicados en estos procesos es a travs de una alteracin del recambio de la matriz extracelular. Todos esos hallazgos han motivado un cambio sustancial en la concepcin fisiopatolgica de muchos de esos procesos benignos. Pero, sin duda, el aspecto que ha generado mayor inters en investigacin clnica es el papel de las MMP en la fisiopatologa tumoral. Esto se debe a que la expresin tumoral de estas enzimas ha sido relacionada con el potencial metastsico de las clulas cancerosas, ya que el proceso de invasin tumoral conlleva la degradacin de determinados elementos de la membrana basal y de la estroma intersticial, como colgenos, laminina, fibronectina, tenascina, gelatinas y proteoglicanos, que son todos ellos sustrato de las MMP 6. Por otra parte, un aspecto relevante de la dinmica de las MMP en la fisiopatologa tumoral es que su expresin puede tener lugar no slo en las propias clulas cancerosas, sino tambin en las clulas estromales peritumorales. As, por ejemplo, se ha demostrado que el ARN y la protena estromalisina-3 se detectan especficamente en los fibroblastos circundantes a las clulas neoplsicas mamarias, pero no en los fibroblastos de la glndula mamaria normal 11,25. Adems, diversos estudios demostraron la expresin de gelatinasa A (MMP-2), mediante estudios de inmunohistoqumica o bien de hibridacin in situ, por las clulas tumorales en una amplia variedad de carcinomas humanos (tabla 2). Estas investigaciones parecen indicar que las clulas tumorales mismas son las principales productoras de gelatinasa A en los tumores malignos in vivo. Sin embargo, los estudios de hibridacin in situ han sealado que el ARNm de la gelatinasa A se expresa en las clulas estromales adyacentes a tumores humanos de piel 26, colon27 y crvix uterino28, y no por las propias clulas tumorales. Se ha sugerido que esa aparente discrepancia entre los estudios de inmunotincin y de hibridacin in situ puede deberse a la unin y/o interiorizacin en las clulas cancerosas de la MMP producida por los fibroblastos peritumorales29. Adems, a esto podemos aadir que existen datos que indican que la produccin de MMP por las clulas estromales peritumorales est motivada por determinadas seales bioqumicas originadas en las propias clulas cancerosas. En este sentido, estudios realizados en el cncer de mama demostraron que la colagenasa-3 (MMP-13) es expresada por los fibroblastos peritumorales mediante activacin por factores difusibles liberados por las clulas cancerosas, como la in terleucina-1 alfa y el factor transformante del crecimiento (TGF-)30,31 (fig. 2). As pues, esto resulta indicativo de un papel relevante de la relacin clulas tumorales-clulas estromales en el contexto de la progresin tumoral, que representa un nuevo paradigma con importantes implicaciones para la fisiopatologa y terapia del cncer. Pero, independientemente del origen celular de la produccin de las MMP en el marco tumoral, estudios recientes demostraron una asociacin significativa entre una expresin tumoral aumentada de diferentes metaloproteinasas y un peor pronstico de los pacientes afectados de diferentes tumores, en trminos de supervivencia libre de enfermedad y de supervivencia total. As, se ha descrito que la expresin tumoral de estromalisina-3 est asociada a un peor pronstico en el cncer de mama32,33 y de colon34; la colagenasa intersticial en el cncer colorrectal35, esofgico36 y en condrosarcomas37; la gelatinasa B en el cncer colorrectal38; la gelatinasa A en el cncer gstrico39, de ovario40, de mama41 y de vejiga urinaria42, y la colagenasa-3 en el cncer de mama43.

Aspartil-proteinasas En este grupo de enzimas proteolticas se encuentra la catepsina D (cat-D), que es una proteasa cida lisosomal presente en todas las clulas a bajas concentraciones, y el pepsingeno C (pep-C), que es una enzima proteoltica normalmente involucrada en la digestin de protenas en el estmago y en la pro telisis del lquido seminal en la vagina. La cat-D se ha propuesto como un marcador de dependencia estrognica de los tumores, como un factor de crecimiento y como una proteasa importante en la invasin tumoral. Esta propuesta se basa en estudios in vitro que demostraron que distintas lneas celulares de tumores humanos secretan activamente una forma precursora de la cat-D (pro-cat-D) que, tras autoactivacin a pH cido, puede promover la proliferacin celular actuando como mitgeno autocrino, favorecer la capacidad invasiva y metastatizante de los tumores, y degradar distintos componentes de la matriz extracelular, incluyendo protenas de adhesin 44-46. Adems, en ese tipo de estudios tambin se ha demostrado que la cat-D puede activar formas precursoras latentes de otras enzimas proteolticas implicadas en la cascada metastsica, como la cat-B y L. Aunque no existen, en la actualidad, pruebas evidentes de que la cat-D pueda tambin facilitar in vivo esos procesos, distintas investigaciones clnicas aportan datos sobre una relacin positiva entre los niveles de la enzima y la progresin tumoral en distintos tipos de carcinomas humanos (tabla 3), si bien no existe acuerdo total sobre el valor clnico de la expresin tumoral de la enzima en algunos carcinomas humanos como, por ejemplo, los colorrectales47,48 y mamarios49-51.

Desde el punto de vista clnico, destacan por su nmero y relevancia los estudios realizados sobre la significacin pronstica de la cat-D en el cncer de mama. Diversos estudios realizados en este sentido sugieren que los valores elevados de la enzima podran ser un factor predictivo de temprana recurrencia tumoral y muerte en las pacientes con cncer de mama y, en especial, en aquellas con ganglios negativos52-55. Sin embargo, esos resultados tan esperanzadores de cara a identificar a mujeres con mal pronstico y, por tanto, candidatas a alternativas teraputicas ms agresivas, contrastan con los resultados de otros estudios que no encuentran relacin entre la enzima y el pronstico de la enfermedad 49-51, o que, al contrario, detectan un posible valor pronstico favorable de los valores intratumorales elevados de cat-D en determinados subgrupos de pacientes56-58. Pero otros estudios tambin sugieren que la significacin biolgica de la cat-D puede ser diferente en funcin del origen celular de su produccin en el contexto tumoral. As, se ha seala-do que la expresin de la enzima por las clulas estromales, ms que por las clulas tumorales mismas, puede afectar de forma importante al pronstico del cncer de mama59-61. No obstante, estos resultados conflictivos que se desprenden de la bibliografa acerca de la significacin pronstica de la cat-D en los carcinomas humanos hacen necesarias futuras investigaciones sobre el mtodo ms apropiado para la determinacin de la enzima, y en relacin con su expresin por determinados tipos celulares de la estroma tumoral.

Por otra parte, un aspecto de probable inters futuro de la cat-D en el cncer de mama es el de su posible valor diagnstico en esta neoplasia. Ello se basa en resultados preliminares que indican la presencia de niveles significativamente ms elevados de la enzima en el fluido mamario obtenido a travs del pezn de mujeres con cncer de mama en relacin con mujeres controles62. A diferencia de la proteinasa lisosomal cat-D, que se expresa en todos los tipos celulares, el pep-C es una enzima proteoltica principalmente involucrada en la digestin de protenas en el estmago, y de expresin muy restringida en los tejidos humanos. Sin embargo, se ha demostrado que tambin el epitelio de los quistes mamarios y un porcentaje significativo de carcinomas mamarios muestran la capacidad de producir pep-C63. Adems, en este mismo tipo de neoplasia con posterioridad se ha demostrado tambin una asociacin significativamente positiva entre la expresin tumoral de la enzima y la buena diferenciacin tumoral y el estado positivo de los receptores hormonales64, as como tambin con un pronstico favorable de las pacientes independientemente del estado ganglionar65 (fig. 3). As pues, contrariamente a muchos estudios sobre la significacin pronstica de las enzimas proteolticas en el cncer, la produccin de pep-C por las clulas cancerosas mamarias est asociada a lesiones de evolucin favorable. Una consideracin que podra explicar el hecho de que la expresin de pep-C no est asociada a lesiones de peor pronstico procede de la observacin de que la enzima es secretada como un precursor de alto peso molecular que requiere un pH muy bajo para desempear su activacin proteoltica63. Puesto que esas condiciones cidas son muy difciles de alcanzar en el medio extracelular, parece muy poco probable que el pep-C presente actividad proteoltica y, por tanto, facilite la expansin tumoral. Sin embargo, la expresin de la enzima por los tumores mamarios podra ser indicativa de dependencia andrognica, ya que existen datos que demuestran que el pep-C es inducido por andrgenos en clulas T-47D de cncer de mama66. Otro aspecto que apunta la posibilidad de un papel de los andrgenos en la expresin tumoral de pep-C, es que los carcinomas mamarios del varn parecen tener unos valores ms elevados de la enzima en relacin con los de la mujer67,68. Por otra parte, m&aac ute;s recientemente tambin se ha descrito la expresin de pep-C por tumores de origen extragstrico como de prstata, ovario, endometrio, pncreas y melanomas (tabla 3). Adems, tambin se ha detectado una asociacin significativa entre la expresin tumoral de la enzima y parmetros morfolgicos indicativos de una menor agresividad tumoral en carcinomas de endometrio69, prstata70 y melanomas71..

Sern-proteinasas Dentro de este grupo de enzimas proteolticas se encuentran los activadores del plasmingeno, que convierten el plasmingeno en plasmina y desempean un papel importante en el proceso de coagulacin. Pero el sistema de la activacin del plasmingeno es, adems, un complejo sistema de cascada proteoltica que, junto a otros sistemas enzimticos, participa en la degradacin de la matriz extracelular durante los procesos de remodelacin tisular en condiciones normales y patolgicas, incluyendo la invasin cancerosa 72,73. Hasta el momento, se han descrito dos tipos gentica e inmunolgicamente diferentes de estas enzimas: el tipo urocinasa (uPA) y el tipo tisular (tPA). El uPA es una enzima que cataliza la conversin de plasmingeno en plasmina activa 74. La plasmina, una proteinasa neutra de amplia especificidad, tiene la capacidad de unirse a diferentes receptores de la superficie de las clulas tumorales 75 y desarrolla una amplia actividad fibrinoltica que cataliza la degradacin de diferentes componentes de la matriz extracelular. Adems, se ha demostrado que la plasmina puede activar otras enzimas proteolticas, conduciendo a una amplificacin de la reaccin. As pues, como resultado de la activacin del uPA se produce la rotura de una amplia variedad de protenas de la matriz extracelular. El uPA se sintetiza y secreta por una amplia variedad de clulas tumorales y estromales en forma de una proenzima inactiva (pro-uPA) que se une a receptores especficos de la superficie de las clulas tumorales72. Tras esa unin, la proenzima puede ser activada por la plasmina y otras enzimas como la calicrena76, o las catepsinas B y L77,78. As pues, los receptores del uPA tambin son un componente esencial de la migracin de la clula tumoral, ya que permiten la regulacin continua de la actividad proteoltica en los contactos celulares

mediante las diferentes localizaciones de uPA y sus inhibidores 79. De esa forma, la clula coordina sus esfuerzos de migracin mediante modificacin escalonada del mapa de la actividad proteoltica en la superficie celular.

