Universidade Estadual de Feira de Santana Departamento de Cincias Biolgicas

Disciplina: PROTISTAS FOTOSSINTETIZANTES

TCNICAS DE MICROSCOPIA

1. MICROSCPIO PTICO O microscpio, de uma maneira geral, compem-se de duas partes: a mecnica e a ptica. Parte Mecnica: Brao - preso base; estrutura rgida que suporte o canho, platina, condensador e a fonte luminosa; Canho - tubo onde se dispem as partes pticas de ampliao, geralmente possuindo movimento vertical; Revolver - pea giratria, onde se conectam as objetivas, permitindo a mudana das mesmas; Platina - mesa de trabalho, onde se coloca a lmina para exame; Chariot- dispositivo preso platina, destinado a movimentar a lmina em exame; Parafuso Macromtrico - destinado a deslocar verticalmente o canho, aproximando ou afastando as objetivas da lmina em observao. Serve para a localizao grosseira; Parafuso Micromtrico - tm a mesma funo da macromtrica, porm serve para a localizao fina. Parte ptica: Sistema de Iluminao: Fonte luminosa; Diafragma ris - localiza-se abaixo do condensador, destinando-se a aumentar ou restringir o feixe luminoso; Condensador - preso parte inferior da platina, o condensador converge luz em direo preparao. Sistema de Ampliao: Objetivas - sistema ptico conectado ao revolver, fornece imagem real, aumentada, do material; Oculares - sistema ptico encaixado no extremo superior do canho, ampliando a imagem fornecia pelas objetivas. 1.2 UTILIZAO E CUIDADOS COM O MICROSCPIO Transporte - segurar o brao com uma das mos e apoiar a base com a outra, mantendo o aparelho na posio vertical, para evitar que partes pticas se soltem e caiam. Choques devem ser evitados para que os sistemas pticos no saiam de concordncia. Manter o aparelho sempre limpo e evitando poeira, pois esta inimiga dos instrumentos pticos. Iluminao - pode ser regulada aproximando ou afastando o condensador de platina e abrindo ou fechando o diafragma, sempre observando atravs da ocular. Deve-se regular constantemente a luz, adaptando-a para preparaes mais opacas ou mais transparentes. Focalizao - girando o revolver, selecionar a objetiva de menor aumento. Caso esteja muito prxima platina, subir o canho, empregando o parafuso macromtrico. Colocar a preparao (lmina) sobre a platina. Olhando por fora do aparelho, baixa-se objetiva bem prxima preparao. Em seguida, olhando pela ocular e empregando o parafuso macromtrico, sobe-se o canho at observar uma imagem mais ou menos ntida. Por fim, utilizando-se o parafuso micromtrico, faz-se localizao fina. Deve-se manter o parafuso micromtrico prximo a metade do seu curso a fim de permitir movimentos livres para cima e para baixo. 2. MICROSCPIO ESTEREOSCPICO (LUPA)

