MTODOS CORRENTES DE IMUNODIAGNSTICO

Os testes laboratoriais de imunologia podem fornecer informaes importantes para o diagnstico e cuidado clnico de pacientes. importante salientar que os testes imunolgicos podem ser usados tanto para doenas apresentando um envolvimento direto do sistema imune, quanto para doenas no imunolgicas. Os testes mais estabelecidos e clssicos so voltados para a deteco de anticorpos contra parasitas, fungos, bactrias, virus, indicando a presena de uma resposta imune contra o agente. Testes mais modernos e sensveis podem detectar a presena de antgenos destes organismos, indicando diretamente a sua presena no hospedeiro. Os testes imunolgicos podem ser utilizados, ainda, para a deteco de produtos como drogas ou hormonios, ajudando no acompanhamento clnico de pacientes.

Os usos de testes imunologicos incluem: a) confirmao de uma impresso clnica; b) diagnstico precoce de uma doena; c) excluso de determinada enfermidade; d) acompanhamento do progresso da doena; e) avaliao da efetividade da terapeutica

O teste imunodiagnstico ideal deveria ser de fcil execuo, barato e de resultado sempre preciso. Tal teste no existe. Muito poucos testes so baratos, e quase todos eles apresentam dificuldades e problemas potenciais na sua execuo (e estes problemas devem ser conhecidos pelo mdico que os solicita). Adicionalmente, muitos testes so usados de maneira inadequada ou interpretados erradamente.

Os testes imunolgicos, quando divididos pela sua metodologia, podem ser agrupados em: 1. Imunoprecipitao 2. Imunoaglutinao 3. Testes utilizando o Complemento 4. Ensaiosreceptor-ligante 5. Imunohistologia

Podemos dividir os testes imunolgicos pela sua aplicao, e neste caso teramos: 1. Mt. para deteco de antgenos 2. Mt. para deteco de anticorpos 3. Mt. para avaliao da imunidade celular 4. Mt. de avaliao do Sistema Complemento 5. Testes de Histocompatibilidade 6. Imunohematologia

A correta interpretao destes conceitos permite o proveito mximo na utilizao dos resultados dos testes laboratoriais. Estes conceitos incluem: sensibilidade, especificidade, resultado falso positivo e falso negativo, e valor preditivo.

Sensibilidade
necessrio distinguir os dois usos do termo sensibilidade. A sensibilidade analtica se refere ao limite de deteco do teste, isto , quantidade mnima da substncia analisada capaz de ser medida. O outro uso do termo sensibilidade, ou sensibilidade diagnstica, a medida da capacidade do teste em detectar todos os indivduos com determinada doena. Desta maneira um teste com 100% de sensibilidade seria capaz de identificar todos os pacientes portadores da doena a ser detectada pelo teste. A sensibilidade do teste dada pela percentagem de resultados positivos em pacientes com uma determinada doena.

Sensibilidade = Verd. Positivos / Total de doentes

Desta maneira se o teste de imunofluorescncia para deteco de anticorpos anti-leishmania positivo em 92 amostras de 100 soros de pacientes leishmaniose cutnea diz-se que a sua sensibilidade de 92%. preciso estar atento ao fato de que a sensibilidade de um teste pode variar em diferentes estgios da doena. Um teste que tem sensibilidade de 100% na fase tardia da doena pode ter uma sensibilidade de 10 a 20% nas formas muito precoces da enfermidade. Isto pode ocorrer, porque a quantidade de anticorpos tende a ser pequena nos estgios iniciais de doena, resultando em testes negativos. Deve-se ainda lembrar que algumas vezes os testes laboratoriais no so necessrios nos estgios avanados de certas doenas, ou porque o diagnstico j bvio ou porque o tratamento pode no mais ser eficiente. Um teste com uma sensibilidade diagnstica muito grande pode ser mais til na excluso de uma hiptese diagnstica, do que na confirmao. Isto acontece porque quando um teste muito sensvel ele se torna menos especfico.

Especificidade
A especificidade analtica se refere capacidade de um anti-soro distinguir entre dois antgenos relacionados. A especificidade diagnstica se refere capacidade do teste em ser negativo quando o indivduo no possui a doena. A especificidade pode ser calculada como a percentagem de resultados negativos em pacientes sem a doena testada.