Diversos estudios sugieren que el uPA puede desempear un papel relevante en la progresin de diversos carcinomas humanos (tabla 3). Adems, los valores intratumorales elevados de uPA han sido asociados con una menor supervivencia de pacientes afectados de cncer de mama80-83, colorrectal84,85, gstrico86, pulmonar87, vejiga urinaria88 y gliomas89. Sin embargo, la actividad resultante del uPA depender, en gran medida, del equilibrio con su inhibidor natural especfico (PAI-1) tambin producido por las clulas tumorales, y cuyos principales aspectos comentaremos ms adelante. Adems, se ha observado que los valores intratumorales del receptor especfico para la enzima tambin tienen importancia en el proceso de invasin tumoral90,91.

El tipo tisular del activador del plasmingeno (tPA) est primordialmente involucrado en la disolucin de los cogulos intravasculares72. Sin embargo, tambin se ha detectado la expresin del tPA en carcinomas de mama y colorrectales. Pero, al contrario del uPA, los valores intratumorales elevados de tPA se han asociado a un pronstico favorable de los carcinomas mamarios83,92,93. As pues, a pesar de estar emparentadas bioqumicamente, estas dos enzimas muestran un comportamiento diferente en el cncer de mama, incluso sus valores tisulares muestran una relacin inversa en este tipo de neoplasia 93. Esa correlacin observada de los valores elevados de tPA en el cncer de mama con el pronstico favorable puede estar relacionada con el hecho de que esta sern-proteinasa es una enzima inducible por estrgenos en el cncer de mama94. De hecho, en este tipo de neoplasia se ha observado una relacin significativamente positiva entre los valores de tPA y los receptores estrognicos 95. Por ello, la expresin tumoral de tPA puede ser indicativa de carcinomas mamarios que tienen un sistema de receptores estrognicos biolgicamente activo, que es una condicin misma asociada con pronstico favorable en esos tu mores. Por otra parte, tambin se ha descrito que los valores descendidos de tPA en la mucosa normal adyacente a los carcinomas colorrectales estn sorprendentemente asociados de manera significativa con una supervivencia ms corta de los pacientes85. Ese hallazgo sugiere que los cambios en la mucosa normal que rodea los carcinomas colorrectales pueden influir en el comportamiento biolgico de esos tumores. De acuerdo con ello, se ha propuesto que los valores elevados de tPA en la mucosa normal circundante a los tumores podran facilitar un incremento de la neovascularizacin peritumoral, propiciando, de esa forma, reacciones inflamatorias que serviran como defensa ante el avance invasivo de las clulas tumorales96. As pues, todo ello resulta indicativo del complejo papel que pueden desempear las enzimas proteolticas en la fisiopatologa tumoral, independientemente de su accin degradativa sobre la matriz extracelular y membrana basal.

Otro miembro de la familia de las sern-proteasas, presente en altas concentraciones en el lquido seminal y de especial inters en la patologa tumoral, es el antgeno prosttico especfico (PSA). Esta enzima presenta actividad proteoltica similar a la tripsina y quimotripsina97, y su produccin est regulada por los andrgenos98. Hasta hace poco tiempo se consideraba que esta enzima era producida exclusivamente por las clulas epiteliales de la glndula prosttica99, pero estudios recientes demuestran que otros tejidos, como las glndulas periuretrales100, anales101, salivales102 y mamaria103, pueden producir PSA. As pues, todos esos datos sugieren que el trmino "prosttico especfico" inicialmente asignado a este antgeno no se ajusta ni mucho menos a la realidad. En el mbito de la patologa tumoral, el PSA ha demostrado ser un marcador srico til para la deteccin, pronstico y seguimiento de pacientes con cncer de prstata99. Sin embargo, la expresin tumoral de esta glucoprotena tambin se ha detectado en carcinomas mamarios, pulmonares, parotideos, adrenales renales, ovricos, colorrectales y melanomas (tabla 3). De especial importancia son los estudios realizados en el cncer de mama, donde el 30% de esos tumores tienen una expresin positiva para el PSA104, que se asocia con la positividad de los receptores de estrgenos y progesterona105, as como a un pronstico favorable de las pacientes106. Tambin se ha demostrado que el PSA puede ser producido por los tumores mamarios y por el tejido mamario normal tras estimulacin esteroide107, y que sus concentraciones sricas en pacientes con cncer de mama metastsico pueden predecir la respuesta al tratamiento hormonal con acetato de megestrol108. Adems, muy recientemente se ha descrito que la expresin tumoral del antgeno se correlaciona positivamente con una peor respuesta a la terapia con tamoxifeno en pacientes con recurrencias de cncer mamario109.

Cisten-proteinasas Las cisten-proteinasas son un grupo de enzimas proteolticas lisosomales que desempean un papel importante en muchos procesos celulares normales, especialmente en relacin con el recambio tisular110. Adems, estas enzimas parecen es-tar involucradas en determinados procesos patolgicos benignos111, as como en el proceso de invasin cancerosa y las metstasis112. Hasta el momento, se han aislado y caracterizado 10 cisten-proteinasas lisosomales humanas: catepsinas B, L, H, S, O, K, C, W, L2 y Z. Todas ellas contienen un residuo de cistena en el centro activo de la molcula y, en prcticamente todos los casos, se sintetizan como proenzimas que deben ser activadas para su actuacin, pero que difieren en algunas caractersticas enzimticas, incluyendo su especificidad de sustrato y su estabilidad en funcin del pH. Se ha demostrado que las catepsinas B, L y O pueden ser secretadas por una variedad de tumores humanos o anima les113-115. Adems, existen estudios que demuestran que las cat-B y L estn involucradas en la degradacin de constituyentes de la membrana basal, como la laminina, fibronectina y el colgeno tipo IV114,116, y que la cat-B puede favorecer la angiognesis117. De acuerdo con esas observaciones experimentales, existen tambin estudios que indican una asociacin significativa entre los valores de expresin tumoral de las cat-B 118 o L119 con ciertos parmetros de agresividad tumoral en carcinomas de colon y prstata. Adems, la expresin tumoral de la cat-B ha sido tambin asociada con un peor pronstico de los pacientes afectados de carcinoma de colon120 o mama121,122. Sin embargo, tambin existen datos en la bibliografa que contradicen estas ltimas observaciones en relacin con el cncer de mama123. Inhibidores de las enzimas proteolticas La actividad de las enzimas proteolticas en patologa tumoral depende en gran medida del balance con sus inhibidores naturales, que pueden ser producidos por las clulas tumorales mismas, o bien por las clulas estromales adyacentes al tejido lesionado. Para cada familia de enzimas proteolticas se han descrito inhibidores especficos (tabla 4). De esos inhibidores naturales, los que ms han sido estudiados en patologa tumoral son los inhibidores tisulares metaloproteinasas (TIMP) y los inhibidores de los activadores del plasmingeno (PAI). Hasta el momento, se han identificado cuatro TIMP. Se trata de glucoprotenas que se unen estrechamente a las formas activas de las MMP, ocasionando una inhibicin de su actividad 124. La importancia de los TIMP en fisiopatologa tumoral viene avalada por diferentes estudios experimentales, que demostraron que la administracin exgena de TIMP puede bloquear o inhibir la invasin o progresin tumoral en diversos modelos experimentales 125-127. Adems, independientemente de la accin inhibitoria de las MMP, se han sealado otras acciones de los TIMP que, como la induccin de la apoptosis o su capacidad de bloquear la formacin de nuevos vasos sanguneos128-130, condicionan tambin una disminucin del crecimiento tumoral.

Sin embargo, a pesar de esos datos que indican una regulacin negativa de los TIMP en el proceso de invasin tumoral y metstasis, la significacin biolgica de la expresin tumoral de estos inhibidores parece, al menos, controvertida. As, tambin se ha demostrado que la elevada expresin tumoral de ARNm de TIMP se relaciona con un incremento del potencial invasivo y metastsico de los carcinomas de origen gstrico, colorrectal, pancretico, cabeza y cuello131-133. Adems, recientemente se ha demostrado que la expresin tumoral de TIMP-1 en el carcinoma gstrico134 y mamario135 est asociada de forma independiente con un peor pronstico de los pacientes. Estas discrepancias en la funcin de los TIMP entre los estudios in vivo e in vitro y la significacin clnica de su expresin tumoral pueden deberse a diversos motivos. As, existen datos que sugieren que el TIMP-1 tiene dos actividades distintas: una inhibidora de las MMP, y otra como factor de crecimiento 136,137. Esos datos, sin duda, resultan indicativos del complejo papel que parecen desempear los inhibidores de las enzimas proteolticas en el proceso tumoral. En este mismo sentido, destacan los estudios clnicos que demuestran la significacin pronstica de los inhibidores de los activadores del plasmingeno (PAI). As, en relacin con el inhibidor del uPA (PAI-1) se ha descrito que, sorprendentemente, los valores elevados del mismo estn asociados con un pronstico adverso en el cncer de mama 93,81,138 y de crvix uterino139. Por el contrario, se ha sealado que los valores elevados del inhibidor del tPA (PAI2) estn asociados a un pronstico favorable en el cncer de mama 140. Aunque estos datos pueden resultar desconcertantes, debemos considerar, como ya sealamos anteriormente, que cada vez resultan ms los efectos asignados a los inhibidores de las enzimas proteolticas en patologa tumoral. As, por ejemplo, se ha demostrado que el PAI-1 tambin desempea un papel importante en la promocin de la angiognesis141, proceso que est ampliamente considerado como un factor de pronstico adverso de los tumores. Adems, tambin se considera que la excesiva liberacin del PAI-1 podra ser importante de cara a la reimplantacin de las clulas tumorales circulantes, teniendo en cuenta que la formacin de la nueva estroma en el lugar de las metstasis requiere el bloqueo temporal de la degradacin de la matriz extracelular ocasionado por el uPA81. En definitiva, de acuerdo con estas observaciones, que apuntan la importancia de la dinmica de los parmetros del sistema activador del plasmingeno en la fisiopatologa tumoral, diversas investigaciones recientes indican que la evaluacin combinada de todos esos parmetros aporta una mejor precisin pronstica en los carcinomas de mama93,142,138,83, gstricos86, de pulmn87 y colorrectales96,85. Finalmente, cabe sealar que la utilizacin de los inhibidores de las enzimas proteolticas representa una nueva alternativa teraputica de los carcinomas humanos. En este sentido, diversos estudios en modelos animales demostraron el efecto inhibidor de la invasin tumoral y antimetastsico del TIMP-2 recombinante143. Sin embargo, la utilizacin de los inhibidores naturales de las enzimas proteolticas parece tener poca utilidad para la aplicacin farmacolgica anticancerosa debido a su baja vida media. Por ello, se est investigando en la actualidad la posible utilidad de inhibidores sintticos de las enzimas proteolticas (tabla 4), algunos de los cuales, como el batimastato y marimastato, que son activos contra las metaloproteinasas, se ha demostrado que puden frenar el crecimiento y reducir las metstasis pulmonares de carcinomas mamarios en modelos experimentales 144,145. Adems, se han iniciado ya una gran variedad de estudios clnicos en estado de fase I, II o III, basados en el uso teraputico de inhibidores sintticos de las MMP en pacientes afectados de diversos tipos de carcinomas humanos146. Conclusiones En la presente dcada se ha generado muchsima informacin acerca de la expresin y significacin clnica de las enzimas proteolticas en los carcinomas humanos. De toda esa informacin se puede concluir que los diferentes tumores humanos utilizan distintas enzimas proteolticas o combinaciones de ellas en el proceso de invasin y metstasis. Adems, estas proteinasas pueden ser producidas por las propias clulas tumorales o inducidas en las clulas de la estroma tumoral en el contexto de una relacin dinmica entre ambos tipos celulares, que parece adquirir cada vez mayor auge en la comprensin de la fisiopatologa tumoral. Por otra parte, no cabe duda del papel complejo de las enzimas proteolticas en la biologa de los tumores humanos, ya que no slo parecen estar involucrados en la degradacin de la membrana basal y matriz extracelular, as como en otros mecanismos que propician la

