Ministrio da Sade Instituto Nacional de Sade Dr.

Ricardo Jorge

Programa Nacional de Controlo de Infeco

PNCI

2004

AUTORES
Ana Bruschy Fonseca (Centro Hospitalar de Cascais) Clotilde Sebastio (Hospital Distrital de Abrantes) Filomena Jos Cardoso Martins (Hospital de S. Francisco Xavier) Maria da Graa V. Carvalho Ribeiro (Hospitais da Universidade de Coimbra) Ismlia Calheiros (Centro Hospitalar de Vila Nova de Gaia) Lus Marques Lito (Hospital de Santa Maria) Margarida Bivar Abecassis (Hospital de Pulido Valente) Margarida Isabel Feij Pinto (Hospital de Santa Marta) Maria Odete Chantre Spencer (Hospital de So Jos) Maria Paula S. Falco M. Pinheiro (Hospital Dr. Jos Maria Grande - Portalegre) Maria Teresa M. Pina M. Costa (Hospital Curry Cabral) Rosa Maria Barros (Hospital de Dona Estefnia) Rosa Fula Bento (Hospital Jos Joaquim Fernandes - Beja)

Colaboraes
Elaine Pina (Programa Nacional de Controlo da Infeco - PNCI e Hospital de S.Antnio dos Capuchos) Helena Ramos (Hospital Geral de Santo Antnio Porto)

Redaco Final e Uniformizao

Ana Bruschy Fonseca Lus Marques Lito Maria Teresa M. Pina M. Costa

Formatao
Ana Bruschy Fonseca

Reviso
Maria Jos Salgado (Hospital de Santa Maria) Elaine Pina, Coordenadora do PNCI Maria Goreti Silva, Enfermeira do PNCI

Publicao
Programa Nacional de Controlo da Infeco (PNCI) Instituto Nacional de Sade, Dr. Ricardo Jorge, Observatrio Nacional da Sade (ONSA)

INTRODUO
O presente trabalho resulta do empenho de um grupo de Microbiologistas Clnicos que, durante alguns anos, se reuniu periodicamente sob a gide do Programa Nacional de Controlo de Infeco. Para o seu desenvolvimento, os autores recorreram bibliografia da especialidade, mas introduziram tambm uma forte componente da experincia adquirida pelo seu trabalho dirio. As ORIENTAES PARA A ELABORAO DE UM MANUAL DE BOAS PRTICAS EM BACTERIOLOGIA, tal como o nome indica, tem como objectivo permitir aos responsveis pelos Laboratrios de Microbiologia a elaborao do seu proprio Manual de Boas Prticas. Assim, neste trabalho, so colocados disposio meios que os podero ajudar a melhor desenvolver esta desejvel tarefa. Neste documento so exclusivamentte tratados temas relacionados com a Bacteriologia, no estando portanto includas reas igualmente importantes como a Micobacteriologia, a Micologia, a Virologia ou a Parasitologia.

Agradecimentos: O grupo de trabalho que elaborou este Manual de Boas Prticas agradece a todos quantos contribuiram de forma directa ou indirecta para a sua elaborao e divulgao. Agradecemos de modo especial, Exm. Sr. Dr. Elaine Pina, Coordenadora do PNCI, Exm. Sr. Dr. Maria Jos Salgado, Microbiologista do Hospital de Santa Maria pela disponibilidade, apoio, sugestes e ensinamentos e Exm. Sr. Enf. Maria Goreti Silva do PNCI pelo trabalho de reviso do Manual.

NDICE
1. GENERALIDADES 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. Tcnicas Laboratoriais usadas no estudo das bactrias Uso do Microscpio Desenvolvimento das bactrias em meios de Cultura Identificao das bactrias Conservao e Transporte de produtos biolgicos e estirpes bacterianas Esterilizao e Desinfeco Tratamento de Resduos Slidos 5 5 8 12 19 21 25 26

2. NORMAS de COLHEITA e TRANSPORTE de PRODUTOS 3. PROCESSAMENTO dos PRODUTOS para EXAME BACTERIOLGICO 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. Urina Hemocultura Lquido Cfalo-raquidiano Lquidos de Serosas Aparelho Respiratrio Superior Aparelho Respiratrio Inferior Exsudados Oculares Exsudados Purulentos 3.8.1.Bipsias cirrgicas e Cateteres Vasculares 3.9. Fezes 3.10. Aparelho Genital 3.11. Amostras para Pesquisa de Anaerbios

40 44 50 52 54 59 65 72 75 78 82 89

4. IDENTIFICAO de MICRORGANISMOS 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. Identificao de COCOS Gram Positivo Identificao de BACILOS Gram Positivo Identificao de COCOBACILOS Gram Negativo Identificao de ENTEROBACTERIACEAE Identificao de BACILOS Gram Negativo no-fermentadores Identificao de BRUCELLA spp. Identificao de MICRORGANISMOS EXIGENTES Identificao das VIBRIONACEAE spp. 100 105 111 118 122 127 129 135 138 159 178

3. TESTE de SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIMICROBIANOS 4. QUALIDADE em MICROBIOLOGIA 5. LABORATRIO de MICROBIOLOGIA e INFECO HOSPITALAR

GENERALIDADES

1. TCNICAS LABORATORIAIS USADAS NO ESTUDO DE BACTRIAS

1.1 - USO DO MICROSCPIO

1.1.1 TCNICA DO ESFREGAO Amostras biolgicas lquidas e culturas de caldo colocar o produto numa lmina e estender em camada fina. Secar a preparao e fixar (calor ou metanol). Amostras biolgicas slidas e culturas de meios slidos colocar sobre a lmina uma gota de gua destilada e juntar uma pequena poro do produto, emulsion-la na gota, estendendo de seguida. Secar e fixar como anteriormente. Amostras espessas ou purulentas (ex.: expectorao) utilizar a tcnica de estiramento colocar uma poro de produto numa lmina e pressionando com outra lmina, fazer deslizar as duas lminas ao longo uma da outra, vrias vezes

Preparao do esfregao por tcnica de estiramento

1.1.2. EXAME A FRESCO Colocar o produto numa lmina, cobrir com uma lamela e observar ao microscpio com objectiva de 40x. Permite apreciar a presena de: Elementos celulares Microrganismos (bactrias, fungos e parasitas)

1.1.3. COLORAES O exame microscpico de preparaes coradas permite precisar as caractersticas morfolgicas das bactrias (forma e afinidade para os corantes):

Colorao SIMPLES - AZUL de METILENO

Reagentes Soluo de azul de metileno: - Soluo alcolica, saturada, de azul de metileno 300 ml - Soluo aquosa, a 0,01% de hidrxido de potssio 1000 ml

Cobrir o esfregao, correctamente fixado, com soluo de azul de metileno durante 3 minutos. Lavar com gua corrente e secar

Colorao DIFERENCIAL - Mtodo de GRAM

Reagentes Soluo de violeta cristal: - violeta de cristal - 2 g - lcool etlico a 95% - 20 ml - oxalato de NH4 - 0.8 g - gua destilada - 100 ml Lugol: - iodeto de potssio 2 g - cristais de iodo 1 g - gua destilada 100 ml Descorante (lcool-acetona): - acetona - 50 ml - lcool etlico a 95% - 50 ml Contra-colorao: - safranina O - 2.5 g - lcool etlico a 95% - 100 ml -Juntar 10 ml desta soluo a 100 ml de gua destilada

Cobrir o esfregao j fixado, com soluo de violeta de cristal durante 1 minuto. Lavar com lugol e deixar actuar durante 1 minuto. Lavar com gua corrente. Descorar com lcool acetona at que no saia mais cor violeta do esfregao. Lavar com gua corrente Cobrir a superfcie com soluo de contra-colorao (safranina, fucsina diluda etc.) durante 1 minuto. Lavar com gua corrente e deixar secar. As bactrias Gram positivo coram de roxo escuro e as Gram negativo de vermelho

Colorao para deteco de CIDO LCOOL RESISTNCIA 1. Colorao de ZIEHL- NEELSEN

Reagentes Fucsina de Ziehl: - fucsina bsica em p 5 g - fenol cristalizado 25 g - lcool absoluto 50 ml - gua destilada 500 ml Colocar a fucsina e o fenol num balo e aquecer em banho de gua fervente durante 5 min, com agitao frequente. Depois de completa dissoluo, adicionar lcool e agitar bem. Juntar, por fim, a gua destilada e filtrar antes de usar. Descorante: - lcool etlico 95% - 97 ml - cido clordrico concentrado (37%) 3 ml Azul de metileno (j descrito)

Cobrir a lmina com soluo de fucsina e aquecer at emisso de vapores. Deixar actuar durante 10 minutos. Lavar com gua Cobrir com soluo descorante (lccol-cido) cerca de 1 minuto. Lavar com gua Corar com azul de metileno durante 15- 20 Seg. Lavar e deixar secar

2. Colorao de KINYOUN
Reagentes Carbolfucsina de Kinyoun: - Soluo 1: dissolver 4 g de fucsina bsica em 20 ml de etanol a 95% - Soluo 2: dissolver 8 g de cristais de fenol em 100 ml de gua destilada. necessrio aquecimento. - Soluo de trabalho: Combinar as solues 1 e 2 lcool- cido a 3% : Juntar cuidadosamente 3 ml de cido clordrico concentrado (37%) a 97 ml de etanol a 95%

Cobrir a lmina com a soluo de carbolfucsina de Kinyoun e deixar actuar 5 minutos Lavar com gua Cobrir a lmina com lcool-cido a 3% e deixar actuar 2 minutos Lavar com gua e retirar o excesso Cobrir a lmina com contra-colorao ( ex. azul de metileno) e deixar actuar 1-2 min. Lavar com gua e deixar secar

3. Colorao da AURAMINA
Reagentes Soluo corante: - Auramina O - 0.3 g - Fenol - 3 g - gua destilada 97 ml Dissolver o fenol na gua morna; juntar a auramina pouco a pouco agitando vigorosamente at dissoluo; filtrar e conservar em frasco de vidro escuro bem vedado. cido- lcool a 3% Soluo de permanganato de potssio: - permanganato de potssio 1 g - gua destilada 1000 ml

Cobrir o esfregao fixado com soluo de auramina, durante 15 minutos. Lavar com gua corrente. Descorar, durante 5 min, com o lcool- cido e lavar com gua corrente. Tratar com permanganato durante 30 segundos. Lavar de novo e deixar secar.

1.1.4. MORFOLOGIA BACTERIANA As bactrias tm 4 formas principais: redonda (cocos) alongadas ou em bastonete (bacilos) curva (vibrio) espiralada (espirilo)

1.2- DESENVOLVIMENTO DE BACTRIAS EM CULTURA

1.2.1. MEIOS DE CULTURA Classificao dos Meios de cultura

Os meios podem ser: - Lquidos - Slidos (com 1,5% de agar) - Semi- slidos (com 0,5% de agar) Tipos de Meios de cultura Meios SELECTIVOS (ex.: MacConkey, Hektoen). Meios NO SELECTIVOS (ex.: Gelose com sangue) Meios DIFERENCIAIS (MacConkey) A tcnica utilizada para preparar os meios muito importante para obter um meio de boa qualidade (devem ser seguidas escrupulosamente as indicaes de cada fabricante).

1. Meio BRAIN-HEART Classificao meio no selectivo Princpio: - A adio de sangue permite o isolamento de bactrias exigentes. - Utiliza-se geralmente como meio de enriquecimento ou meio base para hemoculturas. - A adio de 5-10% de sangue, antibiticos como cloranfenicol e gentamicina, tornam o meio selectivo para fungos.

2. GELOSE COLUMBIA Classificao - meio no selectivo Princpio - meio base que com a adio de substncias especficas, sangue ou agentes selectivos, origina meios de cultura especiais para multiplicao, isolamento ou identificao de microrganismos

2.1. Gelose COLUMBIA com SANGUE Gelose Columbia qual se junta sangue desfibrinado de carneiro ou cavalo, a uma temperatura de 45 C. Pode tornar-se selectivo quando adicionados agentes inibidores. Permite a observao da presena ou no de hemlise e o tipo de hemlise. 2.2. Gelose COLUMBIA com sangue, colistina e cido nalidxico (CNA) A colistina e o cido nalidxico inibem o crescimento das Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp. o que torna o meio selectivo para bactrias Gram positivo, contudo algumas bactrias Gram negativo como Gardnerella vaginalis e alguns Bacteroides spp. tambm se desenvolvem.

2.3. Gelose CHOCOLATE Meio enriquecido, no selectivo obtido a partir da gelose Columbia, pelo aquecimento da mistura com sangue a 80C (hemlise dos eritrcitos). Favorece o crescimento de Neisseria spp. e Haemophilus spp. Agentes selectivos: 1. Gelose chocolate com V.C.A.T. (vancomicina, colistina, anfotericina e trimetropim) com incubao a 35C em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, permite o isolamento de Neisseria gonorrhoeae em amostras com flora indgena. 2. Gelose chocolate com bacitracina favorece o crescimento de Haemophilus spp. nos produtos com flora mista devido inibio das bactrias Gram positivo e maioria das Neisseriaceae.

3. Meio de CHAPMAN( MANITOL SALGADO) Classificao - meio selectivo para o isolamento de Staphylococcus spp., e identificao presuntiva de S. aureus. Princpio - A elevada concentrao de NaCl inibe a maior parte dos Gram negativo permitindo o isolamento de Staphylococcus spp. A fermentao do manitol permite o diagnstico presuntivo de S. aureus.

4. C.L.E.D. (Cistina- Lactose - Deficiente de Electrlitos) Classificao - meio no selectivo, diferencial, habitualmente utilizado para cultura de amostras de urina, que permite o isolamento dos agentes mais frequentes de infeco urinria e quantificao de colnias. Princpio - a deficincia de electrlitos inibe o swarming dos Proteus spp. e a lactose permite diferenciar os fermentadores dos no fermentadores.

5. GELOSE HEKTOEN Classificao - meio selectivo diferencial para o isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. Princpio - os sais biliares inibem os Gram positivo e retardam o crescimento de algumas Enterobacteriaceae.

6. MEIO de MacCONKEY Classificao - meio selectivo e diferencial para isolamento de bacilos Gram negativo (Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. etc.)

Princpio Os sais biliares inibem o crescimento da maioria das bactrias Gram positivo. A presena de lactose permite diferenciar as bactrias fermentadoras das no fermentadoras.

7. MEIO SS (Salmonella Shigella) Classificao - meio selectivo e diferencial de isolamento para Salmonella spp. e Shigella spp. Princpio - Inibio dos coliformes pelo verde brilhante e sais biliares. A presena de sais de ferro permite a deteco das estirpes produtoras de SH2.

8. MEIO de SELENITO Classificao - meio lquido de enriquecimento para Salmonella spp. Princpio: - O selenito de sdio inibe a maioria das Enterobacteriaceae, incluindo algumas estirpes de Shigella spp. - Utilizado para pesquisa nas fezes (coprocultura): - A subcultura para meio slido deve ocorrer entre as 6 e 12 horas, pois esse o prazo mdio de inibio de outras estirpes, tal como o Proteus spp.

9. CALDO GN Classificao - meio lquido de enriquecimento para Enterobacteriaceae, especialmente Shigella spp e Salmonella spp. Princpio: - O citrato e o deoxicolato actuam como agentes selectivos e inibem o crescimento da maioria das Enterobacteriaceae da flora indgena habitual do intestino e todos os tipos de bacilos formadores de esporos. - O manitol promove selectivamente o crescimento de Salmonella spp. e Shigella spp. que o metabolizam. - Utilizado para pesquisa nas fezes (coprocultura): - A subcultura para meio slido deve ocorrer entre as 6 e 12 horas, pois esse o prazo mdio de inibio de outras estirpes, tal como o Proteus spp.

10. MEIO de MULLER - HINTON Classificao - meio no selectivo usado principalmente para o estudo da susceptibilidade aos antimicrobianos.

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1.2.2. TCNICAS DE SEMENTEIRA Devem utilizar-se meios no desidratados, mas cuja superfcie esteja seca e sem gotculas de condensao na tampa. Meio SLIDO em PLACA Por quadrantes ou em roseta - Colocar uma pequena poro de produto (inoculo) num quadrante e proceder sementeira com a ansa. Por inundao, com pipeta (mtodo no recomendado devido a produo de aerossis; quando utilizado deve ser realizado em cmara de segurana biolgica). Por espalhamento com zaragatoa - utilizar para execuo de TSA por difuso em placa (ver tcnica no captulo sobre testes de susceptibilidade). Para quantificao de colnias (urina) utilizar ansa calibrada (de 10 l).

Meio SLIDO em TUBO Pode-se inocular: S em superfcie Ou em superfcie e em profundidade

Tcnica para inoculao em superfcie e em profundidade em tubo com rampa de gelose (AB)

Em meio LQUIDO Produto lquido - semeado com auxlio de seringa ou pipeta Produto slido - mergulhado directamente no meio

1.2.3 -

CONDIES DE INCUBAO

Atmosfera Esto disponveis comercialmente geradores que permitem obter as diferentes atmosferas necessrias para a cultura de microrganismos patognicos em laboratrio: CO2 Microaeroflia Anaerobiose

Existem geradores para jarras ou para sacos (de 2 placas de Petri). Se no houver este tipo de geradores pode-se obter atmosfera de CO2 colocando uma vela acesa dentro de uma jarra de vidro fechada, juntamente com as placas.

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Temperatura Existe uma temperatura ptima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos, que ronda os 35-37C. Alguns podem desenvolver-se a temperaturas mais baixas, como a Listeria spp. (4C), e outros a temperaturas mais elevadas, como o Campylobacter spp. (42C). Provavelmente mais importante que a temperatura de incubao a preveno de grandes flutuaes na mesma.

Humidade A maioria dos microrganismos tem desenvolvimento optimizado com uma humidade igual ou superior a 70%. Os meios de cultura tm de se manter hidratados durante o perodo de incubao. Para manter a humidade numa estufa normal, pode colocar-se um recipiente com gua no seu interior que permita a sua evaporao.

1.3. IDENTIFICAO DAS BACTRIAS

1.3.1. CONSIDERAES GERAIS A deciso do modo de processamento do exame cultural e valorizao clnica das estirpes isoladas, baseia-se na compreenso da patogenia da infeco nos diferentes locais anatmicos. S se deve realizar a identificao e TSA de colnias isoladas. Isolamento da mesma espcie de microrganismo em amostras idnticas colhidas em dias sucessivos, no necessrio proceder sua identificao e TSA. Se a segunda amostra tem um intervalo de cinco ou mais dias necessrio identificao e antibioGrama, pois pode ter havido alterao da flora ou do padro de susceptibilidade.

1.3.2. Aspecto MACROSCPICO das COLNIAS Forma Dimenso Elevao Margem ( bordo da colnia ) Superfcie Consistncia Produo de pigmento

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1.3.3. IDENTIFICAO BASEADA EM CARACTERSTICAS METABLICAS

1. TESTE da POTASSA
Reagentes - Hidrxido de potssio 3 g - Agua destilada para 100 ml

Princpio A parede das bactrias Gram negativo facilmente rompida por uma soluo alcalina diluda e os restos de DNA libertados permanecem agregados na suspenso, apresentando a formao de um filamento. Nas bactrias Gram positivo, por a parede celular ser mais resistente, no apresentam este aspecto. Procedimento Coloca-se uma gota de KOH a 3% numa lmina e faz-se uma suspenso, bem homogeneizada, com uma ansa, elevando-se vrias vezes 1- 2 cm. Se, ao elevar a ansa, se observa a formao de um fio a reaco positiva, indicando a presena de um microrganismo Gram negativo. (Reaco positiva)

2. TESTE da CATALASE
Reagentes

- perxido de hidrognio a 3% (conservar temperatura ambiente e no escuro) Princpio O enzima catalase desdobra o perxido de hidrognio (3%) em gua e oxignio (2H2O2 2H2O + O2) Procedimento Com a ponta de uma pipeta de Pasteur ou com palito, transferir a colnia em estudo para a lmina de vidro. Adicionar uma gota de perxido de hidrognio a 3% e observar imediatamente se existe ou no formao de bolhas de ar (Reaco positiva). possvel tambm fazer esta prova pela ordem inversa.

Limites e Precaues: Culturas com mais de 24h podem dar falsos negativos. Devido existncia de catalase nos eritrcitos, a prova deve ser interpretada com muito cuidado quando efectuada a partir de colnias retiradas de meios contendo sangue (possibilidade de falso positivo).

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3. TESTE da COAGULASE A coagulase uma enzima termoestvel produzida principalmente pelas estirpes de S. aureus. Existem duas formas de coagulase: uma ligada parede celular ou Factor clumping e outra libertada pela clula bacteriana que a coagulase livre. 3.1. Teste da Coagulase em LMINA
Reagentes - Plasma de coelho citratado ou com EDTA (fornecido comercialmente desidratado). - Aps reconstitudo deve ser refrigerado

Princpio A coagulase ligada ou Factor clumping actua directamente no fibrinognio plasmtico e causa aglutinao das bactrias em agregados visveis. Procedimento: Preparar uma suspenso de colnias densa e bem emulsionada em gua destilada. Agitar no vortex e colocar uma gota de suspenso na lmina. Adicionar uma gota do plasma de coelho. Observar a existncia ou no de aglutinao nos 10 a 15 segundos imediatos sem agitar a lmina. (Reaco positiva)

Limites e precaues: Um teste da coagulase em lmina positivo s vlido para estirpes de Staphylococcus spp. que no apresentem autoaglutinao. A autoaglutinao pesquisada efectuando uma suspenso de colnia numa gota de NaCl a 0,85% colocada numa lmina de vidro. A existncia de aglutinao considerada uma reaco positiva de autoaglutinao e invalida a interpretao do teste da coagulase em lmina. Perante esta situao utilizar teste alternativo. No utilizar colnias provenientes de meios com alto teor em NaCl.

3.2. Teste da Coagulase em TUBO

Reagentes - Plasma de coelho citratado ou com EDTA (fornecido comercialmente desidratado). - Pode ser refrigerado durante 10 dias ou congelado em tubos individuais durante vrios meses

Princpio - a coagulase livre (libertada pelas clulas) actua na protrombina originando uma substncia semelhante trombina, trombina livre que actua no fibrinognio formando um cogulo de fibrina Procedimento: Num tubo com 0,5 ml do plasma de coelho inocular uma colnia isolada da cultura em estudo. Incubar a 35- 37 C. Ao fim de 4h de incubao e sem agitar o tubo, verificar se existe formao de cogulo. (Reaco positiva) A ausncia de cogulo s 4h implica a reincubao do tubo com leitura s 24h.

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Limites e precaues: Pode ocorrer lise do cogulo antes da sua observao por produo de enzimas fibrinolticos pela estirpe em estudo. (Falso negativo)

3.3. Protena A (Staphaurex): A maioria dos S. aureus produzem protena A que tem afinidade especfica para o fragmento Fc da imunoglobulina G. A pesquisa de protena A um mtodo alternativo ao teste da coagulase em lmina. Princpio: - Partculas de latex revestidas de plasma humano contendo imunoglobulina G e fibrinognio reagem quer com o factor de aglutinao (factor clumping) quer com a protena A originando aglutinao. - Existem vrios testes comercializados. Procedimento - efectuar a tcnica segundo instrues do fabricante. Limitaes e precaues: S. hycus e S. intermedius podem dar uma reaco positiva mas so raramente isolados como agentes de infeco no ser humano. S. saprophyticus podem dar uma reaco positiva, pelo que quando se trata de estirpe isolada de urina tem de ser identificada por outro mtodo. Espcies de Micrococcus spp., E. coli, C. albicans, Streptococcus spp. e Enterococcus spp. podem tambm originar aglutinao. Algumas estirpes de S. aureus resistentes meticilina podem no aglutinar.

4. TESTES da DEOXIRRIBONUCLEASE (DNase) Princpio - O S. aureus, como outras bactrias como p. ex. Moraxella catarrhalis ou Serratia marcescens, produzem a enzima Dnase. Procedimento: O microrganismo a testar semeado em estria central no agar DNase Aps uma incubao de 18 a 24h, a placa coberta com HCl 1M para precipitar o DNA no hidrolizado Um resultado positivo indicado pela transparentizao do agar em volta das colnias. O DNA no hidrolizado aparece mais opaco (pela precipitao causada pelo cido)

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5. CITOCROMO OXIDASE
Reagentes - tetrametil-p- fenilenediamina dihidrocloreto 1% (reagente de Kovac)

Princpio: As citocromo-oxidases so hemoprotenas que actuam como elo final na cadeia de respirao aerbia transferindo electres (hidrognio) para o oxignio, com formao de gua. O teste utiliza um corante que substitui o oxignio como aceitador de hidrognio (aparecimento de cor).

Procedimento: Tcnica directa em placa - colocar 2-3 gotas de reagente sobre colnias isoladas da bactria a testar. Tcnica indirecta sobre tira de papel - utilizam-se tiras comerciais ou um papel de filtro onde se colocam algumas gotas de reagente. Com uma ansa (no metlica) retira-se uma colnia a testar que colocada sobre o papel.

Interpretao: As colnias com bactrias que contenham a actividade da enzima desenvolvem uma cor azul-roxo escura em mais ou menos 10 segundos.

Limitao: No devem ser usadas ansas de metal pois os produtos de oxidao do metal, que se formam aquando do aquecimento da ansa, podem provocar falsa reaco positiva.

6. TESTE da SOLUBILIDADE na BLIS

Reagentes

- Soluo de desoxicolato de sdio Princpio - os sais biliares tm a capacidade de lisar selectivamente o S. pneumoniae. Procedimento - colocar algumas gotas de reagente em colnias suspeitas. Interpretao - o resultado positivo (S. pneumoniae) se houver lise completa das colnias e seu desaparecimento em 30 min. Limitao: Se for utilizada gelose sangue, aparece uma zona pronunciada de hemlise em volta da gota de reagente que no deve ser confundida com lise bacteriana.

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7. TESTE do INDOL DIRECTO

Reagentes Reagente de Kovac: - paradimetilaminobenzaldedo (PDABA) 5 g - lcool isoamlico 75 g - cido clordrico (37%) 25 ml - Aquecer o PDABA com lcool isoamlico a 50 60 C at dissolver - Arrefecer e adicionar o cido clordrico lentamente e sempre em banho de gua fria (no pode mudar a cor para rosa)

Princpio: O indol um dos produtos de degradao metablica do aminocido triptofano. As bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de hidrolizar e desaminar o triptofano com a produo de indol, cido pirvico e amnia. O teste baseado na formao de uma cor vermelha quando o indol reage com o grupo aldedo do p-dimetilaminobenzaldedo. Este o qumico activo dos reagentes de Kovac e Ehrlich. Deve ser usado um meio rico em triptofano

Procedimento: Impregnar uma tira de papel de filtro com o reagente Com uma ansa retirar uma colnia da bactria a testar e coloc-la sobre o papel

Interpretao: Desenvolvimento imediato de cor vermelha teste positivo

PROVAS BIOQUMICAS O seu estudo reduz-se a alguns aspectos principais: Assimilao dos nutrientes: os nutrientes assimilveis podem variar consideravelmente de uma espcie bacteriana para outra, indo de substncias mais simples s molculas orgnicas mais complexas. Reaces que levam sntese dos constituintes da clula bacteriana: prtidos, glcidos, lpidos. Reaces que fornecem a energia necessria ao metabolismo. Enzimas deteco da sua produo. (Sem os importantes sistemas de exo e endoenzimas as reaces de catabolismo e anabolismo no seriam compatveis com a vida).

Para efeitos prticos de identificao, actualmente, o estudo repousa nos efeitos globais ou pontuais do catabolismo e sobretudo sobre a caracterizao de enzimas diversos. Estes testes encontram-se disponveis isoladamente ou integrados em sistemas comercializados de identificao microbiana. Nomeadamente, alguns dos mais comuns e mais utilizados:

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1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

REDUO dos NITRATOS ORTONITROFENIL-GALACTOSIDASE (ONPG) TESTE do INDOL TESTE do VERMELHO de METIL TESTE de VOGES - PROSKAUER Utilizao do CITRATO TESTE da UREASE DESCARBOXILASES FENILALANINA DESAMINASE TESTE FERMENTATIVO OXIDATIVO / Prova de Hugh e Leifson TESTE da HIDRLISE do HIPURATO TESTE da BILE-ESCULINA

OUTROS MTODOS DE IDENTIFICAO 1. TESTE da OPTOQUINA:

Reagentes - Placa de gelose com 5% de sangue - Disco de 5 g de optoquina

Princpio - A optoquina uma substncia que inibe o crescimento de Streptococcus pneumoniae, provocando um halo de inibio da cultura em placa. Procedimento: Usando uma ansa, seleccionar 1 colnia bem isolada do microrganismo a ser testado e semear numa placa de gelose sangue em duas ou mais direces perpendiculares numa rea de 3 cm de dimetro. Colocar o disco de optoquina no centro da rea semeada. Incubar 18 a 24h a 35 C em CO2.

Interpretao - O crescimento do S. pneumoniae caracteristicamente inibido pelo disco de optoquina produzindo um halo 19 mm.

2. TESTE de SUSCEPTIBILIDADE NOVOBIOCINA Princpio - O S. saprophyticus resistente novobiocina (disco de 5 g); outras estirpes de Staphylococcus coagulase negativa com significado clnico so susceptveis. Procedimento: Efectuar uma suspenso ( 0,5 MacFarland) da colnia em estudo em NaCl a 0,85%, e inocular em placa de Muller-Hinton (ver procedimento para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos) Colocar o disco de novobiocina na placa. Incubar 16 a 18h a 35 C em aerobiose. Examinar e medir o halo de inibio em volta do disco.

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Interpretao uma zona de inibio presuntivamente S. saprophyticus.

16 mm indica resistncia e identifica

3. TESTE de SUSCEPTIBILIDADE BACITRACINA

Reagentes - Disco de Bacitracina a 0,04 U - Placa de gelose sangue

Princpio - O Streptococcus hemoltico do grupo A inibido na gelose sangue quando em presena dum disco de Bacitracina a 0,04 U. um teste de diagnstico presuntivo. Procedimento: Semear com ansa em duas ou mais direces perpendiculares uma placa de gelose sangue a partir de colnia hemoltica. Aplicar o disco de Bacitracina. Incubar 16- 18h a 35 C. Verificar a existncia de halo de inibio.

Interpretao: Qualquer halo de inibio indica identificao presuntiva de Streptococcus hemoltico do grupo A. A ausncia de halo de inibio interpretada como Streptococcus hemoltico no grupo A

Limitaes: O teste s deve ser efectuado em colnias de Streptococcus com -hemlise. Os Streptococcus que apresentam , ou hemlise podem ser inibidos pela bacitracina. H estirpes de Streptococcus -hemlitico do grupo A que so resistentes bacitracina.

2. CONSERVAO E TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLGICOS E ESTIRPES BACTERIANAS

MEIOS DE TRANSPORTE de PRODUTOS BIOLGICOS A sua utilizao tem como objectivo permitir a viabilidade dos microrganismos nos produtos biolgicos quando no podem ser processados imediatamente aps a colheita. Devem ser utilizados de acordo com o produto e os microrganismos que se pretendem pesquisar. Meio de Stuart, meio de Amies com ou sem carvo, Meio de Cary-Blair, etc. - meios de transporte, no nutriente, que visam manter intactos os microrganismos at, geralmente, s 24 horas. A sua seleco depende do produto biolgico. Algumas caractersticas destes meios: A ausncia de compostos nitrogenados impede o crescimento de microrganismos.

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Os hidratos de carbono fornecem energia, permitindo a sobrevida dos microrganismos. Os meios de transporte para a pesquisa de bactrias anaerbias tm um indicador de anaerobiose - o azul de metileno (se houver entrada de ar o meio fica azul nos 2/3 inferiores). Se houver suspeita de N. gonorrhoeae devem ser usadas meios contendo carvo, com o objectivo de neutralizar substncias inibidoras.

CONSERVAO de ESTIRPES BACTERIANAS 1- Perodos CURTOS A maior parte das bactrias de crescimento rpido podem ser conservadas durante 1 a 2 semanas em placas de agar simples hermeticamente fechadas, invertidas e a 4C, ou em tubos de agar inclinado. 2- Perodos LONGOS a- Meios de conservao A maior parte das bactrias de crescimento rpido podem ser mantidas em tubos de conservao durante muito tempo temperatura ambiente e ao abrigo da luz (depende da estirpe, do meio utilizado, do grau de humidade, etc.). O meio de conservao inoculado por picada profunda, podendo ou no necessitar de prvia incubao antes do armazenamento. Conservar hermeticamente fechado. Pode usar-se Meio de gelose peptonada:
- Extracto de carne 5g - Peptona 10 g - NaCl 3g - (Na)2HPO4.2H2O 2g - Agar- 10 g - H2O -1000 ml - Acertar o pH a 7,4. Esterilizar a 121C durante 20 minutos

b- Congelao A - 70C em TSB (meio de tripticase-soja) ou outro caldo nutritivo (p.ex.: Brain Heart Infusion) adicionado de 15 a 18% de glicerol.

c- Liofilizao A maior parte das estirpes podem ser liofilizadas, tendo em considerao que este procedimento pode alterar algumas caractersticas dos microrganimos (p.ex. resistncia a antimicrobianos). As estirpes esporuladas no podem ser sujeitas a liofilizao

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EMBALAGEM DE BACTERIANAS

TRANSPORTE

DE

PRODUTO

BIOLGICO

OU

ESTIRPES

1. Recipiente primrio - recipiente de polipropileno ou polietileno (no se recomenda o vidro), fechado hermeticamente. 2. Recipiente secundrio - com as mesmas caractersticas do primrio. 3. Material absorvente - entre o recipiente primrio e secundrio. Pode utilizar-se algodo hidrfilo. A quantidade deve ser suficiente para absorver o dobro do contedo completo do recipiente primrio. 4. Recipiente exterior - deve ter resistncia suficiente de acordo com a sua capacidade, massa e uso desejado e dever ser capaz de suportar pesos e golpes, que frequentemente tm lugar durante a sua manipulao e transporte. No devem utilizar-se envelopes acolchoados para o envio de amostras.

Sinalizao, etiquetagem e documentao O pacote exterior dever ter o nome do remetente, a informao de que se trata de substncia infecciosa com risco humano e o nome e direco do destinatrio. A informao sobre o material (como p. ex. os dados clnicos ou bacteriolgicos) devero ser colocados entre a embalagem secundria e a exterior. No deve ser colocada informao entre as embalagens primria e secundria. conveniente que a informao que acompanha o produto contenha o nome e nmero de telefone da pessoa responsvel a quem se possa contactar em caso de emergncia.

Indicao da constituio de uma embalagem apropriada ao envio de material com risco biolgico

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3. LIMPEZA, DESINFECO E ESTERILIZAO Definies Limpeza implica a remoo de sujidade e dos microrganismos. A lavagem com gua e sabo remove a maior parte dos microrganismos e ainda as protenas e outra matria orgnica a qual, para alm de constituir fonte de nutrientes para os microrganismos, protege-os contra a secagem e impede a aco de desinfectantes. Desinfeco o processo que destri ou inactiva microrganismos na forma vegetativa mas geralmente no afecta os esporos bacterianos. Os mtodos utilizados podem ser fsicos ou qumicos. Esterilizao consiste na destruio e eliminao de todos os microrganismos na forma vegetativa e esporulada. Tambm aqui os mtodos utilizados podem ser fsicos e/ou qumicos. Descontaminao o tratamento dado ao material para tornar seguro o seu manuseamento posterior. O processo tem em conta a contaminao consequente utilizao que foi dada ao material e portanto inclui a limpeza e pode ir at esterilizao (p.ex. para pries).

Para facilitar a aplicao destes conceitos ao procedimento antimicrobiano a utlizar, segundo Spaulding, o material a ser tratado classificado em trs categorias, de acordo com o risco que representa para o doente: Classificao de risco infeccioso associado com os dispositivos mdicos Risco Elevado Material Crtico Aplicao do dispositivo contacto prximo com soluo de continuidade da pele ou mucosas introduzido em locais estreis do organismo contacto com mucosas ou, contaminado com agentes virulentos ou de fcil transmisso cruzada ou, antes de uso em doentes imunodeprimidos contacto pele intacta no entra em contacto com o doente Recomendao Esterilizao A desinfeco geralmente suficiente, embora a esterilizao possa ser prefervel Limpeza pode ser suficiente em situaes especificadas

Intermdio Material semiCrtico

Baixo Material no Crtico Limpeza

Limpeza

A limpeza o pr-requisito essencial da descontaminao e pode constituir um mtodo suficiente para artigos noinvasivos (baixo risco) mas no deve ser utilizado como o nico processo para artigos de risco intermdio ou elevado onde haja indicao para desinfeco ou esterilizao.

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As indicaes da limpeza passam pela descontaminao do ambiente (paredes, pavimentos, mobilirio) e superfcies de trabalho e equipamentos incluindo os dispositivos mdicos e outros objectos que entram em contacto com a pele intacta. Sempre que possvel deve-se preferir os mtodos mecnicos j que permitem o controlo e validao do processo. Os processos manuais requerem treino especfico e elevado consumo de tempo. Pode ainda haver um risco associado ao manuseamento de material contaminado.

Desinfeco Para a desinfeco podem ser utilizados mtodos fsicos (calor) e qumicos (desinfectantes qumicos). A desinfeco pelo calor inactiva todos os microrganismos com excepo dos esporos bacterianos, alguns vrus resistentes ao calor e o Cryptosporidium. Est indicado para os dispositivos que tolerem a exposio repetida ao calor hmido a temperaturas de cerca de 80-90C. Processa-se em mquinas de lavagem/desinfeco e tm a vantagem de permitir o controlo e validao do processo. Um desinfectante qumico um produto que capaz de destruir microrganismos por meios qumicos ou fsico-qumicos. Pode ser txico, inflamvel, corrosivo ou apresentar outras incompatibilidades com os materiais. Os factores que podem levar ao insucesso da desinfeco qumica incluem a resistncia inata dos microrganismos, inactivao devido diluio ou contacto com outras substncias (ex. matria orgnica), armazenamento inapropriado. Actividade microbicida dos desinfectantes qumicos Desinfectante lcool Glutaraldedo Ortoftalaldedo Outros aldedos*** Dixido de cloro cido peractico*** Comp. peroxigenados*** Amnios quaternrios*** Soro fisiolgico superoxidado
0 = nenhuma + = fraca

Esporos 0 +* +* +* +++ +++ 0 0 +++

+++ = boa

Micobactrias ++ +++** +++ +++ +++ +++ + ++ +++

Bactrias +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++

Vrus ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++

++ = moderada

* a actividade esporicida dos aldedos necessita de contacto prolongado (>3 horas) ** h dvidas sobre a actividade do glutaraldedo sobre algumas micobactrias atpicas *** a actividade de outros aldedos, compostos peroxigenados e amnios quaternrios varia com a concentrao

No laboratrio o uso de desinfectantes est indicado para descontaminao de superfcies de trabalho (lcool a 70 ou hipoclorito 1.000 ppm) , nos recipientes para colocao de material contaminado pipetas, ansas, etc. (discard jars) (hipoclorito 5.000 ppm) e para remoo de matria orgnica vertida (hipoclorito 10.000 ppm).

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ESTERILIZAO Esterilizao pelo CALOR HMIDO (vapor saturado sob presso)

o meio mais seguro para a destruio de todas as formas microbianas atravs do contacto directo com o vapor dando origem a uma desnaturao proteica da clula. O seu poder de aco est baseado em dois factores: humidade e calor numa cmara de concepo adequada (autoclave ou esterilizador). Temperatura 134C 121C Tempo 3 minutos 15 minutos Humidade relativa 100 % 100 %

Os esterilizadores utilizados para os meios de culturas so programados para uma sada lenta do vapor da cmara.Os frascos devem ser encerrados de modo a permitir a entrada do vapor e evitar a condensao. Os frascos/bales so colocados em prateleiras ou cestos de rede ou contentores perfurados para permitir a sada de ar por deslocao para baixo. Para ser eficaz devem ser utilizados pequenos volumes de lquido. Para as culturas deve-se proceder a um arrefecimento lento para evitar a fervura e o extravasamento. A porta do esterilizador no deve ser aberta antes de ser atingida a temperatura de 90 ou 80 conforme se trate de embalagens flexveis ou de vidro.

Esterilizao pelo CALOR SECO ESTUFA

O calor seco utilizado para materiais de vidro, agulhas, instrumentos delicados de corte, artigos metlicos que no so de ao inoxidvel. Fontes de calor - ar quente, chama directa, incinerao, microondas, infravermelhos. Temperaturas 160 170 180 Tempo 120 minutos 60 minutos 30 minutos

As vantagens deste mtodo so a boa capacidade de penetrao (slidos, lquidos no aquosos e cavidades fechadas, substncias em p, ceras) e a no corroso dos materiais. So desvantagens a necessidade de temperaturas elevadas, exposio prolongada e a penetrao heteregnea. CHAMA

Limitada s ansas de inoculao de culturas bacterianas (actualmente utilizam-se sistemas elctricos de esterilizao ou ansas descartveis). As prticas de passar chama instrumentos, rolhas, bocais dos frascos ou tubos de cultura no assegura a sua esterilizao ou proteco contra contaminantes ambientais porque no se atinge uma temperatura suficientemente elevada e o tempo de exposio

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demasiado curto. Estas limitaes mantm-se mesmo quando o artigo previamente mergulhado em lcool. FILTRAO A filtrao difere dos outros mtodos de esterilizao porque no envolve a destruio de microrganismos mas a sua remoo atravs da passagem por filtros sintticos, granulares ou fibrosos. Os lquidos podem ser filtrados para obter esterilidade (p.ex. meios de cultura), avaliar a esterilidade (alguns produtos farmacuticos) ou colheita de amostra para estudo microbiolgico (guas).