Especificidade = Verd. Neg. / Total de sadios

A especificidade de um teste pode ser alterada pela mudana do ponto de corte (cutoff) usado para determinar se um teste positivo ou no. Muitos testes sorolgicos so realizados com diluies seriadas dos soros testados. Numa diluio muito baixa do soro praticamente todos os soros provenientes

de pacientes com a doena seriam positivos, mas possvel que alguns soros de indivduos sem a doena tambm apresentem resultados positivos; nesta diluio o teste seria muito sensvel, porm pouco especfico. Caso se empregasse uma diluio mais alta do soro o teste poderia dar alguns resultados negativos em soros de pacientes com a doena, mas dever conferir muito menos resultados positivos a soros de indivduos sem a doena. O teste perderia em sensibilidade, porm se tornaria mais especfico.

Imunoturbidimetria
Preferencialmente, consequentemente o antgeno a deve conter vrios dos eptopos e A

ocorre

dosagem

policlonal

anticorpos.

concentrao de antgenos e anticorpos deve ser bem definida, para que no ocorra o fenmeno conhecido com Przona. Definese a concentrao ideal atravs da anlise de vrias diluies, at que seja encontrada a Zona de Equivalncia. Paramelhor visualizao dos imunocomplexos (ligaes Ag/Ac), ostestesso realizados emmeio gelificado, que proporcioname formao de uma linha de precipitado, visvel a olho n. Automao nos ensaios de Imunoprecipitao: Nefelometria: Amedio feita atravs da disperso de luz, provocada pela presena dos complexos Ag/Ac; Turbidimetria: a deteco feita atravs de absorbncia.

Imunofluorescncia
As reaes imunolgicas que envolvem a ligao antgeno-anticorpo podem ser visualizadas ou quantificadas por meio de diferentes marcadores para o antgeno ou para o anticorpo. Entre os marcadores mais comumente empregados, podem-se citar os fluorocromos, as enzimas e os compostos radioativose eletro-opacos. Os primrdios da imunofluorescncia direta (IFD) datam de 1942, quando Albert Coons e col. demonstraram a marcao de anticorpos antipneumococos com fluorescena no tecido pulmonar. Os

fluorocromos so corantes que absorvem radiao (luz ultravioleta), so por ela excitados e emitem luz visvel. Para que funcionem como marcadores, necessitam possuir grupos qumicos capazes de formar ligaes covalentes com molculas proticas, emitindo alta fluorescncia no espectro visvel com colorao distinta da emitida pelos tecidos. Devem ter uma conjugao relativamente simples, reteno da atividade do anticorpo na protena marcada e estabilidade do conjugado fluorescente obtido. Um dos fluorocromos mais utilizados o isotiocianato de fluorescena (FITC), de cor verde, que tem um pico de absoro de 490l e de emisso de 520l. A rodamina, outro agente utilizado na IFD, de cor vermelha, possui picos distintos de absoro e de emisso (520l e 610l). O microscpio utilizado para a leitura de IFD pode ser de epiluminescncia ou confocal. Na leitura das reaes de imunofluorescncia (IF), devem-se enumerar trs formas distintas de fluorescncia: especfica, no especfica e autofluorescncia. A fluorescncia especfica deve-se reao entre o substrato e a protena marcada com o fluorocromo (reao antgeno-anticorpo). A

fluorescncia no especfica deve-se colorao dos tecidos por corante livre ou protenas fluoresceinadas, ou ambos. A autofluorescncia ocorre devido fluorescncia natural dos tecidos (amarela, azul), quando expostos luz ultravioleta.

Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

O teste de ELISA (do ingls Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) se baseia reaes antgeno-anticorpo detectveis atravs de reaes enzimticas. A enzima mais comumente utilizada nestas provas a peroxidase, que catalisa a reao de desdobramento da gua oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. Existem vrios modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido (placa de ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno.

Se houver anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao antgeno-anticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto , H2O2 dissolvida em uma substancia qumica que d uma reao colorida quando H2O2 desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a reao antgeno-anticorpo apresentam uma colorao (varivel dependendo do substrato). Outro mtodo o chamado ELISA de bloqueio ou competio, em que a presena de anticorpos em determinado soro revelada pela competio com um anticorpo especfico (mono ou policlonal) dirigido contra o antgeno. Igualmente, o resultado dado pela adio de um conjugado, porm a colorao aparecer nos orifcios onde no havia anticorpos.