progresin tumoral, sino que tambin, en algunos casos, su expresin se relaciona con una menor agresividad tumoral, presumiblemente enmarcada en el mbito de una va especfica de respuesta hormonal. De cualquier forma, la expresin tumoral de muchas enzimas proteolticas parece aportar informacin pronstica til en pacientes afectados de diversos tipos de neoplasias. En este sentido, futuros estudios que realicen una evaluacin combinada de diferentes proteinasas, as como de sus inhibidores, pueden aportar una mayor precisin sobre el comportamiento biolgico y clnico de los diferentes tumores. Finalmente, la utilizacin de inhibidores sintticos de las enzimas proteolticas en patologa tumoral puede significar una nueva e importante alternativa teraputica en los carcinomas humanos. Bibliografa Referencias Bibliogrficas:

1. Solomon E, Borrow J, Goddard AD Chromosome aberrations and cancer. Science 1991; 254: 1153-1160. 2. Clark WH The nature of cancer: morphogenesis and progressive (self)-disorganization in neoplastic development and progression. Acta Oncologica 1995; 34: 3-21. 3. Byers S, Park M, Sommers C, Seslar S Breast carcinoma: a collective disorder. Breast Cancer Res Treat 1994; 31: 203-215. 4. Effert PJ, Strohmeyer TG Theories on the metastatic process and possible therapeutic options. Urol Res 1995; 23: 11-19. 5. Gottesman M Role of proteases in cancer. Semin Cancer Biol 1990; 1: 97-160. 6. Liotta LA, Steeg PS, Stetler-Stevenson WG Cancer metastasis and angiogenesis: an inbalance of positive and negative regulation. Cell 1991; 64: 327-336. 7. Stetler-Stevenson WG, Liotta LA, Kleiner DE Jr Extracellular matrix: role of matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. FASEB J 1993; 7: 1434-1441. 8. Scher W The role of extracellular proteases in cell proliferation and differentiation. Lab Invest 1987; 57: 607633. 9. Woessner J Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling. FASEB J 1991; 5: 2145-2154. 10. Belaaouaj A, Shipley JM, Kobayashi DK, Zimonjic DB, Popescu N, Silverman GA et al Human macrophage metalloelastase: genomic organization, chromosomal location, gene linkage, and tissue-specific expression. J Biol Chem 1994; 270: 14568-14575. 11. Basset P, Bellocq JP, Wolf C, Stoll I, Hutin P, Limacher JM et al A novel metalloproteinase gene specifically expressed in stromal cells of breast carcinomas. Nature 1990; 348: 699-704. 12. Pends AM, Knuper V, Puente XS, Llano E, Mattei MG, Apte S et al Identification and characterization of a novel human matrix metalloproteinase with unique structural characteristics chromosomal location, and tissue distribution. J Biol Chem 1997; 272: 4281-4286. 13. Llano E, Pends AM, Knuper V, Sorsa T, Salo T, Salido E et al Identification and structural and functional characterization of human enamelysin (MMP-20). Biochemist 1997; 36: 15101-15108. 14. Shima I, Sasaguri Y, Kusukawa J, Yamana H, Fujita H, Kakegawa T et al Production of matrix metalloproteinase-2 and metalloproteinase-3 related to malignant behaviour of esophageal carcinoma. Cancer 1992; 70: 2747-2753. 15. Matrisian LM Metalloproteinases and their inhibitors in matrix remodelling. Trends Genet 1990; 6: 121-125. 16. Wolf C, Chenerd MP, Durand de Grossouvre P, Bellocq JP, Chambon P, Basset P Breast-cancer-associated stromelysin-3 gene is expressed in basal cell carcinoma and during cutaneous wound healing. J Invest Dermatol 1992; 99: 870-872. 17. Delaiss JM, Vaes G Mechanism of mineral sollubilization and matrix degradation in osteoclastic bone resorption. Biology and Phisiology of the Osteoclast. Boca Raton: CRC Press, 1992; 289-314. 18. Talhouk RS, Bissell MJ, Werb Z Coordinated expression of extracellular matrix-degrading proteinases and their inhibitors regulates mammary epithelial function during involution. J Cell Biol 1992; 118: 1272-1282. 19. Jeffrey JJ Collagen and collagenase: pregnancy and parturition. Semin Perinatol 1991; 15: 118-126. 20. Harris ED Jr Rheumatoid arthritis: pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med 1990; 322: 1277-1289. 21. Page RC The role of inflammatory mediators in the pathogenesis of periodontal disease. J Periodontal Res 1991; 26: 230-242. 22. Chandler S, Miller KM, Clements JM, Lury J, Corkill D, Anthony DCC et al Matrix metalloproteinases, tumor necrosis factor and multiple sclerosis: an overview. J Neuroimmunology 1997; 72: 155-161. 23. Tamarina NA, McMillan WD, Shively VP, Pearce WH Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in aneurysms and normal aorta. Surgery 1997; 122: 264-272. 24. Guedez L, Lim MS, Stetler-Stevenson WG The role of metalloproteinasses and their inhibitors in hematological disorders. Critical Rev Oncog 1996; 7: 205-225. 25. Hhnel E, Harvey JM, Joyce R, Robbins PD, Sterret GF, Hhnel R Stromelysin-3 expression in breast cancer biopsies: clinico-pathological correlations. Int J Cancer 1993; 55: 771-774. 26. Pyke C, Ralfkiaer E, Huhtala P, Hurskainen T, Dano K, Trygvasson K Localization of messenger RNA for Mr 72,000 and 92,000 type IV collagenases in human skin cancers by in situ hybridization. Cancer Res 1992; 532: 1336-1341. 27. Pyke C, Ralfklar E, Tryggvason K, Dano K Messenger RNA for two type IV collagenases is located in stromal cells in human colon cancer. Am J Pathol 1993; 142: 359-365. 28. Ota S, Miyajima Y, Nakashima A, Morimatsu M, Yakushiji M Expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP2) in cervical neoplasia: Immunohistochemical and in situ hybridation studies. Int J Oncol 1994; 5: 1301-1304. 29. Tryggvason K, Hyhty M, Pyke C Type IV collagenases in invasive tumors. Breast Cancer Res Treat 1993; 24: 209-218. 30. Ura JA, Stahle-Bckdahl M, Seiki M, Fueyo A, Lpez-Otn C Regulation of collagenase-3 expression in human breast carcinomas is mediated by stromal-epithelial cell interactions. Cancer Res 1997; 57: 4882-4888. 31. Ura JA, Jimnez MG, Balbn M, Freije JMP, Lpez-Otn C Differential effects of TGF-* on the expression of

