1 - Introdução Ao DNA

GENTICA MOLECULAR
Biologia Molecular?
Fuso de trs reas da CINCIA BSICA
Biologia
Biomol Qumica Fsica
Biologia Molecular?
Caractersticas Biolgicas e funcionamento das molculas Mecanismos de
Estuda os aspectos fsicos, qumicos e biolgicos das molculas principalmente macromolculas os cidos nuclicos e seus produtos, as protenas
Biologia Molecular?
Cincia recente com o incio (aproximado) na dcada de 50
Uma cincia bsica que permitiu grandes avanos em cincia aplicada como a Engenharia Gentica e Biotecnologia Parte das metodologias utilizadas em biologia molecular subsdios para outras reas como fisiologia, medicina, fsica, botnica, zoologia dentre outros
CONTEDO PROGRAMTICO
1) cidos Nuclicos: Caractersticas principais 2) O cdigo gentico e controle do fluxo informao gentica 3) Introduo ao DNA recombinante
CONTEDO PROGRAMTICO
1) cidos Nuclicos: caractersticas principais DNA e a informao gentica A dupla hlice do DNA e o dogma central da biologia molecular Estrutura do DNA Topologia do DNA Cromossomos, cromatina e Nucleossomo Replicao do DNA Mutabilidade e reparo de DNA
CONTEDO PROGRAMTICO
2) O cdigo gentico e o fluxo informao gentica Mecanismos de transcrio em procariotos Mecanismos de transcrio em eucariotos Processamento de RNA Mecanismos de traduo Cdigo gentico
CONTEDO PROGRAMTICO
3) O controle da informao gentica Regulao gnica em eucariotos Regulao gnica em procariotos Regulao gnica durante o desenvolvimento
CONTEDO PROGRAMTICO
4) Introduo ao DNA recombinante Aplicaes da biologia molecular Tcnicas de anlise
AVALIAO
3 provas tericas parciais, no cumulativas Apresentao de seminrio Ser considerado aprovado o aluno que obtiver a mdia das notas maior ou igual a 6.0 e frequncia maior ou igual a 75%. A disciplina no oferecer prova substitutiva e sim a possibilidade de uma avaliao complementar (recuperao). Esta avaliao englobar toda a disciplina ministrada no perodo a que se refere. Para participar do processo de recuperao o aluno dever ter obtido nota final igual ou superior a 5,0 e frequncia maior ou igual a 75%.
Alternativamente, podero ser solicitados a realizao de trabalhos de pesquisa extra-classe que contribuiro na mdia de avaliao.
AVALIAO
Prova I 09/11 Prova II 07/12 Prova III 18/01 Alteraes nas datas de prova s sero feitas mediante situaes excepcionais
BIOLOGIA MOLECULAR - CBNC 22

BIBLIOGRAFIA BSICA Bibliografia Bsica: 1. WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; BELL S. P.; GANN A.; LEVINE M.; LOSICK R. Biologia Molecular do Gene, 5.edio, Editora Artmed, 2006 2. WATSON, J. D. ; MYERS, R. M.; CAUDY, A. A.; WITKOWSKI, J. A. DNA recombinante, genes e genomas, 3 edio, Editora Artmed, 2008 3. LEWIN, B. Genes IX , Editora Artmed, 2008 Bibliografia Complementar 1. ALBERTS, B. LEWIS, J.; BRAY, D. Biologia Molecular da clula, 4 Edio, Editora Artmed 2004 2. LODISH, H., BERK, A.; MATSUDAIRA P. e colaboradores. Biologia Celular e Molecular - 5 Edio, Editora Artmed
BIOLOGIA MOLECULAR O DNA COMO MATERIAL GENTICO
Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos
DNA e RNA forma descritos pela primeira vez em 1869 por F. Miescher (bilogo suo) Isolou um material contendo fsforo do ncleo das clulas no pus descartado de bandagens cirrgicas nuclena
Friedrich Miescher
Relatou que o contedo do ncleo era constitudo de uma poro acdica (DNA) e uma alcalina (histonas)
Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

A composio qumica do DNA foi determinada em 1909 pelo mdico russo Phoebus Levene no Instituto Rockefeller (bases nitrogenadas, acar e fosfato) e demonstra que estes so polmeros, ou seja, formados por muitas repeties de uma mesma subunidade. Em 1929 Levene tambm estabeleceu que existia uma diferena qumica entre os dois cidos nuclicos, o DNA e o RNA, termos que comearam a ser largamente utilizados. No entanto, Levene morreu em1940, antes que o significado dessas molculas fosse esclarecido.
Phoebus Aaron Theodor Levene
O DNA Como Material Gentico
Durante muito tempo se acreditou que era impossvel que as caractersticas genticas fossem codificadas por uma molcula linear simples formado por somente 4 nucleotdeos como o DNA
Acreditava-se que ele formava um arcabouo para as molculas o qual seria o verdadeiro material gentico Protenas eram consideradas pela maioria grande maioria da comunidade cientfica como o provvel constituinte gentico.
Em 1928, Frederick Griffith fez uma srie de experimentos com ratos infectados com a bactria Streptococcus Griffith tinha duas linhagens da bactria Streptococcus. A linhagem S (smooth) possuia um envelope de polissacardeo que tornava a aparncia das colnias lisas e brilhantes. A linhagem R (rough) as colnias no possuam este envelope e as colnias tinham uma aparncia opaca e mas rugosa.
Frederick Griffith
Princpio Transformante -DNA Frederick Griffith - 1928
O DNA Como Material Gentico Em 1931 Oswald Avery, Collin MacLeod e Maclyn MacCarty deram prosseguimento aos experimentos de F. O. Avery C. Macleod Griffith
M. MacCarthy
Os resultados de seus esforos foram publicados em 1941

