LABORATORIO DE BIOQUMICA 502504 Grupo 1 GUIA No 1- Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes

I. EL PROBLEMA. Demostrar que en la composicin de material biolgico se encuentran carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos de acuerdo con su funcin biolgica. II. FUNDAMENTO TEORICO. Los compuestos biolgicos estn hechos a partir de los mismos elementos que se encuentran en otras molculas pero predominan algunos elementos; los ms comunes son el carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno, fsforo y azufre. El agua es un componente importante de la clula y es la que eleva el porcentaje de composicin del oxgeno. Las reacciones qumicas que se efectan en la clula, forman y rompen enlaces de acuerdo a mecanismos comunes a toda la qumica, pero estas reacciones son catalizadas por o que se llevan a cabo a velocidades muy rpidas. En ests reacciones intervienen una serie de biomolculas y biopolmeros que son indispensables para la clula; entre ellos tenemos las protenas, que son biopolmeros grandes (formados por aminocidos) que entre sus mltiples funciones estn las de tipo estructural y la funcin cataltica (enzimas). Los carbohidratos son un grupo de biomolculas abundantes, en ellos tenemos los azcares sencillos (glucosa), sus polmeros ( almidn) y algunos derivados (cido galacturnico). En cuanto a los lpidos, son los componentes importantes de las membranas biolgicas, los ms sencillos son los cidos grasos, luego estn algunas molculas ms grandes como los fosfolpidos y algunas molculas ms complejas como el HDL. Los cidos nucleicos, ADN y ARN, son biopolmeros conformados por los nucletidos, los cuales a su vez estn formados por un azcar (ribosa), una base nitrogenada (como la citosina) y al menos un grupo fosfato. Entre las principales pruebas de identificacin de los compuestos biolgicos se encuentran las siguientes: Prueba de Molisch Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de cualquier carbohidrato en el que los polisacridos y oligosacridos se hidrolizan con cido sulfrico concentrado hasta monosacridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural, los cuales reaccionan con -naftol formando un producto observable como un anillo de color rosado, violeta o morado.

Prueba de Benedict La solucin mantiene el mismo principio de la de Fehling en la que se oxida en medio alcalino 2+ + y caliente a los carbohidratos reductores, mientras se reduce el Cu a Cu con la formacin de un precipitado de Cu2O, observndose un color amarillo, naranja, rojo brillante o caf. Prueba de Lugol El reactivo de Lugol consta de yodo diatmico (I2) y yoduro potsico (KI) y permite reconocer en el laboratorio polisacridos ramificados o no, con diferentes colores dependiendo de su naturaleza qumica, con el almidn (negro, azul oscuro, morado o violeta claro, dependiendo de la concentracin del polisacrido), glucgeno y dextrinas (rojo-pardo). Reaccin de Milln El anillo fenlico tiene un comportamiento caracterstico frente a las sales de Mercurio a pH cido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenlico de la tirosina, pptidos o protenas que contienen este aminocido. Reaccin de Ninhidrina En esta prueba la Ninhidrina reacciona con el grupo amino de aminocidos pptidos o protenas dando un complejo coloreado que vara de azul a violeta intenso y en algunas ocasiones con ciertos aminocidos libres toma color rosa, amarillo o caf. Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia. Prueba de Lieberman-Burchard Se basa en la reaccin coloreada (inicia rojo y progresa a verde) que dan aquellas sustancias que tienen como ncleo el ciclo pentanoperhidrofenantreno. El color se debe a que el grupo hidroxilo del colesterol que reacciona con los reactivos y el aumento de la conjugacin de la saturacin en el anillo fusionado. Prueba de saponificacin Es una prueba para identificar cidos grasos, por lo tanto, general para los lpidos que los contengan. Durante esta prueba estos compuestos reaccionan con una base y se obtienen las sales de los cidos grasos, es decir jabones, detectables por agitacin. Prueba de difenilamina Es una prueba para identificar ADN, durante este ensayo ocurre una hidrlisis cida que remueve todas las bases pricas (hidrlisis de uniones N-glicosdicas entre pentosa y las bases pricas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotdico, por lo tanto se obtiene como producto cidos nucleicos sin bases pricas. Las desoxipentosas debido a la hidrlisis cida sufren deshidratacin dando aldehdos -hidroxilevulnicos y estos reaccionan con difenilamina dando un producto de color azul. III. GUA PARA ELABORAR EL PREINFORME.

Realice todos los numerales del preinforme (ttulo y consulta, fichas tcnicas en tabla, procedimiento en diagramas de flujo, hiptesis y bibliografa) a mano, en esfero, de acuerdo con las indicaciones de su profesora. - En la consulta, mximo de dos pginas tamao carta, con citas incluya: -La explicacin breve del funcionamiento bioqumico (nombres de rutas metablicas) y fisiolgico (accin biolgica dentro de algn sistema) del rgano o tejido que le corresponde como muestra a analizar.