collagenase-1 and collagenase-3 in human fibroblasts. J Biol Chem 1998; 273: 9769-9777. 32. Linder C, Engel G, Auer G, Strander H, Linder S Distribution of stromelysin-3 mRNA transcripts and microvessels in human breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat 1997; 42: 207-213. 33. Ahmad A, Hanby A, Dublin E, Poulsom R, Smith P, Barnes D et al Stromellysin 3: an independent prognostic factor for relapse-free survival in node-positive breast cancer and demonstration of novel breast carcinoma cell expression. Am J Pathol 1998; 152: 721-728. 34. Porte H, Chastre E, Prevot S, Nordlinger B, Empereur S, Basset KP et al Neoplastic progression of human colorectal cancer is associated with overexpression of the stromelysin-3 and BM-40/ SPARC genes. Int J Cancer 1995; 64: 70-75. 35. Murray GI, Duncan ME, O'Neil P, Melvin WT, Fothergill JE Matrix metalloproteinase-1 is associated with poor prognosis in colorectal cancer. Nature Med 1996; 2: 461-462. 36. Murray GI, Duncan ME, O'Neil P, McKay JA, Melvin WT, Fothergill JE Matrix metalloproteinase-1 is associated with poor prognosis in oesophageal cancer. J Pathol 1998; 185: 256-261. 37. Kawashima A, Okada Y, Nakanishi I, Ueda Y, Iwata K, Roessner A Immunolocalization of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human chondrosarcomas. Gen Diagn Pathol 1997; 142: 129-137. 38. Zeng ZS, Huang Y, Cohen AM, Guillem JG Prediction of colorectal cancer relapse and survival via tissue RNA levels of matrix metalloproteinase-9. J Clin Oncol 1996; 14: 3133-3140. 39. Allgayer H, Babic R, Beyer BCM, Grtzner KU, Tarabichi A, Schildberg FW Prognostic relevance of MMP-2 (72kD collagenase IV) in gastric cancer. Oncol 1998; 55: 152-160. 40. Garzetti GG, Ciavattini A, Lucarini G, Goteri G, De Nictolis M, Garbisa S et al Tissue and serum metalloproteinase (MMP-2) expression un advanced ovarian serous cystoadenocarcinomas: clinical and prognostic implications. Anticancer Res 1995; 15: 2799-2804. 41. Talvensaari-Mattila A, Pkk P, Hyhty M, Blanco-Sequeiros G, Turpeenniemi-Hujanen T Matrix metalloproteinase-2 immunoreactive protein. A marker of aggressiveness in breast carcinoma. Cancer 1998; 83: 1153-1162. 42. Kanayama H, Yokota K, Kurokawa Y, Murakami Y, Nishitani M, Kagawa S Prognostic values of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in bladder cancer. Cancer 1997; 82: 1359-1366. 43. Lamelas ML Expresin y significacin clnica de la colagenasa-3 en los carcinomas mamarios. [Tesis doctoral]. Facultad de Medicina. Universidad de Oviedo, 1998. 44. Rochefort H, Capony F, Garca M, Cavailles V, Freiss G, Chambon M et al Estrogen-induced lysosomal proteases secreted by breast cancer cells. A role in carcinogenesis? J Cell Biochem 1987; 35: 17-29. 45. Montcourier P, Mangeat PH, Salazar G, Morisset M, Sahuquet A, Rochefort H Catepsin D in breast cancer cells can digest extracellular matrix in large acid vesicles. Cancer Res 1990; 56: 6045-6054. 46. Garca M, Platet N, Lliaudet E, Laurent V, Derocq D, Brouillet JP et al Biological and clinical significance of cathepsin D in breast cancer metastasis. Stem Cells 1996; 14: 642-650. 47. Mayer A, Fritz E, Fortelny R, Kofler K, Ludwig H Immunohistochemical evalluation of cathepsin D expression in colorectal cancer. Cancer Invest 1997; 15: 106-110. 48. Villar C, Rodrguez JC, Raigoso PF, Garca-Muiz JL, Martnez E, Vizoso F Cathepsin D cytosol content in colorectal cancer. Int J Biol Markers 1999; 14: 192-194. 49. Hurlimann J, Gebhard S, Gmez F Oestrogen receptor, progesterone receptor, pS2, ERD5, HSP27 and cathepsin D in invasive ductal breast carcinomas. Histopathology 1993; 23: 239-248. 50. Kandalaft PL, Chang KL, Ahn CW, Traweek ST, Mehta P, Battifora H Prognostic significance of immunohistochemical analysis of cathepsin D in low-stage breast cancer. Cancer 1993; 71: 2756-2763. 51. Ravdin PM, Tandon AK, Allred DC, Clark GM, Fuqua SAW, Hilsenbeck SH et al Cathepsin D by wester blotting and immunohistochemistry: failure to confirm correlations with prognosis in node-negative breast cancer. J Clin Oncol 1994; 12: 467-474. 52. Kute TE, Shao Z-M, Sugg NK, Long RT, Russell GB, Case LD Cathepsin D as a prognostic indicator for nodenegative breast cancer patients using both as immunoassays and enzimatic assays. Cancer Res 1992; 52: 51985203 53. Spyratos F, Hacene K Tubiana-Hulin M Prognostic value of oestrogen and progesterone receptors in primary infiltrating ductal breast cancer. A sequential multivariate analysis of 1262 patients. Eur J Cancer Clin Oncol 1998; 25: 1233-1240. 54. Lsch A, Tempfer C, Kohlberger P, Joura EA, Denk M, Zajic B et al Prognostic value of cathepsin D expression and association with histomorphological subtypes in breast cancer. Br J Cancer 1998; 78: 205-209. 55. Foekens JA, Look MP, Bolt-de Vries J, Meijer-van Gelder ME, van Putten WLJ, Klijn JGM Cathepsin-D in primary breast cancer: prognostic evaluation involving 2810 patients. Br J Cancer 1999; 79: 300-307. 56. Henry JA, McCarty AL, Angus B, Westley BR, May FEB, Nicholson S et al Prognostic significance of the estrogen-regulated protein, cathepsin D, in breast cancer. An immunohistochemistry study. Cancer 1990; 65: 265-271. 57. Domagala W, Striker G, Szadowska A, Dukowicz A, Weber K, Osborn M Cathepsin D in invasive ductal NOS breast carcinoma as defined by immunohistochemistry. No correlation with survival at 5 years. Am J Pathol 1992; 141: 1003-1012. 58. Fern M, Baldetorp B, Borg A, Brouillet J-P, Olsson H, Rochefort H et al Cathepsin D, both a prognostic factor and a predictive factor for the effect of adjuvant tamoxifen in breast cancer. Eur J Cancer 1994; 30: 2042-2048. 59. Ttu B, Brisson J, Ct C, Brisson S, Potvin D, Roberge N Prognostic significance of cathepsin-D expression in node-positive breast carcinoma: an immunohistochemical study. Int J Cancer 1993; 55: 429-435. 60. Joensu H, Toikkanen S, Isola J Stomal cell cathepsin D expression and long term survival in breast cancer. Br J Cancer 1995; 71: 155-159. 61. Razumovi JJ, Stojkovi RR, Petrovecki M, Gamulin S Correlation of two methods for determination of cathepsin D in breast carcinoma (immunohistochemistry and ELISA in cytosol). Breast Cancer Res Treat 1997; 43: 117-122. 62. Snchez LM, Ferrando AA, Dez-Itza I, Vizoso F, Ruibal A, Lpez-Otn C Catepsin D in breast secretions from women with breast cancer. Br J Cancer 1993; 67: 1076-1081. 63. Snchez LM, Freije JMP, Merino AM, Vizoso F, Foltmann B, Lpez-Otn C Isolation and characterization of a pepsin C zymogen produced by human breast tissues. J Biol Chem 1992; 267: 24725-24731. 64. Dez-Itza I, Snchez LM, Allende MT, Vizoso F, Ruibal A, Lpez-Otn C Zn-alpha2-glicoprotein levels in breast cancer cytosols and correlation with clinical, histological and biochemical parameters. Eur J Cancer 1993; 29A: 1256-1260.

65. Vizoso F, Snchez LM, Dez-Itza I, Merino AM, Lpez-Otn C Pepsinogen C is a new prognostic marker in primary breast cancer. J Clin Oncol 1995; 13: 54-61. 66. Balbn M, Lpez-Otn C Hormonal regulation of the human pepsinogen C gene in breast cancer cells. J Biol Chem 1996; 271: 15175-15181. 67. Serra C Expresin y significacin clnica de la apolipoprotena D y el pepsingeno C en el cncer de mama del varn. [Tesis Doctoral]. Universidad de Alicante, 1997. 68. Serra C, Vizoso F, Rodrguez JC, Merino AM, Gonzlez LO, Baltasar A et al Expression of pepsinogen C in gynecomastias and male breast carcinomas. World J Surg 1999; 23: 439-445. 69. Vzquez J Expresin y significacin clnica de la apolipoprotena D, el Pepsingeno C y la Colagenasa-3 en los tumores de origen ginecolgico [tesis doctoral]. Facultad de Medicina. Universidad de Oviedo, 1998. 70. Merino AM Anlisis de la expresin del Pepsingeno C y su regulacin hormonal en carcinomas humanos [tesis doctoral]. Facultad de Medicina. Universidad de Oviedo, 1998. 71. Serra C, Quintela I, Vizoso F, Merino AM, Gnzalez LO,Fernndez R et al Expresin del pepsingeno C por los melanomas cutneos malignos y su correlacin con los parmetros clnicos e histolgicos. Comunicacin personal. XXII Congreso Nacional de Ciruga. Asociacin Espaola de Cirujanos. Madrid: 9-13 de noviembre, 1998. 72. Dano K, Andreasen PA, Grondahl-Hansen J, Kristensen P, Nielsen LS, Skriver L Plasminogen activators, tissue degradation, and cancer. Adv Cancer Res 1985; 44: 139-266. 73. Saksela O, Rifkin DB Cell-associated plasminogen action, regulation and physiological function. Ann Rev Cell Biol 1988; 4: 93-126. 74. Duffy MJ Urokinase plasminogen activator and malignancy. Fibrinolysis 1993; 7: 295-302. 75. Miles LA, Plow EF Plasminogen receptors: ubiquitous sites for cellular regulation of fibrinolysis. Fibrinolysis 1988; 2: 61-71. 76. Ichinose A, Fujikawa K, Suyama T The activation of prourokinase by plasma kallikrein and its inactivation by thrombin. J Biol Chem 1986; 261: 3486-3489. 77. Kobayashi H, Schmitt M, Goretzki L, Chucholowski N, Calvete J, Kramer M et al Cathepsin B efficiently activates the soluble and the tumor cell receptor-bound form of the proenzyme urokinase-type plasminogen activator (pro-uPA). J Biol Chem 1991; 266: 5147-5152. 78. Goretzki L, Schmitt M, Mann KH, Calvete J, Chucholowski N, Kramer M et al Effective activation of the proenzyme form of the urokinase-type plasminogen activator (pro-uPA) by the cysteine protease cathepsin L. FEBS Lett 1992; 297: 112-118. 79. Mangel WF Better reception for urokinase. Nature 1990; 344: 488-489. 80. Foekens JA, Schmitt M, van Putten WLJ, Peters HA, Bontenbal M, Jnicke F et al Prognostic value of urokinase-type plasminogen activator in 671 primary breast cancer patients. Cancer Res 1992; 52: 6101-6105. 81. Jnicke F, Schmitt M, Pache L, Ulm K, Harbeck N, Hfler H et al Urokinase (uPA) and its inhibitor PAI-1 are strong and independent prognostic factors in node-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1993; 24: 195-208. 82. Duffy MJ, Reilly D, McDermott E, O'Higgins, Fennelly JJ, Andreasen PA Urokinase plasminogen activator as a prognostic marker in different subgroups of patients with breast cancer. Cancer 1994; 74: 2276-2280. 83. De Witte JH, Sweep CGJ, Klijn JGM, Grebenschikov N, Peters HA, Look MP et al Prognostic impact or urokinase-type plasminogen activator (UpA) and its inhibitor (PAI) in cytosols and pellet extracts derived from 892 breast cancer patients. Br J Cancer 1999; 79: 1190-1198. 84. Mulcahy HE, Duffy MJ, Gibbons D, McCarthy P, Parfrey NA, O'Donoghue DP et al Urokinase-type plasminogen activator and outcome un Dukes' B colorectal cancer. Lancet 1994; 344: 583-584. 85. Ganesh S, Sier CFM, Heerding MM, van Krieken JHJM, Griffioen G, Welvaart K et al Contribution of plasminogen activators and their inhibitors to the survival prognosis of patients with Dukes' stage B and C colorectal cancer. Br J Cancer 1997; 75: 1793-1801 86. Nekarda H, Schmitt M, Ulm K, Wenninger A, Vogelsang H, Becker K, et al Prognostic impact of urokinasetype plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in completely resected gastric cancer. Cancer Res 1994; 54: 2900-2907. 87. Pedersen H, Brunner N, Francis D, Osterlind K, Ronne E, Hansen HH et al Prognostic impact of urokinase, unokinase receptor and type 1 plasminogen activator inhibitor in squemous and large cell lung cancer tissue. Cancer Res 1994; 54: 4671-4675. 88. Hasui Y, Marutsuka K, Suzumiya J, Kitada S, Osada Y, Sumiyoshi A The content of urokinase-type plasminogen activator antigen as a prognostic factor in urinary bladder cancer. Int J Cancer 1992; 50: 871-873. 89. Hsu Dw, Efird JT, Hedley-White ET Prognostic role of urokinase-type plasminogen activator receptor in human gliomas. Cancer Res 1995; 147: 114-123. 90. Reuning U, Magdolen V, Wilhelm O, Fischer K, Lutz V, Graeff H et al Multifunctional potential of the plasminogen activation system in tumor invasion and metastasis (review). Inter J Oncol 1998; 13: 893-906. 91. Suzuki S, Hayashi Y, Wang Y, Nakamura T, Morita Y, Kawasaki KW et al Urokinase type plasminogen activator receptor expression in colorectal neoplasms. Gut 1998; 43: 798-805. 92. Duffy MJ, Reilley D, O'Sullivan C, O'Siorain L, Fennelly JJ, Lijnen MR Tissue-type plasminogen activator, a new prognostic marker in breast cancer. Cancer Res 1988; 48: 1348-1349. 93. Jnicke F, Graeff H, Schmitt M Clinical relevance of the urokinase-type and tissue-type plasminogen activators and of their type 1 inhibitor in breast cancer. Semin Thromb Hemost 1991; 17: 303-312. 94. Butler WB, Kirkland WL, Gargala TL, Goran N, Kelsey WH, Berlinsky PJ Steroid stimulation of plasminogen activator production in a human breast cancer cell line (MCF-7). Cancer Res 1983; 43: 1637-1641. 95. Duffy MJ, O'Grady P, Simon J, Rose M, Lijnen HR. Tissue-type plasminogen activator in breast cancer: relationship with estradiol and progesterone receptor. J Natl Cancer Inst 1986; 77: 621-623. 96. Verspaget HW, Sier CFM, Ganesh S, Griffioen G, Lamers CBHM Prognostic value of plasminogen activators and their inhibitors in colorectal cancer. Eur J Cancer 1995; 101: 1522-1528. 97. Lilja HA A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Invest 1985; 76: 1899-1903. 98. Hentu P, Liao S, Vihko P Androgens up-regulate the human prostate-specific antigen messenger ribonucleic acid (mRNA), but down-regulate the prostatic acid phosphatase mRNA in the LNCaP cell line. Endocrinology 1992; 130: 766-772. 99. Oesterling JE Prostate specific antigen: a critical assessment ot the most useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate. J Urol 1991; 145: 907-923. 100. Iwakiri J, Grandbois K, Wehmer N, Graves HCB, Stamey T An analysis of urinary prostate specific antigen before and after radical prostatectomy: evidence for secretion of prostate specific antigen by the periurethral