OUTROS MTODOS DE ESTERILIZAO Esta uma rea que tem visto grandes desenvolvimentos nos ltimos anos. Para alm das radiaes muito utilizadas na Indstria para esterilizao de material plstico utilizado no laboratrio, os mtodos de microondas e de infravermelhos tm sido utilizados experimentalmente na esterilizao de meios embora a sua utilidade ainda no esteja comprovada para esse fim. Na rea dos dispositivos mdicos, os mtodos de esterilizao pelo plasma de perxido de hidrognio e pelo formaldedo a 2% a baixa temperatura apresentam a vantagem da rapidez em relao ao mtodo mais antigo de esterilizao pelo xido de etileno, porque tem a vantagem de no necessitar do perodo de arejamento exigido com este ltimo mtodo. Tambm a esterilizao pelo cido paractico em equipamento fechado uma opo aceitvel para certos equipamentos como os endoscpios flexveis. Contudo, nenhum destes mtodos tem aplicao no Laboratrio.

4. TRATAMENTO DE RESDUOS SLIDOS Introduo Segundo DL 310/95 de 22/11 Resduos Hospitalares (RH): Resduos produzidos em unidades de prestao de cuidados de sade, incluindo as actividades mdicas de diagnstico, tratamento e preveno da doena em seres humanos ou animais e ainda as actividades de investigao relacionadas. Legislao - Despacho 242/96 de 13/8 que classifica os RH em grupos Objectivos do tratamento de resduos: Reduo do seu volume, de maneira a reduzir o espao necessrio sua eliminao Desinfeco ou esterilizao, por forma a deixarem de ser fonte de organismos patognicos e permitir, portanto, a sua manipulao com maior segurana Reduo e alterao das grandes peas anatmicas de modo a tornarem-se irreconhecveis e mais estticamente aceitveis

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Processos de tratamento: Descontaminao trmica (autoclavagem) Pode ser complementado com uma triturao posterior, e/ou com compactao, necessitando sempre de tratamento dos efluentes lquidos e gasosos. Utilizado principalmente: - Descontaminao de resduos de laboratrios de microbiologia - Resduos com sangue e lquidos orgnicos - Cortantes e perfurantes

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NORMAS de COLHEITA e TRANSPORTE de PRODUTOS para EXAME BACTERIOLGICO

1. INTRODUO O Laboratrio de Microbiologia pode fornecer informao crucial para o diagnstico e tratamento das doenas infecciosas suspeitas ou confirmadas. No entanto, s o poder fazer se as amostras forem de boa qualidade, em quantidade suficiente, colhidas adequadamente e acompanhadas por informao clnica pertinente. As informaes que se descrevem a seguir pretendem servir de orientao para a colheita e transporte de produtos para exame microbiolgico.

2. CONSIDERAES GERAIS 2.1. Segurana Seguir as recomendaes bsicas de segurana - tratar todos os produtos como potencialmente perigosos. No acto da colheita ou manuseamento do produto, usar luvas, bata, avental e se h risco de produo de salpicos necessrio utilizar viseira protectora e/ou mscara. No contaminar a superfcie exterior do recipiente e/ou da requisio acompanhante. Minimizar o manuseamento directo dos produtos a enviar ao laboratrio. Enviar os produtos em cestos de transporte. Os produtos colhidos por aspirao com agulha devem ser transferidos para um recipiente esterilizado. Caso envie o produto em seringa retirar sempre a agulha. Fechar a seringa devidamente e identific-la. Por medida de segurana, os recipientes e/ou requisies visivelmente conspurcados com matria orgnica no devem ser aceites pelo laboratrio. Sempre que possvel, efectuar o processamento do produto em cmara de fluxo laminar.

2.2. Normas Gerais de Colheita Se possvel, efectuar as colheitas, antes de iniciar a teraputica antibitica. Evitar a contaminao da amostra com a flora saprfita do doente e/ou bactrias do ambiente, de modo a que a amostra seja representativa do local da infeco. Utilizar material de colheita e de transporte apropriados e esterilizados. Identificar claramente os recipientes e no o invlucro de papel ou plstico com o nome do doente, servio, n. de processo, data e hora da colheita e origem do produto biolgico.

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Colher o produto em quantidade suficiente para o(s) exame(s) requisitado(s). Quantidade insuficiente pode originar resultados falsamente negativos. Os recipientes para a recolha de produtos lquidos no devem encher-se para alm dos seus 2/3 de capacidade. Utilizar recipientes inquebrveis, esterilizados e de encerramento hermtico e que no permitam ao abrir a formao de aerossis. Deve ser especificada a natureza do exame pretendido. Sempre que o exame pretendido no fizer parte da rotina laboratorial, deve ser contactado o Laboratrio de Microbiologia. Se o produto for colhido atravs da pele intacta, desinfectar a pele primeiro, de acordo com a poltica de anti-spticos do hospital. Prevenir a queimadura pela tintura de iodo removendo o excesso aps a colheita.

2.3. Normas Gerais de Transporte Transportar rapidamente todos os produtos para o laboratrio. Alternativas ao transporte rpido: - Lquor manter na estufa a 35C - Hemocultura manter temperatura ambiente - Restantes produtos refrigerar a 2-8 C - Utilizao de Meios de transporte: 1. Para pesquisa de microrganismos muito sensveis, tais como a Neisseria spp, devem ser colhidos para meio de transporte apropriado (com carvo para pesquisa de N. gonorrhoae) e mantidos temperatura ambiente. 2. Para pesquisa de anaerbios usar o meio de transporte adequado. 3. Fezes - para exame cultural, enviar em meio de transporte especfico (ex.: meio de Cary Blair) 4. Em todos os produtos sempre que o processamento laboratorial no possa ser efectuado dentro do perodo de tempo adequado para cada produto.

3. NORMAS DE COLHEITA por LOCAL ANATMICO / PRODUTO

3.1. HEMOCULTURA 3.1.1. Tcnica de Colheita, Acondicionamento e Transporte O sangue deve ser colhido por puno duma veia perifrica. incorrecta a colheita atravs de catter I.V. Desinfectar o local da puno com lcool a 70% de modo circular e do interior para a periferia. Repetir a operao com soluo alcolica iodada a 1%, ou seguir a poltica de antispticos do hospital. Deixar o anti-sptico secar.

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IMPORTANTE - No palpar a veia aps a desinfeco da pele e antes de inserir a agulha. Se isto acontecer repetir todo o processo de desinfeco. Desinfectar a rolha de borracha do frasco com lcool. Aspirar o sangue e inocular o(s) frasco(s), sem mudar de agulha, no ultrapassando a proporo recomendada pelo fabricante. Aps a colheita, limpar a pele com lcool, para prevenir reaces adversas ao iodo. Nunca refrigerar as hemoculturas aps a colheita. Conservar o frasco em estufa a 37C at ser enviada ao laboratrio (ou temperatura ambiente nos mtodos automticos se assim fr recomendado pelo fabricante).

3.1.2. Volume de sangue O volume de sangue crtico, porque a concentrao de microrganismos na maioria das bacterimias baixa, especialmente se o doente j est com antibioticoterapia. Nas crianas a concentrao de microrganismos durante as bacterimias maior que nos adultos pelo que necessrio menos sangue. O volume de sangue recomendado , em geral: Crianas 1 a 5 ml por puno venosa Adultos 10 a 30 ml por puno venosa O volume de sangue colhido dever ser repartido pelo n. de frascos necessrios de modo a que a diluio final seja de 1: 5 a 1:10, respeitando as indicaes do fabricante.

3.1.3. Nmero e Momento de execuo das Hemoculturas Habitualmente so suficientes 3 hemoculturas em 24 horas, colhidas separadamente, sendo o intervalo entre as colheitas varivel conforme a situao do doente ou a urgncia do incio de administrao de antibiticos. Uma s hemocultura pode levar a que uma bacterimia intermitente no seja diagnosticada assim como pode dificultar a interpretao do significado clnico do isolamento de certos microrganismos. Geralmente a informao adicional obtida com mais de 3 hemoculturas mnima. Para outras informaes consultar captulo respectivo.

3.2. CATETERES INTRAVASCULARES

O envio de catter para exame bacteriolgico s aconselhado se existirem sinais de infeco relacionadas com o catter.

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Antes de retirar o catter, colher sangue para hemocultura de uma veia perifrica, pois s assim ser possvel valorizar o exame cultural do catter. Desinfectar a pele em redor do catter, utilizando um anti-sptico de acordo com a poltica de anti-spticos do hospital. Retirar o catter; e cortar asspticamente cerca de 3 a 5 cm da poro terminal e coloclo em recipiente esterilizado. Nunca enviar pontas de catter em meio lquido ou de transporte.

3.3. BIPSIAS CIRRGICAS e MATERIAL PROTSICO A colheita da exclusiva responsabilidade do cirurgio e enviado em recipiente esterilizado seco ou em meio de cultura lquido, consoante as situaes (vid captulo respectivo).

3.4. LCR 3.4.1. Volumes mnimos recomendados 3.4.2. 1 ml para exame bacteriolgico 2 ml para cultura de fungos 3 ml para cultura de micobactrias Puno Lombar

Desinfectar o local de colheita com uma soluo anti-sptica com lcool, de acordo com a poltica de anti-spticos do hospital. Colher o lquor para tubo esterilizado, inquebrvel, transparente de fundo cnico com encerramento hermtico. recomendada a colheita em trs tubos, que devem ser numerados, sendo o ltimo, utilizado para exame bacteriolgico. Enviar o lquor de imediato ao laboratrio aps a colheita. Nunca refrigerar o lquor. Nota: Devem realizar-se simultaneamente hemoculturas.

3.5. EXSUDADOS PURULENTOS

3.5.1

CONSIDERAES GERAIS Os exsudados de escaras de decbito e de contedo intestinal (ex.: fstulas enterocutneas) so amostras que contm habitualmente uma populao bacteriana mista que impede o exame microbiolgico fivel, pelo que no devem ser processados, salvo casos especiais.

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3.5.2. Leses (Exsudados) PROFUNDA(O)S Descontaminar a pele com soluo anti-sptica de acordo com a poltica de anti-spticos do hospital. Puncionar e aspirar directamente com seringa. Colocar a amostra no recipiente esterilizado ou enviar a prpria seringa sem agulha, mas devidamente fechada.

3.5.3. Leses (Exsudados) SUPERFICIAIS Limpar a superfcie da leso com gua destilada ou soro fisiolgico esterilizado e realizar o desbridamento dos tecidos necrosados. Biopsar a base e bordo da leso e colocar em recipiente esterilizado, de preferncia com prolas de vidro. ou Introduzir uma agulha fina por baixo da camada superficial da leso e aspirar com a seringa e colocando a amostra no recipiente esterilizado ou enviar a prpria seringa sem agulha, mas devidamente fechada. ou Com uma zaragatoa esterilizada esfregar toda a base da leso e coloc-la no meio de transporte adequado.

3.6. URINA 3.6.1. Consideraes Gerais Nunca colher urina de arrastadeira, urinol ou saco de alglia. No processar pontas de alglia. Mtodos de colheita Jacto mdio Puno de catter urinrio Puno supra-pbica Saco colector em crianas Drenagem de nefrostomia /ureterostomia

3.6.2.

a) Colheita do jacto mdio - Mulher Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higinica das mos. Com compressas embebidas em gua e sabo (no utilizar anti-spticos, pois podem inibir o crescimento dos microrganismos), proceder lavagem dos rgos genitais da frente para trs, com uma compressa de cada vez, repetir a operao trs vezes.

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Usando o mesmo processo, lavar s com gua esterilizada e secar. Iniciar a mico, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm para recipiente esterilizado de boca larga.
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b) Colheita do jacto mdio Homem Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higinica das mos. Afastar o prepcio e manter essa posio durante toda a colheita. Limpar a glande com compressas embebidas em gua e sabo. Usando o mesmo processo, lavar agora s com gua esterilizada e secar. Iniciar a mico, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm para recipiente esterilizado de boca larga.
3

c) Puno de catter urinrio - Doente algaliado Clampar a alglia durante 10-15 minutos, acima da derivao, na zona de borracha. Desinfectar com lcool a 70 o local a puncionar. Com agulha e seringa esterilizada aspirar a urina (5 a 20 ml). Transferir a urina para recipiente esterilizado, ou usar seringa prpria para transporte de urina.

d) Puno supra-pbica O doente deve ter a bexiga cheia. Desinfectar a pele da regio supra-pbica com a soluo anti-sptica segundo a poltica de anti-spticos do hospital. Com agulha e seringa esterilizada, puncionar a pele e bexiga ao nvel do 1/3 inferior da linha que une o umbigo snfise pbica. Aspirar a urina e coloc-la em recipiente esterilizado ou enviar na prpria seringa aps remoo da agulha.

e) Saco colector ( utilizado na criana sem controlo dos esfncteres ) Lavar com gua e sabo a rea genital, limpar com gua esterilizada e secar com compressa esterilizada. Aplicar um saco autocolante estril. Se, ao fim de 30 minutos no tiver urinado, retirar o saco e repetir todo o procedimento anterior;

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Transferir a urina para recipiente esterilizado.

3.7. APARELHO GASTROINTESTINAL 3.7.1. FEZES 3.7.1.1. Exame BACTERIOLGICO Despiste por rotina de Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter jejunii/coli. Em certos casos e aps contacto com o Laboratrio: Yersinia enterocoltica, Vibrio spp., E.coli enterotoxignica e Aeromonas hidrophyla.

O despiste de C. difficile s deve ser efectuado quando solicitado, sendo as fezes colhidas sem meio de transporte. Embora tradicionalmente seja aconselhado a colheita at um total de 3 amostras de dejeces diferentes, nos casos agudos uma amostra quase sempre suficiente.

Colheita de fezes - colher para um recipiente limpo e seco e transferir as fezes para recipiente com meio de transporte apropriado (ex. meio de Cary-Blair), escolhendo a poro com ps, muco ou sangue do tamanho de uma noz. No usar papel higinico para colher as fezes, pois pode conter sais de brio, que so inibitrios . 3.7.1.2. Exame PARASITOLGICO Colher 3 amostras em dias sucessivos, de preferncia em dias alternados. Colher as amostras de fezes para recipiente limpo e seco. A pesquisa de Cryptosporidium spp s se justifica em doentes imunocomprometidos e crianas em casos de diarreia comprovada.

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3.7.2. Exsudados rectais Utilizado s para a deteco de Neisseria gonorrhoeae e na deteco de portadores, para fins epidemiolgicos, de Streptococcus -hemoltico do grupo A, Staphyloccocus aureus meticilina-resistente e Enterococcus vancomicina-resistente. Introduzir uma zaragatoa estril 2,5 cm para alm do esfncter anal. Cuidadosamente, rodar a zaragatoa de modo a recolher amostra das criptas anais. Enviar a zaragatoa em meio de transporte com carvo quando se trate de pesquisa de Neisseria gonorrhoeae.

3.7.3. Bipsias Gstricas Usadas para a deteco de Helicobacter pylori. A colheita realizada por endoscopia. Colocar o fragmento de bipsia no meio de transporte apropriado.

3.7.4. Aspirado duodenal Para a deteco de formas vegetativas de Giardia intestinalis, larvas de Strongyloides stercoralis e Ascaris lumbricoides. Para pesquisar Giardia intestinalis, a colheita deve ser realizada na segunda poro do duodeno.

3.8. APARELHO GENITAL 3.8.1. APARELHO GENITAL FEMININO 3.8.1.1 Exsudado vaginal / endocervical Colher com espculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiolgico estril. Com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron colher a amostra do fundo de saco vaginal posterior e endocolo. Colocar a zaragatoa em meio de transporte com carvo, que se deve manter temperatura ambiente. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa para a realizao de esfregaos.

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3.8.1.2 Exsudado uretral Se possvel antes da 1 mico. Se no possvel esperar pelo menos uma hora aps a ltima mico. Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gase esterilizada. Introduzir na uretra cerca de 2 cm uma zaragatoa fina e flexvel, e com um movimento de rotao recolher o exsudado. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa, para a realizao de esfregaos. Restantes procedimentos idnticos aos do exsudado vaginal.

3.8.1.4. Endomtrio Enviar a amostra em recipiente esterilizado. No caso de suspeita de anaerbios, colocar em meio de transporte adequado. recomendvel realizar simultaneamente hemoculturas.

3.8.1.5. Abcessos (Fundos de saco, Trompas, Gl.Bartholin) Colheita por aspirao (no caso da Glndula de Bartholin, descontaminar a pele com antisptico no alcolico). Enviar de imediato amostra at 5 ml em recipiente esterilizado. Se suspeitar de anaerbios utilizar meio de transporte adequado.

3.8.1.6. lceras genitais O Laboratrio de Microbiologia deve ser contactado previamente. Treponema pallidum - Limpar a superfcie da leso com gaze humedecida em soro fisiolgico. Remover a crosta se presente, evitando sangrar. Pressionar a base da leso at surgir um fluido claro e colher com uma pipeta Pasteur ou capilar. Colocar uma gota numa lmina, cobrir com lamela e examinar imediatamente em microscpio de fundo escuro. Haemophilus ducrey - Limpar a superfcie da leso e fazer a colheita por aspirao com uma pipeta Pasteur ou com zaragatoa esterilizada. Semear imediatamente em gelose chocolate enriquecida com suplementos antibiticos.

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3.8.1.7. Lquido amnitico Enviar rapidamente ao laboratrio at 5 ml de amostra em tubo esterilizado e/ou meio de transporte para anaerbios.

(NOTA No realizar exame microbiolgico dos dispositivos intra uterinos, D.I.U.)

3.8.2. APARELHO GENITAL MASCULINO 3.8.2.1. Exsudado uretral A amostra deve colher-se antes da 1 mico da manh. Se no for possvel, esperar pelo menos uma hora aps a ltima mico. Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze esterilizada. Fazer a expresso uretral e introduzir uma zaragatoa fina e flexvel at 2 cm dentro da uretra. Recolher o exsudado com um movimento de rotao para o exame directo a realizar no acto da colheita. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa para o exame cultural, que se deve colocar em meio de transporte com carvo e manter temperatura ambiente at ao envio para o laborattio.

3.8.2.2. Exsudado rectal Procedimento idntico ao do aparelho genital feminino.

3.8.2.3. Abcessos (Epiddimo, Prstata, Testculos) Colheita cirrgica. Introduzir o aspirado, at 5 ml, no meio de transporte apropriado.

3.8.2.4. lceras genitais Procedimento idntico ao do aparelho genital feminino.

3.8.3. AMOSTRAS PARA O ESTUDO DE CHLAMYDIA E DE MYCOPLASMA

Para o estudo da Chlamydia trachomatis e Mycoplasma devem seguir-se as indicaes de cada fabricante, j que a colheita de amostras, meios de transporte e conservao dependem da tcnica utilizada. 3.8.3.1. Chlamydia trachomatis Os mtodos culturais so mais sensveis e especficos, mas devido sua complexidade e custo no so efectuados na rotina da maior parte dos laboratrios.

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Os mtodos no culturais incluem a pesquisa de corpos elementares, antignios, c. nucleicos, por tcnicas de imunofluorescncia directa, EIA ou sondas de c. nucleicos. Nas tcnicas de imunofluorescncia, os esfregaos so realizados no momento da colheita. As amostras adequadas no so as secrees vaginais, mas sim os raspados, j que a Chlamydia trachomatis se encontra nas clulas do epitlio cilndrico. Esfregao endocervical e uretral Remover o excesso de muco. Inserir uma zaragatoa prpria no canal endocervical ou uretral e rodar. Evitar contacto com a mucosa vaginal. Transportar e conservar a amostra de acordo com a informao do fabricante. Para a colheita uretral, o doente no deve urinar pelo menos 1 hora antes da colheita.

3.8.3.2. Mycoplasma / Ureaplasma Exsudado vaginal, cervical ou uretral Colher a amostra com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron e proceder de acordo com as indicaes do fabricante

3.9. EXSUDADO OCULAR 3.9.1. Consideraes gerais Enviar sempre e em separado amostra dos dois olhos, indicando na requisio o lado da infeco. Nos recm-nascidos, efectuar sempre esfregao em lminas.

3.9.2. Colheita Com uma zaragatoa de algodo ou de alginato de clcio na conjuntiva tarsal inferior e no fornix do olho e coloc-la no meio de transporte apropriado.

3.9.3. Pesquisa de C. trachomatis Solicitar ao Laboratrio o material de colheita e seguir as instrues do fabricante. Colher antes de instilar qualquer anestsico.

3.10. APARELHO RESPIRATRIO Consideraes gerais Para o exame bacteriolgico suficiente 1 nica amostra de boa qualidade, apenas para a pesquisa de micobactrias se aconselham 3 amostras em dias consecutivos.

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Se suspeitar de C. diphteriae. B. pertussis, N. gonorrhoeae, antes de efectuar a colheita, contactar o Laboratrio de Microbiologia.

3.10.1. Vias areas SUPERIORES 3.10.1.1. Exsudado Farngeo Usado para a deteco de Streptococcus -hemoltico do grupo A. Se solicitado, poder ser efectuado para pesquisa de N. gonorrhoeae, N. meningitidis (despiste de portadores), Angina de Vincent, Bordetella pertussis e Corynebacterium diphfteriae. No obter amostra se existir inflamao da epiglote, pois pode causar espasmos com consequente obstruo respiratria. Baixar a lngua com esptula. Colher com zaragatoa entre os pilares e por detrs da vula faringe posterior, amgdalas e qualquer rea inflamada ou ulcerada evitando tocar na mucosa bucal e lngua. Enviar no meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.

3.10.1.2. Exsudado Nasal Usado essencialmente para fins epidemiolgicos, na deteco de portadores de Staphylococcus aureus meticilina resistente. Inserir uma zaragatoa estril em cada narina at encontrar resistncia (mais ou menos a nvel dos cornetos). Rodar a zaragatoa contra a mucosa nasal. Colocar, eventualmente em meio de transporte, e enviar rapidamente ao laboratrio.

3.10.1.3. Exsudado nasofarngeo Para diagnstico de B. pertussis e deteco de portadores de Streptococcus -hemoltico do grupo A, e N. meningitidis. Cuidadosamente introduzir uma zaragatoa flexvel de alginato de clcio atravs do nariz e coloc-la em recipiente esterilizado com o meio de transporte adequado.

3.10.1.4. Aspirado de seio perinasal Colheita a efectuar pela O.R.L. Aspirao com agulha de seio maxilar, frontal ou outros seios. Colocar em meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.

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3.10.1.5. Lquido de timpanocentese Produto indicado no diagnstico da otite mdia aguda. Limpar o canal auditivo externo com soro fisiolgico estril. Aspirar com agulha e seringa e enviar em meio de transporte apropriado. Se o tmpano estiver perfurado, o exsudado pode ser colhido com zaragatoa.

3.10.2. Vias respiratrias INFERIORES

3.10.2.1. Expectorao Preferir a 1 amostra da manh em jejum. Lavar a boca e gargarejar s com gua antes de iniciar a colheita. Instruir o doente para colher expectorao por tosse profunda. Colher o produto em recipiente esterilizado, de boca larga de encerramento hermtico.

3.10.2.2. Expectorao induzida Se o doente no conseguir expectorar esta pode ser induzida por: Cinesioterapia respiratria. Nebulizao efectuada apenas com NaCl 0,85% (inalar 20 a 30 ml de uma soluo de 3 a 10% de NaCl 0,85% em H2O).

Restantes procedimentos iguais aos da expectorao Procedimento no recomendado em caso de suspeita de tuberculose.

3.10.3.3. Secrees brnquicas por aspirao endotraqueal Aspirar as secrees e colocar em recipiente esterilizado com tampa de rosca ou tubo de Luken.

3.10.3.4. Amostras colhidas por broncoscopia Lavado brnquico ou Lavado broncoalveolar Enviar as amostras em recipiente esterilizado com tampa de rosca e hermtico, marcando a ordem da colheita (1, 2, 3 ).

Escovado com catter duplamente protegido Depois de retirar o catter exteriorizar a escova da colheita;

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Cortar assepticamente a escova para dentro do recipiente esterilizado com 1 ml de lactato de Ringer.

Bipsia brnquica Colocar em recipiente esterilizado com uma pequena quantidade de gua destilada esterilizada (evitar a secagem).

3.10.3.5. Aspirado transtraqueal Desinfeco correcta da pele no local da puno de acordo com a poltica de anti-spticos do hospital. Anestesia local e colheita por aspirao. Colocar a amostra em recipiente esterilizado ou em meio de transporte apropriado se pretendida cultura para anaerbios.

3.10.3.6. Aspirado pulmonar transtorcico Desinfeco correcta da pele no local da puno de acordo com a poltica de anti-spticos do hospital. Colheita cirrgica controlada por TAC. Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla colher vrias amostras. Enviar de imediato ao laboratrio a amostra na seringa sem agulha devidamente tapada com dispositivo esterilizado.

3.10.3.7. Bipsia pulmonar (toracotomia) Se possvel colher 1- 3 mm de tecido pulmonar; Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla colher vrias amostras Colocar em recipiente esterilizado.
3

3.11. LQUIDOS de SEROSAS

Volumes mnimos recomendados: Exame bacteriolgico .............1 ml Exame micolgico ..................2 ml Exame micobacteriolgico......2 ml

Desinfectar o local da puno com a soluo anti-sptica segundo a poltica de antispticos do hospital. Aspirar com agulha e seringa.

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Colocar a amostra em recipiente seco, esterilizado com tampa de rosca. Na pesquisa de anaerbios, expelir as bolhas da seringa ou colocar o contedo em meio de transporte apropriado. Eventualmente, quando indicado e protocolado com o laboratrio, podem os produtos ser inoculados em frascos para hemocultura (segundo procedimento idntico ao das hemoculturas).

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URINA
1. INTRODUO

As infeces do aparelho urinrio so uma das infeces mais frequentes no Homem. A infeco urinria aguda geralmente causada por bactrias da flora intestinal saprfita, que invade o aparelho urinrio por via ascendente atravs da uretra. Os agentes etiolgicos mais frequentes nas crianas e adultos, sem outras doenas associadas, so as Enterobactereceas com grande destaque para a Escherichia coli. Em doentes internados e com factores de risco como algaliao permanente, tubos de nefrostomia, clculos urinrios e outras patologias do aparelho urinrio, o leque de agentes etiolgicos alarga-se a outros microrganismos, como Pseudomonas spp, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus spp e fungos, estes ltimos particularmente em doentes que esto sob teraputica antibitica.

2. AMOSTRAS 2.2 COLHEITA A urina habitualmente um lquido biolgico estril, mas a sua passagem atravs da uretra durante a mico arrasta os microrganismos que a colonizam, podendo induzir erros na interpretao da urocultura. Para o diagnstico de infeco do aparelho urinrio so vlidas as seguintes amostras de urina (ver captulo NORMAS de COLHEITA) 1. 2. 3. 4. 5. Mico jacto mdio Puno de cateter urinrio Puno supra-pbica Drenagem de nefrostomia / ureterostomia Saco colector em crianas

Urina colhida por mico jacto mdio O doente dever colher a primeira urina da manh, ou se impossvel, colher urina aps ter estado pelo menos duas horas sem urinar. Afastamento dos grandes lbios ou prepcio. Limpeza metdica do meato uretral com gaze embebida em gua e sabo. Usando o mesmo processo, lavar s com gua esterilizada e secar. Recolha do jacto intermdio directamente para recipiente esterilizado aps desperdiar a primeira poro do jacto urinrio.

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Urina colhida por puno de catter urinrio ( Foley ) Clampagem da alglia Desinfeco do local de puno com soluto anti-sptico Aspirao da urina com agulha e seringa A urina pode ser enviada na prpria seringa, fechada com tampa esterilizada (aps remoo da agulha).

Nota - nunca colher urina do saco da alglia Urina colhida por puno supra- pbica Desinfeco cirrgica da pele Puno Envio da urina na prpria seringa

Este mtodo de colheita est particularmente indicado em doentes algaliados nos quais a interpretao de resultados de exames anteriores foi impossvel e em crianas nas quais foi tambm impossvel colher urina pelos outros mtodos. Urina colhida por drenagem de nefrostomia / ureterostomia Quando h um cateter inserido atravs do flanco do paciente directamente na plvis renal ou no ureter, a colheita feita directamente do cateter para recipiente esterilizado. Urina colhida com saco colector em crianas Lavagem dos genitais externos com gua e sabo Colocar o saco bem adaptado. Envio da urina no prprio saco.

2.3. TRANSPORTE Aps a colheita, a urina deve ser transportada ao laboratrio o mais rapidamente possvel, uma vez que dever ser semeada at uma HORA aps a colheita. Se no for possvel, dever ser refrigerada a 4 C e processada at s 24 horas aps a colheita. Quando a refrigerao imediata no possvel, a urina dever ser colhida para recipiente com preservante (ex: cido brico) e colocada temperatura ambiente. Poder ser processada at 24 horas aps a colheita. Neste caso deve ter-se particular ateno ao volume da urina / preservante (possibilidade de falsos negativos quando o volume de urina muito pequeno).

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3. PROCESSAMENTO LABORATORIAL

3.1. Exame DIRECTO Exame do esfregao de urina corado pelo GRAM Colocar 10 l de urina no centrifugada e bem homogeneizada, numa lmina de vidro. Secar ao ar, fixar e corar pelo GRAM. Determinar o nmero de microrganismos por campo, com objectiva de imerso (100 x) a presena de 1 ou mais bactrias por campo pode ser correlacionada com uma 5 contagem de colnias de 10 U.F.C./ ml

Exame directo a fresco do sedimento urinrio observao de elementos celulares como clulas epiteliais, leuccitos, eritrocitos, fungos ou parasitas no sedimento da urina centrifugada.

3.2. Exame CULTURAL Meios de cultura - Gelose sangue e MacConkey ou Meio de CLED Homogeneizar a urina Emergir verticalmente na urina no centrifugada uma ansa calibrada de 1l Semear nos meios apropriados Incubar em atmosfera de aerobiose a 35 C, 18 a 24 horas. Aps a incubao, leitura do n. de colnias: 1 colnia 10 colnias 100 colnias 10 UFC / ml 4 10 UFC / ml 5 10 UFC / ml
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4. INTERPRETAO dos RESULTADOS

Urina colhida por mico jacto intermdio , por puno de catter urinrio A valorizao dos resultados dever ter em conta uma srie de parmetros tais como: mtodo de colheita da urina, tipo de doente (por ex.: urolgico, geritrico, etc.), sintomatologia, observao microscpica do sedimento urinrio e resultados de exames bacteriolgicos anteriores. Se colheita por mico, geralmente quando h crescimento de duas ou mais estirpes bacterianas, considerar que houve uma m tcnica de colheita da urina ou um atraso

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no transporte e/ou no processamento laboratorial da mesma requisitar nova colheita de urina. Segundo os critrios de Kass, uma contagem de colnias de infeco urinria. 10 significativo
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Urina colhida por saco colector em crianas O exame bacteriolgico da urina colhida por este mtodo pode dar resultados falso positivos, por provvel contaminao com a flora do perneo. Se necessrio, estes resultados podem ser confirmados, repetindo a colheita de urina por outro mtodo ( ex: puno supra-pbica)

Urina colhida por puno supra-pbica Excluindo a contaminao por bactrias comensais da pele, devero ser valorizadas quaisquer espcies de bactrias isoladas, independentemente da sua quantificao.

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HEMOCULTURAS
1. INTRODUO A grande maioria das doenas infecciosas podem decorrer com bacterimia transitria, intermitente, ou persistente (ex. endocardite). Como o sangue um produto biolgico estril, o isolamento de um microrganismo a partir duma hemocultura geralmente o agente etiolgico da infeco.

2. AMOSTRAS

2.1 LOCAL de COLHEITA A colheita do sangue para hemocultura efectuada por puno venosa de qualquer das veias perifricas. Quando so realizadas mais do que uma hemocultura sequencialmente, devem efectuar-se as colheitas em diferentes veias perifricas. No recomendada a colheita de sangue por puno de cateter I.V., excepto quando no possvel a puno de veia perifrica (o laboratrio dever ser informado deste facto, essencial para a interpretao do resultado). O volume de sangue colhido por frasco deve respeitar a proporo recomendada pelo fabricante em relao ao meio de cultura.

2.2. TCNICA de COLHEITA - ACONDICIONAMENTO e TRANSPORTE DESINFECO da PELE Desinfectar o local da puno com lcool a 70% de modo circular e do interior para a periferia. Repetir a operao com soluo alcolica iodada a 1%, ou seguir a poltica de antispticos do hospital. Deixar o anti-sptico secar. IMPORTANTE - No palpar a veia aps a desinfeco da pele e antes de inserir a agulha, se isto acontecer repetir todo o processo de desinfeco. Desinfectar a rolha de borracha do frasco com lcool. Aspirar o sangue e inocular o(s) frasco(s), sem mudar de agulha, no ultrapassando a proporo recomendada pelo fabricante

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Aps a colheita, limpar a pele com lcool, para prevenir reaces adversas ao iodo. Nunca refrigerar as hemoculturas aps a colheita. Conservar o frasco em estufa a 37C at ser enviada ao laboratrio (ou temperatura ambiente nos mtodos automticos se assim fr recomendado pelo fabricante).

VOLUME de SANGUE O volume de sangue crtico porque a concentrao dos microrganismos baixa na maioria das bacterimias, principalmente se o doente est sob teraputica antibitica. Nas crianas, a concentrao dos microrganismos durante o perodo de bacterimia muito mais alta do que nos adultos, por isso so necessrios menores volumes de sangue. Volumes recomendados Crianas - 1 a 5 ml por puno venosa Adultos - 10 a 30 ml por puno venosa

2. 3. NMERO e MOMENTO de EXECUO das HEMOCULTURAS No colher sangue para hemocultura no pico febril. O nmero e o intervalo entre as colheitas depende da situao clnica e da urgncia que exista para iniciar a antibioticoterapia. Como indicador apresentam-se algumas situaes clnicas: Colher sequencialmente em locais diferentes 2 a 3 hemoculturas Colher inicialmente 2 a 3 hemoculturas. Febre de origem desconhecida (SFI) Se negativas entre as 24h e as 36h, efectuar mais 2 hemoculturas. Efectuar 3 hemoculturas no 1 dia. Se negativas s Endocardite infecciosa 24h, repetir colheita de 3 hemoculturas Sepsis, meningite, pneumonia Doentes com teraputica antimicrobiana A colheita deve ser feita imediatamente antes da toma do antibitico

3. MEIOS de CULTURA Os meios utilizados devem conter 0,025 a 0,05% de polianetolsulfato (SPS). O SPS um anticoagulante que inibe a actividade bactericida do soro, a fagocitose, inactiva o complemento, neutraliza lisozimas e ainda alguns antibiticos da grupo dos aminoglicosdeos. Note-se que h espcies de Neisseria que podem ser inibidas pelo SPS. 3.1. Meios de cultura ou sistemas para isolamento de microrganismos aerbios e anaerbios facultativos Meios lquidos Brain heart infusion, Brucella, Columbia, TSB Meios bifsicos - meio de Castaeda Sistema de Lise - centrifugao ( Isolator) Meios lquidos para aerbios de sistemas automticos

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3.2. Meios de cultura especficos para anaerbios Meios lquidos - Thioglicolato Meios lquidos para anaerbios de sistemas automticos

4. PROCEDIMENTOS GERAIS Recomendaes GERAIS - devem ser sempre cumpridas todas as normas de precaues universais quando se manipula o sangue: 1. Utilizar luvas aquando da manipulao de qualquer lquido orgnico. 2. Sempre que possvel, efectuar o processamento do produto em cmara de fluxo laminar. 3. Colocar o material contaminado, seringas e agulhas em contentor prprio no perfurvel. 4.1. Meios de Cultura e Sistemas NO- AUTOMTICOS 4.1.1 Meios de cultura lquidos baseados nos meios convencionais Ventilar o frasco para aerbios (havendo assim uma melhor recuperao dos microrganismos aerbios estritos, p. ex. Pseudomonas spp. e fungos leveduriformes): - Descontaminar a tampa do frasco com lcool a 70%. - Deixar secar 1 a 2 min. - Em cmara de fluxo laminar, inserir uma agulha de ventilao para retirar o vcuo. Incubar o frasco da hemocultura em atmosfera de aerobiose a 35C durante 7 dias ou at 28 dias quando suspeita de diagnstico de Brucella.

4.1.2. Meios de cultura Bifsicos O meio utilizado o Meio de Castaeda (fase lquida - TSB e fase slida - TSA). Incubao em atmosfera de aerobiose a 35C durante 7 dias ou at 28 dias quando suspeita de diagnstico de Brucella. Exame macroscpico duas vezes por dia nos primeiros 2 dias e depois diariamente com inverso do frasco para contacto do meio lquido com a gelose.

4.1.3. Sistema de Lise-Centrifugao Colheita de 10 ml ou 1,5 ml de sangue consoante a capacidade do tubo (Isolator). Inverter o tubo para misturar o sangue com o lquido de lise. Processar nas 8 h seguintes colheita. As amostras colhidas em tubos de 10ml devem ser centrifugadas, a fim de permitir concentrao dos microrganismos (no centrifugar os tubos que contm 1,5ml de sangue).

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Centrifugar a 3000 g durante 30 minutos. Efectuar todos os procedimentos seguintes em cmara de fluxo laminar: Retirar o sobrenadante e concentrar o sedimento em agitador durante 20 seg. Inocular em meios de cultura especficos consoante o pedido do exame. Incubao em diferentes atmosferas, dependendo dos microrganismos a pesquisar.

4.2. Sistemas AUTOMTICOS Existem vrios sistemas automticos comercializados. Todos utilizam para a cultura de sangue, meios lquidos para aerbios (ou para anaerbios). A deteco do crescimento bacteriano efectuada automaticamente (medio do CO2 produzido e modificaes do pH). Critrios de Avaliao de um Sistema Automtico 1. 2. 3. 4. Incubao no aparelho temperatura de 35C com ou sem agitao contnua Tempo de incubao proGramvel pelo utilizador Avaliao de falsos positivos Avaliao de falsos negativos

Nota: Nalguns sistemas (equipamentos), aconselhada a realizao de subculturas sempre que haja suspeita de microrganismo de crescimento lento (p. ex. Brucella) ou suspeita de infeco por fungos.

5. Processamento laboratorial das HEMOCULTURAS POSITIVAS 5.1. Mtodo MANUAL Exame macroscpico observao visual diria do crescimento microbiano e subcultura da hemocultura em meio slido, geralmente gelose sangue quando apresenta turvao, hemlise, formao de gs, formao de pelcula ou colnias visveis na transio entre o sedimento eritrocitrio e o meio de cultura. Em alternativa, fazer passagens cegas s 24 horas, 48 horas e 7 dias de incubao (mtodo actualmente o menos recomendado). Efectuar subculturas dos frascos que no apresentem crescimento visvel s 72 h: Gelose sangue e gelose chocolate com incubao em 5% CO2 a 35C at s 48 h. No recomendada subcultura em anaerobiose. Subculturas ao 7 dia consideram-se de pouca utilidade clnica.

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5.2. Mtodo AUTOMTICO Quando o equipamento detecta positividade, realizar subcultura em meio slido, geralmente em gelose com sangue. Possibilidade de efectuar esfregao da hemocultura com suspeita de positividade e corar pelo mtodo de Gram (observao microscpica). Possibilidade de realizao de subculturas em diferentes meios e atmosferas de incubao de acordo com a informao obtida pelo exame microscpico, quando realizado. Incubao em atmosfera de aerobiose, com 5% CO2 ou em anaerobiose a 35C durante 24h a 48h, consoante o microrganismo a pesquisar. Leitura macroscpica das culturas e realizao da identificao e testes de sensibilidade segundo metodologia existente no laboratrio.

6. PROCESSAMENTO DE HEMOCULTURAS QUE REQUEREM TRATAMENTO ESPECFICO 6.1. Culturas de sangue para deteco de Brucella spp. Toda a manipulao das culturas para deteco deste agente tem de obrigatoriamente ser efectuada em cmara de fluxo laminar. Devem ser utilizados preferencialmente os meios Bifsicos ou sistema de Lise centrifugao. Incubar o meio em estufa com 10% de CO2 temperatura de 37C. Se for utilizado um meio bifsico, deve-se proceder ao arejamento do frasco, que deve ser invertido diariamente e observar a presena de crescimento bacteriano. Se utilizado meio lquido manual ou sistema automtico, devem ser efectuadas subculturas semanalmente, durante 4 semanas para Gelose sangue Brucella, Gelose sangue BHI, triptose simples ou outro especfico para a pesquisa deste agente. Em culturas positivas proceder realizao de esfregao da cultura, corar pelo Gram e proceder identificao.

6.2. Cultura para deteco de Leptospira A Leptospira requer meios especficos para o seu crescimento, como o meio de Fletcher com adio de soro de coelho a 14% (vol./vol.) ou meio de Leptospira com albumina e cido gordo. Estes meios devem estar contidos em tubos de 5 ml. Inocular 6 tubos do meio a usar - Em 2 tubos adicionar uma gota de sangue - Em 2 tubos adicionar 2 gotas de sangue - Em 2 tubos adicionar 1 gota de sangue previamente diludo 1:10 em tampo salino de fosfato estril.

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Incubar os tubos no escuro entre 28 C e 30C durante 6 semanas. Semanalmente remover uma gota do meio 1 a 3 cm abaixo da superfcie e examinar em microscpio de fundo escuro.

6.3. Neutralizao ou Inactivao dos Agentes Antimicrobianos Nos doentes que recebem altas doses de -lactmicos, podem ser usados os seguintes procedimentos: 1. Frascos com resinas para remoo dos agentes antimicrobianos 2. Adio de penicilinase - assepticamente adicionar a penicilinase nas propores recomendadas pelo fabricante. (Realizar o teste de esterilidade da penicilinase, inoculando 3 a 5 gotas em TSB e incubar durante 5 dias).