-La composicin de la muestra en porcentaje de biomolculas (carbohidratos, lpidos, y protenas), esta informacin se encuentra en tablas de valor nutricional. *Recuerde que de una buena consulta depende la elaboracin exitosa de las hiptesis de cada prueba y la discusin de resultados del informe. IV. MATERIALES Y REACTIVOS. Materiales por grupo: Un mortero grande con mano Una cpsula de porcelana Dos vasos de precipitados de 100ml Un vaso de precipitados de 500ml Un vaso de precipitados de 250ml Doce tubos de ensayo Dos gradillas para tubos de ensayo Un pipeteador o propipeta Una esptula Seis tubos para centrfuga(grandes y pequeos) Pinzas para tubo Cinco goteros

Materiales y reactivos generales(el volumen de los reactivos est calculado para 10 grupos) todos los reactivos con duplicado: Acido tricloroactico (ATA) al 10% (300ml) Etanol-Eter-Cloroformo 2:2:1 (300ml) Etanol al 95% (500ml) NaCl al 10% (300ml) Reactivo de Lugol con gotero Reactivo de Molisch con gotero Reactivo de Benedict (100ml) Reactivo de Milln (100ml) Solucin de ninhidrina al 2% (50ml) en etanol a 95% y fresca Reactivo de difenilamina fresco:1 g de difenilamina en 100 ml de cido actico glacial y se agregan 2ml de cido sulfrico concentrado. Cloroformo(100ml) Anhdrido actico(100ml) cido sulfrico concentrado en gotero (100ml) NaOH al 15% (200ml) Butanol con gotero (100ml) Arena lavada Hielo en cubeta Cuatro pipetas graduadas de 5ml Agua destilada Balanza analtica Centrfugas Siete goteros plsticos Cuatro vasos de precipitados de 250ml Perlas de ebullicin

Muestras(rganos):

Pulmn de res (nombre comn: bofe), sesin I de recuperacin del festivo del 7 de agosto Cerebro de res, sesin II- 14 de agosto

Soluciones patrn a su disposicin durante la prctica: Colesterol al 2% en etanol-ter-cloroformo 2:2:1(100ml) Almidn al 1% en etanol al 50% (100ml) Ovoalbmina en cloruro de sodio al 1% Maltosa al 2% (100ml) Triolena al 2% en etanol-ter-cloroformo 2:2:1(100ml) Glucgeno al 1% en etanol al 50%(100ml) Suspensin de levadura (1/4 de pastilla en 50 ml de agua) Glucosa al 2 % (100ml)

V. PROCEDIMIENTO. Recuerde tomar fotos ilustrativas de cada procedimiento, con todo debidamente marcado por un marcador de tinta indeleble. I. Cada grupo realizar el fraccionamiento qumico sobre un tejido determinado de acuerdo con el diagrama No 1 (pg.7). II. Con las muestras obtenidas en el procedimiento de fraccionamiento del diagrama No.1(monosacridos-oligosacridos, glicgeno, lpidos, protena y cidos nucleicos) se realizarn las siguientes pruebas de caracterizacin. Carbohidratos: para cada muestra glicgeno, y monosacridos-oligosacridos. Divida cada una de las dos muestras de carbohidratos en tres porciones cada una en un tubo de ensayo diferente (1,2 y 3) y realice las siguientes pruebas respectivamente: 1. Prueba de lugol: en un tubo agregue una fraccin de la muestra 3 gotas de Lugol y observe. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con los resultados obtenidos en las muestras. 2. Prueba de Molisch: A otra fraccin de la muestra adicione 1ml de agua destilada, 2 gotas de reactivo de Molisch (alfa-naftol) y mezcle cuidadosamente. Con los tubos inclinados agregue 1ml de cido sulfrico concentrado el cual forma una capa de cido debajo de la fase acuosa, observe la coloracin del anillo formado en la interfase. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con los resultados obtenidos en las muestras. 3. Prueba de Benedict: Coloque al bao mara por 2 min y luego adicione 2ml de reactivo de Benedict, observe y contine calentando por 15min; vuelva a observar. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con los resultados obtenidos en las muestras. Lpidos: divida la muestra de extraccin de lpidos en dos tubos de ensayo y realice las siguientes pruebas: 1. Prueba de Lieberman: adicione 3ml de cloroformo y mezcle, luego adicione 1ml de anhdrido actico cuidadosamente por la paredes del tubo y agite, luego agregue 3 gotas de cido sulfrico tambin por la paredes y observe la coloracin de la interfase al minuto y a los 15 minutos. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con el resultado obtenido en la muestra.

2. Prueba de saponificacin : agregue 3ml de NaOH al 15% y una perla para ebullicin, y coloque al bao mara durante 20min, adicione 3ml de agua destilada y agite fuertemente. Observe. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con el resultado obtenido en la muestra. Protenas: Coloque la muestra de protenas en un tubo de ensayo y realice el siguiente ensayo: 1. Prueba de milln: adicione 1 ml de agua destilada y suspenda la muestra, agregue 1ml del reactivo de milln y caliente por unos minutos al bao mara, observe. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con el resultado obtenido en la muestra. Prueba de ninhidrina: Adicione 1 ml de agua destilada y suspenda la muestra, agregue 1ml del reactivo de Ninhidrina, caliente en bao de agua a ebullicin por 5 min. Observe los colores desarrollados y anote los resultados. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con el resultado obtenido en la muestra.

