MTODOS DE ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS

Debido al tamao diminuto de los microorganismos, los mtodos de estudio de la microbiologa son caractersticos: Se necesitan: Instrumentos para observarlos con aumento Preparaciones especiales para observarlos al microscopio Conocimiento de sus requerimientos de vida Medios para cultivarlos Tcnicas para caracterizarlos, aislarlos y conservarlos.

EL MICROSCOPIO
El microscopio es el instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo, mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede aumentar el tamao original. y hacer visible un objeto microscpico. Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico. En el microscopio ptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que modifica el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos El microscopio electrnico utiliza un rayo de electrones controlado por un campo magntico

EL MICROSCOPIO OPTICO
Los microscopios de este tipo generalmente alcanzan un aumento de 1000 veces del tamao original, aunque pueden alcanzar hasta 2000 veces, pero la resolucin no es tan buena. Las lentes de un microscopio ptico son el condensador, el objetivo y el ocular. El condensador se utiliza para enfocar la luz sobre la preparacin. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz hasta conseguir el foco preciso. El objetivo es el lente ms cercano al objeto observado y con ella se logra el aumento primario del objeto. Los microscopios que se usan normalmente en microbiologa estn equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersin. Estos objetivos estn montados sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado con el condensador. El ocular es el lente ms cercano al observador, donde la imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente, llamado microscopio simple, que se usa como lupa. Resolucin. En un microscopio, adems del aumento, hay que considerar su poder resolutivo que es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. A mayor poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica. Como los microscopios pticos utilizan luz visible, la longitud de onda est fijada, por lo que la resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo. 0.5 l d: poder resolutivo; l: longitud de onda; a: mitad del ngulo de la lente objetivo d = ----------N: ndice de refraccin del medio N sen a N sen a: apertura numrica Aceites de inmersin. El medio a travs del cual pasa la luz es un factor que afecta la resolucin. . Cuando el objetivo est separado del objeto por el aire, su apertura numrica nunca ser mayor de 1,0.

Para conseguir aperturas numricas mayores, el objetivo debe estar inmerso en un lquido de mayor ndice de refraccin que el aire. A estos lquidos se les denomina aceites de inmersin que utilizados con los objetivos de inmersin elevan la apertura numrica entre 1,2 y 1,4. An as, con luz visible, las partculas con un tamao ms pequeo de 0,25 m no pueden distinguirse unas de otras. Existen varios tipos de microscopios: Microscopio de campo claro: Usa como fuente luz directa una bombilla o la luz solar. Como los microorganismos suelen ser transparentes, es difcil distinguirlos con este tipo de microscopio , por lo que se tien para mejorar su visibilidad. Usa un microscopio ptico dotado con un condensador y un objetivo especial. Con este microscopio, los microorganismos vivos sin teir se ven iluminados contrastando con un fondo oscuro. La muestra se tie con una sustancia fluorescente que absorbe la energa de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas ms largas (verde). Se utiliza una sustancia fluorescente que se une al microorganismo, el cual emite fluorescencia y se puede identificar. Esta tcnica se usa en clnica.

Microscopio de campo oscuro:

Microscopio de fluorescencia:

Microscopio de contraste de Es un microscopio ptico modificado mediante un condensador y un fases: objetivo especial que controlan la iluminacin de tal manera que permite contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al H 2O (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos. Microscopio de luz polarizada Tiene una lmina polarizadora que se ubica por debajo de la platina, para polarizar la luz proveniente de la fuente. El microscopio polarizante se emplea en la interpretacin de textura y relaciones de las sustancias naturales o artificiales tal como aparecen en las secciones delgadas y para determinar algunas propiedades pticas de los minerales

EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de luz. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750nm; violeta - rojo), lo que les permite tener un poder de resolucin muy elevado. Los aumentos pueden llegar a ser de un milln de veces. Es posible con el microscopio electrnico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 m, comparado con los 0,25 m de uno ptico. En este microsacopio slo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo tanto, es necesario preparar muestras mediante tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Despus de la deshidratacin, la muestra se incluye en una resina, a la cual se le realizan cortes finos con un ultramicrotomo (generalmente con , cuchilla de diamante). Una sola clula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan clulas enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido sobre la preparacin y los electrones dispersados por el metal pesado activan una

pantalla de observacin produciendo una imagen. A la primera tcnica se la denomina Microscopa Electrnica de Transmisin (MET) y a la segunda Microscopa Electrnica de Barrido (MEB).El microscopio electrnico de barrido -SEM- es el mejor mtodo adaptado al estudio de la morfologa de las superficies, la imagen se genera por interaccin de un haz de electrones que "barre" un rea.

TECNICAS PARA LA OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS

Todos los microorganismos, excepto los acelulares (virus, viriones) pueden ser observados mediante microscopios pticos, a los cuales vamos a limitar la descripcin de las tcnicas ms usadas para realizar preparaciones de las muestras a observar .

Preparacin en fresco:
Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un cubreobjetos. Se observa al microscopio de contraste de fases o de campo claro los microorganismos vivos, para que semuevan es preciso que no est fijados. Para poder observar mejor la movilidad de un microorganismo se utiliza la tcnica de la gota pendiente.

Tcnicas de tincin:
Para teir los microorganismos de una muestra se siguen, en general, los siguientes pasos: Extensin: Sobre un portaobjetos limpio se extiende con el asa la muestra que contiene los microorganismos. Si la muestra es lquida se hace directamente y, si es slida, hay que suspenderla previamente en una gota de H 2O. El extendido no debe ser muy denso porque obstaculizara el paso de la luz del microscopio y porque los microorganismos quedaran aglomerados. Fijacin: Para adherir la muestra al portaobjetos y para desnaturalizar las protenas de manera que el colorante entre fcilmente, se pasa la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero, cuidando que el caentamiento logre secar la muestra pero no quemarla. Tincin: Se aaden los colorantes sobre los microorganismos sometidos al proceso anterior. Existen varios tipos de tinciones: Negativa: Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina o tinta china), cuyos pigmentos no penetran a la clula. La preparacin se ve como un negativo de fotografa en blanco y negro. Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tincin negativa, slo nos permite observar la forma, el tamao y el tipo de agrupacin de las clulas. Diferencial: Intervienen dos o ms colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominndose colorante de contraste. La Tincin de Gram Es la tcnica de tincin ms utilizada en bacterias. El primero en describirla fue el dans Christian Gram. El procedimeinteo es el siguiente: Se tie la muestra con cristal (colorante azul) Se le agrega Lugol (mordiente, sustancia no colorante que refuerza la accin de un colorante) Se lava con Etanol 96 (decolorante que remueve el colorante de ciertas bacterias, las dems permanecen de color violeta Se aade Safranina (colorante de contraste, rojo, que tie las clulas que quedaron decoloradas en el paso anterior) Esta tincin distingue entre dos amplios grupos de bacterias segn la composicin de la pared celular; las Gram (-) que no retienen el complejo cristal violeta-lugol despus de la decoloracin con alcohol y aparecen teidas de rojo, y las Gram (+) que s lo retienen y aparecen teidas de azul oscuro.