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LQUIDO CFALO - RAQUIDIANO

1. INTRODUO

A Meningite Bacteriana uma Emergncia Mdica pois a infeco das meninges uma situao clnica grave e potencialmente mortal se no tratada atempadamente. O diagnstico laboratorial uma urgncia que requer processamento imediato do produto para determinar o agente etiolgico. Geralmente so as bactrias aerbias que causam esta infeco, mas na presena de abcesso cerebral o agente etiolgico pode ser uma bactria anaerbia. Agentes Etiolgicos das Meningites Agudas Idade ou Condio Recm-nascido < 2 meses < 10 anos Adultos Jovens Adultos Idosos Doentes Imunodeprimidos Microrganismos
Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes, Herpes simplex virus 2 S. agalactiae, L. monocytogenes, E. coli Virus, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis Virus, N. meningitidis S. pneumoniae, N. meningitidis S. pneumoniae, Bacilos Gram negativo, L .monocytogenes Cryptococcus neoformans

2. AMOSTRAS A colheita deve ser feita antes do incio da teraputica antimicrobiana. A colheita feita por puno lombar e o LCR deve ser colhido em tubos inquebrveis, transparentes, com tampa de rosca e fundo cnico para concentrao do produto, uma vez que pode conter muito poucas bactrias. Deve ser enviado ao Laboratrio imediatamente aps a colheita, e mantido temperatura ambiente (ou na estufa a 35C) e nunca refrigerado antes do processamento, a no ser que sejam pedidos estudos virais. Apenas o LCR para estudos virais deve ser refrigerado ou congelado. So necessrios 3 tubos: 2 para exame citolgico e bioqumico e outro para exame microbiolgico (ltimo tubo).

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So necessrios pelo menos os seguintes volumes mnimos: - 1 ml para a cultura bacteriana - 2 ml para a cultura de fungos - 3 ml para a cultura de micobactrias A observao de esfregao corado pelo mtodo de Gram importante, e qualquer resultado positivo deve ser comunicado imediatamente ao clnico.

3. MEIOS de CULTURA e REAGENTES Gelose chocolate com suplemento polivitamnico Gelose sangue Caldo crebro-corao (BHI), ou meio de Tioglicolato na suspeita de anaerbios.

4. PROCESSAMENTO LABORATORIAL Avaliar o volume da amostra de LCR e descrever a sua aparncia microscpica. Se o volume for superior a 1 ml centrifugar durante 20 minutos (1.500 a 3.000 g), se for inferior utilizar s o agitador para homogeneizar a amostra. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta esterilizada, deixando aproximadamente 0,5 a 1 ml de sedimento e guardar aquele para estudos adicionais, durante uma semana. Ressuspender o sedimento agitando vigorosamente durante 30 segundos. Preparar o esfregao colocando uma ou duas gotas sem espalhar do sedimento numa lmina de vidro nova limpa com lcool e seca. Fixar com metanol e corar pelo mtodo de GRAM e AZUL de METILENO. A citocentrfuga um mtodo alternativo para a preparao do esfregao. Com uma pipeta esterilizada, inocular os meios a partir do sedimento incubar a 35C em atmosfera de 5 % CO2 at s 72 horas, observando as placas diariamente. Fazer a passagem dos meios lquidos de enriquecimento s 24 e/ou 48 horas Antignios capsulares bacterianos Pode ser feita pesquisa de antignios bacterianos (Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae) sempre que clinicamente se justifique, nunca dispensando a sua correlao com o exame bacteriolgico directo e cultural. Seguir as instrues do fabricante. Um resultado positivo depende do nvel de antignios detectveis e no substitui a CULTURA. A sensibilidade dos testes de ltex varivel, e cada laboratrio deve avaliar a sensibilidade e especificidade para o mtodo utilizado.

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LQUIDOS de SEROSAS (ORGNICOS)

1. INTRODUO Os lquidos orgnicos so normalmente estreis e qualquer microrganismo encontrado deve ser investigado. A interpretao final deve ter em conta o estado clnico do doente e o microrganismo isolado. 2. AMOSTRAS Lquido pleural Lquido peritoneal Lquido pericrdico Lquido sinovial

3. COLHEITA E TRANSPORTE A colheita depende do local anatmico, mas deve seguir-se sempre uma tcnica assptica. Para o estudo bacteriano recomendado um volume mnimo de amostra de 1 ml. Para a pesquisa de micobactrias ou fungos necessrio, quando possvel, um volume superior (10 a 20 ml). Colher para recipiente esterilizado seco com tampa de rosca. Para pesquisa de anaerbios, utilizar meio de transporte prprio. Enviar de imediato ao laboratrio. Adicionalmente, quando indicado e protocolado com o laboratrio, podem fazer-se colheitas com inoculao em frasco para Hemocultura, o que no dispensa o envio de produto para exame directo ou outros estudos laboratoriais.

4. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES Gelose sangue Meio selectivo para bactrias Gram negativo Meio lquido de enriquecimento (por ex. BHI ou thioglicolato) Quando indicado, utilizar outros meios para pesquisa de outros microrganismos (ex.: gelose chocolate no lquido sinovial)

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5. PROCEDIMENTOS 5.1. Processamento inicial da amostra Observar / Descrever o aspecto macroscpico da amostra Os lquidos lmpidos devem ser concentrados por centrifugao, enquanto as amostras purulentas podem ser inoculadas directamente nos meios de cultura: - Centrifugar durante 15 a 30 minutos a 1500 g. - Aspirar o sobrenadante com uma pipeta esterilizada, deixando cerca de 1 ml de lquido no qual se ressuspende o sedimento. Os lquidos que apresentem cogulos devem ser homogeneizados.

5.2. Exame DIRECTO Preparar um esfregao do sedimento e corar pelo GRAM.

5.3. Exame CULTURAL Com uma pipeta esterilizada transferir 2 gotas do sedimento para cada placa dos meios de cultura e semear com ansa esterilizada. Incubar as placas de gelose sangue e gelose chocolate em atmosfera de 5% de CO2 a 35C, durante 18 a 24 horas. Incubar o meio selectivo para Gram negativo e os meios lquidos a 35C, em aerobiose. Fazer a passagem dos meios lquidos de acordo com o diagnstico, exame directo e a cultura primria.

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FluxoGrama do exame bacteriolgico dos Lquidos de Serosas

Colheita de Amostra
Concentrao

Esfregao Corado Gram e Ziehl-Neelsen

Culturas Primrias

Aerbia
35C CO 18-24horas 2

Incubao

Anaerbia
35C 48horas

Observao Placas

Observao Placas

No Crescimento

Crescimento Bactrias Aerbias

Crescimento

No Crescimento

B. Aerbias Reincubao e Observao Diria do Meio Lquido no mnimo 48 horas B. Anaerbias

ID e TSA

Reincubao Anaerbia 35C 2448 horas

No Crescimento

Colorao Gram

Crescimento

Beta-Lactamase

Resultado Final

ID

Resultado Final

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APARELHO RESPIRATRIO SUPERIOR

1. INTRODUO As infeces das vias respiratrias superiores so muito frequentes, sendo a maior parte de etiologia viral. O diagnstico bacteriolgico dessas situaes representa uma tentativa de identificar, entre uma flora indgena abundante, o(s) agente(s) implicado(s) na infeco. Flora microbiana indgena do aparelho respiratrio superior Existe uma flora mista abundante, constituda por aerbios e anaerbios. Vrios agentes patognicos tais como o S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae, N. meningitidis, leveduras e membros das Enterobacteriaceae, podem constituir uma flora transitria ou estar presente em pequeno nmero na orofaringe de indivduos saudveis. Nos seios paranasais e ouvido mdio no h flora microbiana nos indivduos saudveis.

2. FARINGITE A principal causa de faringite viral. Na faringite bacteriana a principal causa o Streptococcus -hemoltico do grupo A. Outras causas de faringite so a Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis e Corynebacterium diphtheriae, devendo a pesquisa destes agentes ser feita exclusivamente quando existe suspeita clnica e por solicitao especfica do mdico. 2.1. Faringite ESTREPTOCCICA Agente patognico - Streptococcus pyogenes (S. -hemoltico do grupo A) Colheita e Transporte Deprimir a lngua com uma esptula e utilizar uma zaragatoa de algodo, alginato de clcio ou dacron. Colher a amostra passando vigorosamente a zaragatoa ao nvel das amgdalas e poro posterior da faringe, evitando tocar a lngua e a vula. No necessrio a utilizao de meio de transporte se o processamento laboratorial ocorrer dentro de 3 horas aps a colheita. Noutras situaes, deve ser utilizado meio de Stuart ou Amies.

Exame DIRECTO No se recomenda no diagnstico da faringite estreptoccica, devido existncia de uma flora mista e de um grande nmero de outros Streptococcus na orofaringe, sendo por isso difcil a sua interpretao.

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Exame CULTURAL Gelose sangue Meio de Todd-Hewitt suplementado com sangue a subcultura s 24 horas pode facilitar a deteco do Streptococcus hemoltico do grupo A quando ele se encontra presente em pequeno nmero.

Incubar o meio durante 18-24 h a 35 C em atmosfera de aerobiose (eventualmente em anaerobiose que favorece a hemlise uma vez que a Streptolisina O oxignio-lbil). 2.2. Faringite GONOCCICA Agente patognico - Neisseria gonorrhoeae Colheita e Transporte A nvel das amgdalas e faringe posterior com colocao em meio de transporte com carvo (ex.: Meio de Amies com carvo). Exame DIRECTO - no deve ser efectuado, devido existncia de neisserias saprftas que fazem parte da flora farngea. Exame CULTURAL Meio selectivo para N. gonorrhoeae (meio GC, Thayer-Martin modificado ou New York City) Incubao durante 48-72 horas a 35C em atmosfera de 5-10% de CO2 .

2.3. Faringite na TOSSE CONVULSA Agente patognico - Bordetella pertussis Colheita e Transporte Com zaragatoa flexvel de alginato de clcio, colher muco da nasofaringe por via pernasal ou efectuar colheita por aspirao nasofarngea. O agente muito sensvel desidratao, devendo a amostra ser semeada cabeceira do doente e imediatamente enviada ao Laboratrio. Se isso no for possvel, utilizar meio de transporte e de enriquecimento que contm na sua constituio, cefalexina, sangue desfibrinado de cavalo e agar semi - slido.

Exame CULTURAL Em meio de Bordet-Gengou ou outro meio selectivo, com incubao a 35C em atmosfera hmida durante 5-7 dias em aerobiose.

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2.4. Faringite DIFTRICA Agente patognico - Corynebacterium diphtheriae

Colheita e Transporte Colher exsudado a nvel da orofaringe e da nasofaringe com zaragatoa. Se no for processado imediatamente, colocar em meio de transporte.

Exame CULTURAL Semear em meio de Loeffler e incubar 18 horas em aerobiose a 35C. Diagnstico presuntivo da cultura, realizar esfregao e corar com azul de metileno para observao da presena de bacilos em paliada ou caracteres chineses apresentando grnulos metacromticos. Diagnstico definitivo ver captulo respectivo. Se as culturas forem positivas, necessrio para a confirmao clnica de difteria, a pesquisa da toxina (Teste de Elek verificar que se trata de estirpe toxignica).

2.5. Angina de VINCENT um tipo de infeco da faringe devido a dois anaerbios - Borrelia vincentii e Fusobacterium spp. O diagnstico laboratorial feito por exame directo do esfregao de material da faringe colhido com zaragatoa e corado com carbolfucsina diluda (fucsina de Ziehl diluda a 1:10). A observao de muitas espiroquetas e bacilos fusiformes com muitos polimorfonucleares confirma o diagnstico.

3. LARINGITE Quase sempre de etiologia viral, o exame bacteriolgico no est indicado nestas situaes, excepto para a excluso da difteria ou infeco por Streptococcus -hemoltico do grupo A.

4. EPIGLOTITE Geralmente de etiologia bacteriana, sendo na sua maioria provocada pelo Haemophilus influenzae tipo B. O diagnstico essencialmente clnico e atravs de hemoculturas (positivas em cerca de 50% dos casos). Est contra-indicada a colheita de amostras da epiglote devido ao risco de poder originar uma obstruo aguda das vias areas .

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5. SINUSITE Frequentemente de origem endgena, a partir de microrganismos presentes nas vias areas superiores . Agentes mais frequentes Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis Streptococcus spp Staphylococcus aureus Bacilos Gram negativo Eventualmente, Anaerbios

Colheita e Transporte Realizada pelo especialista, a NICA amostra vlida para exame bacteriolgico a obtida por puno do seio perinasal, com envio ao Laboratrio em meio de transporte para aerbios e eventualmente para anaerbios.

Exame DIRECTO Fazer esfregao para colorao pelo GRAM.

Exame CULTURAL

Meios slidos - Gelose sangue - Gelose chocolate Meios lquidos - BHI ou Todd-Hewitt, suplementado com sangue - Meio de carne cozida (para pesquisa de anaerbios) Incubao durante 18 a 24 h em atmosfera de 5% de CO2. Sub-cultura dos meios lquidos para meios slidos de acordo com culturas iniciais. Quando indicado processar para pesquisa de anaerbios.

6. OTITE MDIA A otite mdia uma infeco muito frequente em bebs e crianas Agentes mais frequentes Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Haemophilus influenzae

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Como agentes menos frequentes - S. aureus , M. catarrhalis, Enterobacteriaceae e anaerbios Colheita e Transporte

A melhor amostra a colhida por timpanocentese com transporte ao Laboratrio em meio de transporte para aerbios e para anaerbios. Se tiver havido ruptura do tmpano, utilizar um espculo auricular e colher o exsudado com zaragatoa. Enviar em meio de transporte para aerbios. Exame DIRECTO - fazer esfregao para colorao pelo GRAM . Exame CULTURAL - proceder como em 5.

7. OTITE EXTERNA No uma infeco das vias respiratrias superiores mas importante fazer a distino entre as zaragatoas auriculares para colheita de pus com origem no ouvido mdio por ruptura do tmpano, e as zaragatoas para diagnstico de infeces bacterianas da pele do canal auditivo externo, sendo a Pseudomonas aeruginosa uma causa frequente de otite externa .

8. COLHEITA DE AMOSTRAS COM FINS EPIDEMIOLGICOS A colheita de amostras das vias respiratrias superiores ocorre por vezes com a finalidade de se fazer a deteco de portadores de S. aureus e de N. meningitidis.

Despiste de portadores na nasofaringe de S. aureus - para vigilncia e controlo de surtos de infeco nosocomial. Colheita da amostra - colher com zaragatoa a nvel das narinas e faringe e semear em meio selectivo (manitol salgado). Incubar em aerobiose a 35C durante 18-24h.

Despiste de portadores de N. meningitidis - para controlo de disseminao da infeco a partir de um caso de doena meningoccica. Colheita da amostra - a partir da orofaringe e nasofaringe com colocao em meio de transporte apropriado. Efectuar a sementeira das zaragatoas em meio selectivo (ThayerMartin modificado ou New York City ou VCAT) e incubar durante 48-72h a 35C em atmosfera de 5% de CO2.

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APARELHO RESPIRATRIO INFERIOR

1. INTRODUO O diagnstico das infeces respiratrias inferiores frequentemente dificultado pela contaminao das amostras por flora comensal da orofaringe durante a colheita. O laboratrio deve processar apenas as amostras de boa qualidade.

2. AMOSTRAS

Expectorao Secrees brnquicas (aspirao endotraqueal) Lavado brnquico Lavado bronco-alveolar Escovado brnquico Bipsia brnquica Aspirado transtraqueal Aspirado pulmonar (transtorcico) Bipsia pulmonar (toracotomia)

3. COLHEITA e TRANSPORTE

3.1. Expectorao Se possvel, colher a primeira expectorao da manh. Lavar a boca e gargarejar s com gua antes da colheita. Instruir o doente para colher expectorao por tosse profunda (desprezar amostras de saliva ou rinorreia posterior). Colocar a amostra em recipiente estril, seco, de boca larga e tampa de rosca.

3.2. Expectorao Induzida Se a expectorao for escassa, proceder induo da mesma por nebulizao com soro fisiolgico (20 a 30 ml de uma soluo de 3 a 10% de NaCl 0,85% em H2O). A induo da expectorao tambm pode ser feita por cinesiterapia respiratria. Restantes procedimentos idnticos aos da expectorao. Nota: este procedimento no recomendado em caso de suspeita de tuberculose.

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3.3. Secrees brnquicas por Aspirao Endotraqueal Aspirar as secrees e colocar em recipiente seco, estril com tampa de rosca ou tubo de Luken.

3.4. Amostras colhidas por Broncoscopia 3.4.1. Lavado brnquico ou Lavado bronco-alveolar Enviar as amostras ao laboratrio em recipientes secos, estreis, com tampa de rosca devidamente marcados por ordem de colheita (1, 2 e 3).

3.4.2. Escovado brnquico Colocar o escovado em recipiente esterilizado com 1ml de gua destilada esterilizada ou 1ml de Lactato de Ringer.

3.4.3. Bipsia brnquica e pulmonar transbrnquica Colocar em recipiente esterilizado com uma pequena quantidade de gua esterilizada .

3.5. Aspirado transtraqueal Desinfeco correcta da pele no local de puno Anestesia local e colheita por aspirao Colocar a amostra em recipiente esterilizado ou em meio de transporte apropriado se pretendida cultura para anaerbios

3.6. Aspirado pulmonar (transtorcico) Colheita cirrgica controlada por TAC Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla, colher vrias amostras. Enviar ao laboratrio a amostra na seringa devidamente tapada por borracha esterilizada.

3.7. Bipsia pulmonar (toracotomia) Se possvel colher 1 a 3 mm de tecido pulmonar. Se a leso for de grandes dimenses ou mltipla, colher vrias amostras. Colocar em recipiente seco e esterilizado As amostras devem ser enviadas ao laboratrio no prazo mximo de 30 minutos.
3

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4. MEIOS de CULTURA e REAGENTES Gelose sangue Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp. Meio de MacConkey (opcional) Meios para anaerbios, quando indicado

5. PROCEDIMENTOS 5.1. EXPECTORAO e SECREES BRNQUICAS Exame DIRECTO Seleccionar uma poro purulenta da amostra, efectuar um esfregao por estiramento e corar pelo mtodo de Gram. Observar ao microscpio ptico com objectiva 10 x (cerca de 10 campos) para avaliar a qualidade da amostra tendo em conta a presena de clulas epiteliais pavimentosas (da orofaringe) e leuccitos. Classificar as amostras segundo o critrio de Murray e Washington ou equivalente. Tabela de Murray e Washington Clulas epiteliais / Pequena ampliao (10 X) 25 25 25 10-25 < 10 Leuccitos / Pequena ampliao (10 X) 10 10-25 25 25 25

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5

Segundo este critrio, processar as amostras que se englobem nos grupos 4 e 5. So as de boa qualidade para o exame bacteriolgico habitual. No dever ser aplicado este critrio em doentes neutropnicos e na pesquisa de outros agentes especficos, tais como Mycobacterium sp, Legionella sp, Mycoplasma sp, etc. (agentes que no fazem parte da flora normal da orofaringe e no a colonizam).

Exame CULTURAL De poro purulenta seleccionada, semear com ansa esterilizada segundo o mtodo dos quatro quadrantes, nos seguintes meios de cultura: - Gelose sangue - Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp. - MacConkey (opcional) Incubar em atmosfera de 5 % de CO2 a 35 C durante 18 a 24 horas. Valorizar as culturas de acordo com a observao do Gram e informao clinica. Reisolar e identificar a estirpe valorizada.

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5.2. ESCOVADO BRNQUICO Exame CULTURAL Agitar no vortex o tubo que contm o escovado e o lquido de transporte. Semear com ansa calibrada ou com pipeta 10 l nos meios de cultura: Gelose sangue Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp. MacConkey (opcional)

Incubar em atmosfera de 5 % de CO2 a 35 C durante 18 a 24 horas. Quantificar o crescimento correspondendo cada colnia a 10 U.F.C./ml. 1 Col = 10 Col = 100 Col = 10 U.F.C./ml 3 10 U.F.C./ml 4 10 U.F.C./ml
3 2 2

Valorizar as estirpes isoladas em quantidade >10

O volume de secrees colhidas pelo escovado aproximadamente de 0,001 ml e diludo em 1 ml de lquido de transporte, resulta numa diluio final de 1/1000; assim, um 3 6 crescimento > 10 U.F.C./ml indica uma concentrao de bactrias de 10 U.F.C./ml nas secrees, valor normalmente considerado significativo de infeco. Reisolar e identificar as estirpes valorizadas.

5.3. LAVADO BRONCO-ALVEOLAR O lavado broncoalveolar obtido por instilao e aspirao de uma soluo no bacteriosttica de NaCl 0,85% atravs do broncoscpio encravado num segmento brnquico. A quantidade de soluto instilado no est padronizada, mas considera-se que pelo menos 120 ml so necessrios para obter uma boa amostragem das secrees alveolares. A primeira amostra (fraco brnquica) deve ser processada separadamente para colorao e culturas de determinados microrganismos (Micobactrias, Legionella e Fungos). As outras duas amostras podem ser misturadas e usadas para exame microscpico e culturas quantitativas. O volume mnimo aceitvel para exame directo e cultural de 5 ml para cada.

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Exame DIRECTO Contagem celular Contagem de clulas na amostra no fraccionada nem centrifugada, usando um hematocitmetro. Devem fazer-se duas contagens e a mdia das duas ser registada como o nmero de clulas/ml de LBA (excluem-se os eritrocitos).

Os esfregaos devem ser efectuados aps citocentrifugao do LBA (600 a 1000 rpm durante 10 a 20 minutos). Se no existir citocentrfuga podero ser realizados a partir de um sedimento obtido em centrfuga normal. Colorao GIEMSA Contagem diferencial de leuccitos Clulas epiteliais pavimentosas (>1%, sugere contaminao com flora da orofaringe). Observao da existncia de clulas epiteliais brnquicas

Colorao de GRAM Semiquantificao e caracterizao morfolgica e tinturial dos microrganismos presentes. Referir a % de neutrfilos com microrganismos intracelulares (ICO).

Pesquisa de fibras de Elastina Uma gota de LBA + uma gota KONa 40%. Incubar temperatura ambiente durante 1 a 4 horas ou aquecer chama. Observao microscpica com objectiva 100 x.

Exame CULTURAL Agitar no vortex durante 30 a 60 segundos e semear com ansa 10 l nos meios de cultura: - Gelose sangue - Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp. - MacConkey (opcional) Incubar em atmosfera de 5 % de CO2 em estufa a 35 C durante 24 horas. Se ocorrer crescimento quantificar as colnias segundo o seguinte quadro:

1 Col = 10 Col = 100 Col =

10 U.F.C./ml 3 10 .F.C./ml 4 10 .F.C./ml

4

Valorizar os microrganismos isolados em quantidade > 10 U.F.C./ml.

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O lquido de retorno corresponde a uma diluio de 1/100 do fludo de revestimento 4 6 alveolar: um crescimento > 10 U.F.C./ml indica uma concentrao de bactrias > 10 U.F.C./ml no fluido de revestimento alveolar, valor normalmente considerado significativo de infeco. Em doentes no ventilados, 10 a 10 diferenciar colonizao de infeco.
4 5

U.F.C./ml um valor apropriado para

Em doentes ventilados e sob antibioticoterapia prvia estes valores so imprecisos.

5.4. ASPIRADO TRANSTRAQUEAL, PULMONAR e BIPSIA PULMONAR Exame DIRECTO Aspirado transtraqueal - efectuar esfregao de modo idntico expectorao ou secrees brnquicas. Aspirado pulmonar - efectuar um esfregao fino. Bipsia pulmonar - esfregao efectuado directamente por touchpress ou a partir de homogeneizado.

Exame CULTURAL Aspirado transtraqueal - idntico ao da expectorao e secrees brnquicas. Aspirado pulmonar - semear directamente nos meios de cultura. Bipsia pulmonar - cultura do homogeneizado efectuado por macerao. Meios de cultura: - Gelose sangue - Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp. - MacConkey (opcional) - Meio lquido para anaerbios (quando solicitada cultura para anaerbios e se a amostra tiver sido colhida e transportada em condies adequadas). Incubar as placas em atmosfera 5 % de CO2 em estufa de 35 C durante 24 horas. Identificar todos os microrganismos isolados. Incubar o meio lquido para anaerbios a 35 C e observar diariamente durante 5 dias. Quando apresentar turvao efectuar um esfregao do mesmo e corar pelo Gram. Subcultivar em meios slidos para aerbios e anaerbios. Identificar todos os microrganismos isolados.

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EXSUDADOS OCULARES
1. INTRODUO As infeces oculares podem ser divididas em : Infeces das estruturas externas do olho - blefarites - conjuntivites - queratites Infeces das estruturas internas do olho - endoftalmites Infeces do sistema lacrimal - canaliculites - dacriocistites - dacrioadenites A nvel do saco conjuntival existe uma flora saprfita constituda principalmente por Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus. Mais raramente podem ser encontrados o Haemophilus influenzae, Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Moraxella catarrhalis e fungos.

2. COLHEITA E TRANSPORTE

As indicaes e tcnicas para investigao bacteriolgica so determinadas pela localizao da infeco (ocular ou peri-ocular), sua gravidade e rapidez de instalao e pelo conhecimento dos principais agentes implicados. MATERIAL DE COLHEITA 1. Esptula de platina de Kimura - para a obteno de amostras da conjuntiva e da crnea. 2. Lminas e agulhas descartveis. 3. Zaragatoas de algodo ou de alginato de clcio, com ou sem meio de transporte, de acordo com o tipo de exame que se pretende realizar. 4. Soluo anestsica.

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3. PROCESSAMENTO LABORATORIAL Devido constante aco de lavagem das lgrimas, o nmero de bactrias isoladas de algumas infeces oculares geralmente baixo, pelo que se recomenda a utilizao de um grande inculo e a sementeira em vrios meios de cultura. Habitualmente, semeia-se um meio lquido (TSB ou BHI) e meios slidos (gelose-sangue, gelose-chocolate). Aos meios referidos poder-se-o associar outros, de acordo com a suspeita clnica.

3.1. BLEFARITE Infeco aguda ou crnica da margem da plpebra envolvendo a pele e pestanas. Principais agentes Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Colheita da amostra Molhar uma zaragatoa de algodo ou de alginato de clcio em soro fisiolgico esterilizado e pass-la ao longo das margens superior e inferior da plpebra. Com outra zaragatoa, repetir o mesmo procedimento para o outro olho.

Exame DIRECTO - no til, pelo que no deve ser efectuado. Exame CULTURAL Gelose sangue Gelose chocolate selectiva para Haemophilus spp. Meio para fungos (nas blefarites crnicas) Incubao em 5 % CO2 at s 48 horas

3.2. CONJUNTIVITE A conjuntivite bacteriana representa o tipo mais frequente de infeco ocular e pode ocorrer por inoculao directa ou exgena, ou por disseminao hematognica a partir dum foco infeccioso. Principais agentes de conjuntivite da comunidade Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Neisseria gonorrhoeae Moraxella catarrhalis

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Principais agentes de conjuntivite no recm nascido Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Staphylococcus aureus Bacilos Gram negativo

Principais agentes em doentes imunocomprometidos Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa

Colheita da amostra Com zaragatoa - Deve ser feita antes da aplicao de um anestsico tpico ou antimicrobiano, pois estes agentes podem interferir no isolamento das bactrias. Utilizar uma zaragatoa de alginato de clcio e pass-la ao longo da conjuntiva tarsal inferior. Colher amostras de ambos os olhos . Com esptula de Kimura.

Nota: na suspeita de infeco por Chlamydia trachomatis, efectuar colheita para tcnica de imunofluorescncia directa, de acordo com as instrues do fabricante. Exame DIRECTO Quando efectuado realizar o esfregao na altura da colheita e corar pelo mtodo de Gram. Exame CULTURAL - semear a amostra nos seguintes meios : Meios slidos Gelose-sangue Gelose-chocolate selectiva para Haemophilus spp. Meio selectivo para N. gonorrhoeae - no recm nascido

Meio lquido BHI ou outro - facultativo

3.3. QUERATITE Infeco da crnea que pode apresentar variadas etiologias. As bactrias so responsveis por 65 - 90% dos casos. Dever ser encarada como uma situao de emergncia porque a perda do olho afectado pode ocorrer em 24h quando bactrias como a Pseudomonas aeruginosa ou o Staphylococcus aureus esto envolvidas.

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Principais agentes de infeco Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Moraxella catarrhalis Haemophilus spp Acanthamoeba spp.

Colheita da amostra a. Com zaragatoa de alginato de clcio - o risco de contaminao com a flora indgena maior. b. Com esptula de Kimura - so efectuadas pelo oftalmologista vrias raspagens, sendo cada uma utilizada para inocular um nico meio de cultura e realizao de esfregao para exame directo. c. Bipsia da crnea - mtodo de colheita utilizado pelo oftalmologista quando no existe supurao da crnea. O tecido crneo transportado ao Laboratrio em meio lquido estril ou soro fisiolgico estril. Aps a bipsia, pode ser obtido material adicional por raspagem da base da mesma.

Exame DIRECTO Se possvel devem ser feitos esfregaos para colorao de Gram a partir do material colhido pelos diferentes mtodos, sendo o Gram feito a partir da suspenso ou aps esmagamento do tecido crneo.

Exame CULTURAL - a amostra colhida deve ser semeada em:

Meios slidos - Gelose sangue - Gelose chocolate - Outros, de acordo com a suspeita clnica Meio lquido - BHI ou Todd-Hewitt Os pequenos fragmentos de bipsia podem ser semeados directamente em meio lquido. Incubao a 35 C em aerobiose durante 18-24 h. Sub-cultura dos meios lquidos de acordo com os agentes isolados nas culturas primrias.

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3.4. ENDOFTALMITE a mais grave infeco do olho. uma inflamao da cavidade ocular e tecido intraocular e pode ocorrer por via exgena, endgena ou por contiguidade. Principais agentes de infeco Endoftalmites ps cirrgicas Staphylococcus aureus Staphylococcus coagulase-negativo Streptococcus pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Enterobacteriaceae

Endoftalmites ps traumticas Bacillus spp Clostridium spp

Endoftalmites endgenas Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

Colheita da amostra Devido dificuldade da colheita, o laboratrio deve ser previamente contactado A colheita cirrgica, efectuada pelo oftalmologista. As seringas contendo o produto aspirado devero ser fechadas e enviadas de imediato ao Laboratrio de Microbiologia.

Exame DIRECTO Se o volume da amostra for suficiente, efectuar esfregao para colorao de Gram.

Exame CULTURAL Em meios lquidos e slidos como em 3.3 e efectuar tambm cultura em anaerobiose, quando indicado.

Nota - no diagnstico das infeces oculares graves como as queratites e endoftalmites, devem ser feitas hemoculturas.

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3.5. CELULITE ORBITRIA uma infeco sistmica e grave que envolve o tecido orbitrio resultante de trauma, cirurgia, extenso de infeco a partir do etmide ou seios perinasais ou disseminao hematognea. Principais agentes de infeco Infeco ps cirrgica Staphylococcus aureus

Infeco ps trauma - Infeco mista por aerbios e anaerbios Infeco associada a sinusite Haemophylus influenzae Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Bacilos Gram negativo

Colheita da amostra Deve ser feita pelo oftalmologista Desinfectar a pele com soluo alcolica iodada. Nas leses fechadas, se possvel colher o material purulento com agulha e seringa. Se existir ferida cirrgica ou traumtica, limpar a ferida com soro fisiolgico esterilizado e colher a amostra com zaragatoa. Enviar a amostra ao Laboratrio em meio de transporte para aerbios.

Exame DIRECTO Efectuar esfregao a partir do material colhido para colorao de Gram.

Exame CULTURAL Efectuar em meios lquidos e slidos como em 3.3., e tambm cultura em anaerobiose quando indicado.

3.6. INFECES do APARELHO LACRIMAL

3.6.1. DACRIOADENITE / DACRIOCISTITE A dacrioadenite uma infeco das glndulas lacrimais em que os principais agentes so: Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae

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A dacriocistite uma infeco do saco lacrimal, que ocorre habitualmente por obstruo do canal lacrimal. Os principais agentes so : Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Haemophylus influenzae

Colheita da amostra No deve ser efectuada atravs de puno da glndula lacrimal. Colher exsudado com zaragatoa de algodo ou alginato de clcio .

Exame DIRECTO Efectuar esfregao para colorao de Gram.

Exame CULTURAL como em 3.3

3.6.2. CANALICULITE Inflamao do canal lacrimal, frequentemente associada a obstruo do mesmo. A maior parte das infeces so devidas a anaerbios, embora possam ocorrer infeces mistas por aerbios e anaerbios. Os principais agentes so: Actinomyces israelii Propionibacterium propionicus Moraxella catarrhalis Difteroides Streptococcus viridans

Colheita da amostra Por compresso da plpebra e canalculos. Grnulos sulfurosos podem ser esmagados numa lmina para colorao.

Exame DIRECTO Efectuar esfregao para colorao de Gram.

Exame CULTURAL Gelose sangue Gelose-chocolate Meio para fungos Meio de carne cozida ou de Thioglicolato

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EXSUDADOS PURULENTOS

1. INTRODUO

Muitas so as situaes clnicas e muitos so os respectivos microrganismos responsveis por infeces localizadas que conduzem formao de exsudados purulentos, colectados ou no. No Quadro n. 1 exemplificam-se alguns microrganismos e respectivas potenciais localizaes da infeco. Assim, devido s mltiplas variveis envolvidas, a metodologia para o estudo microbiolgico de qualquer exsudado purulento tem de ter em considerao: 1. 2. 3. 4. Local da infeco Histria clnica, nomeadamente dados epidemiolgicos. Tipo de infeco (abcedada ou no) Modo de colheita

Perante a variedade de situaes clnicas e de agentes microbianos implicados, os procedimentos que se desenvolvem a seguir dizem respeito metodologia geralmente aplicada para a maioria das situaes. No se pode excluir portanto a necessidade de mtodos especficos quando a situao nosolgica indique a probabilidade de se tratar de agente especfico, por ex. pesquisa de bactrias anaerbias, devendo ento reportarmo-nos seco respectiva. A pesquisa de micobactrias ou fungos tm metodologia prpria que no est includa neste manual .

2. COLHEITA e TRANSPORTE das AMOSTRAS 2.1. Normas GERAIS Todas as amostras tm de ser identificadas com os dados demogrficos do doente, data e hora da colheita, identificao do produto, local anatmico da colheita (quando no seja implcito na denominao do produto biolgico). Estes dados condicionam a metodologia laboratorial a utilizar. Toda a amostra tem de se colocar em contentor esterilizado. Eventualmente o produto pode ser enviado ao laboratrio na prpria seringa com que foi colhido, SEMPRE APS RETIRAR A AGULHA e desde que exista forma de fechar a seringa com tampa estril no perfurante ou cortante. O transporte ao laboratrio e respectivo processamento deve ser o mais rpido possvel, no mximo at duas horas aps a colheita. As amostras que no so transportadas rapidamente ao laboratrio, que estejam contaminadas com flora mista da pele, ou ainda que contenham microrganismos de

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colonizao, conduzem a falsos resultados com o consequente diagnstico clnico e respectiva teraputica incorrectos. Os melhores produtos para o isolamento do agente etiolgico so os exsudados colectados ou bipsias tecidulares.

2.2. Exsudados de leses fechadas: A colheita dos exsudados profundos deve ser realizada por puno e aspirao com agulha e seringa. NO devem ser usadas zaragatoas para a colheita de amostras provenientes deste tipo de leses. Quando se realiza por puno, a pele deve ser desinfectada com mistura anti-sptica alcolica (para evitar a contaminao com flora extrnseca ou indgena).

2.3. Exsudados de leses abertas: Quando no h alternativa e se tem de colher com zaragatoa, esta deve ser colocada em meio de transporte (Stuart ou Amies). NO USAR ZARAGATOAS SECAS.

2.4. Material tecidular / Bipsia Colher de forma assptica uma pequena quantidade de tecido (no superior a cerca de 0,5 cm de dimetro). Leses abertas - lavar com lquido estril (gua destilada ou soro fisiolgico), remover o tecido necrosado e fazer a bipsia das leses mais profundas e com sinais de infeco. Leses fechadas - realizar de acordo com o procedimento cirrgico. Colocar a amostra num tubo esterilizado seco e enviar imediatamente ao laboratrio. Estabelecer de acordo com o laboratrio, metodologia diferente de colheita e transporte em produtos particulares.

2.5. Exsudado de lceras de presso (escaras) ou vasculares (lceras varicosas) Estas amostras tm em si uma grande quantidade de tecidos necrosados o que favorece a colonizao com mltiplas estirpes bacterianas, com a consequente dificuldade de determinar o agente etiolgico. Este exame s tem interesse se conduzir a informao clnica relevante no mais curto espao de tempo. O laboratrio tem de fornecer normas de colheita com o objectivo de evitar a contaminao com flora indgena da pele. Distinguir, na valorizao das culturas, microrganismos da pele ou contaminantes, dos agentes potencialmente patognicos.

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S realizar a identificao e teste de sensibilidade aos antimicrobianos dos agentes isolados em amostras colhidas correctamente e em bactrias consideradas como agentes etiolgicos de infeco. Sempre que possvel fazer colheita de biopsia tecidular, aps ter feito a limpeza da ferida como indicado em 2.4. Quando no possvel fazer bipsia colher o exsudado superficial com auxlio de zaragatoa, colocar em meio de transporte e enviar rapidamente ao laboratrio

3. PROCESSAMENTO LABORATORIAL 3.1. Material colhido por ASPIRAO 3.1.1. Exame DIRECTO Colorao de Gram Colorao de Ziehl-Neelsen - eventual Colorao simples (azul de metileno) - eventual

3.1.2. Exame CULTURAL Meios slidos - Gelose sangue - Meio selectivo para bactrias Gram negativo (ex.: MacConkey) - Meio selectivo para bactrias Gram positivo (ex.: Azido de Sdio, ANC) - Meio selectivo para isolamento de Staphylococcus sp. - eventual - Outros de acordo com a suspeita clnica (por ex. Meios selectivos para isolamento de Haemophilus sp. ou Neisseria sp., etc.) Meios lquidos (enriquecimento) - BHI (Brain Hearth Infusion) ou meio Todd-Hewitt com sangue, ou outro. - Meio de carne cozida (seleccionar um ou dois destes meios) Incubao a 35 C, aerobiose, 18-24 horas. Efectuar sub-cultura dos meios lquidos para meios slidos de acordo com o produto biolgico, o tipo morfolgico das bactrias observadas no exame directo, e/ou agentes isolados nas culturas iniciais. Se suspeita de anaerbios, vide seco respectiva do manual.

3.2. Material colhido com ZARAGATOA Colocar a zaragatoa em 0,5 ml de caldo (BHI, Triptose ou Todd-Hewitt) e agitar com auxlio de agitador mecnico (vortex). Com a suspenso obtida, realizar o procedimento como descrito em 3.1.

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3.3. Material TECIDULAR / BIPSIA Triturar a amostra com auxlio de frasco com prolas ( ou outro mtodo disponvel). Restante procedimento como em 3.1.

3.4. Exsudado de LCERAS de presso (escaras) ou vasculares (lceras varicosas) Exame CULTURAL - Gelose sangue - Meio selectivo para isolamento de bactrias Gram negativo (ex: MacConkey) - Meio selectivo para isolamento de bactrias Gram positivo(Azido de Sdio, ANC) Restante procedimento como em 3.1.

(c/ dimenses que no permitem homogeneizao)

BIPSIAS CIRRGICAS MATERIAL PROTSICO

( Vlvulas cardacas, fragmentos vasculares e sseos ) 1. Colheita no Bloco Operatrio Colocar em contentor estril de boca larga e enviar de imediato ao laboratrio. No laboratrio em condies de asspsia adicionar meio lquido (ex.: BHI). Em alternativa - ainda no bloco operatrio colocar a bipsia em frasco de boca larga com meio BHI previamente fornecido pelo laboratrio. Enviar de imediato para incubao e processamento laboratorial.

2. Processamento Incubar 35 C at 12 dias. Observar diariamente a turvao. Se sobrenadante turvo, sub-cultivar em gelose sangue e realizar um esfregao da cultura para colorao de Gram. Se lmpido at ao 12 dia, realizar uma passagem cega para gelose sangue e realizar esfregao para colorao de Gram.

CATETERES VASCULARES (mtodo de Maki)

O objectivo avaliar a possibilidade da responsabilidade do catter como origem de um quadro de bacterimia. 1. Colheita e Transporte Colher, de veia perifrica no cateterizada, sangue para hemocultura, imediatamente antes da retirada do cateter Retirar o penso e desinfectar com anti-sptico alcolico a porta de entrada do catter. Colher assepticamente os 5 cm distais do cateter. Colocar num recipiente estril e seco.

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Enviar imediatamente ao laboratrio.

2. Processamento Assepticamente remover o catter e coloc-lo na superfcie de uma placa de gelose sangue. Rodar o cateter na superfcie do meio de cultura com auxlio de uma vareta esterilizada. Incubar a 35 C. Se desenvolvimento > 15 colnias valorizar e identificar. Correlacionar os isolamentos da cultura do catter, com o resultado da hemocultura concomitante. Quadro 1 Lista parcial de agentes bacterianos detectados em infeces da pele e tecido celular subcutneo: Microrganismo Infeco ou Sindroma Actinobacillus actinomycetemcomitans Leses actinomicticas Aeromonas spp. Feridas Capnocytophaga spp. Abcessos Chromobacterium violaceum Abcessos Corynebacterium jeikeium Feridas; Infeces de catteres Capnocytophaga canimorsus Feridas de mordedura de co Eikenella corrodens Infeces de tecidos moles; mordedura humana Feridas; Feridas crnicas e/ou profundas; Enterobacteriaceae leses de queimaduras. Enterococcus spp. Feridas; leses de queimaduras. Erysipelothrix rhusiopathiae Erisipelide Leses cutneas associadas com infeces Haemophilus influenzae sistmicas Kingella kingae Infeces sseas ou de articulaes Flora oral Feridas de mordeduras Leses cutneas associadas com infeces Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis sistmicas Nocardia spp. Abcessos cutneos ou sub-cutneos Pasteurella multocida Mordedura de animais; osteomielite. Pseudomonas aeruginosa Feridas; leses de queimadura; furunculose; Infeces eritematosas superficiais; infeces Staphylococcus aureus profundas; abcessos; leses de queimadura; feridas; furnculos. Staphylococcus spp. coagulase negativo Catteres Infeces eritematosas superficiais; infeces Streptococcus pyogenes (Grupo A) profundas; abcessos; leses de queimadura; feridas; furnculos; necrose muscular. Streptococcus spp. beta-hemolitico Feridas Streptococcus spp. grupo viridans Feridas; catteres; mordeduras. Streptococcus moniliformis Mordedura de animais Vibrio vulnificus Feridas; necrose muscular (Quadro adaptado de Isenberg, H.D. (ed.) 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology, Washington, D.C.)