2.

cidos nucleicos: Coloque la muestra de cidos nucleicos en un tubo de ensayo y realice la siguiente prueba: 1. Prueba de difenilamina: adicione 1 ml de agua destilada y suspenda la muestra, agregue 1ml de difenilamina mezcle bien y caliente al bao mara por 10 minutos, sin dejar que haya ebullicin, luego enfriar a bao de hielo hasta que parezca la coloracin caracterstica de la desoxirribosa de las bases pricas del ADN. Realice esta prueba con 1 ml de la solucin patrn de su eleccin y compare con el resultado obtenido en la muestra. VI. PARA RESULTADOS Y ANLISIS DE LA PRCTICA.

Recuerde que el informe solo consta de: 1. tablas de resultados. 2. anlisis de resultados con citas APA y fotos. 3. conclusiones y 4.bibliografa con normas APA. 1. Disear la tabla de datos recuerde que esta debe incluir una informacin organizada del tejido u rgano de acuerdo con todas las muestras disponibles(mono-oligosacridos, glicgeno, lpidos, protenas y cido nucleicos) y donde se aclare las observaciones en cada caso y si la prueba puede considerarse positiva o negativa (0,5/5,0). 2.Para la elaboracin del anlisis use toda la informacin de la gua (fundamento terico y procedimiento), la consulta e hiptesis en su preinforme, as como los resultados obtenidos ilustrados con fotos (3,8/5,0). - Primero explique brevemente sobre el diagrama No.1 (pgina 7)qu procedimiento permiti separar las diferentes fracciones moleculares de las muestras (carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos). - Luego para cada prueba explicar en forma concreta: a)El fundamento qumico para la identificacin de cada biomolcula y la relacin con los patrones positivos o negativos usados en la prctica. b)La ecuacin de la reaccin qumica, a excepcin de la de lugol y la de difenilamina c)Si hay presencia de los diferentes tipos carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos en cada tejido u rgano, de acuerdo con su estructura, funcin fisiolgica y bioqumica consultada en el preinforme. d)Composicin comparando con tablas de consulta del preinforme. e)Si logr resolver la pregunta planteada por el problema de esta gua de laboratorio, as como si confirm sus hiptesis del preinforme.

*no olvide: que la discusin de resultados no se escribe a manera de cuestionario, explique tanto las pruebas positivas como las negativas y redacte con citas ( incluyendo figuras)porque de lo contrario no se lee.

3.Conclusiones:redacte una conclusin para cada prueba en donde exprese en forma clara y concreta lo encontrado en cada ensayo de reconocimiento en su tejido u rgano en estudio(0,5/5,0).

Bibliografia: redacte la bibliografa con normas APA y que corresponda con las citas usadas en la discusin de resultados(0,2/5,0).
4. *no olvide hacer la bibliografa porque sin esta no se leen preinformes ni informes.

Diagrama No 1

TEJIDO u RGANO

Cortar en trozos pequeos y pesar unos 7g, pasar a un mortero y adicionar ATA en relacin de 1,5ml/g de tejido. Adicionar aproximadamente 0,5 g de arena lavada, macerar y centrifugar por 10 min.
RESIDUO SOBRENADANTE

Lpidos, Protenas, cidos nucleicos, arena Carbohidratos

Adicione al residuo en una cpsula de porcelana la mezcla de Etanol- Eter-Cloroformo 2:2:1 en 1,5ml/g de tejido y rpidamente pase a tubo de centrifuga y centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos.

En un vaso de precipitados adicione etanol al 95% en una relacin 2:1 con respecto al volumen del sobrenadante y enfriar en un bao de hielo por 5min. Centrifugar por 10 min preferiblemente en fro.

SOBRENADANTE

RESIDUO

Mono y oligosacridos: evaporar al bao mara y guardar.

Glicgeno: sacar y guardar.

SOBRENADANTE

RESIDUO

Lpidos: evaporar al bao mara y guardar

cidos nucleicos, protena y arena

En una vaso de precipitados de 100ml agregar NaCl al 10% (1ml/g tejido original),ms 1ml de butanol, pasar a varios tubos y calentar a 90C en una bao mara por 20 min(use perlas de ebullicin). Sacar perlas y centrifugar a 4000 rpm por 10min. RESIDUO SOBRENADANTE

Protena desnaturalizada y arena, sacar y guardar

cidos nucleicos:adicionar etanol al 95% y en frio en relacin 2:1 y dejar reposar por 10 minutos. Centrifugar a 5000 rpm por 10 minutos.

RESIDUO
cidos nucleicos

SOBRENADANTE
Desechar

VII. BIBLIOGRAFA. - Conferencias para el Laboratorio de Bioqumica para Biologa y Farmacia. (1998). Bogot: Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Qumica. Plummer, David T. (1981). Bioqumica prctica. Barcelona: Editorial Mc Graw-Hill Latinoamericana.