glands. J Urol 1993; 149: 783-786. 101. Kamoshida S, Tsutsumi Y Extra prostatic localization of prostatic acid phosphatase and prostate-specific antigen: distribution in cloacogenic glandular epithelium and sex-dependent expression in human anal gland. Hum Pathol 1990; 21: 1108-1111. 102. Van Krieken TH Prostate marker immunoreactivity in salivary gland neoplams. A rare pitfall in immunohistochemistry. Am J Surg Pathol 1993; 17: 410-414. 103. Yu H, Diamandis EP Prostate-specific antigen in milk of lactating women. Clin Chem 1995b; 41: 54-58. 104. Diamandis EP, Yu H, Sutherland DJA Detection of prostate-specific antigen immunoreactivity in breast cancer tumors. Breast Cancer Res Treat 1994; 32: 301-310. 105. Yu H, Diamandis EP, Sutherland DJA Immunoreactive prostate-specific antigen levels in female and male breast tumors and its association with steroid hormone receptors and patient age. Clin Biochem 1994; 27: 7579. 106. Yu H, Giai M, Diamandis EP, Katsaros D, Sutherland DJA, Levesque MA et al Prostate-specific antigen is a new favorable prognostic indicator for women with breast cancer. Cancer Res 1995; 55: 2104-2110. 107. Yu H, Diamandis EP, Monne M, Croce CM Oral contraceptive-induced expression of prostate specific antigen in the female breast. J Biol Chem 1995; 270: 6615-6618. 108. Diamandis EP, Helle SI, Yu H, Melegos DN, Lundgren S, Lonning PE Prognostic value of plasma prostate specific antigen after megestrol acetate treatment in patients with metastatic breast carcinoma. Am Cancer 1999; 85: 891-898 109. Foekens JA, Diamandis EP, Yu H, Look MP, Meijer-van Gelder ME, van Putten WLJ et al Expression of prostate-specific antigen (PSA) correlates with poor response to tamoxifen therapy in recurrent breast cancer. Br J Cancer 1999; 79: 886-894. 110. Gunette RS, Mooibrooek M, Wong K, Wong P, Tenniswood M Cathepsin B, a cysteine protease implicated in metastatic progression, is also expressed during regression of the rat prostate and mammary glands. Eur J Biochem 1994; 226: 311-321. 111. Golde TE, Estus S, Younkin LH, Selkoe DJ, Younkin SG Procession of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivates. Science 1992; 255: 728-730. 112. Murnane MJ, Sheahan K, Ozdemirli M, Shuja S Stage-specific increases in cathepsin B messenger RNA content in human colo-rectal carcinoma. Cancer Res 1991; 51: 1137-1142. 113. Sloane BF, Moin K, Rozhin J Cathepsin B and its endogenous inhibitors: role in tumor malignancy. Cancer Metastasis Rev 1990; 1: 153-160. 114. Kane SE, Gottesman MM The role of cathepsin L in malignant transformation. Semin Cancer Biol 1990; 1: 127-136 115. Velasco G, Ferrando AA, Puente XS, Snchez LM, Lpez-Otn C Human cathepsin O. Molecular cloning from a breast carcinoma, production of the active enzyme in Escherichia coli, and expression analysis in human tissues. J Biol Chem 1994; 269: 27136-27142. 116. Buck MR, Karustis DG, Day NA, Honn KV, Sloane BF Degradation of extracellular-matrix proteins by human cathepsin B from normal and tumour tissues. Biochem J 1992; 282: 273-278. 117. Sinha AA, Gleason DF, Staley NA, Wilson MJ, Sameni M, Sloane BF Cathepsin B in angiogenesis of human prostate: An immunohistochemical and immunoelectron microscopic analysis. Anat Rec 1995; 241: 353-362. 118. Sinha AA, Wilson MJ, Gleason DF, Reddy PK, Sameni M, Sloane BF Immunohistochemical localization of cathepsin B in neoplastic human prostate. Prostate 1995; 26: 171-178. 119. Maciewicz RA, Wardale RJ, Etherington DJ, Paraskeva C Immunodetection of cathepsin B and L present in and secreted from human pre-malignant and malignant colo-rectal tumour cell lines. Int J Cancer 1989; 43: 478486. 120. Campo E, Muoz J, Miquel R, Palacn A, Cardesa A, Sloane BF et al Cathepsin B expression in colo-rectal carcinomas correlates with tumor progression and shorted patient survival. Am J Pathol 1994; 145: 301-309. 121. Foekens JA, Kos J, Peters HA, Krasovec M, Look MP, Cimerman N et al Prognostic significance of cathepsins B and L in primary human breast cancer. J Clin Oncol 1998; 16: 1013-1021. 122. McGuire TM, Shering SG, Duggan CM, McDermott EW, Higgins NJO, Duffy MJ High levels of cathepsin B predict poor outcome in patients with breast cancer. Int J Biol Markers 1998; 13: 139-144. 123. Budihna M, Skrk J, Zakotnik B, Gabrijelcic D, Lindtner S Prognostic value of total cathepsin B in invasive ductal carcinoma of the breast. Eur J Cancer 1995; 31: 661-664. 124. Gmez DE, Alonso DF, Yoshiji H, Thorgeirsson UP Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J Cell Biol 1997; 74: 111-122. 125. Schultz RM, Silberman S, Persky B, Bajkkowski AS, Carmichael DF Inhibition by human recombinant tissue inhibitor of metalloproteinases of human amnion invasion and lung colonization by murine B16-F10 melanoma cells. Cancer Res 1988; 48: 5539-5545. 126. DeClerck YA, Prez N, Shimada H, Boone TC, Langley KE, Taylor SM Inhibition of invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases. Cancer Res 1992; 52: 701-708. 127. Brian J, Wang Y, Smith MR, Kim H, Jacobs C, Jackman J et al Suppression of in vivo tumor growth and induction of suspension cell death by tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-3). Carcinogenesis 1996; 9: 1805-1811. 128. Fisher C, Gilbertson-Beadling S, Powers EA, Petzold G, Poorman R, Mitchell MA Interstitial collagenase is required for angiogenesis in vitro. Dev Biol 1994; 162: 499-510. 129. Valente P, Fassina G, Melchiori A, Masiello L, Cilli M, Vacca A et al TIMP-2 over-expression reduces invasion and angiogenesis and protects B16F10 melanoma cells from apoptosis. Int J Cancer 1998; 75: 246-253. 130. Baker AH, George SJ, Zaltsman AB, Murphy G, Nawby AC Inhibition of invasion and induction of apoptotic cell death of cancer cell lines by overexpression of TIMP-3. Br J Cancer 1999; 79: 1347-1355. 131. Polette M, Clavel C, Birembaut P, De Cleck YA Localization by in situ hybridization of mRNAs encoding stromelysin 3 and tissue inhibitors of metallo-proteinases TIM-1 and TIMP-2 in human head and neck carcinomas. Path Res Pract 1993; 189: 1052-1057. 132. Urbanski SJ, Edwards DR, Hershfield N, Huchcroft SA, Shaffer E, Sutherland L et al Expression pattern of metalloproteinases and their inhibitors changes with the progression of human sporadic colorectal neoplasia. Diagn Mol Pathol 1993; 2: 81-89. 133. Zeng ZS, Cohen AM, Zhang ZF, Stetler-Stevenson W, Guillem JG Elevated tissue inhibitor of metalloproteinase 1 RNA in colorectal cancer stroma correlates with lymph node and distant metastases. Clin Cancer Res 1995; 1: 899-906. 134. Mimori K, Mori M, Shiraishi T, Fujie T, Baba K, Haraguchi M et al Clinical significance of tissue inhibitor of metalloproteinase expression in gastric carcinoma. Br J Cancer 1997; 76: 531-536.