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Interpretao sumria dos resultados:

Deve realizar-se a Identificao e Teste de Susceptibilidade aos antimicrobianos em:

1. Estirpes com grande probabilidade de serem agentes patognicos, independentemente do nmero presente: Streptococcus beta-hemoltico do Grupo A de Lancefield, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. 2. Agentes potencialmente imprevisvel. patognicos com susceptibilidade aos antimicrobianos

3. Microrganismos isolados de doentes com infeces associadas a catteres e de locais normalmente estreis. Agentes provavelmente contaminantes da pele: (Geralmente no responsveis por infeco)

1. Staphylococcus coagulase negativo, Streptococcus viridans, Bacillus spp., difterides. 2. Excepo - microrganismos isolados em cultura pura e observados no exame directo (Colorao de Gram) No devem ser valorizados clinicamente:

Quando esto presentes mais do que trs espcies microbianas (particularmente da flora intestinal) de locais como abcessos abdominais, liquido peritoneal, rea plvica, abcessos ou fstulas peri-anais, lceras de decbito, lceras vasculares (varicosas).

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EXAME BACTERIOLGICO DAS FEZES

1. INTRODUO

As infeces do aparelho gastrointestinal tm uma alta incidncia na populao em geral, com grande morbilidade em determinados grupos etrios (crianas e velhos). Os microrganismos responsveis por esta infeco, tm vindo a alterar-se devido a vrios factores tais como o aumento dos movimentos migracionais, maior frequncia de viagens intercontinentais, aumento do nmero de doentes imunodeprimidos e o desenvolvimento de mtodos de diagnstico cada vez mais sensveis. Os antecedentes epidemiolgicos, a existncia de factores predisponentes, a presena de sinais e sintomas clnicos e o tipo de diarreia devem orientar na pesquisa do agente etiolgico.

2. AMOSTRAS 2.1. COLHEITA Devem ser obtidas at um total de trs amostras de fezes (cerca de 1 a 2 Gramas tamanho de uma noz), colhidas em dias diferentes. Se possvel escolher uma poro com muco, pus ou sangue. Para pesquisa de toxina de Clostridium difficile s devero ser enviadas fezes diarreicas. Exsudado rectal (para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae ou em casos seleccionados para pesquisa de colonizao intestinal ex: Enterococcus spp resistentes vancomicina )

2.2. TRANSPORTE Colocar as fezes em meio de transporte de Cary Blair ou meio de glicerol tamponado salino. Em situaes em que no exista disponibilidade de meio de transporte, as amostras devem ser processadas at 2 horas aps a sua emisso. As zaragatoas para pesquisa de Neisseria gonorrhoeae devero ser colocadas em meio de transporte com carvo. Nota - No processar amostras contaminadas com urina.

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3. MEIOS de CULTURA MacConkey Meios selectivos para Salmonella e Shigella - meio SS , meio Hektoen Meio selectivo para Campylobacter spp. Meio selectivo para Yersinia enterocoltica Caldos de enriquecimento para Salmonella e Shigella spp. - meio de Selenito F, meio GN e meio de Tetrationato

4. PROCEDIMENTOS 4.1. Exame CULTURAL Por rotina devem ser pesquisados Salmonella spp, Shigella spp, e Campylobacter spp. Para alm das bactrias acima assinaladas, cada laboratrio deve determinar as bactrias que pesquisa por rotina de acordo com a situao geogrfica e epidemiolgica. Meios de cultura a. Meio de MacConkey b. Meio selectivo para Salmonella spp e Shigella spp ex.: meio SS, meio de Hektoen. c. Meio selectivo para Campylobacter spp d. Meio de enriquecimento para Salmonella spp e Shigella spp ex: meio de Selenito F, meio GN e meio de tetrationato. Inocular os meios de MacConkey, os meios selectivos para Salmonella spp e Shigella spp e os meios de enriquecimento em atmosfera de aerobiose, a 35 C, durante 18 a 24 horas. Inocular o meio selectivo para Campylobacter spp. e incubar em atmosfera de microaerofilia (5% de O2, 10% deCO2, e 85% de N2), a 42C, durante 48 a 72 horas. Aps 12 horas de incubao dos meios de enriquecimento, efectuar subculturas para meio de MacConkey e eventualmente para outros meios selectivos.

4.2. PROCEDIMENTOS ESPECIAIS Vibrio spp So capazes de crescer nos meios de rotina. Meio selectivo TCBS (incubar a 35 C, 18 a 24 horas em aerobiose) Agua peptonada alcalina incubar a 35 C em aerobiose e efectuar subcultura s 6 ou 12 horas para TCBS.

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Yersinia spp Meio selectivo CYN ( Cefsulodina, irgasan, novobiocina ) Incubar a 35C, 18 a 24 horas em aerobiose.

Clostridium difficile Na suspeita de colite pseudomembranosa efectuar pesquisa de toxina A, em fezes diarricas.

Escherichia coli enterohemorrgica O157- H7 Meio selectivo MacConkey Sorbitol Incubar a 35C, 18 a 24 horas em aerobiose.

. 5. IDENTIFICAO

5.1. Identificao de Salmonella ou Shigella spp. Das colnias no fermentadoras de lactose com ou sem produo de H2S, efectuar: Subcultura para TSI (superfcie e profundidade) e Ureia Observao do TSI e Ureia no dia seguinte e se padro compatvel com Salmonella spp e Shigella spp, efectuar identificao bioqumica e posterior identificao serolgica.

Nota: Se o Laboratrio no tem possibilidade de efectuar identificao serolgica, dever enviar as estirpes para Laboratrio de Referncia.

5.2. Identificao de Campylobacter spp. Observar as placas s 24 e 48 horas, e das colnias suspeitas efectuar esfregao e corar com Safranina ou Fucsina durante 1 a 3 minutos, para observao da morfologia bacteriana (pequenos bacilos curvos, em S ou em asa de gaivota). Teste da oxidase Teste do hipurato Susceptibilidade ao Ac. nalidxico (30 g) e cefalotina (30 g) (j esto descritas estirpes resistentes) ou Testes bioqumicos comercializados

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5.2. Identificao de Vibrio spp. Observao da cultura e das colnias suspeitas realizar identificao bioqumica. Enviar estirpes para confirmao serolgica em Laboratrio de Referncia.

5.3. Identificao de Yersinia spp Observao da cultura e das colnias suspeitas realizar identificao bioqumica

5.4. Identificao de E.coli enterohemorrgica O157:H7 Do meio MacConkey sorbitol, isolar as colnias no fermentadoras de sorbitol. Identificao bioqumica Confirmao serolgica

5.5. Pesquisa de toxina de Clostridium difficile O teste de referncia a pesquisa de toxina B por cultura de tecidos, mas como muitos laboratrios no tem possibilidade de fazer cultura de tecidos existem outros testes alternativos. Teste de aglutinao em ltex - detecta uma protena no toxina associada ao Clostridium difficile e d resultados falsos positivos com outros Clostridium, Peptoestreptococcus e Bacteroides assacaroliticos. Deteco de Enterotoxina (Toxina A) - existem diversos mtodos comercializados para detectar a toxina nas fezes.

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APARELHO GENITAL

1. INTRODUO A determinao de amostras apropriadas para o diagnstico de infeces do aparelho genital depende do local de infeco e dos microrganismos. Algumas infeces do aparelho genital feminino so devidas a microrganismos endgenos cuja patogenicidade activada por factores do hospedeiro ou por desequilbrio da flora saprfita. obrigatria a informao sobre o tipo de amostra, data de colheita, idade e uma breve histria clnica.

2. AMOSTRAS 2.1. Aparelho genital feminino Exsudado vaginal / endocervical Exsudado uretral Exsudado rectal Endomtrio Abcessos ( Fundos de saco, Trompas, Gl. Bartholin ) Lquido amnitico lceras genitais

2.2. Aparelho genital masculino Exsudado uretral Exsudado rectal lceras genitais Epiddimo Prstata Testculos

2.3. Amostras para o estudo de Chlamydia trachomatis e de Mycoplasma / Ureoplasma

3. COLHEITA E TRANSPORTE APARELHO GENITAL FEMININO 1. Exsudado endocervical Introduzir o espculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiolgico estril. Limpar o orifcio externo do endocolo com compressa esterilizada. Introduzir uma zaragatoa de alginato de clcio ou dacron, cerca de 1 cm no endocolo e rodar.

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Colocar em meio de transporte com carvo Repetir a operao com uma 2 zaragatoa e efectuar esfregao aps o acto da colheita. O envio da amostra deve ser imediato.

2. Exsudado vaginal Introduzir o espculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiolgico estril. Colher o exsudado do fundo de saco posterior e/ou paredes vaginais com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa e efectuar esfregao aps o acto da colheita.

3. Exsudado uretral Se possvel antes da 1 mico. Se no possvel, esperar pelo menos uma hora aps a ltima mico. Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze esterilizada. Introduzir uma zaragatoa fina e flexvel com um movimento de rotao cerca de 1 cm dentro da uretra, para o exame directo. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa, para o exame cultural. Colocar em meio de transporte com carvo.

4. Exsudado rectal Introduzir uma zaragatoa suavemente atravs do esfncter anal. Rodar contra as criptas rectais, deixar 10-30 segundos para fixar os microrganismos e retirar. Evitar o contacto com matria fecal. Quando a zaragatoa ficar contaminada com fezes, deve obter-se nova amostra. Introduzir a amostra em meio de transporte com carvo, que se deve manter temperatura ambiente.

5. Endomtrio Aspirao uterina atravs de catter aps prvia dilatao e descontaminao do crvix. Enviar a amostra em recipiente estril. No caso de suspeita de anaerbios, transporte adequado. recomendvel realizar simultaneamente hemoculturas.

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6. Abcessos ( Fundos de saco, Trompas, Gl. Bartholin ) Colheita cirrgica por aspirao (no caso da Gl. Bartholin, descontaminar a pele com desinfectante no alcolico). Enviar de imediato amostra at 5 ml num recipiente estril e no caso de se suspeitar de anaerbios, em meio de transporte adequado.

7. Lquido amnitico Colheita cirrgica Enviar rpidamente a amostra, at 5 ml, ao laboratrio em tubo estril e/ou meio de transporte de anaerbios.

8. lceras genitais Contactar previamente o laboratrio de Microbiologia. Treponema pallidum - Limpar a superfcie da leso com gazes humedecidas em soluo salina. Remover a crosta se presente, evitando sangrar. Pressionar a base da leso at surgir um fluido claro e colher com uma pipeta Pasteur ou capilar. Colocar uma gota numa lmina, cobrir com lamela e examinar imediatamente em microscpio de fundo escuro. Haemophilus ducrey - Limpar a superfcie da leso com soluo salina. Fazer a colheita por aspirao com uma pipeta Pasteur ou com zaragatoa embebida em soluo salina. Cultivar imediatamente em gelose chocolate enriquecida e suplementos antibiticos.

NOTA: Dispositivo intra-uterino D.I.U. - no produto para a realizao de exame microbiolgico.

APARELHO GENITAL MASCULINO 1. Exsudado uretral Fazer a expresso da uretra A amostra deve colher-se antes da 1 mico da manh. Se no possvel, esperar pelo menos uma hora aps a ltima mico. Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze estril. Introduzir uma zaragatoa fina e flexvel com um movimento de rotao at 2 cm dentro da uretra, para o exame directo a realizar no acto da colheita. Repetir a operao com uma 2 zaragatoa para o exame cultural, que se deve introduzir em meio de transporte com carvo e manter temperatura ambiente. O envio das amostras deve ser imediato.

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2. Exsudado rectal Idntico procedimento ao do aparelho genital feminino.

3. Abcessos ( Epiddimo, Prstata, Testculos ) Colheita cirrgica Introduzir o aspirado at 5 ml em meio de transporte adequado.

4. lceras genitais Idntico procedimento ao do aparelho genital feminino

AMOSTRAS PARA O ESTUDO de CHLAMYDIA TRACHOMATIS e MYCOPLASMA Para o estudo da Chlamydia trachomatis e Mycoplasma devem seguir-se as indicaes de cada kit, j que a colheita de amostras, meios de transporte e conservao dependem da tcnica utilizada. Chlamydia trachomatis Os mtodos culturais so mais sensveis e especficos, mas devido sua complexidade e custo no so efectuados na rotina da maior parte dos laboratrios. Os mtodos no culturais incluem a pesquisa de corpos elementares, antignios, c. nucleicos, por tcnicas de imunofluorescncia directa, EIA ou sondas de c. nucleicos. As amostras adequadas no so as secrees vaginais, mas sim os raspados, j que a Chlamydia trachomatis afecta as clulas do epitlio cilndrico. No so adequadas amostras vaginais. Esfregao endocervical - Remover o excesso de muco com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron. Inserir uma nova zaragatoa no canal endocervical e rodar. Evitar contacto com a mucosa vaginal. Transportar e conservar a amostra de acordo com a fonte comercial utilizada. Esfregao uretral - Limpar qualquer exsudado. Inserir uma zaragatoa fina 2 a 4 cm na uretra e rodar. O doente no deve urinar pelo menos 1 hora antes da colheita. Restantes procedimentos iguais ao exsudado endocervical.

Nota - Nas tcnicas de imunofluorescncia, as preparaes so realizadas no momento da colheita. Mycoplasma / Ureoplasma Amostras - exsudado vaginal, cervical ou uretral. Colher a amostra com zaragatoa de alginato de clcio ou dacron e proceder de acordo com as indicaes do fabricante.

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4. PROCEDIMENTOS 4.1. Exame DIRECTO - A fresco - observar a presena ou no de Trichomonas vaginalis e de elementos leveduriformes. - Aps colorao - corar o esfregao pelo mtodo de Gram e pelo Giemsa (opcional ) e descrever a flora existente 4.2. Exame CULTURAL - semear os produtos em:
GS GC polyViteX
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

M. N. gono.
X X X

M. Anaerbios

Sabouraud
X

Mulher
Endocrvix Endomtrio Gl. Bartholin L. Amnitico Recto Trompas Uretra Vagina
X X X X X X X X X X X X X X X X

Homem
Epiddimo Prstata Recto Testculos Uretra

GS (Gelose sangue) - incubar em aerobiose a 35C - 37C, durante 48 horas, com obs. s 24 e 48 horas. GC polyvitex ( Gelose chocolate com polyvitex ) - incubar em atmosfera de 5 a 7 % de CO2 a 35C - 37C, durante 48 horas, com observao s 24 e 48 horas. M.N. gono. ( Meio de Neisseria gonorrhoae - VCAT, NYC, Thayer - Martin ) - incubar em atmosfera de 5 a 7 % de CO2 a 35C - 37C, durante 72 horas, com observao s 24, 48 e 72 horas. M.Anaerbios ( Meio para pesquisa de anaerbios ) - incubar em anaerobiose a 35C - 37C, durante 6 dias, com observao inicial s 48 horas e depois de 2 em 2 dias. Sabouraud ( Meio de Sabouraud ) - Incubar em aerobiose a 30C, durante 5 dias, com observao s 24 e 48 horas.

5. VALORIZAO CLNICA DAS INFECES DO APARELHO GENITAL FEMININO A valorizao clnica das culturas efectuada de acordo com a informao clnica e o exame directo.

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Assim, deve-se pesquisar por rotina : Vulvo-vaginites -

- diagnstico essencialmente morfolgico (nomeadamente a presena de clue cells). Eventualmente pesquisa de Gardnerella vaginalis, Mobilluncus sp. - associado ao uso de DIU Actinomyces spp. Listeria monocytogenes - em abortos de repetio e infeces neonatais Staphylococcus aureus - associado ao uso de tampes Streptococcus agalactiae - valorizar em grvidas

Candida albicans Trichomonas vaginalis Vaginose bacteriana

Endocervicites Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoae S. agalactiae Actinomyces spp.

- grvidas - assoc. ao DIU

Uretrite Neisseriae gonorrhoae

Recto Neisseriae gonorrhoae Chlamydia trachomatis

Endomtrio (D. Inflamatria Plvica) Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoae

Endometrite (ps - parto) Bactrias anaerbias E. coli Enteroccocus G. vaginalis Streptoccocus agalactiae

Trompas Neisseria gonorrhoae Chlamydia trachomatis Bacteroides spp.

lceras genitais (no efectuados por rotina) Chlamydia trachomatis Haemophilus ducrey Treponema pallidum

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Lquido amnitico Bacteroides spp. Fusobacterium spp. E. coli G. vaginalis S. agalactiae U. urealyticum

Glndula de Bartholin Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoae E. coli Proteus mirabilis U. urealyticum

6. VALORIZAO CLNICA DAS INFECES DO TRACTO GENITAL MASCULINO Pesquisar por rotina Uretrite Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoae

Recto Chlamydia trachomatis Neisseriae gonorrhoae

lceras genitais Chlamydia trachomatis Haemophilus ducrey Treponema pallidum

Epididimite Chlamydia trachomatis Neisseriae gonorrhoae

Prostatite Enterobacteriaceae Pseudomonas spp.

Orquite Enterobacteriaceae Pseudomonas spp

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PROCESSAMENTO GERAL DOS PRODUTOS BIOLGICOS PARA PESQUISA DE BACTRIAS ANAERBIAS

1. INTRODUO A metodologia de trabalho para o diagnstico laboratorial das infeces por bactrias anaerbias complexa e dispendiosa, mas perfeitamente padronizada, de tal modo que, hoje, possvel proceder ao isolamento e identificao destas bactrias, na maior parte dos laboratrios de Microbiologia Clnica. A maioria das infeces por bactrias anaerbias so endgenas, polimicrobianas, envolvendo vrias espcies de bactrias anaerbias e facultativas das mucosas prximas ao local de infeco. Estas bactrias podem ser responsveis por qualquer tipo de infeco, apresentando porm, uma prevalncia muito varivel (por ex. 5% das bacterimias, 80% dos abcessos cerebrais, etc.). O conhecimento da flora comensal das diferentes regies das mucosas possibilita ao microbiologista desenvolver as estratgias mais adequadas ao diagnstico laboratorial. O diagnstico laboratorial das infeces por bactrias anaerbias, envolve um conjunto de procedimentos que se baseiam em trs pilares fundamentais: a qualidade dos produtos, a rapidez do transporte ao laboratrio e a correco dos procedimentos laboratoriais.

2. COLHEITA e TRANSPORTE DAS AMOSTRAS BIOLGICAS A qualidade da colheita e o transporte dos produtos so essenciais para o diagnstico, uma vez que o nmero de anaerbios isolados, assim como o seu significado clnico, esto estreitamente relacionados com estes procedimentos. 2.1. Colheita A amostra deve ser obtida por aspirao ou bipsia e colhido de modo a evitar a contaminao com a flora comensal, associada ao local de infeco. A utilizao de zaragatoas como mtodo de colheita no aconselhada.

2.2. Transporte Deve ser rpido, de forma a preservar a viabilidade das bactrias e as propores relativas das populaes bacterianas nos produtos. Para isso, aconselhada a utilizao de meios de transporte. So geralmente constitudos por um meio semi-slido pr-reduzido e esterilizado em recipiente prprio, com uma atmosfera sem oxignio e que contm um indicador de oxidao-reduo. Assim fundamental: Utilizar sempre meio de transporte para o envio das produtos. Conservar os produtos temperatura ambiente at serem processados.

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Os produtos provenientes de curetagens, bipsias ou tecidos devem ser enviados em recipientes esterilizados, e colocados imediatamente numa atmosfera de anaerobiose (por exemplo Bio Bag, Gas Pack etc.) Os produtos colhidos em zaragatoas (apesar de pouco recomendveis) devem ser enviados em meios de transporte apropriados (ex: BBL Anaerobe Systems etc.). No enviar produtos em seringa com agulha, picadas, aquando do seu manuseamento. pelo risco de acidentes de trabalho,

3. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS Apenas devem ser processadas as amostras adequadas. Aconselha-se a execuo de triagem prvia, atendendo aos seguintes critrios: natureza do produto, modo de colheita, transporte etc Nunca processar : Exsudados colhidos com zaragatoa das seguintes regies: naso e orofaringe, face interna da boca, gengiva, vagina, crvix, uretra, recto, e de lceras superficiais da pele. Expectorao, expectorao induzida, lavado e aspirado brnquico Urina (excepto puno suprapbica) e fezes (excepto para C. difficille) Contedo gstrico ou do intestino delgado.

3.1 - Exame DIRECTO Exame macroscpico - pesquisar sinais sugestivos de infeco por bactrias anaerbias: sangue, aspecto purulento, cheiro ftido, tecidos necrosados, presena de gs, fluorescncia luz ultra violeta, etc. Exame microscpico - observao de esfregao do produto corado pelo mtodo de Gram. Aconselha-se a fixao do esfregao com metanol e recomenda-se a utilizao da fucsina bsica como corante de contraste. O exame microscpico pode fornecer diversos tipos de informao, tais como: Qualidade da amostra Nmero e tipo de microrganismos presentes no produto Identificao presuntiva (correlao da morfologia bacteriana com o tipo de amostra) Deficincias na metodologia utilizada (colheita, transporte, processamento dos produtos), traduzida por incapacidade de recuperao no exame cultural de todos os microrganismos observados no exame microscpico directo. Sugerir a necessidade de utilizao de meios de cultura adicionais e de outras metodologias: cromatografia gs-lquida, tcnicas de imunofluorescncia, etc.

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3.2. EXAME CULTURAL Uma informao clnica completa (tipo de infeco, doenas subjacentes, teraputica antimicrobiana) combinada com a informao obtida do exame macroscpico e microscpico, essencial, ao microbiologista, na escolha dos meios de cultura a utilizar para as sementeiras primrias. 3.2.1. Preparao e sementeira da amostra O processamento da amostra deve ser realizado em cmara de anaerobiose. Se tal no for possvel, o tempo de processamento em aerobiose, no dever ultrapassar os 20 minutos.

Preparao da amostra: Produtos purulentos devem ser homogenizados no agitador vertical (vortex) Produtos de tecidos (moles ou sseos) devem ser colocadas em 1ml de meio lquido pr-reduzido (caldo de tioglicolato ou carne cozida), e triturados at obteno de uma amostra homognea. Produtos enviados em zaragatoas mergulhar em 0,5 ml de meio lquido prreduzido, agitar no vrtex e proceder de seguida ao processamento da amostra.

Sementeira da amostra: Meios de cultura slidos semear cada um dos meios em duplicado: - Produtos purulentos - uma gota de produto por placa - Produtos no purulentos 2 a 3 gotas do produto por placa. Meios de cultura lquidos semear 0,5 / 1 ml de produto.

Incubar de imediato em atmosfera de anaerobiose (cmara, jarras, bolsas de anaerobiose) a 35 - 37C durante 7 dias . As culturas devem ser observadas s 48 horas. Os meios selectivos como o BBE (Bacteroides Bile Esculina) e EYA (Gelose Gema de ovo) podem ser observados s 24 horas. Nota - a aplicao de discos impregnados com Kanamicina 1000g e Penicilina 2 U. respectivamente, no 1 quadrante dos meios enriquecidos no selectivos, constitui um precioso auxlio na interpretao do exame cultural 3.2.2. MEIOS de CULTURA

As bactrias anaerbias so por via de regra nutricionalmente muito exigentes, requerendo meios de cultura com base de gelose sangue, suplementados com vitaminas, coenzimas e factores de crescimento. A preparao dos meios de cultura e as condies de armazenamento dos mesmos, so cruciais para o xito na sua utilizao. Os meios devem ser frescos (at 24 - 48 horas aps preparao) e conservados em atmosfera de anaerobiose. recomendado proceder pr-reduo dos meios de cultura primrios, sempre que no haja possibilidade da utilizao de meios frescos.

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Na prtica, dada a diversidade das exigncias nutricionais das bactrias anaerbias e a natureza polimicrobiana das infeces, aconselha-se o uso de meios nutritivos gerais enriquecidos no selectivos e selectivos, o que, para alm de aumentar a taxa de isolamento, proporciona uma economia de tempo, uma vez que facilitam o reconhecimento e isolamento de diferentes microrganismos .

A - Meios slidos NO SELECTIVOS (enriquecidos) Geralmente so meios gelosados enriquecidos com sangue de carneiro (5%), menadiona (1 g/ ml), hemina (5 g/ ml) com uma base varivel (Columbia, Brucella, Schaedler, Brain Heart Infusion, Wilkins Chalgren, etc.). B - Meios slidos SELECTIVOS Meios gelosados com agentes selectivos incorporados (antibiticos, bile etc.). H mltiplos meios selectivos, no existindo porm unanimidade quanto sua utilizao. O ideal combinar a utilizao de dois ou trs destes meios. So de uso comum: Gelose sangue neomicina (75 mg/L) : inibe o crescimento dos bacilos Gram negativo aerbios. Gelose sangue lacado com Kanamicina (75 mg/L) e Vancomicina (7,5mg/L) selectivo para Bacteroides spp e Prevotella spp. Gelose bile esculina (BBE) com ou sem gentamicina (100mg/L): selectivo para Bacteroides do grupo fragilis e Bilophila wadsworthia. Gelose cicloserina-cefoxitina-frutose (CCFA): selectivo para Clostridium difficille.

C - Meios LQUIDOS: Caldo de carne cozida ( grnulos) e glicose Caldo de tioglicolato enriquecido com hemina, menadiona e carbonato de sdio.

3.2.3 SISTEMAS de INCUBAO A escolha do sistema de incubao a utilizar determinada pelo volume de trabalho, custo do equipamento e eventuais limitaes de espao. Alguns dos sistemas de incubao, so sofisticados e necessitam de equipamento complexo assim como de pessoal especializado, como o caso dos tubos rotatrios pr-reduzidos e esterilizados (PRAS) e da cmara de anaerobiose. A incubao em jarra de anaerobiose, de fcil utilizao, proporciona resultados na recuperao de bactrias anaerbias com importncia clnica, comparveis aos sistemas referidos anteriormente. 1. Jarra de anaerobiose - sistema de incubao utilizado na maior parte dos laboratrios. So recipientes hermticos, simples, onde a atmosfera de anaerobiose pode ser conseguida de vrias maneiras:

Tcnica de evacuao / substituio em desuso

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Sistema gerador de Hidrognio (ex: Gs Pack) - Este envelope constitudo por uma tablete de cido ctrico e bicarbonato de sdio, e outra de borohidrato de sdio e cloreto de cobalto. A atmosfera de anaerobiose efectuada pela adio de 10 ml de gua ao envelope. Necessita da presena de catalisador. Sistema gerador de dixido de carbono (ex: Anaerogen ) - Este envelope constitudo por cido ascrbico. No necessita de cataltico nem da adio de gua para desenvolvimento da atmosfera de anaerobiose.

2. Sistema gerador de anaerobiose em saco - podem ser utilizados, como sistema de incubao, em situaes em que apenas uma ou duas placas necessitem de ser estudadas. 3. Cmara de anaerobiose A atmosfera conseguida pelo preenchimento da cmara com uma mistura gasosa cuja composio j foi acima referida. necessrio utilizao de cataltico, que deve ser substitudo diariamente. necessrio controlar a humidade, aconselhando-se a colocao de um recipiente com cristais de gel de slica no fundo da cmara. 4. Jarra de Espera - Recipiente banhado por fluxo contnuo de azoto, onde so colocados os meios de cultura inoculados e no inoculados, por perodos curtos (no mais de uma hora) at incubao definitiva em atmosfera de anaerobiose. A monitorizao do ambiente de anaerobiose deve ser efectuado, utilizando controlos qumicos (rezasurina, azul de metileno, etc.) e controlos biolgicos (Pseudomonas aeruginosa inoculada em meio de citrato).

4. OBSERVAO das CULTURAS PRIMRIAS

A observao das culturas primrias deve ser efectuada s 48 horas. Os produtos incubados em cmara de anaerobiose podem ser observados s 24 horas. Todos os diferentes morfotipos das colnias devem ser semi-quantificados e subcultivados. Para isso: Comparar os resultados das culturas obtidas em anaerobiose com os obtidos em atmosfera com 3 a 5% de CO2. Pesquisar caractersticas macroscpicas tpicas como corroso do meio (Pitting), invaso (swarming), dupla hemlise, pigmentao etc. Pesquisar a presena de fluorescncia. Fazer o exame microscpico (Gram) dos diferentes tipos de colnias com caracterizao e registo das particularidades morfolgicas e tinturiais observadas. Executar subculturas em duplicado de todos os morfotipos, em meio no selectivo. Incubar uma das subculturas numa atmosfera com 3 a 5% de CO2 Prova de aerotolerncia).

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Fazer subculturas dos meios lquidos das sementeiras primrias sempre que: No tenha havido recuperao, nas sementeiras primrias, executadas em meios slidos, dos microrganismos observados no exame microscpico directo. Observada turvao das culturas primrias em meio lquido, sem obteno de crescimento nas culturas primrias realizadas em meios slidos.

Interpretao das culturas: Se esto presentes cinco ou mais morfotipos sugestivos de diferentes espcies de bactrias anaerbias, no efectuar qualquer tipo de estudo. Informar - presena de uma flora mista de bactrias anaerbias. Se observamos mais do que dois morfotipos de bactrias anaerbias, (at um mximo de trs), executar o exame microscpico directo (Gram) e uma prova de aerotolerncia. Informar por ex. bacilos anaerbios Gram negativo. Sempre que a cultura e o exame microscpico directo sugerir determinado microrganismo, acrescentar esse dado informao, por ex. bacilos anaerbios Gram negativo sugestivo de Fusobacterium) - Identificao nvel 1. Se existe o predomnio de um microrganismo em relao aos outros, - efectuar uma identificao parcial ou rpida (Gram, catalase, indol, TIQ ( teste de inibio pelos quimioterapicos) - Identificao nivel 2. Existncia de uma cultura pura de bactrias anaerbias - proceder ao seu estudo. Contudo a dimenso do estudo a efectuar deve ser ponderado de acordo com a situao clnica. Os cocos anaerbios devem ser sempre informados da identificao a nvel de gnero ( Ex: Peptostreptococcus spp.)

5. IDENTIFICAO A identificao das bactrias anaerobias pode ser efectuada a trs nveis, pela combinao de vrias metodologias (quadro n. 1) Quadro n. 1 Mtodos de identificao mais importantes 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Exame microscpico directo - colorao de GRAM Fluorescncia luz ultravioleta Comportamento aos antimicrobianos (TIA) Fermentao dos carbohidratos Estudos enzimticos Cromatografia gs- lquida Deteco de antignios Sondas de DNA Anlise da estrutura do peptidoglicano

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A Identificao nvel 1 Informao das culturas primrias de acordo com as necessidades da atmosfera, colorao de Gram, e caractersticas macroscpicas das colnias Identificao apenas presuntiva B Identificao nvel 2 Para alm das informaes de nvel 1, necessita da execuo de alguns testes como: teste de inibio pelos antimicrobianosos (TIA), catalase, indol spot, nitratos, urease, lipase etc, o que permite um agrupamento preliminar das bactrias, e, por vezes, mesmo uma identificao definitiva de alguns microrganismos C Identificao nvel 3 Indicada sempre que possa estar presente um microrganismo muito virulento, ou que a sua identificao seja essencial para a prescrio teraputica. Os mtodos convencionais de identificao so laboriosos com perodos de incubao longos, baseados quer na fermentao dos carbohidratos ou outras actividades bioqumicas, quer na determinao dos perfis de cidos gordos de cadeia curta, resultantes da metabolizao da glicose. Nos ltimos anos desenvolveram-se vrios sistemas alternativos de identificao A micromtodos - uns baseados na fermentao dos hidratos de carbono (API 20 , Minetek II etc), outros na pesquisa de enzimas pr-formadas (ATB32A, AnIdent system, BBL CRYSTAL Anaerobe etc). A utilizao destas metodologias permitem percentagens de identificao, a nvel de espcies, de 60- 90%. A utilizao de sondas de DNA em estudos de hibridizao, com ou sem amplificao, no constituem, ainda, uma alternativa eficaz para o estudo das infeces ocasionadas por este tipo de microrganismos.

5.1 Provas rpidas de identificao 5.1.1. Prova da Catalase ver captulo GENERALIDADES 5.1.2. Teste do Indol spot geralmente includos nos sistemas comercializados 5.1.3. Teste de reduo dos nitratos - geralmente includos nos sistemas comercializados 5.1.4. Teste de Inibio a discos impregnados com carga especial de antimicrobianos (TIA) Princpio - A susceptibilidade ou resistncia das bactrias a determinados discos permite o agrupamento preliminar de alguns gneros e espcies das bactrias anaerbias. Material - discos impregnados com Vancomicina (5 g) Colistina (10 g) Kanamicina (1000 g) SPS (5%) e Bile (20%)

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Procedimento Subcultivar o microrganismo numa placa de meio enriquecido, fazendo a sementeira por estria em trs planos perpendiculares. Colocar os discos afastados uns dos outros 20 mm, num mximo de 4 discos por placa de 90 mm de dimetro. Incubar as placas em anaerobiose 24 a 48 horas. Interpretao: 1. Vancomicina, Kanamicina, Colistina: Sensivel zona de inibio > 10 mm Resistente zona de inibio < 10mm 2. Polianatolsulfonato de sdio (SPS): Sensivel - > 12 mm Resistente - < 12 mm 3. Bile: Sensivel qualquer zona de inibio volta do disco Resistente nenhuma zona de inibio volta do disco

Controlo de qualidade: B. fragilis ATCC 25285 C. perfringens ATCC 13124 F. necrophorum ATCC 25286 P. anaerobius ATCC 27337 P. asaccharolyticus ATCC 29745 Prevotela melaninogenica ATCC 25845

5.1.5. Prova da Lecitinase Princpio - a lecitinase hidrolisa a lecitina em diglicerideos e fosforicolina. A formao destes compostos insolveis causam uma opacidade volta das colnias. Material - meio de gelose gema de ovo (EYA) Procedimento - Subcultivar o microrganismo em meio de gelose gema de ovo e incubar em anaerobiose 24 a 72 horas. Interpretao: Positiva: zona opaca e difusa do meio de cultura ao redor das colnias Negativa: nenhuma alterao no meio de cultura

Controlo de qualidade: C. perfringens ATCC 13124 - Positiva C. sporogenes ATCC 11437 - Negativa

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5.2 - Sistemas comercializados para Identificao A Sistemas bioqumicos de identificao Princpio - Utilizao ou consumo de substratos com produo de produtos finais, durante o crescimento dos microrganismos. Limitaes: Baixo desempenho na identificao dos microrganismos no sacarolticos (F. nucleatum, etc.), e nos de crescimento lento ( Prevotela spp). Algumas bactrias sacarolticas reduzem o indicador, tornando difcil a interpretao da cor final das reaces. Reaces de indol so com frequncia falso negativas Necessidade frequente da execuo de testes suplementares

B- Sistemas enzimticos de identificao Princpio: Degradao de substratos cromogneos por enzimas pr-formadas (glicosidases, aminopeptidases etc.). Limitaes: No podem ser utilizadas subculturas efectuadas em meios ricos em acares (ex.: gelose Schaedler) Alguns microrganismos provenientes da cavidade oral podem no ser completamente identificados por estes mtodos. Microrganismos subcultivados por longos perodos podem ocasionar reaces aberrantes e identificaes incorrectas. Algumas reaces so difceis de interpretar As identificaes esto limitadas base de dados existentes, podendo alm disso no ter includa alteraes taxonmicas posteriormente definidas. Requerem um volume de inculo grande.

C- Cromatografia gs lquida um mtodo de identificao definitiva, somente realizado em laboratrios de referncia, uma vez que requer tecnologia e equipamento especial. Aconselha-se a consulta de literatura apropriada.

6. TESTES de SUSCEPTIBILIDADE 6.1. Consideraes Gerais Durante muitos anos as bactrias anaerbias, com a excepo dos Bacteroides do grupo fragilis, apresentaram um padro de susceptibilidade previsvel. Hoje, o isolamento cada vez mais frequente de espcies produtoras de -lactamases e de estirpes resistentes a grande nmero de antimicrobianos, leva os laboratrios de microbiologia necessidade de reavaliar a metodologia utilizada e a melhorar o tipo de informao fornecida aos clnicos.

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Existem bactrias anaerbias (Bacteroides do grupo fragilis, Prevotella spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, B. gracilis, Bilophila wadsworthia, C. ramosum, C. clostridiforme, etc.) em que obrigatria a execuo dos testes de susceptibilidade, quer para orientao teraputica quer para estudos de susceptibilidade cumulativa capazes de orientar as teraputicas empricas sempre que estamos perante estes microrganismos. Os mtodos de determinao da susceptibilidade das bactrias anaerbias tm evoludo ao longo dos anos, suscitando ainda alguma controvrsia em relao a: - Quais os antimicrobianos a ensaiar. - Qual a metodologia a realizar. - Interpretao dos resultados

Antibiticos como a Penicilina, Cefoxitina, Clindamicina, devem sempre ser avaliados uma vez que a sua eficcia imprevisvel. Relativamente ao Metronidazol, Cloranfenicol, Carbapenemes, no consensual a sua avaliao, uma vez que o seu padro de susceptibilidade permanece inaltervel. Porm, importante que estes antimicrobianos sejam monitorizados ao longo do tempo. Mesmo os mtodos recomendados pelo NCCLS mtodo de diluio em meio slido (mtodo de referncia), e os mtodos de macro e microdiluio em caldo, no recolhem o consenso absoluto, uma vez que todos eles so complexos, e apresentam vantagens e inconvenientes (recomenda-se a consulta do NCCLS). A escolha do mtodo deve ser ponderada de acordo com a finalidade pretendida com a execuo dos testes de susceptibilidade. Para alm da variabilidade tcnica entre as vrias metodologias, existem factores que constituem uma dificuldade na interpretao dos resultados tais como: A definio e determinao do ponto de inibio CIM de determinados antimicrobianos (-lactmicos), principalmente nas bactrias anaerbias Gram negativo. A escolha das concentraes criticas (breakpoints) adoptadas para a definio de resistncia e susceptibilidade. Existncia de cluster de concentraes inibitrias mnimas isto agrupamento de valores da CIM muito prximas ou iguais s concentraes crticas. Variabilidade na expresso dos resultados resultados expressos em valores de CIM50 e CIM90, em percentagens de resistncia, em percentagens cumulativas de estirpes resistentes a todas as concentraes de antimicrobianos estudadas.

consensual que os testes de susceptibilidade no devem ser executados por rotina, e que a pesquisa de - lactamases deve ser efectuada em todos os bacilos Gram negativo, uma vez que pode fornecer informaes para orientao teraputica, em tempo til. Assim o teste de susceptibilidade deve ser efectuado nas seguintes situaes: Em todos os microrganismos isolados de locais geralmente estreis (SNC, sangue etc.) Nas situaes clnicas, que requerem teraputicas prolongadas (endocardite, osteomielite). Na ausncia de resposta teraputica emprica instituda.

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Na monitorizao peridica dos padres de susceptibilidade dentro de uma instituio. No estudo da susceptibilidade das bactrias anaerbias a novos agentes antimicrobianos.

6.2. Mtodos de estudo da susceptibilidade Apesar de todos os mtodos apresentarem limitaes, a escolha do mtodo para a determinao da susceptibilidade das bactrias anaerbias deve depender, do tipo de laboratrio e da finalidade da sua execuo. Em virtude da sua flexibilidade e da facilidade de execuo o -test um mtodo interessante, simples e eficiente (com boa preciso e exactido) para a determinao da susceptibilidade das bactrias anaerbias.

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IDENTIFICAO DE COCOS GRAM POSITIVO

INTRODUO Os Cocos Gram positivo aerbios dividem-se na famlia Micrococcaceae em dois grandes grupos: Catalase POSITIVA nos gneros: - Staphylococcus - Micrococcus - Stomatococcus - Planococcus Catalase NEGATIVA nos gneros: - Streptococcus - Enterococcus - Leuconostoc - Pediococcus - Aerococcus - Gemella Para identificao destas bactrias fundamental: Observao da sua morfologia ao microscpio aps colorao pelo mtodo de Gram. O aspecto macroscpico das colnias em meios de cultura slidos (selectivos ou no selectivos) que pode sugerir a possvel identificao. Provas especficas de identificao

GNERO STAPHYLOCOCCUS
1. Descrio do Gnero So cocos Gram positivo (0.5 a 1.5 m de dimetro) que se dispem preferencialmente em cachos, mas tambm podem aparecer isolados, aos pares, em ttradas, em pequenas cadeias . So imveis, no formam esporos e habitualmente so catalase positiva e desprovidos de cpsula. A maioria das espcies anaerbia facultativa. O Gnero Staphylococcus compreende actualmente 27 espcies.

2. HABITAT O gnero Staphylococcus existe em abundncia na principalmente na pele e mucosas dos mamferos e aves. natureza, encontrando-se

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3. Significado CLNICO Algumas espcies de Staphylococcus so frequentemente agentes etiolgicos de infeco. A espcie S. aureus a causa mais frequente de infeco no homem dentro deste gnero. Os Staphylococcus coagulase negativo se bem que sejam considerados saprfitas ou de baixa patogenicidade para o homem, so cada vez mais valorizados como agentes oportunistas de infeco; sempre que isolados de locais habitualmente estreis tais como sangue, L.C.R. e infeces associadas a prteses e catteres.

4. DIAGNSTICO LABORATORIAL 4.1. Exame DIRECTO - colorao de Gram 4.2. Exame CULTURAL Em gelose sangue, as colnias desenvolvem-se a 35C em 18-24h e apresentam-se com 1 a 3 mm de dimetro com superfcie lisa e brilhante, bordo inteiro, consistncia gordurosa, aspecto opaco, de cor varivel entre o branco e o amarelo; verifica-se por vezes a existncia de hemlise. As amostras provenientes de locais com flora mista devem ser semeadas em meios selectivos como por exemplo manitol salgado ou gelose com colistina e cido nalidxico (Columbia ANC).