Western blotting
O immunoblot consiste em um ensaio imunoenzimtico que tambm conhecido como western blotting. Considero o termo western bloting incorreto, j que o mesmo refere-se somente ao procedimento da eletrotransferncia para membrana de nitrocelulose. O teste utilizado como um valioso recurso na caracterizao de fraes antignicas imunodominantes e identificao da reatividade especfica de anticorpos detectados por um teste de triagem utilizando mltiplas fraes antignicas (teste confirmatrio ou suplementar). Para a deteco da interao antgeno-anticorpo necessrio em primeiro lugar a obteno da membrana com as fraes da misturantignica, onde as protenas so separadas de acordo com o seu tamanho, atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Depois de separadas so transferidas para uma membrana de nitrocelulose onde ficam inertes e posteriormente sero utilizadas como suporte para a deteco da interao antgeno-anticorpo.

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) utiliza o detergente aninico dodecil-sulfato de sdio (SDS), que confere carga negativa s protenas, facilitando a separao por peso molecular. Laemmli foi o idealizador da tcnica em 1970 quando a utilizou com a finalidade de determinar a mobilidade das protenas em gel submetido corrente eltrica. A mobilidade esta relacionada diretamente ao tamanho da protena. Outro fator que influencia na mobilidade ante ao gel, o tamanho dos poros do mesmo. Para melhor resoluo de peptdeos de pesos moleculares abrangendo uma faixa maior, comum a utilizao de gradiente do gel, de 5% a 20%, por exemplo. Dessa forma, as protenas grande ficaram retidas no incio da corrida e os pequenos peptdeos iro migrar at o final do gel na eletroforese. A amostra de protenas que ser aplicada no gel tratada para estar solubilizada e tambm desnaturada com a quebra das pontes dissulfeto, foras eletrostticas e pontes de hidrognio. A amostra tambm aquecida em banho at fervura por 5 minutos, geralmente, para garantir a melhor discriminao dos componentes da mistura. Na soluo de amostra tambm adicionado glicerina, que ir facilitar a penetrao da amostra no gel, e como marcador de corrida utilizado o corante azul de bromofenol. A colorao do gel tem por finalidade a identificao da composio de protenas e peptdeos. Conforme o princpio da eletroforese, as fraes anitgnicas sofrem ao de carga eltrica, migrando para o plo positivo. Conforme j sabido, as protenas de menor tamanho migram com maior velocidade que as protenas de tamanho maior, pela barreira fsica estabelecida pelo sistema do gel. Uma vez separadas pelo tamanho, a posio das protenas definida por comparao migrao de um padro de molculas de tamanho molecular conhecido. Dessa forma, possvel determinar com preciso o tamanho molecular de protenas entre 5 e 250 KDa. Aps a separao das protenas, elas so ento eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose pelo fato do gel de eletroforese ser um meio pouco apropriado para a imunodeteco, por no ser um bom suporte para as ligaes antgeno/anticorpo. A membrana de nitrocelulose possui grupos nitro ligados celulose produzindo desta forma um suporte com alta afinidade por

protenas, fazendo com que estas permaneam presas a sua superfcie. Para transferir o antgeno do gel de eletroforese para a membrana utiliza-se um campo eltrico (mesmo princpio da eletroforese). Ao final da

eletrotransferncia essa membrana servir como suporte para o ensaio imunoenzimtico (Immunoblot). Neste mtodo, feito um sanduche com a membrana. Conforme ilustrado na figura abaixo, o sanduche montado sobre o nodo (+) onde colocada uma esponja, um papel filtro, a membrana de nitrocelulose e em seguida o gel, depois outro papel filtro e outra esponja que entrar em contato com o ctodo (-). O sanduche deve ser montado conforme ilustrado para que as protenas presentes no gel, ainda embebidas em SDS (-), possam migrar para o nodo (+), conforme o princpio da eletroforese.

REFERNCIAS

ABBAS, A. K., Lichtman, A. H. Imunologia Celular e Molecular, 5 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA). <www.anvisa.gov.br > Acesso em: 01 de julho de 2013. Disponvel em:

JANEWAY, C. A.; TRAVERS, P.; WALPORT, M. & CAPRA, J. D.: Imunobiologia: O sistema imunolgico na sade e na doena. 7. ed. Porto Alegre, Artes Mdicas Sul. 2010 Aoki V. Imunofluorescncia, immunoblotting e imunoprecipitao. In: Sampaio SA, Rivitti E, eds. Dermatologia. 3 ed. Sao Paulo: Artes Mdicas; 2007. p.12738. VAZ, A., J. ; TAKEI, K. ; BUENO E., Imunoensaios Fundamentos e Aplicaes. Ed. 1. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. 357p