135. McCarthy K, Maguire T, McGreal G, McDermott E, O'Higgins N, Duffy MJ High levels of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 predict poor outcome in patients with breast cancer. Int J Cancer 1999; 84: 44-48. 136. Agrez MV, Meldrum CJ, Sim ATR, Aebersold RH, Clark IM, Cawston TE et al A fibroblast elongation factor purified from colon carcinoma cells shares sequence identity with TIMP-1. Biochem Biophys Res Cammun 1995; 206: 590-600. 137. Chesler L, Golde DW, Bersch N, Johnson MD Metalloproteinase inhibition and erythroid potentiation are independent activities of tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Blood 1995; 86: 4506-4515. 138. Foekens JA, Buessecker F, Peters HA, Krainick U, Van Putten WLJ, Look MP et al Plasminogen activator inhibitor-2: prognostic relevance in 1012 patients with primary breast cancer. Cancer Res 1995; 55: 1423-1427. 139. Kobayashi H, Fujishiro S, Terao T Impact of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor type I on prognosis in cervical cancer of the uterus. Cancer Res 1994; 54: 6539-6548. 140. Foekens JA, Schmitt M, Van Putten WL, Peters HA, Kramer MD, Jnicke F et al Plasminogen activator inhibitor-1 and prognosis in primary breast cancer. J Clin Oncol 1994; 12: 1648-1658. 141. Montesano R, Pepper MS, Mohlesteinlein U, Risau W, Wagner PP, Orci T Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T-oncogene. Cell 1990; 62: 435-445. 142. Grondahl-Hansen J, Christensen IJ, Rosenquist C, Brunner N, Mouridsen HT, Dano K et al High levels of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res 1993; 53: 2513-2521. 143. Oku T, Ata N, Yonozawa K, Tokai H, Fufii H, Shinagawa A et al Antimetastatic and antitumor effect of a recombinant tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in murine melanoma models. Biol Pharm Bull 1997; 20: 843849. 144. Sledge GW, Qulali M, Goulet R, Bone EA, Fife R Effect of matrix metalloproteinase inhibitor batimastat on breast cancer regrowth and metastasis in athymic mice. J Nat Cancer Inst 1996; 87: 1546-1550. 145. Eccles SA, Box GM, Qulali M, Goulet R, Bone EA, Fife R Effect of matrix metalloproteinase inhibitor batimastat on breast cancer regrowth and metastasis in athymic mice. J Natl Cancer Inst 1996; 87: 1546-1550. 146. Brown PD Clinical studies with matrix metalloproteinase inhibitors. APMIS 1999; 107: 174-180. 147. Goldberg GI, Wihelm SM, Kronberger A, Bauer EA, Grant GA, Eisen AR Human fibroblast collagenase: complete primary structure and homology to an oncogene transformation-induced rat protein. J Biol Chem 1986; 261: 6600-6605. 148. Collier IE, Wihelm SM, Eisen AZ, Marmer BL, Grant GA, Selter JL et al H-ras oncogene-transformed human bronchial epithelial cells (TBE-1) secrete a single metalloproteinase capable of degrading basement membrane colagen. J Biol Chem 1988; 263: 6579-6587 149. Whitham SE, Murphy G, Angel P, Rahmsdorf H-J, Smith BJ, Lyons A, et al Comparison of human stromelysin and collagenase by cloning and sequence analysis. Biochem J 1987; 240: 913-916. 150. Quantin B, Murphy G, Breathnach R Pump-1 codes for a protein with characteristics similar to those of classical collagenase family members. J Biochem 1989; 28: 5327-5334. 151. Hasty KA, Pourmotabbed TF, Goldberg GI, Thompson JP, Spinella DG, Stevens RM et al Human neutrophil collagenase: a distinct gene product with homology to other matrix metalloproteinases. J Biol Chem 1990; 265: 11421-11424. 152. Wilhelm SM, Collier IE, Marmer BL, Eisen AZ, Grant GA, Goldberg GI SV40-transformed human lung fibroblast secrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted by normal human macrophages. J Biol Chem 1989; 264: 17213-17221. 153. Muller D, Quantin B, Gesnel MC, Millon-Collard R, Abecassis J, Breathnach R The collagenase gene family in humans consist of at least four members. Biochem J 1988; 253: 187-192. 154. Shapiro SD, Kobayashi DK, Ley TJ Cloning and characterization of a unique elastolytic metalloproteinase produced by human alveolar macrophages. J Biol Chem 1993; 268: 23824-23829. 155. Freije JM, Dez-Itza I, Balbn M, Snchez LM, Blasco R, Tolivia J et al Molecular cloning and expression of collagenase-3, a novel human matrix metalloproteinase produced by breast carcinomas. J Biol Chem 1994; 269: 16766-16773. 156. Sato H, Takino T, Okada Y, Cao J, Shiinagawa A, Yamamoto E et al A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells. Nature 1994; 370: 61-65. 157. Will H, Hinzmann B cDNA sequence and mRNA tissue distribution of a novel human matrix metalloproteinase with a potential transmembrane segment. Eur J Biochem 1995; 231: 602-608. 158. Takino T, Sato H, Shinagaw A, Seiki M Identification of the second membrane-type matrix metalloproteinase gene form a human placenta cDNA library. MM-MMP form a unique membrane-type subclass in the MMP family. J Biol Chem 1995; 270: 23021-23030. 159. Puente XS, Pends AM, Llano E, Velasco G, Lpez-Otn C Molecular cloning of a novel membrane-type matrix metalloproteinase from a human breast carcinoma. Cancer Res 1996; 56: 944-949 160. Stolow MA, Bauzon DD, Li J, Sedgwick T, Liang VC, Sang QA Identification and characterization of a novel collagenase in Xenopus laevis: possible roles during frog development. Mol Biol Cell 1996; 10: 1471-1483. 161. Pends AM, Santamara I, lvarez MV, Pritchard M, Lpez-Otn C Fine physical mapping of the human matrix metalloproteinase genes clustered on chromosome 11 q22.3. Genomics 1996; 37: 266-268. 162. Velasco G, Pends AM, Fueyo A, Knauper V, Murphy G, Lpez-Otn C Cloning and characterization of human MMP-23, a new matrix metalloproteinase predominantly expressed in reproductive tissues and lacking conserved domains in other family members. J Biol Chem 1999; 274: 4570-4576. 163. Llano E, Pends AM, Freije JP, Nakano A, Knauper V, Murphy G et al Identification and characterization of human MT5-MMP, a new membrane-bound activator of progelatinase a overexpressed in brain tumors. Cancer Res 1999; 59: 2570-2576. 164. Okada A, Bellocq J-P, Rouyer N, Chenard M-P, Ro M-C, Chambon P et al Membrane-type matrix metalloproteinase(MT-MMP) gene is expressed in stromal cells of human colon, breast and head and neck carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 2730-2734. 165. Monteagudo C, Merino MJ, San-Juan J, Liotta LA, Stetler-Stevenson WG Immunohistochemical distribution of type IV collagenase in normal, benign, and malignant breast tissue. Am J Pathol 1990; 136: 585-592. 166. Kossakowska AE, Huchcroft SA, Urbanski SJ, Edwards DR Comparative analysis of the expression patterns of metalloproteinases and their inhibitors in breast neoplasia, pulmonary carcinomas and malignant nonHodgkin's lymphomas in humans. Br J Cancer 1996; 73: 1401-1408. 167. Basset P, Wolf C, Chambon P Expression of the stromelysin-3 gene in fibroblastic cells of invasive carcinomas of the breast and other human tissues: a review. Breast Cancer Res Treat 1993; 24: 185-193. 168. Engel G, Hessefmeyer K, Auer G, Bckdahl M, Eriksson E, Linder S Correlation between stromelysin-3 mRNA