4.3. Prova da Catalase - positiva 4.4. Prova da Coagulase - Teste da coagulase em lmina - Teste da coagulase em tubo - Protena A (ex.: Staphaurex) 4.5. Teste da Deoxiribonuclease (DNase) 4.6. Teste da susceptibilidade Novobiocina 4.7. Sistemas Comerciais de Identificao da espcie

GNERO STREPTOCOCCUS e outros COCOS GRAM POSITIVO e CATALASE NEGATIVA

Descrio do Gnero Cocos Gram positivo aos pares (diplococos) ou em cadeia. A maioria das espcies anaerbio facultativo, imveis, capsulados ou no capsulados.

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Streptococcus hemoltico do Grupo A de Lancefield (S. pyogenes)

1. Significado CLNICO a causa mais frequente da amigdalite bacteriana nas crianas dos 5 aos 10 anos de idade. 2. DIAGNSTICO LABORATORIAL 2.1. Exame DIRECTO A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo, esfricos de 0,7 a 0,9 m que ocorrem em cadeias de comprimento varivel (quando observado na amostra ou em cultura de meio lquido).

2.2. Exame CULTURAL Gelose sangue - incubao a 35C numa atmosfera com 5 % de CO2, 18 a 24 horas. As colnias apresentam-se com 0,5 a 1mm de dimetro, transparentes ou translcidas, pouco convexas de superfcie lisa e bordo inteiro com larga zona de hemlise quando o sangue utilizado de equdeo ou carneiro. Nalguns produtos pode usar-se meio lquido de enriquecimento (ex.: Todd-Hewitt) para aumentar a sua recuperao.

2.3. Prova da Catalase - negativa 2.4.Teste de susceptibilidade Bacitracina (disco de 0,04 U) - positiva (identificao presumptiva) 2.5. Identificao Serolgica o mtodo de referncia extraco de Lancefield que, pela sua dificuldade tcnica, est actualmente substituido por mtodos comercializados.

Streptococcus hemoltico do grupo B de Lancefield (S. agalactiae)

1. Significado CLNICO A importncia do Streptococcus do grupo B advm do seu potencial infeccioso no recmnascido. 2. DIAGNSTICO LABORATORIAL 2.1. Exame DIRECTO A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo, esfricos de 0,7 a 0,9 m que ocorrem em cadeias de comprimento varivel (quando observado na amostra ou em cultura de meio lquido).

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2.2. Exame CULTURAL Para alm da sementeira em meio slido deve ser tambm semeado em meio lquido (ex: Todd-Hewitt). aconselhado o uso de gelose sangue incubado a 35C numa atmosfera com 5 % de CO2. As colnias aps 18-24h de incubao apresentam-se com 0,5 a 1 mm de dimetro, transparentes ou translcidas, pouco convexas de superfcie lisa e bordo inteiro com estreita zona de hemlise quando o sangue utilizado de equdeo ou carneiro. 2.3. Prova da catalase - negativa 2.4. Identificao serolgica o mtodo de referncia extraco de Lancefield que, pela sua dificuldade tcnica, est actualmente substituido por mtodos comercializados.

Streptococcus pneumoniae
1. Significado CLNICO Fazendo parte da flora indgena da orofaringe a principal causa de pneumonia da comunidade e frequente causa de otite mdia, sinusite e meningite. 2. Diagnstico LABORATORIAL 2.1. Exame DIRECTO A colorao de Gram mostra diplococos Gram positivo de 0,8 a 1 de tamanho, ovides ou lanceolados, com as extremidades mais largas opostas, por vezes capsulados. 2.2. Exame CULTURAL Microrganismo anaerbio facultativo que aps 18-24h de incubao a 35C numa atmosfera com 5 % de CO2 apresenta colnias, na gelose sangue, com cerca de 1 mm de dimetro, redondas de bordo inteiro e circundadas por uma zona de hemlise. Podem ser mucoides. A superfcie pode ser plana ou com depresso central. 2.3. Teste da Optoquina 2.4. Teste da Solubilidade em Blis 2.5. Identificao Serolgica

Enterococcus spp
1. Significado CLNICO Dentro dos cocos Gram positivo o agente mais frequentemente associado a infeco urinria. Est tambm muitas vezes associado Infeco Hospitalar.

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2. Diagnstico LABORATORIAL 2.1. Exame DIRECTO A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo ovides ou em curtas cadeias. 2.2. Exame CULTURAL Embora no necessite de sangue para se desenvolver em cultura, as colnias em gelose sangue aps 18-24h de incubao a 35C so de cor branca ou acinzentada com 0,5 a 1,5 mm de dimetro e convexas. Aps incubao prolongada (superior a 48h) podem apresentar , ou ausncia de hemlise 2.3. Prova da Catalase - negativa 2.4. Teste da Blis-Esculina 2.5. Sistemas Comerciais de Identificao Bioqumica permitem a identificao da espcie

Streptococcus viridians
1. Significado CLNICO Microrganismo frequente como agente de endocardite sub-aguda bacteriana. 2. Diagnstico LABORATORIAL 2.1. Exame DIRECTO A colorao de Gram mostra cocos Gram positivo em cadeia. 2.2. Exame CULTURAL Microrganismo exigente que necessita de meios enriquecidos com sangue. Aps 18-24h de incubao a 35C em atmosfera de 5 % de CO2, as colnias em gelose sangue apresentam dimetro varivel entre 0,1 a 0,5 mm de dimetro. Podem ter ou ausncia de hemlise. 2.3. Sistemas Comerciais de Identificao Bioqumica Permitem a identificao da espcie .

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BACILOS GRAM POSITIVO

GNERO LISTERIA
Do gnero Listeria s a Listeria monocytogenes e a Listeria ivanovii esto associadas com doena no Homem. A Listeria monocytogenes a espcie mais frequentemente isolada nos laboratrios clnicos e a sua patogenicidade bem conhecida no Homem.

Listeria monocytogenes
1. HABITAT A Listeria monocytogenes encontrada numa ampla variedade de ambientes. Pode ser isolada na flora comensal de vrios animais tais como alguns roedores, no aparelho gastrointestinal do Homem saudvel e a partir de fontes ambientais tais como gua de rios, vegetao em decomposio, esgotos etc. Pode ainda ser isolada no leite e derivados, quer pasteurizados quer no pasteurizados. 2. Significado CLNICO A Listeria monocytogenes causa mais frequentemente infeces em mulheres grvidas, recm-nascidos, idosos e doentes imunodeprimidos. As infeces mais frequentes so a meningite e a sepsis. Alguns doentes podem ter uma bacterimia assintomtica. A Listeria monocytogenes pode ainda causar infeces localizadas na pele, endoftalmites, endocardites, linfadenites, artrites, osteomielites, abcessos cerebrais, peritonites e colecistites.

3. IDENTIFICAO LABORATORIAL 3.1. Exame DIRECTO Bacilos Gram positivo, no esporulados, geralmente curtos, mas ocasionalmente dispostos aos pares e em cadeias curtas. 3.2. Exame CULTURAL Meios de cultura - Gelose sangue: Incubao a 35 C durante 24 horas em aerobiose, atmosfera de 5% de CO2 ou em anaerobiose. As colnias so pequenas, translcidas e acinzentadas, com pequeno halo de hemlise.

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3.3. Testes de IDENTIFICAO Catalase POSITIVA Teste da mobilidade - realizar com um meio semi-slido (ex.: meio de Sims ), inocular por picada com fio recto e incubar temperatura ambiente. Observa-se uma zona de crescimento em chapu de chuva 2 a 5 mm debaixo da superfcie do meio. Crescimento a 4 C Hidrlise da esculina Produo de H2S Identificao definitiva - testes bioqumicos comercializados

GNERO CORYNEBACTERIUM

O gnero Corynebacterium inclua um grupo muito heterogneo de bactrias. Durante a ltima dcada, taxonomistas redefiniram o gnero Corynebacterium e vrias espcies foram reagrupadas em outros gneros. Este gnero inclui espcies aerbias e anaerbias facultativas, so na sua maioria Catalase POSITIVA. So imveis, com excepo do Corynebacterium aquaticum.

HABITAT e Significado CLNICO As bactrias do gnero Corynebacterium encontram-se amplamente distribudas na natureza (solo e gua) e fazem parte da flora da pele e mucosas do Homem. Exceptuando-se o Corynebacterium diphtheriae, os isolamentos em produtos biolgicos de bactrias deste gnero, so geralmente considerados contaminantes. No entanto, o seu repetido isolamento em amostras normalmente estreis (sangue, LCR e outros lquidos biolgicos) sugere a sua implicao na etiologia do processo infeccioso.

Corynebacterium diphtheriae
3. IDENTIFICAO LABORATORIAL 3.1. Exame DIRECTO Bacilos Gram positivo, pleomrficos, rectos ou ligeiramente curvos e grossos, no formam esporos. 3.2. Exame CULTURAL Meios no selectivos Gelose sangue - crescem algumas estirpes de Corynebacterium que no crescem nos meios com telurito.

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Meio de Loeffler Utiliza-se para o diagnstico presuntivo de Corynebacterium diphtheriae nos exsudados farngeos. Este meio favorece a formao de grnulos que coram metacromticamente com coloraes simples, por ex: com azul de metileno de Loeffler.

A morfologia das colnias em gelose sangue semelhante s colnias dos outros bacilos aerbios Gram positivo, portanto tero que ser subcultivadas para meio selectivo ou identificadas bioquimicamente. Meios selectivos So meios com telurito de potssio - O telurito de potssio inibe o crescimento da maior parte das bactrias saprfitas do aparelho respiratrio superior permitindo o crescimento dos Corynebacterium. Gelose sangue com telurito e cistina - o meio com cistina e telurito mais fcil de preparar e tem uma durabilidade de cerca de um ms. Neste meio, todas as espcies de Corynebacterium produzem colnias de cor acinzentada / preta aps 24 horas de incubao a 35 C. Meio de Tinsdale - o meio de Tinsdale mais difcil de preparar e deve ser usado no prazo de 2 a 3 dias aps a preparao. As colnias de Corynebacterim diphtheriae so facilmente diferenciadas das dos outros Corynebacterium porque tm um halo acastanhado.

3.3. TESTES de IDENTIFICAO Identificao Presuntiva - presena de grnulos metacromticos observados em esfregao realizado a partir da cultura em meio de Loeffler. Identificao Definitiva - testes bioqumicos comercializados. Testes de TOXOGENICIDADE - estirpes de C. diphtheriae no toxignicas podem ser isoladas da orofaringe e nasofaringe de pessoas saudveis. Assim, por razes clnicas e epidemiolgicas, a identificao laboratorial definitiva das estirpes patognicas deve incluir testes de toxigenicidade (Teste de toxigenicidade in vitro Elek modificado consultar manuais de microbiologia).

Corynebacterium spp
As bactrias do gnero Corynebacterium so freqentemente isoladas de uma grande variedade de amostras clnicas. 3. IDENTIFICAO LABORATORIAL 3.1. Exame DIRECTO Bacilos Gram positivo, no esporulados, pleomrficos que variam de curtos cocobacilos a longos bacilos.

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3.2. Exame CULTURAL Meio de cultura - Gelose sangue - Incubao 18 a 24 horas em 5 % de CO2. 3.3. Testes de IDENTIFICAO - Testes bioqumicos comercializados

GNERO ERISIPELOTHRIX

No gnero Erysipelothrix so conhecidas duas espcies, o E. rhusiopathiae e o E. tonsillarum. O Erysipelothrix rhusiopathiae a nica espcie deste gnero que agente patognico para o Homem.

Erysipelothrix rhusiopathiae
1. HABITAT Erysipelothrix rhusiopathiae encontra-se amplamente distribudo na natureza e tem sido isolado do solo, alimentos e gua presumivelmente contaminados por animais infectados. Tem sido isolado do aparelho gastrointestinal de sunos saudveis e acredita-se ser o porco domstico o maior reservatrio. 2. Significado CLNICO Foi isolado pela primeira vez no Homem a partir de leses da pele que se convencionou chamarem de erisipeloides. uma forma de celulite que envolve habitualmente a pele das mos e dedos. uma doena profissional em pessoas que manipulam carne, peixe, crustceos e galinceos. Pensa-se que a bactria entra na pele atravs de solues de continuidade da mesma. Raramente pode ocorrer sepsis e endocardite. 3. IDENTIFICAO LABORATORIAL 3.1. Exame DIRECTO Bacilos Gram positivo, pequenos, finos, rectos ou ligeiramente curvos. s vezes formam longos filamentos. 3.2. Exame CULTURAL Meios de cultura: Gelose Sangue e Gelose chocolate - incubar a 35 C em aerobiose at 48 horas. Meio lquido de enriquecimento com 1% de glucose - incubao a 35 C em atmosfera de 5 % de CO2.

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As colnias podem ser planas ou rugosas. As colnias planas podem medir entre 0,5 e 1 mm e so convexas, circulares e transparentes. As colnias rugosas so maiores, baas e tm um bordo fimbriado. Aps prolongado perodo de incubao, pode aparecer uma descolorao esverdeada do meio adjacente s colnias - hemlise. 3.3. Testes de IDENTIFICAO Catalase NEGATIVA Testes bioqumicos comercializados

GNERO RHODOCOCCUS

Do gnero Rhodococcus, a espcie Rhodococcus equi a mais frequentemente responsvel por infeces no Homem, embora outras espcies tenham sido referidas como agentes causadores de infeces oportunistas.

Rhodococcus equi 1. HABITAT O Rhodococcus encontra-se amplamente distribudo no solo e em alguns animais.O solo pode ser a origem das infeces no Homem que no contacta com animais. A infeco no Homem pode ser adquirida por inalao do agente a partir destes reservatrios. 2. Significado CLNICO A infeco pulmonar a mais frequente, nomeadamente pneumonias invasivas com cavitao particularmente em doentes com SIDA. A disseminao para o crebro, fgado, bao e outros rgos tambm frequente nestes doentes. 3. IDENTIFICAO LABORATORIAL 3.1. Exame DIRECTO Bacilos Gram positivo, curtos e s vezes cocides, disposio difteroide ou em paliada. 3.2. Exame CULTURAL Meio de cultura - Gelose sangue Incubar a 35 C em aerobiose 18 a 24 horas. As colnias so lisas, brilhantes e com uma cor que pode variar de rosa salmo a alaranjada aps incubao prolongada

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3.3. Testes de IDENTIFICAO Catalase POSITIVA Testes bioqumicos comercializados.

GNERO NOCARDIA O gnero Nocardia um dos gneros pertencentes famlia das Nocardiaciae. So actinomicetos aerbios parcialmente acido-resistentes, no entanto a presena desta propriedade varivel estando dependente das condies da cultura e da prpria estirpe. Os microrganismos pertencentes ao gnero Nocardia so Gram positivo, variavelmente cido-resistentes, catalase POSITIVA e aerbios estritos. 1. HABITAT A maior parte das espcies encontrada normalmente no solo e na gua. 2. Significado CLNICO Das 11 espcies includas no gnero Nocardia, s a N. asterides, N. nova, N. farcinica, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum e a N. transvalensis esto descritas como sendo patognicas para o Homem. A Nocardia asterides responsvel por mais de 80 % das infeces nos humanos. As infeces a Nocardia podem ser adquiridas quer por inoculao traumtica quer por inalao. A Nocardia spp pode causar infeces na pele, infeces pulmonares invasivas e infeces sistmicas. 3. IDENTIFICAO LABORATORIAL 3.1. Exame DIRECTO Bactrias Gram positivo, ramificadas ou parcialmente ramificadas e filamentosas. So cido-resistentes quando coradas por colorao de Ziehl-Neelsen (utilizar cido Sulfrico a 1% para descorar).

3.2. Exame CULTURAL Meios de cultura Gelose sangue Gelose chocolate Meio de Sabouraud dextrosado A maior parte dos actinomicetos aerbios no tem exigncias nutricionais complexas e cresce nos meios de cultura de rotina laboratorial tais como a gelose sangue, gelose chocolate ou meio de Sabouraud dextrosado. No entanto, como um microrganismo de crescimento lento, a flora comensal que pode estar presente em determinadas amostras clnicas pode mascarar o seu crescimento.

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Podem ser semeados os meios de Lowenstein e Middlebrook 7H10 que facilitam a identificao presumptiva destes agentes. Incubar a 35 C e a 30 C, durante 2 a 3 semanas. A morfologia das colnias nos meios de rotina extremamente varivel: so aderentes, rugosas, secas, quebradias e com uma cor que pode variar do branco cal ao laranja acastanhado.

3.3. TESTES de IDENTIFICAO - Identificao presuntiva

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IDENTIFICAO COCOBACILOS GRAM NEGATIVO

GNEROS NEISSERIA e MORAXELLA

1. INTRODUO Para a identificao destas bactrias fundamental a observao das caractersticas das colnias assim como a sua morfologia aps colorao pelo mtodo de Gram. Estes microrganismos so cocos Gram negativo. Organizam-se em pares ou pequenas cadeias, sendo que os pares apresentam os lados adjacentes achatados com a forma de gro de caf ou de rim. A diviso celular em dois planos em ngulo recto por vezes com a formao de tetradas. As clulas individuais variam em tamanho de 0,6 a 1,5 m dependendo da espcie, local de isolamento e idade da cultura. So imveis e no produzem esporos. As espcies patognicas para o Homem so, geralmente, exigentes nas necessidades de crescimento, com um desenvolvimento ptimo a 35 C e metabolizam poucos ou nenhuns hidratos de carbono. So capnofilicas e desenvolvem-se melhor em atmosfera hmida. Todas as espcies so oxidase positiva e catalase positiva (excepto a N. elongata que catalase negativa). O habitat natural destas bactrias so as membranas mucosas dos animais de sangue quente.

2. DIAGNSTICO LABORATORIAL 1. Meios de CULTURA 1.1. Produtos biolgicos normalmente estreis: Gelose sangue Gelose chocolate simples e/ou com suplemento polivitamnico

1.2. Produtos biolgicos com flora indgena Meios selectivos para isolamento de Neisseria spp.: - Thayer-Martin modificado (MTM) - Gelose chocolate ou com sangue lacado suplementado com VCAT ou LCAT

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Os meios selectivos contm agentes antimicrobianos que inibem outros microrganismos e permitem o isolamento selectivo quer de N. gonorrhoeae quer de N. meningitidis 2. INCUBAO Em aerobiose, atmosfera hmida com 5% de CO2 a 35 C. Deve ser observado o crescimento at s 72 horas

3. Morfologia das COLNIAS e IDENTIFICAO A morfologia das colnias varivel. Tm opacidade varivel, tendem a ser pequenas, brilhantes e elevadas. Nas subculturas estas caractersticas podem modificar-se. As culturas devem observar-se s 24, 48 e 72 horas. Devem ser feitos esfregaos das colnias para comprovao da morfologia caracterstica.

Neisseria gonorrhoeae
s 24 horas de incubao apresenta colnias branco opaco elevadas e brilhantes que reflectem a luz. Para a identificar deve efectuar-se o teste da oxidase e Gram das colnias suspeitas, o que permite uma identificao presuntiva se isolada de amostra urogenital. A identificao confirmatria da espcie deve ser feita com testes bioqumicos (mais frequentemente) ou com mtodos serolgicos.

Neisseria meningitidis
Os menigococos no so to exigentes como os gonococos, embora as amostras de produtos com suspeita de infeco a este agente devam ser semeadas em meios enriquecidos. Embora estas bactrias no se desenvolvam bem em meios lquidos as amostras de locais habitualmente estreis podem tambm ser inoculadas nestes meios. Morfologicamente as colnias so maiores que as dos gonococos, atingindo um dimetro superior a 1 mm s 18 horas de incubao. So redondas e convexas com uma superfcie lisa, hmida e brilhante e um bordo inteiro. As culturas jovens apresentam uma consistncia gordurosa e as colnias emulsificam com facilidade em soro fisiolgico e com tempo h uma autlise e as colnias ganham uma consistncia elstica e pegajosa. A identificao presuntiva faz-se pelo teste da oxidase e pela colorao de Gram. A confirmao feita por testes bioqumicos. A serogrupagem muito importante para fins epidemiolgicos, e deve ser feita exclusivamente em Laboratrios de Referncia.

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Outras Neisseria spp.

Outras Neisseria sp. podem fazer parte da flora indgena da nasofaringe e da orofaringe. A N. lactamica, N. cinerea, N. polysaccharea, N. flavescens, N. subflava, N. sicca, N. mucosa e N. Elongata, embora sejam consideradas de baixa virulncia, em alguns casos tm sido responsabilizados como agentes etiolgicos de infeces. A N. lactamica e a N. polysaccharea so as que mais se confundem com a N. meningitidis porque crescem em meio selectivo para gonococo e fermentam a glucose e a maltose.

Moraxella catarrhalis

considerada causa de doena humana desde o principio do sculo XX embora s h cerca de 20 anos tenha havido uma clara apreciao do seu envolvimento na patogenia de algumas doenas. A M. catarrhalis tem sido responsvel como agente de infeco do aparelho respiratrio (otite mdia aguda, sinusite, e infeces bronco pulmonares). Esto tambm descritos casos de endocardite e meningite. O seu isolamento faz-se em gelose sangue ou gelose chocolate, com incubao a 35 C em aerobiose com uma atmosfera de 5 % de CO2. No se desenvolve em MacConkey. As colnias so pequenas, redondas, inteiras, esbranquiadas, de 3 a 5 mm de dimetro. No aderem ao meio, deslizam inteiras quando arrastadas com a ansa. catalase e oxidase positivas, no fermenta os aucares, produz DNAse, reduz os nitratos e produz butirato esterase. Um dos testes mais teis a comprovao da produo de DNAse. A identificao pode tambm fazer-se (ou confirmar-se) por testes bioqumicos (geralmente comercializados).

GNERO HAEMOPHILUS Este gnero inclui vrias espcies: - H. .influenzae - H. parainfluenzae - H. haemolyticus - H. parahaemolyticus - H. aphrophilus - H. paraphrophilus - H. segnis - H. ducreyi

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As espcies deste gnero fazem parte da flora habitual do aparelho respiratrio superior humano e dos animais (com excepo do H. ducrey). As espcies consideradas patognicas para o homem so: H. influenzae, H. parainfluenzae, H. aphrophilus e H. ducreyi. As infeces humanas variam desde as no complicadas e facilmente tratveis (conjuntivite, otite mdia aguda, sinusite, etc.) at s invasivas e potencialmente mortais (pneumonia, meningite, pericardite, endocardite, etc.) geralmente causadas pela espcie H. influenzae. O H. ducreyi agente patognico obrigatrio exclusivamente humano (provoca a doena sexualmente transmitida designada por cancride).

1. Exame DIRECTO Na colorao de GRAM geralmente apresentam a forma de cocobacilos Gram negativo pleomrficos. 2. Exame CULTURAL Meios de cultura: - gelose chocolate - gelose com sangue de cavalo ou coelho (tm hemina e NAD).

A maioria das espcies de Haemophilus exigem hemina (factor X) e NAD (factor V) para o seu desenvolvimento, por isso no crescem em gelose com sangue de carneiro (que s tem hemina) nem em MacConkey. Algumas espcies bacterianas produzem NAD pelo que, na gelose com sangue de carneiro, se podem desenvolver colnias de Haemophilus spp volta dessas colnias produtoras de NAD fenmeno de satelitismo. As espcies de Haemophilus no se desenvolvem bem nos meios lquidos habitualmente usados no laboratrio, incluindo os meios comercializados para hemoculturas. Desenvolvem-se em aerobiose, mas o seu crescimento estimulado com atmosfera suplementada com 5% de CO2. Geralmente observa-se crescimento aps 24 h de incubao a 35C, mas pode ser necessrio prolongar a incubao at 48-72 h. (O H. ducreyi exige perodo de incubao de 7 dias). As colnias so pequenas, redondas, convexas ou achatadas, translcidas com a zona central mais opaca e com cheiro caracterstico a ninho de ratos.

3. TESTES de IDENTIFICAO Podem ter reaco positiva para o teste da oxidase e a reaco tambm varivel para a catalase. Tradicionalmente, a identificao consiste na demonstrao da exigncia dos factores de crescimento X e/ou V.

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O mtodo mais vulgar para demonstrar essa exigncia consiste em colocar discos ou tiras de papel de filtro impregnados respectivamente dos factores X, V e XV sobre um meio de cultura no suplementado (gelose simples, Mueller-Hinton, Tripticase,etc) o qual foi previamente inoculado com uma suspenso (0.5 de McFarland) do microrganismo. Aps 18-24 h de incubao verifica-se se h crescimento bacteriano volta dos discos/tiras (existem comercializados discos e tiras impregnados de factores de crescimento). (Quadro n. 1) A identificao tambm pode ser feita pelo Teste da Porfirina - detecta a presena de enzimas que convertem o cido alfa-aminolevulnico (ALA) em porfirinas ou protoporfirinas. As espcies que requerem o factor X no possuem essas enzimas (teste negativo). Este teste pode ser feito em caldo, gelose ou disco. As porfirinas so detectadas por iluminao com luz UV (360 nm) apresentando fluorescncia vermelha. QUADRO 1

FERMENTAO

FERMENTAO

FERMENTAO

FERMENTAO

SACAROSE

BETA-HEMLISE

ESPCIE

H. influenzae H. influenzae bitipo aegypticus H. haemolyticus H. parahaemolyticus H. parainfluenza H. paraphrophilus H. segnis H. ducreyi H. aphrophilus

FACTOR X

+ + + + -

+ + + + + + + -

+ + -

+ + + + + + + +

+ + + + +

+ +

+ + +

+ reaco positiva - reaco negativa V reaco varivel;

A identificao de espcie tambm se pode fazer recorrendo a testes bioqumicos geralmente comercializados (ex. Api NH , Vitek NHI ). (Quadro 1) A deteco dos antignios capsulares do H. Influenzae tem interesse epidemiolgico e em investigao mas tem pouco interesse clnico. A deteco de antignios ou a utilizao de sondas moleculares, quando disponveis no mercado, podero revelar-se muito teis na deteco do H. ducreyi que dificilmente cultivvel.

CATALASE

FACTOR V

GLUCOSE

LACTOSE

MANOSE

+ + + V V -

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GNERO BORDETELLA
As 3 espcies principais so: B. pertussis B. parapertussis B. bronchiseptica

A B. pertussis e B. parapertussis so agentes patognicos exclusivamente humanos e causam um quadro de infeco respiratria alta designada por tosse convulsa. A sua incidncia diminuiu muito depois da utilizao generalizada da vacina. A infeco humana por B. bronchiseptica muito rara estando quase sempre relacionada com histria de contacto com animais.

1. Exame DIRECTO So cocobacilos Gram negativo, embora corem mal pelo mtodo de Gram. 2. Exame CULTURAL A colheita do exsudado naso-farngeo para exame cultural tem, obrigatoriamente, de ser realizada com zaragatoa de alginato de clcio. Meio de cultura: Meio de Bordet-Gengou (B. pertussis e B. parapertussis no se desenvolvem bem em gelose sangue nem em gelose chocolate) Incubao: Aerobiose (so aerbios estritos), atmosfera hmida a 35 C. A maioria das vezes as colnias s se tornam visveis ao fim de 3 a 5 dias; inicialmente so pequenas, brilhantes, fazendo lembrar gotculas de mercrio.

3. TESTES de IDENTIFICAO A identificao presuntiva baseada na morfologia bacteriana coradas pelo mtodo de Gram e pelo aspecto das colnias. As espcies so todas catalase positiva. A identificao da B. bronchiseptica faz-se por testes bioqumicos, eventualmente comerciais (ex.: Api 20 E , GNI-Vitek ). (Quadro 2) A identificao definitiva serolgica utilizando um antisoro especfico aplicado ao microrganismo em cultura pura.

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QUADRO 2
B. pertussis B. parapertussis B. bronchiseptica

Crescimento em gelose sangue Crescimento em MacConkey Oxidase Urease Reduo dos nitratos Motilidade a 37C
+ reaco positiva - reaco negativa

+ -

+ v + (24h) -

+ + + + (4h) + +

v - reaco varivel

GNERO PASTEURELLA
O gnero Pasteurella um dos gneros pertencentes famlia Pasteurellaceae. Todos os membros do gnero Pasteurella tm certas caractersticas fenotpicas em comum. So bacilos ou cocobacilos Gram negativo, anaerbios facultativos e imveis. A maior parte das espcies oxidase POSITIVA, catalase POSITIVA, fermenta a glicose e reduz os nitratos a nitritos.

Pasteurella multocida
1. HABITAT A maior parte das espcies de Pasteurella faz parte da flora comensal de alguns animais selvagens e domsticos. transmitida ao Homem por contacto prximo ou por mordedura destes animais. Pode ainda colonizar o aparelho respiratrio superior de quem possui animais domsticos. 2. Significado CLNICO A maior parte das espcies, pode ser considerada como patognica oportunista. A Pasteurella multocida a espcie mais frequentemente isolada. Em doentes imunodeprimidos tambm pode ser responsvel por infeces do aparelho respiratrio e do S.N.C., entre outras. 3. IDENTIFICAO 3.1. Exame DIRECTO Bacilos Gram negativo, rectos e tipicamente curtos. 3.2. Exame CULTURAL Meios de cultura Gelose sangue Gelose de Chocolate

Incubao: Aerobiose, suplementada com 5% CO2 a 35 C num mnimo de 24 horas.

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Morfologicamente, as colnias em gelose sangue so convexas, lisas, cinzentas, no hemolticas mas por vezes h variantes rugosas e mucides.

3.3. Testes de IDENTIFICAO Testes que permitem diagnstico presuntivo: - Oxidase positiva - Catalase positiva - Reduo de nitratos a nitritos - Indol positivo - Urease negativa Testes confirmatrios: - Testes bioqumicos (geralmente comercializados)

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IDENTIFICAO das ENTEROBACTERICEAE

1. INTRODUO

As bactrias da famlia das Enterobacteriaceae so agentes comuns de infeco no Homem. Estas estirpes bacterianas so das mais frequentemente isoladas no Laboratrio de Microbiologia, do ambiente ou colonizadores de outros animais. Todos os membros das Enterobacteriaceae so: Bacilos Gram negativo Oxidase NEGATIVA Fermentam a glicose Crescem em gelose de MacConkey A maior parte tambm reduz os nitratos a nitritos

Habitat natural As Enterobacteriaceae habitam numa grande variedade de locais que incluem o aparelho gastro intestinal humano, o de outros animais e vrios locais do meio ambiente.

3. Significado CLNICO GNEROS e ESPCIES de ENTEROBACTERIACEAE que NO ESTO habitualmente associadas a INFECES HUMANAS
Budvicia aquatica Buttiauxella agrestis Cedecea lapagei Cedecea neteri Citrobacter farme i Citrobacter younge Obesumbacterium spp. Citrobacter braakii Citrobacter werkmanii Citrobacter sedlakii Edwardsiella hoshinae Edwarsiella ictaluri Enterobacter asburiae Enterobacter hormaechei Enterobacter intermedius Enterobacter cancerogenus Enterobacter dissolvens Enterobacter nimipressuralis Erwinia spp. Escherichia fergusonii Escherichia hermannii Escherichia vulneris Escherichia blattae Ewingella americana Klebsiella ornithinolytica Klebsiella planticola Klebsiella rhinoscleromatis Klebsiella terrigena Kluyvera ascorbata Kluyvera cryocrescens Leclercia adecarboxylata Leminorella grimontii Leminorella richardii Moellerella wisconsensis Morganella morganni subsp.siboni Pantoea dispersa Pragia fontium Proteus myxofaciens Providencia alcalifaciens Providencia rustigianii Providencia heimbachae Rahnela aquatilis Serratia rubidaea Serratia odorifera Serratia plymuthica Serratia ficaria Serratia entomophila Serratia proteamaculans subsp. quinov Tatumella pytseos Trabulsiella spp. Xenorhabdus spp. Yersinia kristensenii Yersinia rohdei Yersinia aldovae Yersinia bercovieri Yersinia mollaretii Yokenella regensburgei

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GNERO e ESPCIES de ENTEROBACTERIACEAE que normalmente colonizam o HOMEM e PODEM estar associadas a INFECES HUMANAS
Citrobacter freundii Citrobacter (diversus) koseri Citrobacter amalonaticus Edwardsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter agglomerans group ( Pantoea agglomerans) Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Enterobacter amnigenus Enterobacter taylorae Escherichia coli Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Morganella morganni Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia retgeri Providencia stuarti Salmonella (todos os serotipos) Serratia marcescens Serratia liquefaciens (grupo) Shigella dysenteriae (grupo A) Shigella flexeneri (grupo B) Shigella boydii (grupo C) Shigella sonnei (grupo D) Yersinia pestis Yersinia enterocolitica Yersinia frederiksenii Yersinia intermedia Yersinia pseudotuberculosis

Alguns so agentes de zoonoses. As espcies que colonizam normalmente o Homem podem provocar infeces endgenas. Estes microrganismos so frequentemente agentes de infeco nosocomial. As espcies Salmonella spp., Shigella spp., e Yersinia enterocoltica so sempre agentes patognicos do aparelho gastrointestinal.

As Enterobacteriaceae clinicamente relevantes podem ser consideradas em 2 grupos: Bactrias patognicas oportunistas (os mais comuns) - E. coli. - Klebsiella spp. - Proteus spp. - Enterobacter spp. - Serratia spp. - Citrobacter spp. Bactrias patognicas obrigatrias - Salmonella spp - Shigella spp. - Yersinia pestis, Y. enterocoltica, Y. pseudotuberculosis

EPIDEMIOLOGIA das Enterobacteriaceae CLINICAMENTE SIGNIFICATIVAS

MICRORGANISMO HABITAT TRANSMISSO

Escherichia coli

Shigella spp

S se encontra em humanos na altura da infeco; no faz parte da flora normal do intestino

Nas infeces no gastrointestinais os microrganismos podem ser endgenos ou transmitidos de pessoa a Flora normal do intestino humano pessoa, especialmente no hospital; nas infeces e de outros animais; tambm gastrointestinais, a transmisso varia com o tipo de E. pode habitar o aparelho genital coli, e pode ser transmisso fecal-oral entre humanos feminino atravs de ingesto de alimentos ou gua contaminados, carne mal cozinhada ou leite de gado colonizado. De pessoa a pessoa por via fecal-oral, especialmente em reas sobrecarregadas e reas com ms condies sanitrias

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MICRORGANISMO Salmonela typhi e paratyphi Outras Salmonella spp Edwardsiella tarda

HABITAT

TRANSMISSO

Yersinia pestis

Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis Citrobacter spp Enterobacter spp Klebsiella spp Morganella spp Proteus spp. Providencia spp. Serratia spp

S se encontra em humanos mas De pessoa a pessoa via fecal-oral por ingesto de comida no faz parte da flora normal ou gua contaminadas com excrementos humanos do intestino Ingesto de alimentos contaminados derivados de animais, frequentemente aves domsticas, e tambm de lacticnios. Amplamente disseminadas na Pode ocorrer transmisso de pessoa a pessoa via fecalnatureza e associadas a vrios oral em centros de prestao de cuidados de sade animais quando as normas de lavagem das mos no so respeitadas. Aparelho gastrointestinal de Incerto; provavelmente pela ingesto de gua contaminada animais de sangue frio, tais como ou contacto directo com o animal transmissor rpteis De roedores a humanos pela picada de pulga ou pela ingesto de tecidos de animais contaminados. Durante as Transmitida pelos ratos de cidade epidemias humanas de doena pneumnica pode ser e domsticos e roedores transmitido de pessoa a pessoa pela inalao de gotas de selvagens ar contaminadas; raramente transmitida pelo manuseamento ou inalao de tecidos ou fludos contaminados Ces, gatos, roedores, coelhos, Ingesto de alimentos mal cozinhados (especialmente porcos ovelhas. No faz parte da porco), produtos do dia, tais como leite e ingesto de gua flora normal humana contaminada ou contacto com animais infectados Roedores, coelhos, veados e Ingesto do microrganismo durante o contacto com pssaros. No fazem parte da animais infectados ou comida ou gua contaminadas flora humana normal

Flora gastrointestinal normal

Endgena, ou pessoa a pessoa, especialmente em doentes hospitalizados.

4. EXAME LABORATORIAL 4.1. Exame DIRECTO Microscopicamente, estes microrganismos aparecem como cocobacilos, ou bacilos rectos Gram negativo, com extremidades arredondadas. A Yersinia pestis assemelha-se a um alfinete de segurana fechado, quando corada com azul de metileno ou corante de Wayson; este a chave caracterstica para o diagnstico rpido da peste.

4.2. Exame CULTURAL Meios de Cultura - Gelose sangue - Gelose chocolate - MacConkey. - Cled Nas coproculturas utilizam-se meios selectivos: Para pesquisa de Salmonella spp e Shigella spp - Gelose Hektoen (HE), gelose de xilose-lisina-desoxicolato (XLD) e gelose de Salmonella-Shigella (SS).

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Para a pesquisa de Yersinia enterocoltica - Gelose CIN (cefsulodina-irgasannovobiocina) Para a pesquisa de E.coli O157:H7 - Gelose MacConkey com sorbitol.

Incubao em atmosfera de aerobiose, 18 a 24 horas a 35 C. Os meios selectivos para Yersinia spp incubam a 25 a 30 C

4.3. TESTES de IDENTIFICAO Identificao bioqumica com testes geralmente comercializados - qualquer sistema comercial de identificao pode ser utilizado para a identificao das Enterobacteriaceae e podem-se obter resultados dentro de 4 a 24 horas, consoante o sistema utilizado. Em alternativa utilizao dos testes comercializados, a maioria das Enterobactericias pode ser identificado presuntivamente utilizando um nmero reduzido de substractos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Kligler / T.S.I Indol Ureia Citrato Vermelho de metilo Voges-Proskauer

Utilizam-se para identificar presuntivamente as Espcies patognicas entricas. Identificao serolgica do Gnero Salmonella spp Os antisoros polivalentes fornecidos comercialmente, designados como A, B, C1, C2, D, E, F, G, H, I, e Vi, so comumente usados para o grupo preliminar de Salmonella spp. O antisoro A at I contm anticorpos anti-antignios somticos (O), e o antisoro Vi preparado contra o antignio capsular (K) da Salmonella typhi. A serotipagem feita usando um teste de aglutinao em lmina. Se uma bactria aglutina com o antisoro Vi e no reage com os do grupo O, deve-se preparar uma suspenso salina do microrganismo, aquecida a 100C por 10 minutos para inactivar o antignio Vi. O microrganismo deve ento ser retestado. A Salmonella typhi positiva com o grupo Vi e grupo D.

Identificao serolgica do Gnero Shigella spp O grupo serolgico preliminar de Shigella spp tambm executado usando anticorpos polivalentes somticos O, fornecidos comercialmente, designados como A, B, C e D. Assim como a Salmonella spp, tambm a Shigella pode produzir uma cpsula, e pode ser necessrio aquecer, antes da serotipagem A subtipagem de Shigella spp, nos grupos A, B e C (a Shigella grupo D s tem um sertipo) geralmente feita em laboratrios de referncia.

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 Identificao serolgica da Espcie E.coli O 157 A E. coli sorbitol negativa pode ser serotipada, usando antisoro fornecido comercialmente, para determinar a presena dos antigneos somticos O 157 e flagelar H 7.

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BACILOS GRAM NEGATIVO NO FERMENTATIVOS

1. INTRODUO Grupo de bactrias aerbias estritas no esporuladas que se desenvolvem rapidamente nos meios habituais de cultura e se caracterizam por no produzirem energia pelo processo da fermentao, ou seja, na fosforilao oxidativa, o aceitador final dos electres apenas o oxignio. Representam cerca de 15% dos bacilos Gram negativo isolados nos laboratrios de microbiologia, e destes, 75% so representados pela Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni. A maioria destas espcies fazem parte do meio ambiente e causam infeces oportunistas.

2. PROCEDIMENTOS GERAIS de DESPISTE dos NO-FERMENTADORES Cheiro, pigmentao e morfologia das colnias Colorao de Gram Morfologia da bactria e presena de esporos Motilidade e tipo de flagelos Modo de utilizao da glicose Produo de sulfito de hidrognio e presena de arginina-dihidrolase (ADH) Produo de OXIDASE Crescimento a 42C Oxidao da glicose, xilose, lactose e maltose em meio oxidativo-fermentativo (OF) ou meio de Hugh-Leifson

GNERO PSEUDOMONAS, BURKHOLDERIA e outros semelhantes

Nomenclatura actual Nomenclatura prvia

Brevundimonas diminuta..Pseudomonas diminuta Brevundimonas vesicularis..Pseudomonas vesicularis Burkholderia cepacia....Pseudomonas cepacia Burkholderia pseudomallei..Pseudomonas pseudomallei Burkholderia malleiPseudomonas mallei Burkholderia gladioli.Pseudomonas gladioli Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas fluorescens Pseudomonas mendocina Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas putida Pseudomonas sp. CDC gr. 1 Pseudomonas stutzeri (inclui CDC gr. Vb-3) Pseudomonas denitrificans Pseudomonas-like gr. 2 CDC grupo Ic Ralstonia pickettiPseudomonas picketti e Burkholderia picketti

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1. DEFINIO Grupo de bacilos Gram negativo, aerbios estritos, oxidase positiva, no fermentativos, mveis por 1 flagelo polar, que utilizam uma variedade de carbohidratos, lcoois e aminocidos como fontes de energia. So bacilos com 1 a 5 m de comprimento e 0,5 a 1 m de largura. So bactrias mesoflicas: tm uma temperatura ptima de crescimento entre 30 e 37C, mas podem sobreviver a baixas temperatura (4C), ou crescer a 42C.

2. HABITAT A Burkholderia spp e Ralstonia picketti fazem parte do meio ambiente e no da flora humana habitual. A sua transmisso em meio hospitalar envolve contacto humano com equipamento mdico contaminado. A B. cepacia a mais frequente, tem como reservatrio as plantas (p.ex.: cebolas), solo e gua e pode sobreviver no material mdico e desinfectantes. B. pseudomallei o agente de uma infeco especfica, a melioidose. As Pseudomonas so bactrias patognicas oportunistas, responsveis por infeces nosocomiais, sendo as mais frequentes: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. stutzeri.