A lupa utilizada constantemente para materiais muito grandes ou muito opacos para serem observados ao microscpio. utilizada ainda na preparao de material para observao ao microscpio, como por exemplo, realizao de cortes, dissociao de tecidos, localizao de estruturas, etc. Possui um sistema de iluminao inferior, principalmente para materiais mais transparentes e outro de iluminao superior, para materiais opacos. Os mesmos cuidados descritos para o microscpio devem ser tomados com a lupa e, em especial, no fazer preparaes diretamente sobre a platina, mas sim sobre lmina de vidro ou papel vegetal. 3. PREPARAO DO MATERIAL 3.1. Confeco de Cortes: A microscopia ptica s permite a observao de objetos transparentes ou translcidos; logo, exige materiais cortados em seces finas para permitir a transmisso da luz. Os cortes podem ser feitos com auxlio de micrtomo (geralmente para preparao de lminas permanentes) ou de lminas de barbear novas (lminas semipermanentes ou de curta durao). Materiais resistentes podem ser segurados com os dedos polegar e indicador e, materiais delicados, podem ser presos em um suporte macio e homogneo, como medula de imbaba, isopor, etc. Bons cortes podem ser obtidos colocando-se o material sobre papel vegetal e observando este lupa. Aps prender este como dedo indicador, secionar com gilete nova (manter um ngulo de 30 graus em relao ao material) fazendo movimentos contnuos e suaves com a mesma, sobre o material. Os cortes selecionados podem ser removidos com um pincel e colocados sobre a lmina com gua ou lcool 70%. Normalmente, para se obter um bom corte necessrio fazer vrios, selecionando apenas os melhores. 3.2. Montagem das Lminas O material para exame deve ser montado em lminas de vidro especiais para microscopia e recoberto com lamnula, tambm de vidro. A lmina deve estar limpa, sendo um bom critrio para avaliar sua limpeza, colocar uma gota de gua sobre a mesma. Se a gota se espalhar, tendendo a ocupar ampla superfcie, a lmina pode ser considerado limpa, caso contrrio deve ser novamente lavada. As lminas podem ser lavadas com detergente e guardadas em lcool 70%. A preparao deve ser feita colocando uma gota do meio de montagem sobre a lmina, com auxilio de um estilete, pina ou pincel. Se necessrio, dissocia-se o material com dois estiletes, observando-se lupa. Cobre-se a preparao com a lamnula, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. O excesso de lquido de montagem, que extravasa pelos bordos da lamnula deve ser retirado com papel absorvente, evitando-se que a platina do microscpio se molhe. A substituio de um lquido de montagem por outro, por exemplo, um corante, pode ser feito sem a remoo da lamnula. Para isso, coloca-se uma gota do novo lquido sobre a lmina, junto ao bordo da lamnula. Do outro lado de lamnula encosta-se um pedao de papel de filtro que por capilaridade promover a substituio. Preparaes semipermanentes so feitas evitando-se a evaporao do lquido de montagem. Neste coso importante empregar como lquido de montagem um fechado (formol a 4%) para evitar a decomposio do material. A vedao da lamnula pode ser feita com esmalte de unha incolor. Para isso a lmina e a face superior de lamnula devem estar bem limpas e secas. Uma preparao em lmina pode ser mantida, ainda, por curtos perodos (uma semana ou menos) em uma cmara mida feita com placa de Petri, especialmente quando o lquido de montagem for glicerina a 30%. Uma boa lmina, onde se faz uma boa observao, deve apresentar as seguintes caractersticas:

Isenta de bolhas de ar; Conter pequena quantidade de material, pois as preparaes muitos densas impedem a passagem de luz; Ter lquido em toda extenso entre a lmina e lamnula; A lamnula no deve estar flutuando (o excesso de lquido pode ser retirado com papel absorvente); Nunca deve haver lquido sob a lmina. A platina no deve ser molha.

4. ILUSTRAO Selecionar as partes e estruturas para documentar o estudo, iniciando pelo aspecto geral, em observao macroscpica em lupa e finalmente ao microscpio. Neste ltimo, inicia-se com a objetiva de menor aumento, passando-se para aumentos maiores conforme o que se pretende observar. As legendas nunca devem faltar e devem ser indicadas por meio de traos bem visveis e cuja extremidade se localize sobre a estrutura correspondente. 5. SOLUES FIXADORAS E CORANTES EMPREGADOS EM ESTUDOS DE ALGAS Soluo de Formalina (1 litro): Formol P.A.................... 40 ml + gua destilada ............ 960ml Soluo de Transeau: Formol a 40% 100 ml + lcool a 96o G. L 300 ml + gua destilada 600 ml

Soluo de Lugol Actico: Iodo 20 g + KI 20 g + gua destilada 200 ml + Acido acticos 20 g Soluo de Karo: um meio de montagem usado em preparao de lminas semi-permanentes. Evita o dessecamento do material pela evaporao da gua da lmina. Xarope de acar de milho (Karo) 50ml + gua destilada 50ml + 3 cristais de fenol Colorao: consiste em passar o material em solues de corantes ou reagentes. Assim o material apresentar uma cor ou duas ou mais cores diferentes, ou ento apenas algumas estruturas ficaro coradas. Os corantes empregados na aula so: Azul de anilina: corante aquoso que tm afinidade por protina, corando componentes proticos em azul. Azul de anilina. 0,05 g + gua destilada 100,0 mL Azul de toluidina : corante aquoso, cora o material de diferentes cores no espectro da cr rosa at azul devido a metacromasia. Azul de toluidina. 0,05g + gua destilada .100,0mL Nos dois casos acima, aps a colorao, lavar os cortes em gua destilada e posteriormente colocar soluo de karo. Para realizar a vedao das bordas da lamnula utilizar esmalte incolor, este procedimento evita a evaporao do meio de montagem. Para evidenciar flagelos e mucilagem das algas utiliza-se o emprego da tinta nanquim, tal procedimento deixa a lmina fosca e enegrecida permitindo evidenciar tais estruturas.