level and outcome of human breast cancer. Int J Cancer 1994; 58: 830-835. 169. Polette M, Nawrochi B, Gilles C, Sato H, Seiki M, Tournier JM et al MT-MMP expression and localisation in human lung and breast cancers. Virchows Arch 1996; 428: 29-35. 170. Ueno H, Nakamura H, Inoue M, Imai K, Noguchi M, Sato H et al Expression and tissue localization of membrane-types 1, 2, and 3 matrix metalloproteinases in human invasive breast carcinomas. Cancer Res 1997; 57: 2055-2060. 171. D'Errico A, Garbisa S, Liotta LA, Castronovo V, Stetler-Stevenson WG, Grigioni WF Augmentation of type IV collagenase, laminin receptor, and Ki67 proliferation antigen associated with human colon, gastric, and breast carcinoma progression. Mod Pathol 1991; 4: 239-246. 172. Levy AT, Cioce V, Lobel ME, Garbisa S, Grigioni WF, Liotta LA et al Increased expression of the Mr 72,000 type IV collagenase in human colonic adenocarcinoma. Cancer Res 1991; 51: 439-444. 173. Yamagata S, Yoshii Y, Suh JG, Tanaka R, Shimizu S Occurrence of inactive form of gelatinase in human gastric and colorectal carcinoma tissues. Cancer Lett 1991; 59: 51-55. 174. Newell KJ, Witty JP, Rodgers WH, Matrisian LM Expression and localization of matrix-degrading metalloproteinases during colorectal tumorogenesis. Mol Carcinog 1994; 10: 199-206. 175. McDonell S, Navre M Kr, Coffey RF, Matrisian LM Expression and localization of the matrix metalloproteinase PUMP-1 (MMP-7) in human gastric and colon carcinomas. Mol Carcinog 1991; 4; 527-533. 176. Witty JP, McDonell KJ, Cannon P, Navre M, Tressler RJ, Matrisian LM Modulation of matrilysin levels in colon carcinoma cell lines affects tumorigenicity in vivo. Cancer Res 1994; 54: 4805-4812. 177. Yamamoto H, Itoh F, Hinoda Y, Senota A, Yoshimoto M, Nakamura H et al Expression of matrilysin mRNA in colorectal adenomas and its induction by truncated fibronectin. Biochem Biophys Res Commun 1994; 201: 657664. 178. Takeha S, Fujiyama Y, Bamba T, Sorsa T, Nagura H, Ohtani H Stromal expression of MMP-9 and urokinase receptor is inversely associated with liver metastasis and with infiltrating growth in human colorectal cancer: a novel approach from immuno/inflammatory aspect. Jpn J Cancer Res 1997; 88: 72-81. 179. Ohtani H, Motohashi H, Sato H, Seiki M, Nagura H Dual over-expression pattern of membrane-type metalloproteinase-1 in cancer and stromal cells in human gastrointestinal carcinoma revealed by in situ hybridisation and immunoelectron microscopy. Int J Cancer 1996; 68: 565-570. 180. Migita T, Sato E, Saito K, Mizoi T, Shiiba K, Matsuno S et al Differing expression of MMPs-1 and 9 and urokinase receptor berween diffuse-and intestinal-type gastric carcinoma. Int J Cancer 1999; 84: 74-79. 181. Grigioni WF, D'Errico A, Fortunato C, Fiorentino M, Mancini AM, Stetler-Stevenson WG et al Prognosis of gastric carcinoma revealed by interactions between tumor cells and basement membrane. Mod Pathol 1994; 7: 220-225. 182. Otani Y, Okazaki I, Arai M, Kameyama K, Wada N, Maruyama K et al Gene expression of interstitial collagenase (matrix metalloproteinase 1) in gastrointestinal tract cancers. J Gastroenterol 1994; 29: 391-397. 183. Nomura H, Sato H, Seiki M, Mai M, Okada Y Expression of membrane-type metalloproteinase in human gastic carcinomas. Cancer Res 1995; 55: 3263-3266. 184. Gress TM, Mulla-Pillasch F, Lach MM, Friess H, Buchla M, Adla G Expression and in-situ localization of genes coding for extracellular matrix proteins and extracellular matrix degrading proteases in pancreatic cancer. Int J Cancer 1995; 62: 407-413. 185. Bramhall SR, Neoptolemos LP, Lemoine NR Imbalance of expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of the matrix metalloproteinases (TIMPs) in human pancreatic carcinoma. J Pathol 1997; 182: 347-355. 186. Rouyer N, Wolf C, Chenard MP, Ro MC, Chambon P, Bellocq JP et al Stromelysin-3 gene expression in human cancer: an overview. Invasion Metastasis 1994-95; 14: 269-275. 187. Autio-Harmainen H, Karttunen T, Hurskainen T, Hyhty M, Kauppila A, Tryggvason K Expression of 72 kilodalton type IV collagenase (gelatinase A) in benign and malignant ovarian tumors. Lab Invest 1993; 69: 312321. 188. Moser TL, Young TN, Rodrguez GC, Pizzo SV, Bast RC Jr, Stack MS Secretion of extracellular matrixdegrading proteinases is increased in epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer 1994; 56: 552-559. 189. Tamakoshi K, Kikkawa F, Nawa A, Ishikawa H, Mizuno K, Tamakoshi A et al Characterization of extracellular matrix-degrading proteinase and its inhibitor in gynecological cancer tissues with clinically different metastatic form. Cancer 1995; 76: 2565-2571. 190. Naylor MS, Davies BD, Balkwill FR Expression and activity of MMPS and their regulators in ovarian cancer. Int J Cancer 1994; 58: 50-56. 191. Fishman DA, Bafetti LM, Stacks MS Membrane-type matrix metalloproteinase expression and matrix metalloproteinase-2 activation in primary human ovarian epithelial carcinoma cells. Invasion Metastasis 1996; 16: 150-159. 192. Afzal S, Lalani EN, Poulsom R, Stubbs A, Rowlinson G, Sato H et al MT1-MMP, and MMP-2 mRNA expression in human ovarian tumors: possible implications for the role of desmoplastic fibroblasts. Hum Pathol 1998; 29: 155-165. 193. Nuovo GJ, MacConnell PB, Simsir A, Valea F, French DL Correlation of the in situ detection of polymerase chain reaction-amplified metalloproteinase complementary DNAs and their inhibitors with prognosis in cervical carcinoma. Cancer Res 1995; 55: 267-275. 194. Gilles C, Polette J, Piette C, Munaut EW, Thopmson P, Birembaut JM et al High level of MT-MMP expression is associated with invasiveness of cervical cancer cells. Int J Cancer 1996; 65: 209-213. 195. Inoue Y, Abe K, Obata K, Yoshioka T, Ohmura G, Doh K et al Immunohistochemical studies on matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and type IV collagen in endometrial carcinoma. J Obstet Gynecol Res 1997; 23: 139-145. 196. Johansson N, Vaalamo M, Grnman S, Hietanen S, Klemi P, Saarialho-Kere U et al Collagenase-3 (MMP-13) is expressed by tumor cells in invasive vulvar squamous cell carcinomas. Am J Pathol 1999; 54: 469-480. 197. Pajouh MS, Nagle RB, Breathanach R, Finch JS, Brawer MK, Bowden GT Expression of metalloproteinase genes in human prostate cancer. J Cancer Res Clin Oncol 1991; 117: 144-150. 198. Stearns ME, Wang M Type IV collagenase (M(r) 72,000) expression in human prostate: benign and malignant tissue. Cancer Res 1993; 53: 878-883. 199. Powell WC, Knox JD, Navre M, Grogan TM, Kittelson J, Nagle RB et al Expression of the metalloproteinase matrilysin in DU-145 cells increases their invasive potential in severe combined immunodeficient mice. Cancer Res 1993; 53: 417-422. 200. Hamdy FC, Fadlon EJ, Cottam D, Lawry J, Thurrell W, Silcochs PB el al Matrix metalloproteinase 9 expression in primary human prostatic adenocarcinoma and benign prostatic hyperplasia. Br J Cancer 1994; 69: 177-182.

201. Davies B, Miles D, Happerfield L, Naylor M, Bobrow L, Rubens R et al Activity of type IV collagenases in benign and malignant breast disease. Br J Cancer 1993; 67: 1126-1131. 202. Narvo S, Kanayama H, Aki M, Kagawa S Gene expressions of type IV collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP) in human bladder cancers. Jpn J Urol 1993; 84: 841-850. 203. Gohji K, Fujimoto N, Komiyama T, Fujii A, Ohkawa J, Kamidono S et al Evaluation of serum levels of matrix metalloproteinase-2 and 3 as new predictors of recurence in patients with urothelisl carcinoma. Cancer 1996; 78: 2379. 204. Kugler A, Hemmerlein B, Thelen P, Kallerhoff M, Radzun HJ, Ringert RH Expression of metalloproteinase 2 and 9 and their inhibitors in renal cell carcinoma. J Urology 1998; 160: 1914-1918. 205. Polette M, Clavel C, Muller D, Abecassis J, Binninger I, Birembaut P Detection of mRNAs encoding collagenase I and stomelysin 2 in carcinomas of the head and neck by in situ hibridization. Invasion Metastasis 1991; 11: 76-83. 206. Muller D, Breathnach R, Engelmann A, Millon R, Bronner G, Flesch H et al Expression of collagenase-related metalloproteinase genes in human lung or head and neck tumours. Int J Cancer 1991; 48: 550-556. 207. Muller D, Wolf C, Abecassis J, Milloni R, Engelmann A, Bronner G et al Increased stromelysin 3 gene expression is associated with increased local invasiveness in head and neck squamous cell carcinomas. Cancer Res 1993; 53: 165-169. 208. Johansson N, Airola K, Greman R, Kariniemi AL, Saarialho-Kere U, Khri VM Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinasee-13) in squamous cell carcinomas of the head and neck. Am J Pathos 1997; 151: 499508. 209. Airola K, Ahonen M, Johansson N, Heikkil VM, Saarialho Kere UK Human TIMP-3 in expressed during fetal development, hair growth cycle and cancer progression. J Histochem Cytochem 1998; 46: 437-448. 210. Visnen A, Tuominen H, Kallioinen M, Turpeenniemi-Hujanen T Matrix metalloproteinase-2 (72 kD type IV collagenese) expression occurs in the early stage of human melanocytic tumour progression and may have prognostic value. J Pathol 1996; 180: 283-289. 211. Van der Oord JJ, Paemen L, Opdenakker G, de Wolf-Peeters C Expression of gelatinase B and the extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN in benign and malignant pigment cell lesions of the skin. Am J Pathol 1997; 151: 665-670. 212. Gray ST, Wilkins RJ, Yun K Interstitial collagenase gene expression in oral squamous cell carcinoma. Am J Pathol 1992; 141: 301-306. 213. Majmudar G, Nelson BR, Jensen TC, Johnson TM Increased expression of matrix metalloproteinase-3 (stromelysin-1) in cultured fibroblasts and basal cell carcinomas of nevoid basal cell carcinoma syndrome. Mol Carcinog 1994; 11: 29-33. 214. Tsukifuji R, Sakai Y, Hatamochi A, Shinkai H Gene expression of matrix metalloproteinase-1 (interstitial collagenase) and matrix metalloproteinase-3 (stromelysin-1) in basal cell carcinoma by in situ hybridization using chondroitin ABC lyase. Histochem J 1997; 29: 401-407. 215. Airola K, Johansson N, Kariniemi AL, Khri VM, Saarialho-Kere UK Human collagenase-3 is expressed in malignant squamous epithelium of the skin. J Invest Dermatol 1997; 109: 225-231. 216. Brown PD, Bloxidge RE, Stuart NS, Gatter KC, Carmichael J Association between expression of activated 72kilodalton gelatinase and tumor spread in nonsmall-cell lung carcinoma. J Natl Cancer Inst 1993; 85: 574-578. 217. Nakagawa H, Yagihashi S Expression of type IV collagen and its degrading enzymes in squamous cell carcinoma of lung. Jpn Cancer Res 1994; 85: 934-938. 218. Urbanski SJ, Edwards DR, Maitland A, Leco KJ, Watson A, Kossakowska EAE Expression of metalloproteinases and their inhibitors in primary pulmonary carcinomas. Br J Cancer 1992; 66: 1188-1194. 219. Tokuraku M, Sato H, Murakami Y, Okada Y, Watanabe M, Seiki M Activation of the precursor of gelatinase A/72 kDa type IV collagenase/MMP-2 in lung carcinomas correlates with the expression of membrane-type matrix metalloproteinase (MT-MMP) and with lymph node metastasis. Int J Cancer 1995; 64: 355-359. 220. Kameyama K Expression of MMP-1 in the capsule of thyroid cancer relationshiip with invasiveness. Pathol Res Pract 1996; 192: 20-26. 221. Campo E, Merino MJ, Liotta L, Neumann R, Stetler-Stevenson W Distribution of the 72-kd type IV collagenase in nonneoplastic and neoplastic thyroid tissue. Hum Pathol 1992; 23: 1395-1401. 222. Nakamura H, Ueno H, Yamashita K, Shimada T, Yamamoto E, Noguchi M et al Enhanced production and activation of progelatinase A mediated by membrane-type 1 matrix metalloproteinase in human papillary thyroid carcinomas. Cancer Res 1999; 59: 467-473. 223. Nakano A, Tani E, Miyazaki K, Yamamoto Y, Guruyama J Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteases in human gliomas. J Neurosurg 1995; 83: 208-307. 224. Lampert K, Machein U, Machein MR, Conca W, Peter HH, Volk B Expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human brain tumors. Am J Path 1998; 153: 429-437. 225. Nakano A, Tani E, Miyazaki K, Furuyama J, Matsumoto T Expression of matrilysin and stromelusin in human glioma cells. Biochem Biophys Res Commun 1993; 192: 999-1003. 226. Rao JS, Steck PA, Mohanam S, Stetler, Stevenson WG, Liotta LA, Sawaya R Elevated levels of M 92,000 type IV collagenase in human brain tumors. Cancer Res 1993; 53: 2208-2211. 227. Yamamoto M, Mohanan S, Sawaya R, Fuller GN, Seiki M, Sato ZL et al Differential expression of membranetype metalloproteinase and its correlation with gelatinase A activation in human malignant brain tumors in vivo and in vitro. Cancer Res 1996; 56: 384-392. 228. Sugiura Y, Shimada H, Seeger RC, Laug WE, DeClerckYA Matrix metalloproteinases-2 and 9 are expressed in human neuroblastoma: contribution of stromal cells to their production and correlation with metastasis. Cancer Res 1998; 58: 2209-2216. 229. Berend KR, Toth AP, Harrelson JM, Layfield LJ, Hey LlA, Scully SP Association between ratio of matrix metalloproteinase-1 to tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and local recurrence, metastasis, and survival in human chondrosarcoma. J Joine Joint Surg Am 1998; 80: 11-17. 230. Scambia G, Benedetti-Panici P, Ferrandina G, Battaglia F, Baiocchi G, Mancuso S Cathepsin D in ovarian cancer, correlation with pathological features and receptors for oestrogen, progesterone and epidermal growth factor. Br J Cancer 1991; 64: 182-184. 231. Nazeer T, Malfetano JH, Rosano GT, Ross JS Correlation of tumor cytosol cathepsin D with differentiation and invasiveness of endometrial adenocarcinoma. Am J Clin Pathol 1992; 97: 764-769. 232. Snchez LM, Vizoso F, Dez-Itza I, Lpez-Otn C Identification of the major protein components in breast secretions from women with benign and malignant breast diseases. Cancer Res 1992; 52: 95-100. 233. Will CH, Wilhelm O, Hhl S, Mbus V, Weidle U, Kreienberg R et al Expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA) in human ovarian cancer cells and in vitro invasion capacity.