. -

2. DIAGNSTICO LABORATORIAL Crescem nos meios de cultura habituais como a gelose sangue e MacConkey, com colnias no fermentadoras da lactose, aps incubao em aerobiose ou com 5% CO2, bem como em caldos nutritivos (tioglicolato e BHI). Nos doentes com fibrose qustica, deve ser efectuada a pesquisa de B. cepacia utilizando um meio selectivo (p.ex.: OFPBL - oxidativo fermentativo polimixina bacitracina lactose). Pode requerer incubao at s 96 horas. A maioria dos sistemas comercializados identifica correctamente a Pseudomonas aeruginosa e a Burkholderia cepacia, mas para os outros microrganismos, no to fivel. A identificao da P. aeruginosa baseia-se nos seguintes testes preliminares: Oxidase POSITIVA Bom crescimento a 42C Produo de pigmento azul-esverdeado (piocianina), ou vermelho acastanhado (piorubina), difusvel em meio incolor (ex: gelose simples, meio Mueller-Hinton).

A P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida fazem parte do grupo das Pseudomonas pigmentadas, mas apenas a primeira cresce a 42C. As estirpes mucides de P. aeruginosa podem reagir mais lentamente nos testes bioqumicos e impedir a sua correcta identificao pelos sistemas comercializados. Deve-se suspeitar de B. cepacia quando se encontra uma bactria no fermentativa que descarboxila a lisina (80%). A identificao correcta das estirpes lisina-negativo (20%) ou oxidase negativo (15%) requer a execuo completa dos testes bioqumicos.

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MICRORGANISMO

Burkholderia cepacia Burkhoderia pseudomallei (bacilo de Withmore) Burkholderia mallei Burkholderia gladioli Ralstonia picketti

HABITAT Solo, gua, plantas, meio hospitalar. No faz parte da flora humana; pode colonizar aparelho resp. em doentes com fibrose qustica Solo. No faz parte da flora humana. reas do Sudoeste asitico No faz parte da flora humana Agente de doena em equdeos e macacos Meio ambiente. Causa doenas em plantas No faz parte da flora humana pode colonizar ap. resp. doentes com fibrose qustica Meio ambiente Meio ambiente, sobrevive em tubagens e canalizaes domsticas, piscinas, solues de lentes de contacto e meio hospitalar. Raramente faz parte da flora humana Meio ambiente (solo, gua) No faz parte da flora humana

TRANSMISSO
Exposio a material contaminado, transmisso pessoa a pessoa Inalao ou inoculao directa a partir da pele ou mucosas Transmisso a humanos rara. Contacto com animais e penetrao pela pele ou mucosas Transmisso a humanos rara. Modo de transmisso desconhecido Modo de transmisso desconhecido; envolve exposio a material mdico contaminado. Ingesto de alimentos ou gua contaminada; exposio a material e solues contaminadas; transmisso pessoa a pessoa. Exposio a material e solues contaminadas

DOENAS e INFECES
Infeces graves em doentes com fibrose qustica ou doenas granulomatosas crnicas Agente da Melioidose, com formas leves a formas fatais por sepsis Infeces humanas raras, desde inf. agudas ou crnicas da pele at sepsis. Idem Infeces humanas raras. Pode ser isolada no sangue, urina ou expectorao: suspeitar de contaminao Patogneo oportunista pode causar infeces comunitrias (foliculite, otite externa, osteomielite ps traumtica, endocardite e inf. respiratrias) ou nosocomiais (aparelho respiratrio, urinrio, feridas, bacterimia e SNC) Infeces humanas raras. Pode ser isolada no sangue, urina ou expectorao: suspeitar de contaminao

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens, putida, stutzeri

P. mendocina alcaligenes, pseudoalcaligenes, CDC gr 1, Meio ambiente P. denitificans, No faz parte da flora humana Pseudomonas-like gr. 2, CDC gr. Ic Brevindomonas vesicularis e diminuta
Meio ambiente No faz parte da flora humana

Desconhecido. Rara em humanos

No causam infeces no Homem

Desconhecido. Rara em humanos

Infeces humanas raras. B. vesicularis causa rara de bacterimia

130

GNEROS ACINETOBACTER, STENOTROPHOMONAS, FLAVIMONAS e CHRYSEOMONAS spp.

Nomenclatura actual

Nomenclatura prvia

Chryseomonas luteola..........................................Pseudomonas luteola, CDC grupo Ve-1 Flavimonas oryzihabitans.....................................Pseudomonas oryzihabitans, CDC grupo Ve-2 Acinetobacter spp; Sacaroltico, no-hemoltico..................................Acinetobacter baumanii, A .calcoaceticus, A . anitratus, A . calcoaceticus subsp. anitratus Acinetobacter spp; sacaroltico, hemoltico..........................................Acinetobacter alcaligenes, A .anitratus, A . haemolyticus Acinetobacter spp; assacaroltico, no-hemoltico...............................Acinetobacter calcoaceticus subsp. Lwoffi Acinetobacter johnsonii, A . junii, A . lwofii Acinetobacter spp; assacaroltico, hemoltico Stenotrophomonas maltophilia...............................Xanthomonas maltophilia, P. maltophilia CDC grupo NO-1

1. DEFINIO

So cocobacilos Gram negativo, oxidase NEGATIVA que oxidam a glicose ou no a utilizam, ao contrrio das Enterobacteriaceae que a fermentam. Nenhum deles faz parte da flora saprfita humana mas devido a uma alta prevalncia de Acinetobacter spp. e S. maltophilia no meio hospitalar, estas espcies podem colonizar a pele e o aparelho respiratrio de doentes hospitalizados em UCI, em unidades de queimados, ou doentes debilitados, submetidos a manobras invasivas e sujeitos a antibioticoterapia sendo mais frequentemente isolados como colonizadores do que como agentes de infeco.

Microrganismo

Habitat
Meio ambiente e hospitalar Flora saprfita da pele e aparelho respiratrio Meio ambiente e equipamento hospitalar Meio ambiente e equipamento hospitalar Orofaringe de animais

Transmisso
Colonizao de doentes hospitalizados; equipamento hospitalar (p. ex. cateteres i.v. ou urinrios) Semelhante ao Acinetobacter spp

Tipo de Infeces
Geralmente isolado como agente colonizante. As verdadeiras infeces so nosocomiais (ITU, ap. respiratrio, feridas, tecidos moles e bacterimia)

Acinetobacter spp

Stenotrophomonas malthophilia Chryseomonas luteola Flavimonas oryzihabitans CDC grupo NO-1

Agente de colonizao de doentes internados. Infeces nosocomiais

Incerta

Cateteres, bacterimia e peritonite associada a dilise peritoneal contnua ambulatria

Mordedura ou arranhadela de animal

Infeces de ferida

131

2. DIAGNSTICO LABORATORIAL

2.1 Exame DIRECTO Apresentam-se como cocbacilos GRAM negativo.

2.2 Exame CULTURAL Crescem bem em meio de MacConkey, Gelose sangue e caldos nutritivos (BHI e tioglicolato) aps incubao a 35C com ou sem CO2. O Acinetobacter spp. e S. maltophilia podem ser facilmente identificados com os mtodos bioqumicos comercializados. Dentro do grupo Acinetobacter spp, as estirpes dividem-se em : Espcies sacarolticas (oxidam a glicose) no-hemolticas A. baumanni Espcies assacarolticas (no oxidam a glicose) no-hemolticas A.lwoffi Espcies hemolticas A. haemolyticus

132

GENERO BRUCELLA
1. INTRODUO As bactrias do gnero Brucella so responsveis por uma infeco conhecida historicamente como febre ondulante, febre Mediternea, febre de Gibraltar ou febre de Malta. A Brucelose uma zoonose, isto uma doena que o Homem pode adquirir atravs do contacto directo com os animais infectados ou pela ingesto de produtos lcteos contaminados. A doena pode ainda ser contrada por inalao de aerossis. O gnero Brucella comporta seis espcies: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. bovis e B. neotomae das quais s as quatro primeiras espcies so responsveis por doena no Homem. A Brucella melitensis a espcie mais virulenta.

2. HABITAT A Brucella pode infectar uma grande variedade de animais tais como gado caprino, gado ovino, gado bovino, etc. O microrganismo transmitido entre os animais atravs do aparelho gastrointestinal, pele e membranas mucosas. Nalguns animais a bactria pode proliferar no tero e glndulas mamrias.

3. SIGNIFICADO CLNICO A brucelose pode ser difcil de diagnosticar devido ao largo espectro de manifestaes clnicas associadas. Na fase aguda da doena os sintomas mais frequentes so febre, suores nocturnos, arrepios, mialgias e artralgias. Linfadenopatias, esplenomegalia e hepatomegalia bem como manifestaes cutneas podem estar presentes. Na forma crnica e aguda, a brucelose pode originar complicaes que atingem vrios rgos, nomeadamente o sistema nervoso central, aparelho respiratrio, sistema esqueltico, cardiovascular e pele.

4. DIAGNSTICO LABORATORIAL 4.1. Exame DIRECTO Apresentam-se como cocobacilos GRAM negativo, aerbios estritos, imveis, no capsulados e no esporulados. 4.2. Exame CULTURAL Meios de cultura: - meio lquido de Triptose - meio de Castanheda ou outro meio de hemocultura que permita o crescimento desta bactria - meio de Middlebrook 7H10.

133

Como a Brucella um microrganismo de crescimento lento a incubao deve ser de 4 a 6 semanas a 35 C em atmosfera de aerobiose. Fazer passagens cegas semanalmente para gelose sangue e gelose chocolate. Incubar estes meios a 35 em atmosfera de 5% de CO2. A Brucella abortus em cultura primria necessita de 5% de CO2 para se desenvolver.

4.3. Testes de IDENTIFICAO Os mtodos convencionais para a identificao da Brucella incluem: Necessidade de atmosfera de 5% de CO2 para o seu crescimento Produo de H2S Produo de urease Crescimento na presena de corantes (Tionina, Tionina azul e Fucsina Bsica) Catalase POSITIVA Oxidase POSITIVA

Testes serolgicos - Confirmao serolgica do gnero Brucella com antisoros monoclonais. No permite a identificao da espcie. Nota: A Brucella um microrganismo que s deve ser manipulado em Laboratrios do grupo IV.

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IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS EXIGENTES Grupo HACEK

1. INTRODUO

O termo exigente aplica-se tradicionalmente a microrganismos que no se desenvolvem ou desenvolvem mal nos meios convencionais de cultura (gelose sangue, gelose chocolate, MacConkey), requerem atmosfera capnoflica ou microaeroflica e podem exigir incubao prolongada para serem detectados. As suas exigncias especiais de crescimento tambm dificultam a sua identificao bioqumica. Nenhum dos sistemas de identificao comerciais identificam de forma fivel estes microrganismos. O facto de serem considerados agentes de infeco raros pode reflectir, em parte, a dificuldade no seu isolamento e identificao. Em geral, fazem parte da flora microbiana normal do Homem e animais, e como tal a sua virulncia baixa, excepto se associados a infeco periodontal. Geralmente s causam doena no Homem quando introduzidos em tecidos ou locais estreis, por exemplo aps traumatismos tais como mordeduras ou manipulaes da cavidade oral.

GNERO ACTINOBACILLUS
Este gnero contm 6 espcies: Actinobacillus equuli Actinobacillus ureae Actinobacillus hominis Actinobacillus lignieresii Actinobacillus suis Actinobacillus pleuropneumoniae ( espcie factor V dependente) o

A infeco humana est associada s 3 espcies que colonizam exclusivamente homem: A. actinomycetemcomitans, A. ureae, e A. hominis.

O A. actinomycetemcomitans j foi classificado neste gnero mas estudos recentes mostraram uma relao muito prxima com o H. aphrophilus e H. segnis (no entanto, em termos prticos, continua a ser tratado como uma espcie do gnero Actinobacillus). So agentes indgenas habituais das mucosas dos aparelhos respiratrio e genitourinrio quer humano quer animal. A maioria das espcies so agentes patognicos para os animais.

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O A. actinomycetemcomitans est associado a periodontite, endocardite e abcessos principalmente cerebrais. O A. ureae e A. hominis so bactrias oportunistas isoladas sobretudo na expectorao e secrees traqueais de doentes com doena respiratria crnica e pneumonia. As infeces humanas por A. lignieresii e A. equuli decorrem geralmente de mordeduras de animais, sendo o agente isolado quer da ferida quer do sangue.

1. Exame DIRECTO Bacilos Gram negativo curtos (0,4-1 m), dispostos isoladamente, aos pares ou em cadeia e tendem a exibir colorao bipolar. 2. Exame CULTURAL Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey, ou tem um crescimento muito escasso. Incubao em atmosfera hmida e suplementada com 5% de CO2 ou em anaerobiose, durante 24-72h As culturas podem ser pleomrficas dando o aspecto de cultura no pura. As colnias de A. actinomycetemcomitans so acinzentadas, viscosas e aderentes ao meio; muito tpico o enrugamento no centro das colnias em forma de estrela. As colnias de A. ureae tm 0.5-1 mm de dimetro, lisas, convexas, no hemolticas, com ligeiro escurecimento da gelose por baixo das colnias. As colnias de A. hominis inicialmente tm 1-2 mm, transparentes, mas tornam-se brancas ou acinzentadas com o tempo. Nos meios lquidos forma grnulos que aderem s paredes do tubo ficando o caldo lmpido.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

GNERO CAPNOCYTOPHAGA

Este gnero contm 7 espcies: C. gengivalis C. granulosa C. haemolytica C. ochracea C. sputgena C. canimorsus C. cynodegmi

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A C. gengivalis, C. granulosa, C. haemolytica, C. ochracea e C. sputgena fazem parte da flora oral humana, enquanto a C. canimorsus e C. cynodegmi colonizam a cavidade oral de ces e gatos. As espcies que colonizam o homem so bactrias oportunistas tendo sido implicadas em doena periodontal, abcessos, queratites, osteomielite, endocardite, etc. As espcies que colonizam os animais so responsveis por infeces no Homem resultantes de mordeduras desses animais.

1. Exame DIRECTO Bacilos Gram negativo fusiformes, de 1-3 m de comprimento, por vezes com a forma de lgrima, podendo ainda apresentar formas filamentosas ou cocides.

2. Exame CULTURAL Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey. Incubao em atmosfera hmida e suplementada com 5% de CO2 durante 24-72h As colnias s 24h so muito pequenas podendo atingir 2-3 mm de dimetro s 48-72h de incubao. As colnias so convexas ou achatadas, com bordos irregulares (fingerlike), no hemolticas, podem apresentar swarming e podem corroer o meio de cultura. As colnias de C. haemolytica podem ser fracamente hemolticas mas essa propriedade perde-se rapidamente nas subculturas. As colnias de C. ochracea tm cheiro a amndoa amarga. As espcies animais (C.canimorsus e C. cynodegmi) distinguem-se das humanas por serem, sempre catalase POSITIVA e oxidase POSITIVA .

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

GNERO EIKENELLA

Este gnero pertence famlia Neisseriaceae. Inicialmente classificada como Bacteroides corrodens mais tarde reclassificada como Bacteroides ureolyticus (estirpes anaerbias estritas) e por fim Eikenella corrodens (estirpes microaeroflicas). Os microrganismos inicialmente classificados como HB1 so hoje reclassificados como Eikenella corrodens. comensal da flora oral humana podendo ser responsvel por infeces quer orais quer extra orais: pleuropulmonares, abcessos dos tecidos moles, artrite, meningite, endocardite, ferida cirrgica, etc.

1. Exame DIRECTO Bacilos Gram negativo finos e rectos, de 1,5 a 4 m de comprimento, com extremidades arredondadas, imveis.

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2. Exame CULTURAL Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey. Incubao em atmosfera suplementada com 5% de CO2 , durante 24-72h Demora 2-4 dias at se desenvolverem colnias bem visveis. Inicialmente as colnias so transparentes mas com o tempo adquirem uma cor amarelada. Podem apresentar um cheiro semelhante ao Haemophilus. A maioria das estirpes corroem o meio, no entanto na mesma cultura podem aparecer colnias que corroem e outras no.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro

GNERO KINGELLA e Grupo EF-4 do CDC

Pertencem famlia Neisseriaceae. A Kingella spp faz parte da flora do aparelho respiratrio humano. A K. kingae uma bactria oportunista, podendo causar endocardite, osteomielite e sepsis. A K. oralis tem sido isolada na placa dentria mas o seu papel na doena periodontal desconhecido. A K. denitrificans s muito raramente isolada tendo sido associada a endocardite. As estirpes EF-4 fazem parte da flora oral de ces e gatos podendo provocar infeces humanas aps mordeduras, arranhes e at contaminao de feridas preexistentes. O EF4a est mais associado a ces enquanto o EF-4b est mais associado a gatos.

1. Exame DIRECTO Cocobacilos Gram negativo dispostos em pares ou cadeias curtas podendo ser confundidos com Neisseria, no esporulados, imveis. Os microrganismos do grupo EF-4 tambm so cocobacilos Gram negativo mas dispostos isoladamente.

2. Exame CULTURAL Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. Incubao atmosfera de aerobiose, suplementada com 5% de CO2. Tempo de incubao prolongado >48 horas. As colnias de Kingella so lisas e convexas com tendncia para se espalharem e por vezes corroem o meio. A K. kingae produz -hemlise. As colnias de EF-4 podem pigmentar fracamente de amarelo e cheiram a pipocas.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro A K. kingae diferencia-se das outras espcies porque acidifica a maltose, mas uma reaco demorada.

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A K. denitrificans a nica espcie de Kingella que reduz os nitratos. As caractersticas fenotpicas do EF-4 so semelhantes Kingella spp. mas a catalase positiva e algumas estirpes crescem em MacConkey.

GNERO CARDIOBACTERIUM e SUTONELLA

Os dois gneros so membros da famlia Cardiobacteriacea (que inclui ainda o gnero Dichelobacter agente patognico veterinrio) e fazem parte da flora habitual do aparelho respiratrio e ocasionalmente do aparelho urogenital humanos. O gnero Cardiobacterium constitudo por uma nica espcie, Cardiobacterium hominis e o gnero Sutonella tambm constitudo por uma nica espcie, Sutonella indologenes (antes classificada como K. indologenes). O C. hominis tem sido associado a endocardite e S. indologenes a infeces oculares.

1. Exame DIRECTO O C. hominis apresenta-se como bacilos Gram negativo pleomrficos de 1-3 um de comprimento, com extremidades bulbosas, dispostos em roseta ou em cacho. S. indologenes so bacilos Gram negativo e, tal como a Kingella e Cardiobacterium resistentes descolorao.

2. Exame CULTURAL Meio de Cultura gelose sangue e/ou chocolate. No se desenvolve em MacConkey. Incubao Em atmosfera aerbia, durante 24-72h Aps dois dias de incubao observam-se pequenas colnias circulares, achatadas, com tendncia para se espalharem. As colnias de Cardiobacterium so brancas ou amareladas, podem ter ligeira -hemlise e corroer o meio, enquanto as de Sutonella so cinzentas e translcidas.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro C. hominis fosfatase alcalina negativo e acidifica a maltose, enquanto S. indologenes fosfatase alcalina positivo e a acidificao da maltose varivel, geralmente negativa.

STREPTOBACILLUS MONILIFORMES
Faz parte da flora da orofaringe e nasofaringe dos ratos (selvagens e de laboratrio), as infeces humanas, geralmente , so consequncia de mordeduras de rato ou do consumo de alimentos contaminados.

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Tem sido isolado no sangue , lquido sinovial e aspirados de abcessos.

1. Exame DIRECTO Bacilo Gram negativo muito pleomrfico, de 0,3-0,5 m de largura e 1-5 m de comprimento, mas podendo apresentar formas filamentosas de 100-150 m.

2. Exame CULTURAL Meio de Cultura Meios slidos ou lquidos tm de ser suplementados com 10% de sangue de cavalo e 10% de extracto de levedura. (O SPS se presente em meio de hemocultura inibidor deste gnero bacteriano). Incubao Em atmosfera hmida e suplementada com 5% de CO2, durante 24-72h. Aps os trs dias de incubao aparecem colnias de 1-2 mm de dimetro, redondas, lisas, cinzentas, butirosas. Algumas colnias tm aspecto de ovo estrelado fazendo lembrar as de Mycoplasma. Nos meios lquidos desenvolvem-se sob a forma de puff balls.

3. TESTES de IDENTIFICAO - ver Quadro QUADRO de TESTES IDENTIFICAO Capnocytophaga Cardiobacterium

Oxidase Catalase Desenvolvimento em MacConkey Citrato Simmons Reduo dos nitratos Dihidrolase da arginina Urease Indol Manitol (acidificao) Glicose (acidificao)

+ v v + v v +

v v v +

+ + -

+ v +

+ + v + v F

+ + v v + O

+ + + +

+ v v + +

v v +

+ reaco positiva - reaco negativa V reaco varivel F fermenta a glicose O oxida a glicose.

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Chromobacterium

Actinobacillus

Streptobacillus

Sutonella

Eikenella

Kingella

EF-4b

EF-4a

DF-3

v + + v + + v v +

IDENTIFICAO das VIBRIONACEAE

Nome actual Nome prvio

Vibrio alginolyticusVibrio parahaemolyticus biotipo2 Vibrio cholerae Vibrio cincinnatiensis Vibrio damsela Vibrio fluvialis.CDC grupo EF-6 Vibrio furnissi Vibriohollisae.CDC grupo EF-13 Vibrio metschnikovii.CDC grupo entrico 16 Vibrio mimicus..Vibrio cholerae (sucrose negativo) Vibrio parahaemolyticus..Pasteurella parahaemolyticus Vibrio vulnificus.CDC grupo EF-3 Aeromonas caviae Aeromonas hydrophila Aeromonas jandaei Aeromonas schubertii Aeromonas sobria Aeromonas veronii Aeromonas shigelloides Chromobacterium violaceum

1. INTRODUO Grupo de bacilos Gram negativo, mveis por flagelo polar. Sendo aerbios ou anaerbios facultativos, tm um metabolismo oxidofermentativo (a glicose fermentada sem produo de gs), so oxidase POSITIVA, e crescem em meio de MacConkey. No fazem parte da flora humana habitual, e a transmisso faz-se por ingesto de gua contaminada, mariscos ou atravs de descontinuidade da pele e mucosas. Desta famlia fazem parte os gneros Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas shigelloides e Chromobacterium violaceum.

2. HABITAT e SIGNIFICADO CLNICO

MICRORGANISMO Vibrio cholerae Vibrio alginolyticus V. parahaemolyticus Aeromonas sp. Plesiomonas shigelloides

HABITAT(reservatrio)
Nicho fora do aparelho GI humano entre epidemias incerto. Sobrevive em estado latente em guas marinhas. Portadores assintomticos raros gua salgada gua salgada gua salgada, gua canalizada, piscinas gua doce especialmente em clima quente

TRANSMISSO
Fecal-oral, ingesto de gua contaminada, ou marisco contaminado gua contaminada Ingesto gua contaminada ou marisco Ingesto alimentos ou gua contaminada; exposio de pele ou mucosas; picada de anzis Ingesto gua contaminada ou marisco

DOENA
Clera Infeces feridas ou ouvido

Gastroenterite, feridas e sepsis

141

3. DIAGNSTICO LABORATORIAL Para o diagnstico da clera, as amostras devem ser colhidas em meio de Cary-Blair e no meio de glicerol. EXAME DIRECTO Na colorao de Gram, os vibries apresentam-se como bacilos Gram negativo, curtos, geralmente isolados, em forma de vrgula. EXAME CULTURAL Meio TCBS ( tiosulfato citrato sais biliares sucrose) Meio de MacConkey Meio SS Pode ser ultilizada gua peptonada (pH 8.4) como meio de enriquecimento, com incubao durante 5 a 8 horas a 35C e subcultura para meio TCBS.

Todas as espcies crescem bem em gelose sangue, gelose chocolate e meio de MacConkey, meio de caldo crebro-corao e meio tioglicolato, a 35C com ou sem CO2 ao fim de 24 horas. Morfologia das COLNIAS nos Meios de CULTURA Microrganismo Meio de cultura
GS

Aparncia das colnias

Mdias ou grandes, lisas, opacas com halo esverdeado. Lactose (-) , excepto V. vulnificus. Amarelas ou verdes, consoante a espcie Grandes, redondas, opacas; betahemolticas excepto A. cavie. Lactose (+) ou (-) Brilhantes, opacas, lisas, nohemolticas. Lactose (+) ou (-) Redondas, lisas, convexas algumas beta-hemolticas; pretas ou violeta escuro; cheiro a amnia Lactose (-)

Vibrio spp

Mac

TCBS GS

Aeromonas spp.
Mac GS Mac GS

Plesiomonas shigelloides

Chromobacterium violaceum

Mac

As colnias destes microrganismos so semelhantes s Enterobacteriaceae, mas so oxidase POSITIVA (excepto V. metschnikovii). O principal problema na identificao do gnero Vibrio deve-se ao caracter haloflico da maioria das espcies e ausncia de concentraes suficientes de NaCl nos meios de cultura dos testes de identificao comercializados.

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Dividem-se em 2 grandes grupos: 1. Espcies haloflicas - necessitam de meio salino para se desenvolverem: V. parahaemolyticus, V. Alginolyticus. 2. Espcies no-haloflicas - no necessitam de meio salino: V.cholerae, V.mimificus, Aeromonas spp. e Plesiomonas shigelloides.

As estirpes patognicas de Vibrio cholerae pertencem ao serogrupo 01, que compreende 3 especificidades antignicas (A,B,C) para os dois biotipos, V. cholerae (clssico) e El Tor. Os serotipos Ogawa e Inaba so os mais frequentes. As estirpes toxignicas do serogrupo 01 so as que esto envolvidas nas epidemias.

3.2. Identificao BIOQUMICA testes bioqumicos comercializados

colnias
Amarelo Verde Amarelo Verde Amarelo Verde

Cresc/ 0%NaCl

Cresc/ 6%NaCl

Sucrose

Oxidase

Lactose

MICRORGANISMO

Cresc/ TCBS
Bom Bom Bom Bom Bom

Myo.inositol

D-glicose

Aeromonas hydrophila Aeromonas caviae Aeromonas v. biovar sobria Aeromonas v. biovar veronii Plesiomonas shigelloides Chromobacterium violaceum Vibrio chorelae Vibrio mimificus Vibrio metschnikovii Vibrio vulnificus Vibrio alginolyticus Vibrio parahaemolyticus
+ : >90% espcies positivo

+ + + + + V + + + + +

+ + + -

+ V V v -

+ + + + V + + v -

+ NT V -

+ + + + + + V + + +

+ + + + V -

+ + + + v V +

+ + + + + + + + -

v V V v + +

- : > 90% espcies negativo

V: varivel

NT- no testado

Cr TCBS
NT

ODC

ADH

LDC

143

TESTE de SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIMICROBIANOS

INTRODUO

O Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (AM) deve realizar-se para qualquer microrganismo que seja responsvel por um processo infeccioso e que necessite de teraputica antimicrobiana, sempre que a susceptibilidade no puder ser previsvel pelo conhecimento da identidade do microrganismo. Os testes de susceptibilidade esto principalmente indicados quando o microrganismo pertence a uma espcie capaz de exibir resistncia aos antimicrobianos mais frequentemente utilizados. Nos casos em que a infeco, apesar de provocada por um microrganismo cuja susceptibilidade a um determinado AM devidamente reconhecida (ex.: susceptibilidade Penicilina do Streptococcus pyogenes) e o doente alrgico a esse AM, outros AM devem ser testados. Os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos devem ainda ser efectuados em estudos epidemiolgicos de resistncia e em estudos de novos agentes antimicrobianos. Os vrios tipos de testes de susceptibilidade disponveis podem-se classificar em dois grandes grupos como mostra o esquema abaixo:

TESTES de DILUIO TESTE de Gradiente de difuso TESTES de DIFUSO

Em meio LQUIDO

Teste

Em AGAR

Macro Micro

Mtodo de Kirby-Bauer Mtodo de Stokes Mtodo Comparativo

Os testes de diluio, quer em meio lquido ou em agar, usam-se para medir quantitativamente a actividade in vitro de um AM numa estirpe bacteriana. 1. Teste de Macrodiluio em Meio Lquido Foi dos primeiros a ser desenvolvido e ainda o 1 Mtodo de Referncia. Utiliza diluies seriadas do antimicrobiano em caldo de Mueller-Hinton suplementado com caties, que so distribudas por 10 tubos. O tubo n. 10 no tem AM e serve como controlo de crescimento. Inoculao de cada um dos tubos com uma suspenso bacteriana padronizada. Incubao a 35 C durante 18 horas. No final da incubao, os tubos so visualmente examinados para observao de turvao

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A turvao indica que o crescimento bacteriano no foi inibido pela concentrao de AM contido naquele tubo. A mais baixa concentrao de AM em g / ml que impede o crescimento bacteriano in vitro a Concentrao Inibitria Mnima (CIM).

2. Teste de Microdiluio em Meio Lquido Adaptao do teste anterior a pequenos volumes. A susceptibilidade do microrganismo aos antimicrobianos determinada em microplaca. As vantagens do mtodo so o uso de pequenos volumes de reagentes, a possibilidade de testar grande nmero de bactrias contra um painel de AM e o baixo custo.

3. Teste de Diluio em Agar o 2 mtodo de referncia. Adaptado ao uso em rotina em grandes laboratrios. Uma suspenso padronizada da bactria inoculada numa srie de placas de gelose Mueller-Hinton, cada uma contendo uma diferente concentrao de AM. As concentraes de AM utilizadas abrangem as concentraes teraputicas da droga. O valor da CIM estabelecida como sendo a da placa em que j no h crescimento bacteriano (endpoint).

4. Testes de Difuso Utilizam uma suspenso bacteriana padronizada que semeada em meio slido apropriado aos diferentes mtodos utilizados.(ex.: gelose Mueller-Hinton para o Kirby Bauer) Colocao de discos de papel de filtro impregnados em antimicrobianos Medio dos halos de inibio de crescimento Resultados - Sensvel / Intermdio /Resistente

5. - Test Combina o princpio do mtodo de difuso com disco (a preparao do inoculo igual) com o do mtodo de diluio (concentraes seriadas do AM impregnadas em tiras)

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Resultados em CIM. Os critrios utilizados para a interpretao da CIM so os utilizados pelos mtodos de diluio e encontram-se nos documentos do NCCLS M7-A3 para bactrias aerbias e M11-A3 para anaerbias

6. Pesquisa de lactamases (ver seco respectiva)

TESTE DE DIFUSO - Mtodo de KIRBY-BAUER

1. DEFINIO O mtodo de difuso em agar um dos mais utilizados na rotina dos Laboratrios de Microbiologia, para testar in vitro, a susceptibilidade aos antimicrobianos (AM) das bactrias de crescimento rpido e de alguns microrganismos exigentes. O mtodo actualmente recomendado pelo NCCLS, Documento M2-A7 baseia-se no mtodo originalmente descrito por Bauer e col. em 1966. Esta metodologia simples, mas bem controlada permite obter um resultado qualitativo que se baseia na relao dos breakpoints das CIM com os nveis teraputicos dos antimicrobianos atingidos no sangue nas infeces sistmicas, ou ainda com nveis de AM concentrado na urina para aqueles utilizados apenas em infeces do aparelho urinrio. As tabelas de consenso do NCCLS so actualizadas anualmente num processo contnuo que se reflecte nos procedimentos, mtodos e protocolos. Assim, imprescindvel que os Laboratrios de Microbiologia que utilizem esta metodologia estejam actualizados com as novas edies ou suplementos das recomendaes publicadas pelo NCCLS, para os testes de susceptibilidade aos AM.

2. PRINCPIO Um inculo padronizado do microrganismo aplicado na superfcie de uma placa de gelose Mueller-Hinton, onde se colocam discos impregnados de antimicrobianos. Aps incubao, em geral durante 16-18 horas, so medidos os dimetros dos halos de inibio de crescimento para cada disco. O tamanho do halo inversamente proporcional CIM do microrganismo, e baseando-se nas recomendaes do NCCLS, obtido um resultado qualitativo que se exprime em sensvel, intermdio ou resistente.

3. INDICAES do MTODO Os testes de susceptibilidade esto indicados para qualquer microrganismo responsvel por um processo infeccioso em que seja necessria a teraputica antimicrobiana.

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Este mtodo de difuso utilizado para os seguintes microrganismos: Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Neisseria gonorrhoeae Haemophilus spp. Vibrio choerae

Excepto para os microrganismos em que, com a evoluo microbiolgica, o NCCLS vai criando recomendaes e tabelas de consenso, o teste de difuso no deve ser utilizado para testar a susceptibilidade noutros microrganismos de crescimento lento, que requerem enriquecimento especial dos meios de cultura (ex.: Campylobacter spp., Corynebacterium spp.). Devem ser utilizadas colnias isoladas do microrganismo em causa, obtidas a partir de uma cultura pura. Esto desaconselhados testes de susceptibilidade feitos directamente a partir do produto biolgico.

4. SELECO dos ANTIMICROBIANOS para os TESTES DE ROTINA A seleco dos antimicrobianos a serem testados deve ser uma deciso de cada laboratrio clnico em conformidade com a Comisso de Farmcia e Teraputica e a Comisso de Controle de Infeco. A lista de antimicrobianos a testar por microrganismo, proposta nas Tabela 1 e 1A do NCCLS inclui agentes comprovadamente eficazes para o tratamento das infeces por eles provocadas e pode ser uma indicao dos AM a testar. Todos os antimicrobianos devem ser referidos utilizando os nomes genricos e agrupados por classes farmacolgicas.

5. REAGENTES e MATERIAL 5.1 Meios de Cultura slidos Gelose Mueller-Hinton (MH) Gelose Mueller-Hinton com 5% sangue carneiro (MH5%SC) Gelose GC com 1% suplemento Gelose Haemophilus Test Medium (HTM)

O pH da Gelose MH deve ser de 7,2 a 7,4 e verificado sempre para cada lote do meio na altura em que est pronto a ser distribudo em placas. Tambm deve conter 10-30mg de ies livres de Mg++/L e 50-60 mg de ies livres de Ca++/L.

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Nas placas, o meio deve ter uma superfcie plana e altura uniforme de 4 mm. Todas as placas devem ser conservadas a 4C e as produzidas no Laboratrio, devem ser utilizadas no prazo de uma semana.

5.2 Meios Lquidos para preparao do inculo Caldo de Mueller-Hinton (CMH) Caldo BHI Meio TSB Soluo de NaCl a 0,85%

5.3 Soluo padro de McFarland a 0,5 / Densitmetro 5.4 Discos de antibiticos com concentraes conhecidas (ver tabela) Os discos de -lactmicos, carbapenemes, cefalosporinas e combinaes com clavulanato devem ser armazenados a 20 C por perodos longos, ou a 4 C por perodos mais curtos. Todos os outros, armazenar refrigerados a 4 C ou congelados. Devem ser retirados do frigorfico 1 a 2 horas antes de serem utilizados e deixados temperatura ambiente antes de retirar da embalagem de conservao (com exsicante) pois as gotas de condensao podem causar diminuio da actividade antimicrobiana ou da concentrao de AM, levando a falsas resistncias. Nunca utilizar discos fora de prazo.

5.5 Outro material Pina esterilizada Craveira ou rgua Fonte luminosa regulvel Superfcie negra no reflectora Agitador de tubos (vrtex) Estufa de 33-35C

6. PROCEDIMENTO GERAL

Para os testes de susceptibilidade dos microrganismos de crescimento lento (Streptococcus spp., Haemophilus spp. e N. gonorrhoeae), ver modificaes especiais ao procedimento geral.

6.1. Temperatura Deixar as placas e os discos atingirem a temperatura ambiente antes de serem utilizadas.

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As placas podem ser colocadas na estufa a 35C entreabertas para evaporao das gotas de condensao na superfcie do meio e na tampa, por perodos curtos para evitar a desidratao do meio (< 30 min).

6.2. Preparao do Inculo Microrganismos provenientes de meios de conservao, congelados ou liofilizados devem ser subcultivados 2 vezes, antes de serem testados.

A - Mtodo PADRO (de crescimento) ou de Fase Logartmica (LFG) Este o mtodo recomendado para os testes de susceptibilidade de microrganismos de crescimento rpido em placas de cultura com incubao > 24h. Retirar 4 a 5 colnias bem isoladas, morfologicamente semelhantes, de meio de cultura selectivo ou no selectivo. Tocando com a ansa no topo de cada colnia, transferir o inculo para um tubo com 4 a 5 ml de caldo de Mueller-Hinton ou outro caldo nutritivo. Incubar este meio a 35C (2 a 6 horas) at atingir ou exceder a turvao de 0,5 da escala 8 de McFarland (contm 1 a 2 x 10 CFU/ml). Ajustar escala 0,5 com NaCl 0,85% ou caldo, visualmente ou com densitmetro. Agitar no vrtex durante 15-20 segundos para homogeneizar.

B - Mtodo DIRECTO (suspenso de colnias) Este o mtodo recomendado para os testes de susceptibilidade de: Qualquer microrganismo proveniente de culturas de 18-24 horas Haemophilus spp, Neisseriae gonorrhoeae, e Streptococcus spp. Deteco da resistncia meticilina nos Staphylococcus spp.

Retirar 4 a 5 colnias bem isoladas, morfologicamente semelhantes, de meio de cultura no selectivo e inocular em NaCl 0,85 %. Ajustar escala 0,5 com NaCl 0,85%, visualmente ou com densitmetro. Agitar no vrtex durante 15-20 segundos para homogeneizar.

6.3. Inoculao das Placas Dentro de 15 minutos aps a preparao do inculo, rodar uma zaragatoa esterilizada na suspenso, e esprem-la contra as paredes do tubo acima do nvel do lquido, para retirar o excesso de lquido. Aplicar a zaragatoa no meio de cultura, semeando em estrias apertadas em toda a superfcie da placa, em 2 ou mais direces, rodando cerca de 60 de cada vez, de modo a garantir a distribuio uniforme do inculo. Por fim, rodar a zaragatoa na periferia da placa. Evitar embater com fora a zaragatoa nos bordos da placa, para que no se formem aerossis.

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Deixar secar as placas inoculadas 3-5 min, mas no mais que 15 minutos, antes de aplicar os discos.

6.4. Aplicao dos discos de Antimicrobianos Aplicar os discos na superfcie da placa (distribuidor automtico ou pina esterilizada) com ligeira presso de modo a assegurar o contacto completo com o agar. A distncia entre discos (centro-centro) deve ser superior a 24 mm e cada um a 15 mm do bordo da placa: Placas de 100 mm de diametro mximo de 5 discos Placas de 150 mm de diametro mximo de 12 discos

Nunca recolocar um disco em local diferente aps contacto com a placa, porque o AM difunde imediatamente. Os meios de cultura com sangue contm timidina, um antagonista do trimetoprim, sulfamidas e cotrimoxazol, pelo que estes AM no devem ser testados no meio de MH5%SC.

6.5. Incubao Inverter a placa e colocar em estufa a 35 C, em aerobiose, durante 16 a 18 horas (no mais de 15 minutos aps a aplicao dos discos). A atmosfera de CO2 altera o pH da superfcie e s deve utilizar-se para o Haemophilus spp., N. gonorrhoeae e Streptococcus spp. (ver procedimentos especiais). No colocar mais que 5 placas sobrepostas na estufa. Para o Staphylococcus spp. incubar 24 horas o disco de oxacilina, no ultrapassando a temperatura de 35 C. Do mesmo modo, para o Enterococcus spp. incubar 24 horas o disco de vancomicina.

6.6. Leitura das Placas Examinar as placas ao fim de 16 a 18 horas, e medir os halos de inibio se o crescimento for confluente ou semi-confluente. Se houver crescimento com colnias isoladas, repetir o teste. Nos meios transparentes (MH, HTM, GC 1%), os halos devem ser medidos em mm (rgua ou craveira), com a placa fechada invertida debaixo de luz reflectida a um ngulo de 45, sobre um fundo negro. Na leitura do disco de oxacilina nos Staphylococcus spp., e do disco de vancomicina nos Enterococcus spp., observar cuidadosamente o halo de inibio com luz transmitida, segurando a placa entre a luz e o observador. Qualquer crescimento dentro da zona de inibio indicativo de resistncia meticilina ou vancomicina, respectivamente.

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Nos meios com sangue, retirar a tampa e medir os halos pela frente, com luz reflectida a um ngulo de 45. Quando testado um microrganismo hemoltico medir cuidadosamente o halo de inibio e ignorar a hemlise. Com excepo do disco de oxacilina nos Staphylococcus spp. e disco de vancomicina nos Enterococcus spp., ignorar a presena de pequenas colnias visveis apenas com luz transmitida, ou com lupa. Ignorar a presena de swarming nas estirpes de Proteus spp.. Na leitura dos halos de sulfamidas, trimetoprim ou cotrimoxazol, ignorar pequenas colnias em crescimento (haze), medindo o halo correspondente a 80% ou mais de inibio. Grandes colnias que crescem dentro do halo de inibio, podem representar cultura mista ou variantes resistentes. Devem ser repicadas, subcultivadas, identificadas e retestadas para TSA. Se os testes derem o mesmo resultado, ou na zona de resistncia, dar como resistente.

7. PROCEDIMENTOS ESPECIAIS

7.1. HAEMOPHILUS SPP. O meio de cultura a utilizar sugerido pelo NCCLS o Haemophilus test medium (HTM) Para o inculo utilizar o mtodo directo da suspenso das colnias a partir de uma placa de gelose chocolate com 18 a 24 horas de crescimento. Fazer uma suspenso em caldo de MH ou NaCl a 0,85% ajustada a 0,5 da escala de McFarland. Uma vez que este microrganismo produz grandes halos de inibio no meio HTM, devem ser aplicados menos discos (habitualmente 3). Incubar as placas a 35 C em atmosfera de 5% CO2 durante 16 a 18 horas.

7.2. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE ou outros STREPTOCOCCUS spp. O meio de cultura a utilizar o Mueller-Hinton c/ 5% sangue carneiro (MH5%SC). Para o inculo utilizar o mtodo directo da suspenso das colnias a partir de uma placa de gelose sangue com 18 a 24 horas de crescimento. Fazer uma suspenso em caldo de MH ou NaCl a 0,85% ajustada a 0,5 da escala de McFarland. Incubar em 5% CO2 durante 20-24 horas a 35C.

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A resistncia Penicilina de Streptococcus viridans deve ser feita determinando a CIM.