Int J Oncol 1994; 5: 753-761. 234. Kuhn W, Pache L, Schmalfeldt B, Dettmar P, Schmitt M, Jnicke F et al Urokinase (uPA) and PAI-1 predict survival in advanced ovarian cancer patients (FIGO III) after radical surgery and platinumbased chemotherapy. Gynecol Oncol 1994; 55: 401-409. 235. Gleeson N, Gonsalves R, Bonnar J The plasminogen activator urokinase and its inhibitor PAI-2 in endometrial cancer. Gynecol Oncol 1992; 47: 58-61. 236. Pujade-Lauraine E, Lu H, Mirshahi S, Soria J, Soria C, Bernadou A et al The plasminogen-activation system in ovarian tumors. Int J Cancer 1993; 55: 2731. 237. Bilgrami S, Singh NT, Shafi N, Ciesielski T Raised prostate-specific antigen in adenocarcinomaoflung. Lancet 1994; 344: 1371-1372. 238. Levesque M, Yu H, D'Costa M, Diamandis EP Prostate specific antigen expression by various tumors. J Clin Lab Anal 1995; 9: 123-128. 239. Yu H, Diamandis EP, Levesque M, Asa SL, Monne M, Croce CM Expression of the prostate-specific antigen gene by a primary ovarian carcinoma. Cancer Res 1995; 55: 1603-1606. 240. Bodey B, Bodey B Jr, Kaiser HE Immunocytochemical detection of prostate specific antigen expression in human primary and metastatic melanomas. Anticancer Res 1997; 17: 2343-2346. 241. Kozyreva EA, Zhordanina KI, Basalyk LS, Vasil'ev AV Prognostic significance of determining cathepsin B activity in malignant ovarian tumors. Vopr Med Khim 1994; 40: 25-27. 242. Chauhan SS, Goldstein LJ, Gottesman MM Expression of cathepsin L in human tumors. Cancer Res 1991; 51: 1478-1481. 243. Nishida Y, Kohno K, Kawamata T, Morimitsu K, Kuwano M, Miyakawa I. Increased cathepsin L levels in serum in some patients with ovarian cancer: comparison with CA 125 and CA 72-4. Gynecol Oncol 1995; 56: 357-361. 244. Docherty AJP, Lyons A, Smith BJ, Wright EM, Stephens PE, Harris TRJ et al Sequence of human tissue inhibitor of metalloproteinases and its identity to erythroid-potentiating activity. Nature 1985; 318: 66-69. 245. Stetler-Stevenson PW, Brown PPD, Onisto M, Levy AT, Liotta LA Tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2) mRNA expression in tumor cells lines and human tumor tissues. J Biol Chem. 1990; 265: 13933-13938. 246. Ura JA, Ferrando A, Velasco G, Freije JMP, Lpez-Otn C Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3, a new member of the metalloproteinase inhibitor family. Cancer Res 1994; 54: 2091-2094. 247. Greene J, Wang M, Liu YE, Raymond LA, Rosen C, Shi YE Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloporteinase 4. J Biol Chem 1996; 271: 30373-30380. 248. Cajot JF, Bamat J, Bergonzelli GE, Kruithof EK, Medcalf RL, Testuz J et al Plasminogen-activator inhibitor type 1 is a potent natural inhibitor of extracellular matrix degradation by fibrosarcoma and colon carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6939-6943. 249. Montgomery AM, De Clerk YA, Langley KE, Reisfeld RA, Mueller BM Melanoma-mediated dissolution of extracellular matrix: contribution of urokinase-dependent and metalloproteinase-dependent proteolytic pathways. Cancer Res 1993; 53: 693-700. 250. Bergman BL, Scott RW, Bajpai A, Watts S, Baker JB Inhibition of tumor-cell-mediated extracellular matrix destruction by a fibroblast proteinase inhibitor, protein nexin. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 996-1000. 251. Zou Z, Anisowicz A, Hendrix MJ, Thor A, Neven M, Sheng S et al Maspin, a serpin with tumor-suppresing activity in human mammary epithelial cells. Science 1994; 263: 526-529. 252. Stenman U-H, Huhtala M-L, Koistinen R, Seppl M Immunochemical demostration of an ovarian cancer associated urinary peptide. Int J Cancer 1982; 30: 53-57. 253. Corticchiato O, Cajot JF, Abrahamson M, Chan SJ, Keppler D, Sordat B Cystatin C and Cathepsin B in human colon carcinoma: Expression by cell lines and matrix degradation. Int J Cancer 1992; 52: 645-652. 254. Freije JP, Balbn M, Abrahamson M, Velasco G, Dalboge H, Grubb A et al Human cystatin D. cDNA cloning, characterization of the Escherichia coli expressed inhibitor, and identification of the native protein in saliva. J Biol Chem 1993; 268: 15737-15744. 255. Briozzo P, Morisset M, Capony F, Rougeot C, Rochefort H In vitro degradation of extracellular matrix with Mr 52,000 cathepsin D secreted by breast cancer cells. Cancer Res 1988; 48: 3688-3692. 256. Reich R, Thompson EW, Iwamoto Y Effects of inhibitors of plasminogen activator, serine proteinases and collagenase IV on the invasion of basement membranes by metastatic cells. Cancer Res 1988; 48: 3307-3312. 257. Naito K, Kanbayashi N, Nakajima S Inhibition of growth of human tumor-cells in nude-mice by a metalloproteinase inhibitor. Int J Cancer 1994; 58: 730-735. 258. Davies B, Brown P, East N, Crimmin MJ, Balkwill FR A synthetic matrix metalloproteinase inhibitor decreases tumor burden and prolongs survival of mice hearing human ovarian carcinoma xenografts. Cancer Res 1993; 53: 36521. 259. Beckett RP, Davidson AH, Drummond AH, Huxley P, Whittaker M Recent advances in matrix metalloprtoteinase inhibitor research. Drug Discovery Today 1996; 1: 16-26. 260. Hornung RL, Pearson JW, Bexwith M, Longo DL Preclinical evaluation of bryostatin as anticancer agent against several murine tumor lines. In vitro versus in vivo activity. Cancer Res 1992; 52: 101-107. 261. Ohkoshi M, Akagawa T, Makajima M Effects of serine protease inhibitor FOY-305 and heparin on the growth of squamous cell carcinoma. Anticancer Res. 1993; 13: 936-966. 262. Nishimura Y, Yasui W, Yoshida K, Matsuyama T, Dohi K, Tahara E A serine protease-inhibitory benzamide derivative inhibits the growth of human colon carcinoma cells. Jpn J Cancer Res 1992; 83: 723-728 263. Kimura T, Fuchimoto S, Iwagaki H, Hizuta A, Orita K Inhibitory effect of nafamostat mesilate into the livers of mice and on invasion of the extracellular matrix by cancer cells. J Int Med Res 1992; 20: 343-352. 264. Kobayashi H, Ohi H, Sugimura M, Shinohara H, Fujii T, Terao T Inhibition of in vitro ovarian cancer cells invasion by modulation of urokinase-type plasminogen activator and cathepsin B. Cancer Res 1992; 52: 36103614. 265. Aznavoorian S, Murphy AN, Stetler-Stevenson WG, Liotta LA Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis. Cancer 1993; 71: 1368-1382. 266. Balbn M, Pends AM, Ura JA, Jimnez MG, Freije JP, Lpez-Otn C Expression and regulation of collagenase3 (MMP-13) in human malignant tumors. APMIS 1999; 107: 45-5