7.4. NEISSERIA GONORRHOEAE O meio de cultura a utilizar a Gelose GC suplementado a 1% aps autoclavagem. Para o inculo, utilizar o mtodo directo da suspenso das colnias a partir de uma placa de gelose chocolate com 18 a 24 horas de crescimento. Fazer uma suspenso em caldo de MH ajustada a 0,5 da escala de McFarland (contm 1 8 a 4 X 10 CFU/ml) Incubar em 5 % CO2 durante 20-24h a 35C.

7.5 NEISSERIA MENINGITIDIS No h critrios padronizados para o mtodo de difuso em agar (Kirby-Bauer)

7.6. MORAXELLA CATARRHALIS Fazer apenas a pesquisa da -lactamase pelo mtodo da nitrocefina - susceptibilidade extrapolada para ampicilina, penicilina e amoxicilina. Para os outros AM (cotrimoxazol, tetraciclina, eritromicina, amoxicilina+c.clavulnico, cefuroxime, cefotaxime, e cloranfenicol) utilizar a Tabela 2 do NCCLS M2-A7.

8. CONTROLE DE QUALIDADE O controle de qualidade deve ser efectuado fazendo o antibiograma das estirpes padro durante 30 dias consecutivos. Para cada antibitico, se apenas 3 em 30 resultados estiverem fora dos limites de confiana, o CQ pode ser reduzido para semanal. Para um controle dirio, apenas 1 em 20 resultados pode estar fora dos limites. Para um controle semanal, todos os resultados devem estar dentro dos limites. Quando houver resultados fora dos controles, efectuar aces correctivas.

ESTIRPE PADRO E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 S. aureus ATCC 25923

Indicao
Conjunto de discos para bacilos Gram negativo

Observaes
Estirpe -lactamase negativa Estirpe -lactamase positiva Estirpe -lactamase negativa

-lactmico+inibidor das -lactamases

Conjunto de discos para cocos Gram positivo

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ESTIRPE PADRO P. aeruginosa ATCC 27853 E. faecalis ATCC 29212 ou 33186 H. influenzae ATCC 49247 H. influenzae ATCC 49766 H. influenzae ATCC 10211 N. gonorrhoeae ATCC 49226 S. pneumoniae ATCC 49619

Indicao
Aminoglicosdeos Cotrimoxazol Controle de aminoglicosdeos Alta Carga (AC) Conjunto de testes para Haemophilus Algumas cefalosporinas Controle de crescimento do HTM Conjunto de testes para N. gonorrhoeae Conjunto de testes para S. pneumoniae e outros Streptococcus spp.

Observaes

Verifica as quantidades de timidina do agar Utilizar com HTM Utilizar com HTM Utilizar com HTM

Utilizar com MH 5 %SC

9. INTERPRETAO do TESTE Desde que o Controle de Qualidade com as estirpes padro esteja dentro dos limites de confiana - Tabela 3 e 3A , interpretar as zonas de inibio de acordo com as tabelas do NCCLS e descrever o microrganismo como sensvel, intermdio ou resistente a cada AM testado. SENSVEL o microrganismo responde teraputica com o AM utilizando a dosagem normalmente recomendada para aquele tipo de infeco e espcie bacteriana. RESISTENTE improvvel uma boa resposta teraputica s concentraes de AM atingidas com as dosagens habitualmente utilizadas com aquele AM e/ou est presente um mecanismo especfico de resistncia. INTERMDIO a CIM do AM para o microrganismo prxima do valor que ele pode atingir no sangue ou tecidos e para a qual a resposta clnica inferior de uma estirpe sensvel. Implica clinicamente a sua utilizao em locais onde a droga concentrada fisiolgicamente (urina) ou a utilizao de altas doses do AM (-lactmico). Tabela 2A Enterobacteriaceae Tabela 2B P. aeruginosa e Acinetobacter Tabela 2C Staphylococcus spp. Tabela 2D Enterococcus spp.. Tabela 2E Haemophilus spp. Tabela 2F Neisseria gonorrhoeae Tabela 2G Streptococcus pneumoniae Tabela 2H Outros Streptococcus spp.. Tabela 2I Vibrio cholerae A leitura interpretativa do TSA pressupe um conhecimento vasto sobre os antimicrobianos, incluindo a estrutura qumica, modo de aco, farmacodinmica, farmacocintica, mecanismos de resistncia e respectivos fenotipos, resistncia intrnseca, e correlao dos resultados in vitro com a resposta clnica teraputica.

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Algumas regras importantes (ver comentrios nas tabelas respectivas) : 9.1. ENTEROBACTERIACEAE Nas estirpes de Salmonella e Shigella spp. isoladas nas fezes, s deve ser testada a ampicilina, uma quinolona e o cotrimoxazol. Para as estirpes isoladas em infeces extraintestinais, testar tambm o cloranfenicol e uma cefalosporina de 3 gerao. No testar cefalosporinas de 1 e 2 gerao e aminoglicosdeos. Os resultados para a Salmonella spp. no devem ser fornecidos aos clnicos nas gastroenterites sem gravidade. O disco de ampicilina representativo da ampicilina e amoxicilina. O disco de cefalotina representativo da cefalotina, cefapirina, cefradina, cefalexina, cefaclor e cefadroxil. A cefazolina, cefuroxime, cefpodoxime, cefprozil e loracarbef devem ser testadas individualmente. Nas estirpes isoladas no LCR, testar e informar o resultado para o ceftriaxone ou cefotaxime.

9.2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA e ACINETOBACTER spp. O tamanho dos halos dos aminoglicosdeos so dependentes do pH e da constituio do meio, devido s variaes catinicas, pelo que a Tabela 2B s deve ser aplicada quando a estirpe de P.aeruginosa ATCC 27853 se encontra dentro dos limites aceitveis. O cloranfenicol, cotrimoxazol e tetraciclina podem ser testados nas estirpes de Acinetobacter, mas no na Pseudomonas aeruginosa.

9.3. STAPHYLOCOCCUS spp. O disco de oxacilina 1g deve ser utilizado para testar a susceptibilidade s penicilinas resistentes penicilinase (meticilina, nafcilina, cloxacilina, dicloxacilina e flucloxacilina) por ser mais resistente degradao do armazenamento e por detectar melhor as estirpes heteroresistentes. Os Staphylococcus meticilina-resistentes (MRSA) so resistentes in vivo a todos os betalactmicos, associaes betalactmico+inibidor, cefalosporinas e carbapenemes, independentemente do resultado in vitro para estes AM. Um dado suspeito de estirpe MRSA a presena frequente de multiresistncia a outras classes de antimicrobianos (aminoglicosdeos, macrlidos, clindamicina e tetraciclina). Algumas estirpes de MRSA podem no ser detectados por este mtodo fazer o teste de screening da oxacilina com MH c/ NaCl. As estirpes resistentes Penicilina so quase sempre produtoras de -lactamase. Deve ser utilizado o disco de Penicilina 10 U, e os resultados so extrapolveis para todas as

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penicilinas sensveis penicilinase (ampicilina, amoxicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina e ticarcilina) O cloranfenicol, macrlidos e clindamicina no devem ser referidos nos isolados da urina.

9.4. ENTEROCOCCUS spp. No CQ, pode ser utilizada a estirpe de S. aureus ATCC 25923 para os AM referidos na tabela, excepto para o disco de Gentamicina (120g) e de Estreptomicina (300g), nos quais de deve utilizar a estirpe de E. faecalis ATCC 29212: Gentamicina - 16 a 22mm Estreptomicina - 14 a 19mm Cotrimoxazol (1.25/23.75g)- 20 mm (testa o contedo em timidina do meio MH)

O disco de ampicilina representativo da ampicilina, amoxicilina e combinaes com inibidores das betalactamases para as estirpes no produtoras de -lactamase. O disco de Vancomicina deve ser lido s 24 horas, utilizando luz transmitida (ver procedimento geral - leitura das placas) e um resultado intermdio deve ser confirmado com a determinao da CIM. recomendada a deteco da resistncia penicilina ou ampicilina exclusivamente pela produo de -lactamase pelo mtodo da nitrocefina. No devem ser testados cefalosporinas, clindamicina, cotrimoxazol e aminoglicosdeos (excepto ALTA CARGA) devido a serem potencialmente errneos.

9.5. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Deve ser utilizado o disco de Oxacilina de 1g para detectar a resistncia Penicilina e no o disco de Penicilina (10 U): Sensvel - 20 mm ( CIM 0,06g/ml) Resistente - 19 mm Este mtodo no distingue a resistncia intermdia (CIM entre 0,06-1g/ml) da alta resistncia (CIM 2 g/ml). Em estirpes com um halo a 19 mm deve ser determinada a CIM da Penicilina e do Ceftriaxone ou Cefotaxime. A resistncia Penicilina NO por produo de -lactamase por isso este teste no deve ser utilizado. O disco de Oxacilina representativo para as Aminopenicilinas e Cefalosporinas orais (1 e 2 geraes). Se a estirpe fr sensvel Penicilina tambm sensvel a todas as Cefalosporinas e Carbapenemes. A susceptibilidade ao Cefotaxime e Ceftriaxone deve ser feita pela determinao da CIM e no pelo mtodo de difuso.

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Nas infeces graves (meningite, bacterimia) deve ser determinada a CIM para a Penicilina, Cefotaxime ou Ceftriaxone bem como Vancomicina. As estirpes sensveis Ofloxacina tambm so sensveis Levofloxacina.

9.6. STREPTOCOCCUS spp. Nos Streptococccus viridans isolados em hemoculturas e locais no estreis (LCR) a susceptibilidade Penicilina deve ser determinada pela CIM.

9.7. HAEMOPHILUS spp. Deve ser feita a pesquisa da -lactamase, e as estirpes POSITIVAS devem ser dadas como resistentes ampicilina e amoxicilina, independentemente do tamanho dos halos. As raras estirpes resistentes ampicilina -lactamase NEGATIVAS (alterao das PBP) devem ser consideradas resistentes s associaes -lactmico+inibidor das -lactamases, Cefaclor, Cefetamet, Cefonicid, Cefprozil, Cefuroxime, Loracarbef e Piperacilina/Tazobactam, independentemente dos resultados in vitro para estes agentes. Nas estirpes isoladas em hemoculturas e LCR em infeces graves (meningite, bacterimia, epiglotite, celulite, etc.) s deve ser dado o resultado da Ampicilina, Cefalosporina de 3 gerao e Cloranfenicol. O resultado dos AM administrveis por via oral s deve ser dado nas infeces localizadas pouco graves (sinusite, otite mdia no complicada, infeces broncopulmonares)

9.8. NEISSERIA GONORRHOEAE A deteco de resistncia plasmdica Penicilina deve ser feita pela pesquisa da lactamase, pelo mtodo da nitrocefina.

10. LIMITAES da TCNICA

Este mtodo apenas est padronizado para bactrias de crescimento rpido e alguns microrganismos de crescimento exigente, referidos no incio. Sempre que seja utilizado para os microrganismos sem mtodo de difuso padronizado, os resultados devem ser dados como presumptivos, devendo isso ser referido no resultado final (p.ex.: Eikenella spp.) Alguns bacilos Gram negativo no fermentativos, crescem melhor a 30 que a 35C, e podem dar halos de inibio anormalmente grandes a 35C, originando falsas susceptibilidades. Este mtodo s vlido para P. aeruginosa e Acinetobacter spp.

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Em culturas > 24 horas, o n. de microrganismos inviveis aumenta, pelo que o inculo 8 feito pelo mtodo directo ajustado a 0,5 da escala McFarland, contm menos de 1.5 x 10 CFU/ml. Existem numerosas FONTES DE ERRO que podem afectar os resultados: Inculo demasiado concentrado ou diludo. Composio do meio de Mueller-Hinton: pH, contedo inico em Mg e Ca (estes ies afectam a susceptibilidade da P.aeruginosa aos aminoglicosdeos) e contedo em timina e timidina. Espessura do meio : se < 4 mm - aumento do dimetro dos halos e vice-versa . Perda da potncia dos discos. Pr incubao das placas > 15 minutos. Pr-difuso das placas > 15 minutos. Temperatura incorrecta da estufa de incubao e frigorfico. Erros na leitura dos halos e erros de transcrio.
++ ++

11. TESTE DE DESPISTE de RESISTNCIA METICILINA do Staphylococcus spp. em meio slido (Tabela M7-A5) O meio a utilizar o Mueller-Hinton c/ NaCl (4%p/v ; 0,68 mol/L). A concentrao de AM de 6ug/ml Oxacilina ou 10 ug/ml Meticilina. Para o inculo utilizar o mtodo DIRECTO de suspenso das colnias (0,5 da escala de McFarland). Incubar a 35C em aerobiose durante 24 horas. A presena de 1 colnia sinnimo de RESISTNCIA. Para o CQ utilizar as estirpes de Staphylococcus aureus ATCC 29213 (susceptvel) e de Staphylococcus aureus ATCC 43300 (resistente).

12. TESTE de DESPISTE da RESISTNCIA de ALTO NVEL AOS AMINOGLICOSDEOS nas estirpes de Enterococcus spp. pelo mtodo de difuso em agar (Tabela M2-A7) O meio a utilizar a gelose Mueller-Hinton. Os discos de AM a utilizar so: Gentamicina 120ug e Streptomicina 300ug Leitura dos halos Tabela 2D

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Um resultado intermdio deve ser confirmado por outros testes (diluio em agar ou microduluio).

PESQUISA de LACTAMASES

1. INTRODUO As -lactamases so enzimas bacterianos heterogneos que clivam o anel - lactmico das Penicilinas e Cefalosporinas para inactivar o AM. As -lactamases so encontradas numa variedade de bactrias Gram positivo e Gram negativo. Os enzimas produzidos pelos Staphylococcus spp, Haemophilus spp, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae e Enterococcus faecalis, so clinicamente importantes. O significado dos enzimas produzidos pelas Enterobacteriaceae menos claro e estas bactrias no devem ser testadas para pesquisa de -lactamases. No entanto, o aparecimento das -lactamases de espectro estendido (ESBL) nestas bactrias tem merecido especial ateno particularmente no que diz respeito aos seus mecanismos de resistncia. Os processos mais usados nos laboratrios para pesquisar as -lactamases so: 1. Mtodo da cefalosporina cromognea 2. Mtodo acidimtrico 3. Mtodo iodomtrico Todos estes testes so baseados na deteco visual dos produtos finais da hidrlise dos lactmicos pela -lactamase, os quais so detectados por reaco colorimtrica.

2. AMOSTRAS 4 a 5 colnias morfologicamente semelhantes de uma cultura pura e isoladas de qualquer meio no selectivo, com 18 a 24 horas de incubao. Alguns Staphylococcus spp. requerem induo, isto uma prvia exposio a um agente -lactmico para aumentar a produo do enzima para nveis detectveis. Neste caso, seleccionar colnias da periferia do halo de inibio do disco de 1 g de oxacilina.

3. Mtodo da CEFALOSPORINA CROMOGNICA 3.1. Princpio Discos de papel de filtro so impregnados com Cefinase (cefalosporina cromognea). A lactamase hidrolisa a ligao amido do anel -lactmico e produz alterao de cor.

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Este mtodo o preferido no uso clnico porque fcil de realizar e detecta as mais conhecidas -lactamases incluindo as dos Enterococcus spp, Neisseria spp e Moraxella catarrhalis. 3.2. Meios e Reagentes Discos / bastes de Cefinase (Nitrocefin), guardados sempre em congelador (20C) H2O destilada esterilizada Laminas de vidro Pipetas Pasteur esterilizadas Ansa

3.3. Procedimento (Cefinase em disco) Humedecer com H2O destilada e esterilizada o disco de Nitrocefin previamente colocado na lmina de vidro Usando uma ansa, remover 4 a 5 colnias morfologicamente semelhantes da cultura e depositar na superfcie do disco. Verificar se h modificao da cor: resultados positivos aparecem 15 segundos a 5 min depois. Se no houver alterao de cor o teste negativo

Nota: Algumas estirpes de Staphylococcus spp. podem dar reaces tardias ( at 1 hora )

4. Mtodo ACIDIMTRICO 4.1. Princpio Pode ser realizado em tira ou disco de papel e em tubo e utiliza uma soluo de vermelho de fenol. A soluo ou o disco contm benzilpenicilina e um indicador de pH, normalmente o vermelho de fenol ou a prpura de bromocresol. A -lactamase hidrolisa a benzilpenicilina e forma acido penicilinico, causando uma descida do pH e uma consequente alterao da cor. Fcil de realizar mas no detecta todas as lactamases. 4.2. Meios e reagentes Disco ou tira acidimtrica Restante material igual ao do mtodo anterior

4.3. Procedimento Igual ao do mtodo anterior O resultado positivo ocorre dentro de 10 min. Se no houver alterao de cor aos 10 min, considerar o teste negativo

Nota: Algumas estirpes de Staphylococcus spp. podem dar reaces tardias.

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O mtodo acidimtrico em tubo e o mtodo iodomtrico no so descritos neste manual por no serem de execuo fcil na prtica diria laboratorial. O mtodo iodomtrico no to especfico nem to sensvel como os mtodos anteriores.

5. Procedimentos ESPECFICOS -lactamases nos Staphylococcus spp.: A produo de -lactamase pelos Staphylococcus spp. requer induo pela exposio destes Penicilina. Se um teste negativo 1 hora em bactrias que no foram expostas a um agente indutor (-lactmico), no se pode concluir que o isolado no seja produtor de -lactamase. Deve-se retestar a estirpe aps a induo com um lactmico. A pesquisa das -lactamases tem a vantagem de ter os resultados disponveis muito mais precocemente que os testes de susceptibilidade convencionais. A produo de -lactamase no o nico mecanismo de resistncia aos -lactmicos (embora seja o mais frequente). Um teste de -lactamase positivo indica resistncia Penicilina, Ampicilina e Amoxicilina. Um teste de -lactamase negativo no garante susceptibilidade a estes agentes, pelo que dever ser efectuado um teste de susceptibilidade convencional. Os testes de microdiluio com CIM falham para detectar a produo de -lactamases nalgumas estirpes que a produzem em pequenas quantidades. Um teste aps induo necessrio nestas situaes.

-lactamases na Moraxella catarrhalis As recomendaes do NCCLS para os testes de rotina da Moraxella catarrhalis s incluem a realizao de pesquisa de -lactamase, uma vez que a incidncia de resistncias aos outros AM muito baixa. Deve ser feita com Nitrocefin -lactamases no Haemophilus influenzae Se a -lactamase negativa, recomenda-se o teste de susceptibilidade convencional Ampicilina, porque h outros mecanismos de resistncia (alteraes das PBPs) principalmente se o Haemophilus isolado de locais habitualmente estreis (consultar testes de difuso com discos).

-lactamases na Neisseria gonorrhoeae Todas as estirpes devem ser testadas para pesquisa de -lactamase com Nitrocefin -lactamases no Enterococcus faecalis O mtodo da cefalosporina cromognea o nico mtodo que mostrou ser eficaz na deteco de produo da -lactamase pelo Enterococcus faecalis ( no requer induo)

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Estirpes de Enterococcus faecalis produtores de -lactamase geralmente parecem ser susceptveis Ampicilina e Penicilina pelos mtodos convencionais de difuso em disco e CIM, mas devem ser dados como Resistentes a estes agentes se so produtores de lactamase.

6. CONTROLO de QUALIDADE Estirpes padro utilizadas - Staphylococcus aureus ATCC 29213 - positiva - Haemophilus influenzae ATCC 10211 - negativa Manter as culturas stock a 70 C at 3 anos ou at perderem a viabilidade. Subcultivar duas vezes antes de testar. Testar as estirpes de C.Q. sempre que se realiza o teste e em cada novo lote de reagentes. Registar os resultados na folha de registo do C.Q. e determinar se os resultados so aceitveis.

7. TESTES de DESPISTE e CONFIRMATRIOS da presena de LACTAMASES DE ESPECTRO ALARGADO (ESBL) em estirpes de K. pneumoniae, K. oxytoca e E. Coli 7.1. TESTES de DESPISTE O meio a utilizar a gelose Mueller-Hinton. Discos de AM a utilizar (um ou mais dos seguintes): - Cefpodoxime (10ug) - Ceftazidima (30ug) - Aztreonam (30ug) - Cefotaxime (30ug) - Ceftriaxone (30ug) Para o inculo, seguir os mtodos recomendados no procedimento geral. Incubao a 35C, em aerobiose , durante 16-18 horas. Se se obtiver um dos seguintes resultados presena de ESBL suspeita. - Cefpodoxime 22mm - Ceftazidima . 22mm - Aztreonam 27mm - Cefotaxime 27mm - Ceftriaxone 25mm

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Para o CQ, utilizar as estirpes E.coli ATCC 25922 e K.pneumoniae ATCC 700603. - Cefpodoxime 9 a 16mm - Ceftazidima - 10-18mm - Aztreonam - 9-17 mm - Cefotaxime 17-25mm - Ceftriaxone 16-24 mm

7.2. TESTES CONFIRMATRIOS O meio a utilizar a gelose Mueller-Hinton. Discos de AM a utilizar: Ceftazidima (30ug) Ceftazidima/c.clavulnico (30/10ug) e Cefotaxime (30ug) Cefotaxime/c.clavulnico (30/10ug)

Para os testes confirmatrios utilizar os discos de Cefotaxime e Ceftazidima isolados e em combinao com o cido clavulnico Para o inculo, seguir os mtodos recomendados no procedimento geral. Incubao a 35C, em aerobiose , durante 16-18 horas. Um aumento de 5 mm do halo de inibio para cada AM testado isolado e com o c.clavulnico ESBL POSITIVO Para o CQ, utilizar as estirpes: E. coli ATCC 25922 aumento de 2 mm do halo de inibio para cada AM testado isolado e com o c.clavulnico K. pneumoniae ATCC 700603 - aumento de 5 mm do halo de inibio Ceftazidima e de 3 mm do halo de inibio do Cefotaxime

As estirpes de Klebsiella spp e E. coli produtoras de ESBL podem ser clinicamente resistentes ao tratamento com Penicilinas, Cefalosporinas e Aztreonam apesar da aparente susceptibilidade in vitro, por isso deve ser informada a resistncia a todos estes agentes Nota: H outros mtodos confirmatrios como, p. ex., a deteco do sinergismo entre Amoxicilina/cido Clavulnico com Cefotaxime, Ceftazidime ou Aztreonam.

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TESTES DE DIFUSO Microrganismo AM a testar Tabela de leitura Inculo Meio de cultura

MH

Temp. Tempo de incubao

30-35C 16-18 horas 24 horas (oxacilina)

Atmosfera

Estirpes CONTROLE
S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 35218 S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 P. aeruginosa ATCC 27853 E.coli ATCC 35218 H. influenzae ATCC 49247 H. influenzae ATCC 49766 H. influenzae ATCC 10211 E. coli ATCC 35218 N. gonorrhoeae ATCC 49226 S. pneumoniae ATCC49619 S. pneumoniae ATCC49619 E. coli ATCC 25922

Staphylococcus spp Tabela 1

Tabela 2 C M2-A7 Directo Directo /LPG Directo /LPG Directo /LPG

aerobiose

Enterococcus spp. Enterobacteriaceae P. aeruginosa e Acinetobacter spp. Haemophilus spp.

Tabela 1 Tabela 1 Tabela 1

Tabela 2 D M2-A7 Tabela 2 A M2-A7 Tabela 2 B M2-A7

MH MH MH

35C 35C 35C

16-18 horas 24 Horas aerobiose (vancomicina) 16-18 horas 16-18 horas aerobiose aerobiose

Tabela 1 A

Tabela 2 E M2-A7 Directo

HTM

35C

16-18 horas

5% CO2

N. gonorrhoeae S. pneumoniae Streptococcus spp. V. cholerae

Tabela 1 A Tabela 1 A Tabela 1 A

Tabela 2 F

Directo

GC+1% suplement 35C o MH5%SC MH5%SC MH 35C 35C 35C

20-24h 20-24h 20-24h 16-18 horas

5% CO2 5% CO2 5% CO2 aerobiose

Tabela 2 G M2-A7 Directo Tabela 2 H M2-A7 Directo Tabela 2I M2-A7 Directo /LPG

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A QUALIDADE em MICROBIOLOGIA
(Q Qualidade ; LM Laboratrio de Microbiologia) A Qualidade consiste num espectro de actividades e processos que formam as caractersticas de um produto ou servio, espectro esse que se divide em traos gerais, em 5 nveis: 1. Qualidade total ou gesto total da Qualidade ou melhoria contnua da Qualidade abordagem de gesto que visa o sucesso a longo prazo atravs da satisfao do cliente, ou seja, uma forma de gesto que pretende, atravs da satisfao das necessidades do cliente atingir sucesso a longo prazo. Satisfao do cliente ao mais baixo custo. 2. Gesto da Qualidade - consiste na coordenao e articulao dos vrios elementos que dizem respeito poltica de Qualidade, seus objectivos, responsabilidades, e meios de implementao tais como: planeamento da Qualidade, controlo da Qualidade, garantia da Qualidade, melhoria da Qualidade. 3. Sistema de Qualidade - todo o conjunto de esforos para atingir os objectivos da Qualidade, i.e., a estrutura organizacional, recursos, processos e procedimentos necessrios para assegurar a conformidade do produto ou servio, sem desvios em relao a um referencial escolhido. 4. Garantia de Qualidade - conjunto de actividades que demonstram que uma organizao atingiu um nvel aceitvel de Qualidade. 5. Controlo de Qualidade - tcnicas operacionais para medir, comparar com objectivos, identificar erros ou problemas e respectivas medidas correctivas. Actualmente, a maioria dos servios de sade operam a nvel do Controlo de Qualidade (nvel 5) e da Garantia de Qualidade (nvel 4). Os servios de sade devem fazer um esforo para atingir, pelo menos, o nvel 3 (Sistema de Qualidade), particularmente se pretendem corresponder aos requisitos de Sistemas Acreditao ou Certificao os quais inevitavelmente, acabaro por se impor em todos os pases europeus ( por ex. Certificao segundo as Normas ISO 9000, Certificao segundo o Kings Fund, Acreditao segundo a Norma NP 17025). Para que uma organizao como um hospital atinja os padres de Qualidade desejados necessria a participao activa de todo o seu pessoal. Num Hospital, as funes de cada grupo profissional tm que estar definidas na estrutura de gesto da Qualidade da Instituio (ver quadro n. 1). O conceito de Qualidade em Microbiologia dever portanto ser encarado como parte do conceito mais vasto da Qualidade dos servios de sade. Assim cada LM dever procurar implementar sua escala um sistema de Qualidade.

Para implementar um sistema de Qualidade em Microbiologia bom comear por definir especificamente nesta rea trs (3) termos muito utilizados: Controlo de Qualidade (CQ) - monitorizao contnua das prticas de trabalho, do equipamento e dos reagentes. o prprio pessoal que faz a avaliao dos resultados/dados. Tambm denominado Controlo de Qualidade Interno.

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Avaliao de Qualidade (AQ) ou Avaliao do desempenho - consiste na avaliao por terceiros, do desempenho do LM atravs da anlise dos resultados obtidos em exames de material de controlo (amostras fictcias) realizados da forma e nas condies habituais de funcionamento do LM. Tambm denominado Controlo de Qualidade Externo, embora a avaliao do desempenho possa ter origem externa ou interna ao LM. Garantia da Qualidade (GQ) - o processo total que garante a Qualidade dos resultados finais fornecidos pelo laboratrio; compreende no s o controlo da fase analtica mas tambm das fases pr e ps analticas do ciclo analtico. O controlo da fase analtica compreende tanto o CQ como a AQ.

FASE PR-ANALTICA

1. Utilizao RACIONAL do Laboratrio de Microbiologia Para garantir a Qualidade dos seus servios, o LM tem uma palavra a dizer na forma como utilizado utilizao racional do LM. Assim, indispensvel existirem recomendaes quanto adequao, nmero e frequncia dos pedidos de exame microbiolgico. Tais recomendaes devem ser estabelecidas por consenso entre os responsveis dos servios clnicos e os microbiologistas. Em laboratrios informatizados o prprio Programa informtico pode ser concebido para fazer cumprir tais recomendaes. Alguns exemplos: Se recepcionada uma hemocultura isolada em 24 horas, automaticamente emitida uma mensagem para o mdico/servio requisitante chamando a ateno para a necessidade de colher trs (3) hemoculturas a fim de optimizar o diagnstico de bacterimia. Se recepcionadas duas (2) ou mais uroculturas em dias consecutivos, automaticamente emitida uma mensagem para o mdico/servio requisitante informando que as amostras redundantes s sero processadas depois de consultado o Microbiologista.

No sentido de uma utilizao racional o LM deve ainda, recusar a requisio de exames microbiolgicos que no permitem obter resultados clinicamente fiveis, como por exemplo: Exsudados uretrais para diagnstico de infeco urinria. Exsudados vaginais para diagnstico de endometrite. Urina colhida por jacto mdio para cultura de anaerbios. Expectorao para cultura de anaerbios. Exsudados nasofarngeos para diagnstico de otite mdia aguda ou sinusite.

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2. COLHEITA e TRANSPORTE das AMOSTRAS A Qualidade dos resultados microbiolgicos est directamente dependente da Qualidade e adequao das amostras recebidas, por isso amostras correctamente colhidas e transportadas ao laboratrio so essenciais para a Qualidade dos resultados em Microbiologia. O LM responsvel pela elaborao de normas de colheita e transporte das amostras, bem como pela sua divulgao junto dos utilizadores (utentes, pessoal da sade, servios clnicos, etc.). Essas normas devem incluir, no mnimo, indicaes sobre: Desinfeco do local da colheita Mtodo da colheita, tipo e volume de amostra Recipientes a utilizar (esterilizados e com encerramento hermtico) Meios de transporte Dados que devem constar na requisio (ex.: data e hora da colheita, tipo de produto, se h presena de dispositivos invasivos, se o doente est a fazer teraputica antibitica, etc.)

O LM tambm deve monitorizar regularmente se as amostras so transportadas dentro de um prazo razovel de tempo. Para isso necessrio saber a data e hora da colheita e a data e hora da recepo no LM (ver sondas de Qualidade - Quadro n. 8). O LM deve, no mnimo, documentar a data e hora da recepo da amostra no laboratrio. O LM deve poder garantir a informao que determinada amostra deu entrada no laboratrio e em que ponto do processamento se encontra ( audit trail). O LM deve ainda, estabelecer normas para avaliao da qualidade das amostras recebidas e deve recusar amostras cuja qualidade duvidosa, no permitindo a obteno de resultados fiveis tais como : zaragatoas de material de leses da boca, abcessos perianais, lceras de decbito ou lquios, pontas de alglia, pontas de drenos, tubos orotraqueais, etc.

3. Poltica de REJEIO de AMOSTRAS O LM deve estabelecer claramente uma poltica de rejeio de amostras cujo principal objectivo seja evitar a produo de resultados errneos e garantir a segurana e sade quer do pessoal que faz o transporte quer do pessoal do laboratrio. O LM tem de estabelecer critrios especficos de rejeio de amostras e aces subsequentes, como por exemplo: Amostra no identificada - no processar at resoluo do problema. Chamar algum do servio requisitante para vir ao LM fazer a identificao. Discrepncia entre a identificao da requisio e da amostra - pedir ao mdico/servio requisitante para resolver o problema. Documentar o ocorrido no relatrio de resultados.

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Amostra em contentor visivelmente conspurcado - avisar o mdico/servio requisitante. No processar. Amostra enviada em recipiente inadequado - notificar o mdico/servio requisitante e se possvel colher nova amostra. S processar se no for possvel nova colheita, documentar o problema no relatrio de resultados. Atraso excessivo entre a colheita e a recepo no LM - notificar o mdico/servio requisitante e pedir nova colheita. S processar se grave prejuzo para o doente, documentar o problema no relatrio de resultados. Volume insuficiente de amostra para todos os testes solicitados - notificar o mdico/servio requisitante para que escolha os exames prioritrios.

FASE PS ANALTICA

O LM deve responsabilizar-se pela entrega atempada dos resultados ao mdico/servio requisitante. O LM deve estabelecer os tempos de demora mdia esperada para cada tipo de anlises executadas. Embora idealmente o tempo de demora mdio esperado deva ser estimado entre o momento da colheita e o momento em que o resultado entregue ao mdico/servio requisitante, em termos prticos o LM apenas consegue garantir o tempo que decorre desde o momento em que a amostra recepcionada no laboratrio e o momento em que o respectivo resultado emitido. Sempre que se detecta um erro depois do resultado ser emitido deve fazer-se um novo relatrio de resultados corrigido mas sem apagar o erro original, i.e., o relatrio corrigido deve referir claramente o erro ocorrido. As eventuais correces com importncia clnica relevante devem ser comunicadas de imediato ao mdico/servio prescritor. Sempre que se detecta algum erro, o LM deve proceder s modificaes necessrias de polticas e/ou procedimentos para evitar a recorrncia do erro. Idealmente o LM deve estabelecer uma poltica para a comunicao o mais rpida possvel de informao com particular relevncia clnica (por ex. resultados positivos de exames directos ou culturais de Lquor, presena de B.A.A.R. em amostras respiratrias, hemoculturas inequivocamente positivas, etc.), bem como proceder a uma monitorizao apertada do tempo de demora mdio na obteno dessa mesma informao. Se a poltica do LM incluir a comunicao telefnica de determinada informao deve ficar documentado quem d a informao, quem a recebe, data e hora da comunicao. A comunicao telefnica pode levar a mal-entendidos e por isso deve ser restringida apenas aos dados clinicamente relevantes e urgentes. Toda a informao comunicada pelo telefone dever ser considerada preliminar at sua apresentao por escrito. Os LM hospitalares devem periodicamente (no mnimo anualmente) disponibilizar os resultados cumulativos dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos, j que esta informao de grande importncia para a seleco racional das teraputicas antimicrobianas empricas, para desenvolver e actualizar o formulrio de antimicrobianos do hospital e para analisar e prever as tendncias de resistncia nos microrganismos isolados.

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FASE ANALTICA

O controlo da fase analtica compreende tanto o CQ (Controlo de Qualidade Interno) como a AQ (Avaliao da Qualidade ou Controlo de Qualidade Externo). O CQ e a AQ so actividades complementares e no podem ser usadas para se substiturem uma outra. Devem aplicar-se Programas de Controlo de Qualidade quer internos quer externos que sejam prticos, realistas e econmicos, independentemente da dimenso do laboratrio. Cada laboratrio deve desenvolver o seu prprio Programa de Qualidade, pois o tempo e recursos despendidos variam (na razo inversa) consoante o volume e o leque de anlises realizadas no laboratrio. No necessrio monitorizar todos os reagentes e todas as tcnicas todos os dias. A frequncia da monitorizao deve ser directamente proporcional frequncia dos erros detectados. Para ser bem sucedido o Programa de Qualidade deve ser supervisionado por um membro snior da equipa tcnica

1. CONTROLO de QUALIDADE INTERNO O CQ interno reparte-se pelas seguintes reas principais: Manual de procedimentos Manuteno e controlo do equipamento Monitorizao dos meios de cultura e reagentes (corantes, antisoros, discos de identificao, discos de antibioGrama, etc.).

Para um Programa eficaz de CQ indispensvel que o LM possa dispor de um conjunto mais ou menos extenso de estirpes microbianas de referncia, reconhecidas internacionalmente, tambm chamadas estirpes de coleco (ATCC American Type Culture Collection, NCTC National Collection of Type Cultures) e que esto disponveis em vrias fontes comerciais. Estas estirpes tm caractersticas e comportamentos bem definidos e conhecidos e por isso servem de referncia ou controlo (ver quadros n. 2 e 3). 1.1. MANUAL de PROCEDIMENTOS (MP) O MP o documento mais importante para melhorar e manter a Qualidade de um servio ( imprescindvel para a Acreditao dos Laboratrios de Microbiologia Clnica). Deve conter toda a informao relevante sobre o funcionamento do LM. Embora o MP de outros laboratrios possa ser usado como guia, cada LM tem caractersticas especficas e portanto deve desenvolver o seu prprio MP. A utilizao exclusiva da literatura inclusa nos kits comerciais no recomendada embora a sua utilizao como fonte de informao seja de encorajar.

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O MP para ser verdadeiramente til tem que preencher 4 requisitos: 1. Ter carcter vinculativo - deve ser elaborado por um ou mais membros seniores da equipa tcnica, com reconhecida idoneidade e experincia prtica na matria e deve ser ratificado pela pessoa que tem a responsabilidade dos procedimentos em uso no LM. 2. Ser realista - fazendo uma descrio clara, concisa e explicativa dos procedimentos (por exemplo, recorrendo a uma descrio por passos numerados), evitando ideais tericos. Procedimentos complicados rapidamente deixam de ser respeitados e cumpridos. Um MP bem estruturado aquele que permite a qualquer tcnico de outro laboratrio executar determinado exame apenas com recurso ao MP. 3. Estar actualizado - formalmente o MP deve ser revisto anualmente; no entanto a reviso deve ser um processo contnuo sendo o MP actualizado sempre que necessrio. Nenhum procedimento novo ou modificado deve entrar em uso at ser verificado pelo responsvel do LM e oficialmente incorporado no MP. Todos os procedimentos originais e subsequentes revises e/ou modificaes devem ser datadas , aprovadas e assinadas pelo responsvel do LM. Todos os procedimentos que se tornaram obsoletos devem ser conservados por um perodo regulamentado por lei. 4. Estar disponvel - o MP deve estar facilmente acessvel nas reas de trabalho a todo o pessoal relevante. da responsabilidade dos profissionais mais velhos e experientes garantir que o MP seja rigorosamente cumprido.

O LM deve conservar, por um perodo regulamentado por lei, os registos suficientes para documentar todos os aspectos respeitantes s anlises executadas sobre as amostras recepcionadas.

1.2. MANUTENO e CONTROLO dos EQUIPAMENTOS Junto de cada equipamento deve estar o seu manual de instrues com: Descrio do equipamento Princpio de funcionamento e seu objectivo Acessrios e reagentes - necessrios ao seu funcionamento Avarias /problemas mais frequentes e respectiva resoluo Procedimentos de C.Q. de rotina Programa de manuteno

Cada LM deve estabelecer um Programa de manuteno e controlo de todos os equipamentos em uso. Esse Programa tem que ser documentado atravs de um registo concebido e adaptado a cada laboratrio: por exemplo pode ir de simples fichas a um Programa informtico (ver Quadro n. 4). Actualmente, a microbiologia clnica utiliza cada vez mais equipamento complexo que exige um Programa de manuteno adequada a fim de evitar avarias e consequentes perodos em que no pode ser utilizado (down time).

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Os Programas de manuteno geralmente contemplam dois aspectos: 1) Manuteno de rotina - tarefas necessrias, (incluindo a limpeza), para manter em funcionamento todos os elementos que constituem determinado equipamento. Tem que estar definida no Manual de procedimentos. 2) Manuteno peridica - a sua frequncia ou periodicidade definida em funo do tipo de equipamento e respectiva utilizao. Os equipamentos mais utilizados exigem uma manuteno mais frequente do que aqueles usados raramente.

Embora o pessoal do laboratrio se possa encarregar da manuteno mais simples e deva ser responsabilizado por tarefas especficas da manuteno de rotina, as tarefas mais complicadas (manuteno peridica) so da responsabilidade dos Servios de Instalao e Equipamentos (SIEs) ou da responsabilidade do prprio fabricante do equipamento, mediante um contrato de manuteno. Os custos dos contratos de manuteno devem ser pesados contra os custos de reparao, quase sempre mais caros, e contra as consequncias dos tempos de imobilizao do equipamento (down time). A manuteno do equipamento no deve ser encarada como um aspecto secundrio da Qualidade. Uma vez definida (responsabilizao, tarefas especficas e periodicidade) e treinado o pessoal, o Programa deve ser regular e sem interrupes. Uma soluo prtica aconselhada atribuir especificamente a um determinado tcnico do laboratrio a responsabilidade da manuteno, bom funcionamento de cada aparelho e respectiva documentao. Nos equipamentos cuja temperatura crtica, esta deve ser controlada com termmetros calibrados. Os limites de tolerncia geralmente considerados aceitveis so os seguintes: Estufas de incubao: 2c, excepto se uma dada temperatura especfica exigida. Banhos-maria e blocos de aquecimento: 1c. Frigorficos: 4 - 8c Congeladores: 5c. Ultra congeladores: 10c, desde que abaixo de 60c.

A limpeza das superfcies dos equipamentos deve seguir as instrues do fabricante, o qual recomenda por vezes, a sua prpria soluo de limpeza e descontaminao. Evitar as solues de hipoclorito de sdio nas partes metlicas devido sua aco corrosiva. As solues mais indicadas so geralmente de lcool a 70%. O uso de toalhetes de papel embebidos na soluo desinfectante indicada pode ser uma soluo prtica. Devem seguir-se todas as recomendaes de segurana no que se refere ao equipamento, preconizadas no manual de segurana do laboratrio. Leitura recomendada para informao mais detalhada sobre manuteno e controlo de equipamentos: captulo n. 12 de Clinical Microbiology Procedures Handbook 1992, ASM.

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1.3. MONITORIZAO DOS MEIOS DE CULTURA E REAGENTES 1.3.1. MEIOS de CULTURA Dos meios de cultura (comercializados ou preparados no prprio LM) esperam-se as seguintes caractersticas: Esterilidade e Propriedades nutritivas para permitir o desenvolvimento microbiano e/ ou Propriedades de selectividade ou inibio para determinados microrganismos e/ou Capacidade para manifestar uma resposta bioqumica apropriada. Meios preparados no LM Se os meios de cultura forem preparados no prprio laboratrio a partir de materiais desidratados que tm de ser reconstitudos, aquecidos e por vezes suplementados com aditivos, essencial controlar o efeito de cada um desses passos. Todos os lotes antes de serem utilizados, tm que ser testados quanto a: 1. Esterilidade do Meio (testes de esterilidade) Uma amostra representativa de cada novo lote incubada 18-24h a 35-37C, e mais 24h temperatura ambiente (para excluir a contaminao com bactrias psicrfilas). Para lotes de 100 unidades ou menos, uma amostra representativa deve ser no mnimo de 5% das unidades; para lotes maiores 10 unidades escolhidas ao acaso suficiente. A contaminao dos meios selectivos pode no ser detectada pelos testes habituais de esterilidade mas se forem dissolvidos alguns mililitros do produto final em 10 vezes o seu volume de caldo estril (para diluir as substncias inibidoras) detecta-se qualquer eventual contaminao. Se os testes de esterilidade mostrarem contaminao o respectivo lote no deve ser usado. As amostras usadas nos testes tm que ser descartadas no podendo ser reutilizadas (devido desidratao).

2. Comportamento do Meio A capacidade para proporcionar o desenvolvimento microbiano ou exibir determinadas qualidades selectivas e/ou diferenciais testada com o recurso a estirpes de controlo. Ver quadro n. 5. Sempre que aplicvel e possvel, podem utilizar-se as estirpes descritas no quadro n. 2 como estirpes controlo. No entanto, estirpes selvagens isoladas no prprio LM, depois de bem caracterizadas, de preferncia em laboratrio de referncia, podem ser conservadas e utilizadas no CQ.

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As estirpes de controlo podem alterar as suas caractersticas quando so mantidas em subculturas sucessivas, prefervel manter as estirpes congeladas a 70 C ou liofilizadas.

2.1. Testes para a Capacidade de Desenvolvimento Semear os meios a testar com um inculo leve e incubar nas mesmas condies em que vo ser utilizados por rotina. Para obter um inculo leve, fazer uma suspenso da estirpe de controlo apropriada com densidade de 0.5 de McFarland; diluir esta suspenso de 1/10 ou 1/100 em caldo estril ou soro fisiolgico. Inocular os meios a testar com: 1 microlitro - para a diluio de 1/10 10 microlitros - para diluio de 1/100 A inoculao nos meios slidos pode fazer-se com ansa calibrada.

2.2. Testes para a Capacidade de Inibio ou Selectividade Os meios selectivos so concebidos no s para permitir o desenvolvimento de alguns microrganismos, mas tambm para inibir o crescimento de outros e por isso devem ser testados com 2 tipos de estirpes controlo, um cujo desenvolvimento esperado e outro cuja inibio esperada: Inocular pelo menos um microrganismo para testar as caractersticas de desenvolvimento e um microrganismo para testar/confirmar as caractersticas inibitrias. Para se demonstrar o efeito inibitrio semear os meios a testar com um inculo forte e incubar nas mesmas condies em que vo ser utilizados por rotina. O inculo utilizado deve ser forte: suspenso bacteriana com densidade de 0.5 de McFarland Inocular os meios a testar com 10 microlitros.

2.3. Testes para a resposta Bioqumica (caractersticas fenotpicas) Para cada resposta esperada especfica (por exemplo fermentao de hidratos de carbono, produo de SH2, produo de indol, etc.) tem que se inocular um microrganismo apropriado que produza a desejada reaco. Deve usar-se pelo menos um microrganismo como controlo positivo, que produz a reaco esperada e um microrganismo como controlo negativo, que no produz a reaco esperada. Os meios diferenciais (com indicadores bioqumicos) tambm so testados com 2 tipos de estirpes controlo: um que se sabe demonstrar resposta positiva e outro que se sabe demonstrar resposta negativa. Os laboratrios que preparam os seus prprios meios tm que arranjar uma forma prtica mas segura para os rotular com indicao do n. de lote, data de preparao e data de validade - expirao.

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Os contentores de meios desidratados usados no laboratrio devem ter registada a sua data de abertura ( a sua composio e prazo de validade geralmente j fazem parte do rtulo comercial). O prazo de validade dos meios preparados no prprio LM varivel e o LM deve informarse disso, mas de um modo geral:

Os meios em placa duram cerca de: - 15 dias - se conservados a 4c - 4-6 semanas - se conservados a 4c, em sacos de plstico fechados Os meios em tubo duram cerca de : - 2 semanas - se conservados temperatura ambiente - 4 semanas - se conservados a 4c, com rolhas arejadas (de algodo) - 6 meses - se conservados a 4c e fechados hermeticamente Meios Comercializados prontos-a-usar: Actualmente, a maioria dos laboratrios usa meios de cultura comercializados cuja Qualidade controlada pelo prprio fabricante ou entidade autorizada. O LM deve ter a documentao, fornecida pelo fabricante/vendedor comprovativa de que o meio de cultura adquirido (comprado) est conforme o protocolo de CQ recomendado pelas autoridades ou entidades de sade de cada pas. Esta documentao muitas vezes faz parte da bula. O utilizador no necessita de repetir o protocolo de CQ, excepto no que se refere verificao se o meio no est desidratado, hemolisado, contaminado ou fracturado, ou ainda sempre que se verifique algum mau funcionamento de qualquer dos meios em utilizao nas condies de rotina do laboratrio. Nestes casos o CQ faz-se segundo um esquema idntico ao descrito para os meios preparados no prprio laboratrio

1.3.2. REAGENTES Todos os reagentes em uso, quer de origem comercial quer preparados no prprio laboratrio, devem estar rotulados quanto sua composio, data de preparao (ou abertura) e prazo de validade. Os reagentes de origem comercial devem ser conservados de acordo com as instrues do fabricante, descartados quando fora do prazo de validade, e sujeitos a CQ preconizado pelo fabricante. Todos os reagentes em uso, quer de origem comercial quer preparados no prprio laboratrio, devem ser testados regularmente com pelo menos uma testemunha positiva e uma testemunha negativa; esta periodicidade varivel de acordo com cada reagente e deve ser estabelecida pelo Microbiologista responsvel (Quadros n. 6 e n. 7). Os kits de identificao microbiana de origem comercial, so geralmente constitudos por uma coleco mais ou menos extensa de testes miniaturizados, pelo que o seu CQ tem que demonstrar que todos os testes esto a funcionar correctamente quer isoladamente quer no seu conjunto; assim quase sempre necessrio recorrer a vrias estirpes de

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controlo (e no apenas a uma testemunha positiva e outra negativa). As estirpes de controlo a utilizar devem ser indicadas pelo fabricante (muitas vezes so estirpes descritas no Quadro n. 3). Leitura recomendada para informao mais detalhada sobre monitorizao dos meios de cultura e reagentes: captulo n. 13 de Clinical Microbiology Procedures Handbook 1992, ASM.

AVALIAO DA QUALIDADE ( AQ)

Tambm denominada avaliao da proficincia, avaliao do desempenho ou controlo de Qualidade externo da Qualidade, embora a sua origem possa ser externa ao LM ou no. A Avaliao da Qualidade consiste na avaliao do desempenho do LM atravs da anlise dos resultados obtidos/ emitidos nos exames de material de controlo, realizados da forma e nas condies habituais de funcionamento. Na prtica, a avaliao da Qualidade consiste num sistema em que amostras de contedo conhecido mas no revelado, so introduzidas no laboratrio para serem examinadas exactamente da mesma forma que so examinadas na prtica habitual do laboratrio as amostras semelhantes dos doentes/utentes. Os resultados obtidos so depois comparados com os resultados esperados e que no tinham sido revelados. Esta avaliao do desempenho pode ser Externa ou Interna: 1. Na Avaliao Externa h uma entidade externa ao LM que regularmente envia as amostras controlo para serem examinadas e procede avaliao dos resultados. 2. Na Avaliao Interna o prprio LM que cria amostras de controlo, por exemplo a partir de material biolgico. Essas amostras so examinadas no prprio LM em tempos diferentes ou por tcnicos diferentes, comparando-se depois a fiabilidade e reproductibilidade dos vrios resultados obtidos, ou ento essas amostras so enviadas para um laboratrio de referncia para posterior comparao dos resultados. Todos os LM devem estar envolvidos em Programas de avaliao da Qualidade de acordo com o respectivo grau de especializao (Bacteriologia geral, Micobacteriologia, Micologia, Parasitologia, Biologia molecular, etc.) Devido sua complexidade e diversidade em relao s outras reas da medicina laboratorial, torna-se muito difcil produzir materiais de controlo que abranjam todas as reas da microbiologia; alm disso existem vrias dificuldades tcnicas na preparao de amostras para a AQ (ex.: manter a viabilidade dos microrganismos, conseguir a uniformizao de todas as amostras, conseguir a simulao de amostras reais, etc.) por isso, quase sempre mais fcil e mais econmico participar num Programa j em funcionamento (p.ex.: NEQAS) do que estar a criar o seu prprio Programa.

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INDICADORES ou SONDAS de QUALIDADE

Actualmente uma das formas mais recomendadas para avaliar a Qualidade global dos servios de sade, incluindo a Medicina Laboratorial atravs da comparao de indicadores de desempenho com padres/objectivos/especificaes considerados desejveis. Um indicador (tambm chamado sonda ou monitor) uma varivel mensurvel relacionada com algum aspecto da prestao de cuidados (servios). Devem escolher-se indicadores teis, capazes de fazer a discriminao entre um sistema que est a funcionar bem e outro com deficincias. importante compreender que os indicadores mais teis podem requerer acesso a informao que no est facilmente disponvel no laboratrio por exemplo o processo clnico do doente/utente. No Quadro n. 8 mostram-se alguns indicadores apropriados para a prtica da microbiologia.

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QUADRO n. 1 - FUNES DO PESSOAL Programa de GARANTIA de QUALIDADE

CARGO / ORGO

FUNO
Liderar e apoiar o Programa de melhoria de Qualidade da Instituio. Designar o pessoal e distribuir os recursos destinados s actividades do Programa de melhoria de Qualidade. Delinear os objectivos/metas do Servio, rever os procedimentos, interpretar os resultados do Programa externo de Qualidade. Fazer a ligao com as outras unidades funcionais da Instituio. Rever e aprovar as polticas e procedimentos necessrios para se conseguir atingir as metas traadas num Programa de melhoria de Qualidade. Implementar procedimentos e gerir a informao de acordo com os objectivos/metas do Programa de Garantia de Qualidade. Providenciar junto do Director, recomendaes para melhorar produtos e servios. Participar na monitorizao e avaliao dos servios laboratoriais. Providenciar recomendaes para melhorar produtos e servios.

Conselho de Administrao

Director do Laboratrio ( Servio de Patologia Clnica )

Director Clnico

Director / Responsvel do LM

Microbiologista e Tcnicos de microbiologia

QUADRO n. 2 - ESTIRPES PADRO indicadas para CONTROLO de ATMOSFERA DE INCUBAO Tipo de Atmosfera Estirpe controlo Comentrio
Pode utilizar-se uma estirpe CO2 dependente isolada no prprio LM

Atmosfera de CO2 (5-10%) Atmosfera de microaerofilia (10% CO2, 5% O2 e 85% de N2 ) Atmosfera de anaerobiose (5% Hidrognio, 10% CO2 e 85% de N2)

N. gonorrhoeae ATCC 43069

C. jejuni ATCC 33291

Clostridium novyi A ATCC 19402 Fusobacterium nucleatum ATCC 25586

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QUADRO n. 3 - ESTIRPES-PADRO indicadas para os TESTES de SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIMICROBIANOS Mtodo de diluio (NCCLS)
ATCC 29213 (produtora de lactamase) ATCC 29212 ATCC 27853 ATCC 25922 ATCC 43300 ATCC 51299 ATCC 700603 ATCC 35218 ATCC 49619 ATCC 49766 ATCC 49247 ATCC 10211 ATCC 49296 ATCC 35218 NCTC 11954 NCTC 11560 ATCC 49619 NCTC 12977 NCTC 12140 ATCC 49766 ATCC 49247 NCTC 12699 ATCC 10211 ATCC 49296 NCTC 12700 NCTC 12700 Para testar os inibidores da lactamase Mtodos de difuso em Mueller-Hinton com sangue NCTC 11913 Para testar Cefalosporinas de 1 e 2 G (orais) Para testar antimicrobianos em geral excepto Cefalosporinas de 1 e 2 G (orais) no meio HTM. Para testar meio de HTM, especialmente indicado para os fabricantes Mtodos de difuso em meio de GC

MICRORGANISMO

Mtodo de difuso (NCCLS)

ATCC 25923 NCTC 12981 (no produtora de -lactamase) ATCC 29212 NCTC 12697 ATCC 27853 NCTC 12934 ATCC 25922 NCTC 12241 NCTC 12493

Mtodo de difuso comparativo (Stokes)

NCTC 6571 NCTC 12697 NCTC 10662 NCTC 10418

Comentrios
ATCC 29213 pode ser usada como controlo positivo e a ATCC 25923 como controlo negativo nos testes de produo de lactamase Para testar o contedo do meio em antagonistas do Trimetoprim-Sulfametoxazol

S. aureus (sensvel aos AM habitualmente testados) E. faecalis (sensvel aos AM habitualmente testados) P. aeruginosa (sensvel aos AM habitualmente testados) E. coli (sensvel aos AM habitualmente testados) S. aureus ( resistente Meticilina) E. faecalis (resistente Vancomicina e Aminoglicosidos alta concentrao) K. pneumoniae ( produtora de lactamases de espectro expandido) E. coli ( produtora de lactamase) S.pneumoniae (sensibilidade intermdia Penicilina) H. influenzae H. influenzae H. influenzae N. gonorrhoeae

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QUADRO n. 4 - CONTROLO e MANUTENO dos EQUIPAMENTOS FREQUNCIA

EQUIPAMENTO Estufas de incubao aerobiose Estufas de incubao CO2 Diria ou em cada utilizao ou em cada lote Registo da temperatura Registo da temperatura Verificar presso de CO2 (5-10%) Subcultura de estirpe de N. gonorrhoeae ATCC 43069 Limpeza com gua e detergente Subcultura de estirpe de N. gonorrhoeae ATCC 43069 Limpeza com gua e detergente Subcultura de estirpe de C. jejuni ATCC 33291 Verificar temperatura e presso de gs Usar indicador redox: azul de metileno ou resazurina. Reactivar o catalisador (aquecer 2h a 160C) se aplicvel Limpeza com gua e detergente. Usar um indicador (azul de metileno /resazurina). Reactivar o catalisador (aquecer 2h a 160C) se aplicvel Verificar registos de Temperatura Controlo do equilbrio Limpeza Verificar temperatura Retirar leo de imerso.Cobrir para proteger do p. Segundo indicaes do fabricante Segundo as indicaes do fabricante Verificao do fluxo de ar.Limpeza com lcool 70 Limpeza das superfcies. Filtragem e reposio dos corantes Limpeza das cuvettes. Renovao dos corantes Segundo indicaes do fabricante. Controlo com estirpes de referncia Segundo as indicaes do fabricante Limpeza e descontaminao Limpeza das lentes e platina Segundo indicaes do fabricante Segundo as indicaes do fabricante Semanal Verificar humidade (40-50%) Limpeza Verificar humidade Verificar se paredes e tampa esto deterioradas (substituir se necessrio) Verificar se paredes e tampa esto deterioradas (substituir se necessrio) Cultura controlo de Clostridium novyi A ATCC 19402 Verificar humidade. Limpeza e descontaminao com cloreto de Benzalkonium Mensal Limpeza Testar com dispositivo de Fyrite Peridica (por pessoal especializado) Reviso anual Reviso anual Verificar ventoinha e contaminao com fungos

Jarras de CO2

Jarras de microaerofilia

Cmara de Anaerobiose

Reviso anual

Jarras de anaerobiose

Verificar se paredes e tampa esto deterioradas (substituir se necessrio) Testar indicador biolgico- Bacillus stearothermophilus Verificar vlvulas de segurana.

Autoclaves

Limpeza

Reviso anual Reviso anual Teste com tacmetro Reviso anual Descongelar bianual Reviso anual Limpeza, lubrificao e realinhamento Reviso anual

Centrfugas Frigorficos

Microscpios Equip.autom. identificao microbiana e antibioGrama Equipamentos automatizados Hemoculturas Cmaras de segurana

Reviso anual Verificar integridade dos filtros HEPA e o fluxo do ar bianual Reviso anual

Colorador de laminas

(Alguns dos intervalos entre revises so da responsabilidade dos autores deste trabalho)

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QUADRO n. 5 - CONTROLO do COMPORTAMENTO dos MEIOS de CULTURA

Meio de cultura Gelose-sangue ( 24h aerobiose) Gelose-chocolate MacConkey Thayer-Martin (selectivo para N. Gonorrhoeae) Gelose selectiva para Campylobacter Gelose SS

Estirpes de controlo
S. pyogenes H. influenzae N. gonorrhoeae E. coli P. mirabilis N. gonorrhoeae E. coli S. epidermidis Candida spp C. jejuni E. coli E. aerogenes E. coli S. typhimurium E. coli P. mirabilis P. aeruginosa F. necrophorum C perfringens S. pneumoniae B. fragilis B. fragilis S. aureus S. pyogenes S. typhimurium E. coli P. vulgaris E. coli

Incubao
24h aerobiose 24h aerobiose 24h CO2 24h aerobiose 24h CO2 48h microaerofilia 24h aerobiose

Resultados esperados
Desenvolvimento: colnias com -hemlise Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento: colnias rosadas Desenvolvimento: colnias incolores Desenvolvimento Sem desenvolvimento Sem desenvolvimento Sem desenvolvimento Desenvolvimento Sem desenvolvimento Desenvolvimento: colnias rosadas Sem ou escasso desenvolvimento Desenvolvimento: colnias incolores com centro negro Rampa pH cido e base pH cido, com gs, sem SH2 Rampa pH alcalino e base pH cido, com gs, com SH2 Rampa pH alcalino e base pH alcalino, sem gs, sem SH2 Desenvolvimento Desenvolvimento: colnias com dupla zona de hemlise Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento Desenvolvimento na subcultura Sem ou com escasso desenvolvimento na subcultura Positivo: mudana para cor rosa forte Negativo: sem mudana de cor ou cor amarela A subcultura deve fazer-se 12h aps a inoculao.

Colnias rosadas -FL Colnias incolores - NLF

Kligler ou TSI Gelose-sangue para anaerbios Caldo de hemocultura para Aerbios Caldo de hemocultura para Anaerbios Thioglicolato, BHI ou outros Caldo de Selenito, Tetrationato ou GN Caldo de ureia (produo de urease)

24h aerobiose At s 48 h anaerobiose 24h aerobiose 24h anaerobiose 24h anaerobiose 24h aerobiose 12h aerobiose 4-6h aerobiose

pH cido: cor amarela pH alcalino: cor rosa-vermelho SH2: cor negra Gs: bolhas de ar ou meio fracturado

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QUADRO n. 6 - CONTROLO de REAGENTES Reagente Microrganismo

S. aureus Streptococcus spp S. aureus S. epidermidis E. coli E. aerogenes P. aeruginosa

Reaco esperada
Positiva : borbulha Negativa : no borbulha Positiva: formao de cogulo em 4h Negativa: ausncia de cogulo Positiva: formao de anel vermelho superfcie em 24h. Negativa: formao de anel amarelo superfcie Positiva: cor prpura em 10-30 segundos. Negativa: sem cor em 10-30 segundos Crescimento volta do disco XV, em 24 h

Comentrio
Usar H2O2 a 3% O teste tambm pode fazer-se com uma gota de sangue

Catalase (H2O2) Coagulase (plasma) Indol

O teste em spot pode ser controlado da mesma forma

Oxidase Factores de crescimento: Discos de X, V, XV Optoquina (disco) Discos impregnados de antibitico Colorao de Gram Colorao de Kinyoun e ZiehlNeelsen
(cido-alcoolresistente)

E. coli H. influenzae

S. pneumoniae S. viridans
Estirpes ATCC indicadas no captulo TSA

Sensvel em 24h = halo de inibio de 19 mm Resistente = sem zona de inibio. Halo de inibio com dimetro dentro dos limites esperados (tabela NCCLS ) Gram positivo: cor azul escuro (cocos em cacho) Gram negativo: cor vermelhorosado (bastonetes) Bacilos vermelho-rosados sobre um fundo azul Os laboratrios de nvel de segurana 2 podem usar M. tuberculosis. As tabelas so actualizadas periodicamente

(para TSA difuso)

S. aureus E.coli M. gordonae

Colorao de fluorescncia
(cido-alcoolresistente)

M. gordonae Streptomyces spp

Positiva: bacilos com fluorescncia amarela Negativa: bacilos azuis no fluorescentes De acordo com indicaes do fabricante As estirpes de controlo so quase sempre estirpes de coleco conhecidas

Kits de identificao de origem comercial

Estirpes de controlo indicadas pelo fabricante

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QUADRO n. 7 - FREQUNCIA do CONTROLO de REAGENTES Reagente Reagentes qumicos: catalase, coagulase, indol, oxidase, etc Discos de optoquina, discos de factores de crescimento Discos impregnados de antibitico (para TSA difuso) Soros para deteco de antignios (antisoros de identificao) Colorao de Gram, Kinyoun, Ziehl-Neelsen Colorao de fluorescncia Kits de identificao de origem comercial Frequncia do controlo

Cada vez que se abre novo frasco e depois em cada dia de utilizao

Cada vez que se abre novo frasco e depois semanalmente

Cada vez que se inicia novo lote e depois semanalmente

Cada vez que abre um frasco novo e depois mensalmente

Cada vez que se utiliza novo lote ou frasco e depois semanalmente Cada vez que se utiliza novo lote ou frasco e depois em cada utilizao

Cada novo lote

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QUADRO n. 8 - INDICADORES ou SONDAS de QUALIDADE

Procedimento/ Amostra Hemoculturas Hemoculturas Expectorao Expectorao Expectorao Liquor (LCR) Liquor (LCR) Liquor (LCR) Liquor (LCR) Urina Urina AntibioGrama (TSA) AntibioGrama (TSA) Objectivo Utilizao adequada Colheita correcta Colheita apropriada Utilizao adequada Interpretao correcta do Gram Colheita apropriada Colheita apropriada Utilizao adequada Utilizao dos resultados Colheita apropriada Utilizao adequada Utilizao dos resultados Utilizao dos antimicrobianos Indicador Hemoculturas isoladas ou > 3 hemoculturas/ 24h Hemoculturas contaminadas Esfregao corado pelo Gram: > 25 clulas epiteliais por campo 10 Uma nica colheita para pesquisa de BAAR Correlao entre a observao do Gram e os resultados da cultura Volume suficiente para os exames requisitados Culturas contaminadas Requisio para serologia da sfilis, pesquisa de antignio criptoccico ou culturas para micobactrias quando o exame citoqumico normal Instituio de teraputica face ao resultado preliminar do Gram Culturas com 2 agentes Repetio de colheitas no mesmo doente Correlao da teraputica antimicrobiana com o TSA Taxa cumulativa dos perfis de susceptibilidade aos AM Anlise Determinar a prevalncia e as razes de hemoculturas isoladas ou em n. excessivo Determinar a % de contaminantes, taxa por servios, etc. Rever os procedimentos quando verificada uma taxa muito alta Determinar a % global e por servios, de amostras de m Qualidade. Interveno educativa quando detectada uma % muito elevada Determinar a % global e por servios. Determinar as razes de uma nica colheita Rever as discrepncias e as razes da incorrecta interpretao Do Gram. Determinar o n. de amostras com volume insuficiente. Calcular a sua % global e por servios. Rever os procedimentos quando verificada uma taxa muito alta Determinar o n. de contaminantes e a % global e por servios. Verificar se a deficincia do laboratrio ou da colheita. Determinar a % de resultados positivos e a razo dos pedidos. Desenvolver um algoritmo para a requisio dos exames. Determinar a % de doentes tratados com antibitico em funo do resultado positivo do Gram ( dever ser 100% nos casos inequvocos) Determinar a % global e por servios (no dever ser > 5%) Determinar a razo do problema: colheita incorrecta?, atraso no transporte?, etc. Determinar a razo de > 2 colheitas/semana. Infeco suspeita ou confirmada?. Determinar a % de tratamentos adequados e tratamentos discrepantes. Notificar imediatamente o mdico assistente. Publicitao dos dados para as decises de teraputica emprica. Reviso dos dados com fins epidemiolgicos, ex. : tendncias de resistncia.

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Bibliogragia principal (QUADRO N. 8):

Raymond C. Bartlett. MEDICAL MICROBIOLOGY quality cost and clinical relevance: John Wiley& sons, 1974. JJS Snell, ID Farrel, C Roberts. QUALITY CONTROL principals and practice in microbiology laboratory: PHLS, 1992. Henry D. Isenberg . Clinical Microbiology procedures Handbook: ASM, 1992. RC Bartlett, MMSulivan, JZ Tetreault, S Lobel, J Nivard. Evolving approaches to management of Quality in Clinical Microbiology. 1994. Clin Microbiol. Rev. 7: 55-88. JJS Snell, DFJ Brown, C Roberts. QUALITY CONTROL - principals and practice in microbiology laboratory: PHLS, 1999. NCCLS. Performance and standards for antimicrobial susceptibility testing, 2002.

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O LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA NA VIGILNCIA

EPIDEMIOLGICA DAS INFECES

Os dados de rotina do laboratrio constituem o ponto de partida da maioria dos mtodos de vigilncia epidemiolgica das infeces nosocomiais. Por outro lado, o laboratrio solicitado, com alguma frequncia, a realizar estudos microbiolgicos para outros fins que no o de diagnstico de infeco. O contributo da Microbiologia no Controlo de Infeco abrange as seguintes reas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Identificao correcta e atempada dos agentes de infeco Vigilncia das resistncias aos antimicrobianos Procedimentos especficos para caracterizao de estirpes Investigao de surtos Culturas para vigilncia de doentes e de pessoal Culturas para vigilncia do ambiente

CONSIDERAES GERAIS A. Um aspecto fundamental que deve ser tido em considerao quando o laboratrio fornece informao para fins epidemiolgicos a distino entre n de agentes isolados e n de doentes/infeces. A anlise de resultados globais ou de isolamentos leva a distores significativas pelo que, para alm da excluso de isolamentos repetidos no mesmo doente, deve haver uma poltica clara sobre a incluso de estirpes isoladas em infeces da comunidade versus infeces nosocomiais por um lado e, por outro, a excluso de duplicados (quando se considera um isolamento uma mesma infeco). B. Do ponto de vista do estudo de resistncias e dadas as limitaes dos mtodos automatizados, o laboratrio deve ter a possibilidade de executar mtodos manuais para confirmao epidemiolgica de resistncias. C. Finalmente, considerando a necessidade de estudos suplementares ou tipagem de estirpes deve ser definida uma poltica para conservao de culturas iniciais em casos de microrganismos resistentes ou outros microrganismos alerta e a conservao de estirpes multirresistentes especficas consideradas endmicas ou nosocomiais dando origem a surtos. No estando no mbito deste captulo abordar os aspectos relacionados com a actividade de rotina do laboratrio iremos considerar apenas os aspectos da colaborao do laboratrio na investigao de surtos, culturas de vigilncia de doentes e profissionais, esclarecimento das contaminaes ambientais nomeadamente de superfcies, do ar e dispositivos mdicos.

INVESTIGAO de SURTOS Um surto definido como o aparecimento de um nmero de casos de uma infeco superior ao habitual. A nvel hospitalar e quando se refere, por exemplo, a microrganismos

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multirresistentes, um surto o isolamento, em dois ou mais doentes, da mesma estirpe multirresistente. A investigao de surtos necessria para os controlar e evitar novos surtos, para melhorar os conhecimentos no que se refere ao hospedeiro, ao agente e suas inter-relaes no ambiente, para avaliar ou iniciar um sistema de vigilncia e ainda para desenvolver aces educativas no terreno. So as seguintes as etapas de uma investigao de surto: 1. Identificao do problema Comprovar a existncia de surto excluindo os falsos surtos devidos mudana de tcnicas laboratoriais ou de rotinas de requisio de exames devido a novos profissionais ou novos servios. Confirmar o diagnstico recorrendo aos isolamentos microbianos, serologia, etc. ( suficiente a confirmao de mais ou menos 20% dos casos)

2. Caracterizao do surto Definir e contar os casos: recorrer a critrios simples tendo em conta a definio habitual de infeco trata-se de uma definio epidemiolgica e no clnica. No caso de microrganismos multiresistentes deve-se distinguir infeco da colonizao. Calcular a taxa de ataque. Organizar os dados em funo de tempo (curva epidemiolgica) local e pessoas

3. Identificao das causas e resoluo da situao Determinar a populao de risco Formular/testar uma hiptese: veculo comum ou transmisso directa ou indirecta? pessoa a pessoa ou por vector? Comparar a hiptese com os factos. Deve haver concordncia entre dados clnicos, laboratoriais e epidemiolgicos. Aprofundar o estudo para precisar melhor os pormenores da via de transmisso, veculos e dose infectante e para definir melhor os grupos de risco e outros factores pertinentes. Redigir o relatrio Recomendar e implementar as medidas de controlo e preveno

Em diversas destas etapas necessria a interveno do laboratrio nomeadamente atravs de Tipagem de estirpes, estudos em doentes, no pessoal ou no ambiente.

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TIPAGEM DE ESTIRPES A investigao de surtos muitas vezes requer o reconhecimento e diferenciao da estirpe causal. Se se trata da mesma estirpe (clone) pode-se inferir tratar-se de uma fonte ou reservatrio comum ou de transmisso de pessoa a pessoa. Tradicionalmente as estirpes epidmicas tm sido caracterizadas, recorrendo a mtodos fenotpicos, por gnero, espcie, biotipo, fagotipo, produo de bacteriocina e susceptibilidade aos antimicrobianos. Os mtodos fenotpicos reflectem caractersticas genticas e so geralmente bastante especficas. Contudo, so influenciados pela presso selectiva ambiental, instabilidade de algumas das caractersticas, e pelo facto de os padres de resistncias aos antimicrobianos serem fortemente influenciados pelas prticas na utilizao de antibiticos. Por isso, torna-se por vezes necessrio recorrer aos mtodos genotpicos com anlise de DNA cromossmico ou plasmdico que pode dar informao mais rigorosa. Os diversos mtodos disponveis devem ser seleccionados de acordo com o microrganismo implicado e torna-se quase sempre necessrio recorrer ao exterior para este tipo de estudos.

Mtodos para a vigilncia microbiolgica de pessoal e doentes A vigilncia microbiolgica de profissionais e/ou doentes apenas deve ser iniciada em situaes bem definidas de surto. Em casos muito especficos e previamente definidos pode ser necessrio fazer culturas de vigilncia em doentes imunodeprimidos. importante salientar que estes estudos devem ter uma abordagem diferente das culturas para fins diagnsticos. necessrio identificar todos os microrganismos presentes e a quantificao desejvel. Por isso, a maioria dos autores no recomenda a vigilncia de doentes a no ser em situaes de surto, em que se procura um agente especfico. 1. Os locais a cultivar dependero do microrganismo suspeito:

Staphylococcus aureus : colheitas no nariz, axilas, mos e perneo. Ter presente que 30% de adultos podem ser portadores de S. aureus. essencial confirmar que se trata da mesma estirpe. Um aspecto importante a ter em conta a presena de situaes que podem favorecer a disseminao (dermatite, leses nasais e paronquia). Streptococcus beta hemoltico do grupo A : colheita da orofaringe e em situaes especiais do anus ou vagina. Enterobacteriaceae e Enterococcus: colheita por zaragatoa rectal

2. Mtodos para colheitas das mos dos profissionais: so geralmente efectuadas para estudar a contaminao/colonizao com microrganismos implicados em surtos a fim de identificar possveis vias de transmisso cruzada. Humedecer zaragatoas estreis com soro fisiolgico ou BHI e friccionar na superfcie palmar de ambas as mos. Semear em meio apropriado de acordo com o microrganismo a pesquisar e incubar 24 horas a 37C.

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Alternativa 1: colocar 50ml de BHI num saco estril. Friccionar as mos dentro do lquido durante 1minuto. Semear e incubar conforme indicado. Alternativa 2: Pressionar a face palmar da mo sobre a superfcie da placa. Incubar as placas conforme indicado.

Interpretao dos resultados: como o objectivo encontrar um microrganismo especfico a interpretao fcil devendo ser seleccionados os meios de cultura selectivos que facilitem o isolamento do agente pretendido. Para fins educativos podem-se fazer colheitas por impresso das polpas dos dedos, incluindo o polegar, numa placa de gelose. um mtodo quantitativo e no h indicao para identificao dos microrganismos encontrados. O limite aceitvel para mos limpas de menos de 5 ufc/dedo.

VIGILNCIA MICROBIOLGICA DO AMBIENTE Inclui o estudo de superfcies (clnicas e domsticas), ar e gua. A monitorizao ambiental deve ser planeada cuidadosamente porque constitui um acrscimo de custos, no existem padres validados para comparao podendo-se gerar dados inconclusivos levando implementao de procedimentos desnecessrios. Actualmente recomenda-se a monitorizao sistemtica de processos de esterilizao, gua e lquidos utilizados em hemodilise, bancos de leite materno, rgos de transplante e cmaras de fluxos laminares. Estes estudos tm sistemas prprios ou so efectuados em laboratrios especializados no sendo funo dos laboratrios de microbiologia hospitalares. As situaes especiais onde pode ser solicitada a colaborao do laboratrio so a investigao epidemiolgica para identificar reservatrios ou fontes ou, por vezes, quando se pretende provar a eficcia de um mtodo de limpeza ou desinfeco. Poder envolver dispositivos mdicos, ar, gua e outros fluidos, alimentos e superfcies.

Consideraes gerais Nunca se deve iniciar estudos do ambiente antes de se decidir de forma clara o objectivo pretendido, os critrios para avaliao dos resultados e as aces a tomar face aos resultados obtidos. Deve-se iniciar por uma reviso dos resultados dos ltimos meses a fim de identificar padres ou situaes de aparecimento do agente em estudo. Dada a especificidade dos locais e mtodos de colheita em funo do agente suspeito, recomenda-se uma reviso bibliogrfica prvia para orientao. Os estudos epidemiolgicos devem ser feitos por solicitao e com a colaborao da CCIH. Antes de iniciar o estudo, deve-se elaborar conjuntamente um plano escrito com descrio clara dos locais, nmero, mtodos e frequncia de colheitas, definir se se trata de um estudo qualitativo e/ou quantitativo, os mtodos de processamento, tempo e condies de incubao e critrios de leitura dos resultados e intervenes possveis em funo dos resultados esperados/encontrados.

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Mtodos de estudo do ambiente Podem ser estudos qualitativos e/ou quantitativos. Deve-se ter em conta a possibilidade de falsos negativos devido presena de resduos de desinfectantes, inculos muito pequenos e microrganismos com exigncias especficas. As colheitas devem ser efectuadas em condies rigorosas de asspsia. Nos mtodos quantitativos faz-se uma contagem de colnias. Nos mtodos qualitativos devem ser seleccionadas para identificao pelo menos duas colnias representativas de cada tipo morfolgico presente nas culturas. Os meios de cultura utilizados para anlise quantitativa devem ser nutritivos, no selectivos (como o BHI ou tripticase soja) com ou sem sangue. Para o estudo qualitativo so utilizados meios selectivos. Quando indicado, deve-se utilizar um meio para neutralizar detergentes ou desinfectantes presentes. A seleco do neutralisador depende do desinfectante residual presente. Quadro 1: Neutralisadores de desinfectantes qumicos Glutaraldedo; Formaldedo Fenlicos Amnios quaternrios Cloro; Iodo Perxido de hidrognio Glicina Tween 80 Lecitina + Tween 80 Tiossulfato de sdio Catalase

Nota: o Tween 80 muitas vezes recomendado como um suplemento para os lquidos usados para colheitas por lavagem Os tempos e temperaturas recomendadas para incubao so os seguintes: Bactrias Fungos Tripticase soja 30C +/- 1C 25C +/- 1C 3 dias 5 dias

ESTUDO MICROBIOLGICO DE SUPERFCIES E DISPOSITIVOS

1. Estudo microbiolgico de superfcies: placas de contacto No um mtodo para estudo da carga biolgica porque apenas recolhe uma pequena proporo de microrganismos presentes. Avalia a qualidade de higiene de superfcies planas como cho, mesas, alguns equipamentos e roupas. Pressionar a superfcie de placas (tipo RODAC) contra a rea a estudar e incubar. So necessrios um mnimo de 15 placas para uma sala mdia. A incubao deve ser de 48 horas. No deve ser utilizado em superfcies sujas ou hmidas porque o elevado n de ufc previsto no permitir uma leitura adequada das placas. Roupa: embora no existam padres para a roupa limpa considera-se que a presena de menos de 5 ufc por placa constitui um resultado aceitvel.

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2.

Mtodo de lavagem Se o artigo o permitir, imergir totalmente a pea em BHI contido num recipiente estril Retirar e estudar o lquido Para artigos como nebulizadores ou tubagens de equipamento respiratrio introduzir o lquido nos canais, agitar e recolher o lquido para estudo Colheita com zaragatoa Para superfcies grandes, planas e no absorventes, criar um molde (template) para delimitar a rea (p.ex. 5cm x 5cm) e friccionar a rea com zaragatoa humedecida em soro fisiolgico ou BHI. Os moldes so geralmente feitos em cartolina e esterilizados. Para superfcies irregulares ou com reentrncias: friccionar a zaragatoa de forma repetida (10 vezes) e consistente de modo a cobrir todas as reas. A interpretao dos resultados depende dos objectivos do estudo. No caso de dispositivos mdicos o resultado deve ser analisado em funo de se tratar de material crtico (ausncia total de microrganismos), semi-crtico ou no crtico (ausncia de agentes patognicos). Embora no existam padres estabelecidos, tm sido recomendados os seguintes critrios: 0 a 25 colnias BOM 26 - 50 colnias ACEITVEL > 50 colnias MAU

3.

Quadro 2: Principais agentes nosocomiais e suas fontes Agente Klebsiella Enterobacter Serratia P.aeruginosa B. cepacia S. maltophilia Proteus/Morganella Providencia Flavobacterium Citrobacter Acinetobacter Staphyloccocus C. difficile Legionella Micobacterias atpicas Fonte ambiental Equipamento de suporte respiratrio Fluidos IV; gua Equipamento de suporte respiratrio gua, desinfectantes, Equipamento de suporte respiratrio Reservatrios de gua, equipamento contaminado gua gua gua gua, fluidos IV gua Equipamento de suporte respiratrio Superfcies em redor de doentes e zonas sujas gua, torres de arrefecimento gua da torneira, equipamento respiratrio contaminado fonte humana faringe, fezes, urina mos, fezes, urina mos, urina mos, faringe, fezes urina mos mos mos, urina mos mos mos, secrees respiratrias mos, nariz mos, fezes secrees respiratrias secrees respiratrias

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ESTUDO MICROBIOLGICO DO AR

O nmero de partculas no ar varia em funo das condies atmosfricas, movimentao de pessoas, operao de equipamento e materiais em uso. A avaliao microbiolgica do ar no deve ser iniciada de nimo leve porque a execuo das colheitas e a interpretao das placas relativamente complexa dada a inexistncia de padres uniformes e o facto de que as partculas no ar poderem estar livres ou aglomeradas (com vrios microrganismos) e a probabilidade de as mesmas serem desfeitas ser maior ou menor conforme os mtodos de colheita. importante salientar que os dados obtidos so apenas valores indicativos e no valores absolutos reais. Para se ter uma apreciao global necessrio analisar ao partculas com 0,5 ou maiores. Os mtodos disponveis para o estudo do ar podem ser activos ou passivos. Nos mtodos activos existem equipamentos que recolhem, por tcnicas diversas, um volume estabelecido de ar que contacta com placas contendo os meios de cultura apropriados. Os resultados no esto padronizados e dependem do volume de ar, a velocidade do fluxo e o tempo da sua recolha (que so variveis para cada tipo de aparelho) e ainda do nmero de microrganismos presentes. As exigncias para este tipo de aparelhos so as seguintes: capacidade de deteco de nveis baixos de contaminao, possibilidade de controlar o volume do ar, facilidade de manuseamento, de limpeza, desinfeco e esterilizao e ainda a validao do mtodo. Os locais de colheita devem ser seleccionados em funo do risco: mesa operatria, mesa de instrumentao, locais onde h menor circulao do ar. Deve-se fazer duas colheitas de cada local. No mtodo passivo mede-se a sedimentao de partculas atravs da exposio de placas contendo meios de cultura apropriados. No h correlao com os mtodos activos j que a sedimentao afectada pelo tamanho, forma e velocidade de deposio das partculas e no possvel controlar o volume de ar estudado. No entanto, constitui um mtodo simples e barato de avaliao quantitativa, podendo ter indicao nas situaes menos complexas. A fim de permitir uma padronizao deve-se utilizar placas de 9 cm de dimetro colocadas a um nvel de 1 metro do cho e afastadas um metro das paredes e expostas durante 1 hora. A incubao deve ser feita a 37C durante 24 horas. Fungos - O ar transporta fungos oriundos do solo, ambientes hospitalares hmidos e locais em obras. Dado a sua ubiquidade, a sua avaliao s interessa em meios controlados (ambientes com ventilao com filtros HEPA, fluxos laminares, etc.). Nestas situaes o que interessa a avaliao quantitativa em comparao com ambientes contguos no controlados. Os resultados permitiro determinar a eficcia do sistema de ventilao e o seu eventual papel nas infeces em doentes imunodeprimidos.

Apenas se recomenda o estudo de fungos no ar nas seguintes situaes: 1. Infeces nosocomiais atribudas a fungos aerotransportados 2. No decurso de obras na proximidade de servios com neutropnicos 3. Aps a instalao de sistemas de ventilao especiais e antes de ocupao das respectivas instalaes. Nos equipamentos de fluxo laminar, blocos operatrios, farmcia etc. deve ser feita por outros mtodos nomeadamente contagem de partculas e anemmetro.

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ESTUDO MICROBIOLGICO DE LQUIDOS

Existem vrios mtodos para o estudo microbiolgico de lquidos e a seleco de um deles depende da natureza do lquido (pour plates, spread plates, filtros de membrana). O estudo microbiolgico da gua requer mtodos especiais pelo que deve ser efectuado em laboratrios especializados. As amostras devem ter um mnimo de 100 ml e a colheita deve ser feita com equipamento estril, recomendando-se a adio de um agente redutor (tiossulfato de sdio) para neutralizar o cloro residual. Antes de efectuar colheitas em torneiras deve-se deixar correr bastante gua e no caso de torneiras misturadoras, estas devem ser desmontadas. As amostras devem ser transportadas frias e trabalhadas dentro de 24 horas.

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