Romperam clulas S mortas e removeram os lipdeos e carboidratos Dividiram o extrato purificado em trs fraes: Frao 1 + Protease Frao 2 + RNAse Frao 3 + DNAse
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Qual o componente celular responsvel pela informao?
Princpio transformante - Griffiths
Avery, MacLeod e MacCarty demonstraram que o DNA o material gentico??? Parte do meio cientfico ainda no ficou convencida...
Acreditavam que o DNA era um catalisador para a ativao de genes constitudos de protenas...
No incio dos anos 50 muitos cientistas testavam os bacterifagos Sabiam que o vrus injetava algo na bactria que causava sua propagao O que era injetado DNA ou protena?
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O DNA Como Material Gentico Bacterifagos vrus que infectam bactrias

Compostos unicamente por DNA e protena!
Fagos Cabea
Cauda Fibras da Cauda Clula bacteriana

DNA, Protena ou DNA + Protena?
Bacterifago T2 Infectando uma clula de E. coli
Microscopia eletrnica de transmisso do fago T2 infectando E. coli. O fago T2 utiliza parte da cauda para injetar seu material gentico na bactria

Lise
Bacterifago T2
Propagao
Injeo do material gentico
Ciclo ltico de um bacterifago *Existe tambm um ciclo denominado de lisognico o material gentico do vrus incorporado ao do hospedeiro
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Aps o fim da segunda guerra mundial (08/05/1945), diversos fsicos que haviam trabalhado anteriormente com energia nuclear estavam migrando para a biologia Em 1952 Hershey e Chase demonstraram o papel essencial do DNA atravs de experimentos utilizando istopos radiativos
Martha Hershey e Alfred Chase
Eles comearam a trabalhar com bactrias e bacterifagos (ou fagos), o que posteriormente ajudou a fundar a BIOLOGIA MOLECULAR!
O experimento de Hershey e Chase

Protenas do fago marcadas com 35S
5. Radioatividade encontrada no meio lquido
Centrifugao
1.Cultura de bactrias e infeco por fagos crescidos previamente na presena de 35S 2. Agitao da cultura em um liquidificador capsdio se desprende 3.Radioatividade encontrada nas protenas 4.Separao capsdios no meio lquido bactrias fundo (slido)
Material gentico injetado pelo fago o DNA
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O experimento de Hershey e Chase

DNA do fago marcado com 32P
5. Radioat. encontrada no meio slido
Centrifugao
1.Cultura de bactrias e infeco por fagos crescidos previamente na presena de 32P 2. Agitao da cultura em um liquidi. capsdio se desprende 3.Radioatividad e encontrada no DNA 4. Separao capsdios no meio lquido bactrias fundo (slido)
Radiao encontrada no interior das bactrias Material gentico injetado pelo fago DNA
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PROVA DEFINITIVA DNA O MATERIAL GENTICO
Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos
Em 1952 quando foi provada que a molcula de DNA era realmente a detentora da informao gentica comeou-se a dar importncia s suas caractersticas qumicas e estruturais
Muitos trabalhos que haviam sido negligenciados comearam a mostrar sua importncia
Em 1938, o fsico britnico William Thomas Astbury (1898-1961), discpulo de Lawrence Bragg, o primeiro a estudar o DNA pela cristalografia por raio X e a estabelecer que sua estrutura apresenta a forma de um longo filamento
William T. Atsbury
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Incio da dcada de 1950 Alexander Robertus Todd, qumico orgnico (Cambridge), determinou como eram constitudos os nucleotdeos Os nucleotdeos que compe o DNA tem como arcabouo um accar: A RIBOSE constituda de cinco carbonos que so numerados, por conveno no sentido anti-horrio da molcula de O presente em seu anel
Alexander Robertus Todd
Nobel 1957
Pentose acar que possui um anel com 5 tomos. Ligado ao anel h um grupo fosfato, composto de um tomo de fsforo ligado covalentemente a 4 tomos de oxignio
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Os nucleotdeos possuem: Uma base nitrogenada ligada quimicamente a um acar (pentose) e este a um grupo fosfato.
As bases nitrogenadas que compe os nucleotdeos possuem anis formados por C-N. Entretanto tamanhos distintos. Pirimidinas possuem um anel enquanto as purinas ocorre um anel fusionado outro.
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Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos Uma diferena entre DNA e RNA ... RNA DNA
Ribose
Desoxiibose
OH
OH
OH
Os carbonos com maior importncia estrutural so:

C1 - Se liga a base nitrogenada C3 OH deste carbono utilizado na ligao fosfodiester
C5 - Se liga o grupamento fosfato
ERRADO!!!!!
Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos Outra diferena entre DNA e RNA ...
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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos A.Todd tambm concluiu que estes estavam unidos a grupos fosfatos nas posies 3`e 5` das molculas de desoxirribose, o acar do DNA. Essas ligaes recebiam a denominao de ligaes fosfodister.
Totalmente diferente do modelo anterior ...
Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos Em uma A ligao extremidade fosfodiester ela termina tambm com o grupo ocasiona uma P ligado ao carbono 5 polarizao da
molcula DNA.
de
Na outra extremidade termina com OH (ligado do carbono 3 )
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Em 1949 Erwin Chargaff fez uma descoberta espetacular Trabalhando hidrlise de DNA com cromatografia em papel ele determinou que existia uma relao na proporo de purinas e pirimidinas
Erwin Chargaff
Hidrlise DNA
Cromatografia Nucleotdeos
Feita a cromatografia e possvel quantificar a quantidade de cada base 1) Os nucleotdeos no esto presentes em quantidades equivalentes (ex: 25% A, 25% C,...) 2) A propores aleatrias.... relativas no so
A C G T
Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T% Qual a importncia destes dados?
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Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T%. 1) A quantidade de bases pricas e pirimdicas so equivalentes: A (31%) + G (20%) ~ 50% T (29%) + C (20%) ~ 50% 2) Existem uma razo entre determinadas purinas e pirimidinas: A (31%) T (29%) ~1 C (20%) G (20%) =1
Portanto existia uma razo 1 entre purinas e pirimidinas Como tambm razo 1 entre A/T e G/C
Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos A propores eram verdadeiras somente para espcie humana? Chargaff investigou a proporo para diversas espcies.
A razo 1 entre purinas e pirimidinas Como tambm razo 1 entre A/T e G/C ficaram conhecidas como Regras de Chargaff
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Uma vez que sua importncia foi reconhecida, alm da valorizao e reconhecimento dos trabalhos mencionados, comeou uma corrida para se a investigar como a molcula de DNA estruturada.
A corrida teve envolvimento de vrios grupos extremamente respeitados L. Pauling e Robert Corey CalTech M. Wilkins e R. Franklin Kings College J. Watson e F. Crick Cambrige
Linus Carl Pauling
Nobel 1954 e 1962

Qumica 1954 -Pesquisa sobre a natureza da ligao qumica e sua aplicao elucidao da estrutura das substncias complexas. Paz 1962 - por tentar proibir o uso das armas nucleares
Em 1953 Pauling publicou um artigo em que proponha a estrutura do DNA com base em dados cristalogrficos No artigo o DNA possua uma tripla hlice!!!!! Pauling... Duas vezes prmio Nobel, descobriu a ordenao de orbitais qumicos, a alfa hlice de protenas... At os gnios erram ...
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Enquanto isso no Kings College
R. Franklin, sob orientao de M. Wilkins, obtinha o padro de difrao de cristais de DNA

Maurice Wilkins e R. Franklin
Gerador de raios X
Cristal de DNA (fibras)
Padro de difrao
Feixe de raios X
Difrao de raios X de fibras de DNA
Geradores de raios-X
Ou maiores
Equipamentos do tamanho de prdios
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Voltando a Rosalind Franklin e ao padro de difrao obtido
R. Franklin
Difrao de raios X de fibras de DNA
Padro sugeria uma molcula helicoidal
Mas nem R. Franklin nem seu orientador M. Wilkins souberam interpretar os resultados...
Neste mesmo ano (1953) James Watson e Francis Crick visitaram o laboratrio de M. Wilkins e R. Franklin...

Analisaram os difratogramas
James Dewey Watson e Francis Crick
E proporam uma teoria utilizando os dados de Franklin....
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A interpretao
James Dewey Watson e Francis Crick
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Algumas unidades de medida trabalhos de biologia molecular Micro () = 10-6 Nano (n)= 10-9 Angstrons () = 10-10 Pico (p)= 10-12 Femto (f)= 10-15 Atto (a)= 10-18 Zepto (z)= 10-21
utilizadas
em
A dupla hlice apresenta raio de 1nm. Distncia entre as bases de 0.34nm.

As bases nitrogenadas pareadas no
centro da molcula e unidas por pontes Pares de bases em posies de H. Sendo que o pareamento A/T equivalentes ocorrem a cada 34nm. possui 2 pontes H e G/C trs. A conformao helicoidal tpica Grupamentos fosfato-acar do produz dois tipos cavidades: menor esqueleto esto posicionados para o (12 ) e maior (22 ) exterior da dupla hlice
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Outro observao de Watson e Crick que as fitas so antiparalelas A extremidades 3 (hidroxila-OH) 5 (fosfato-P) so invertidas nas duas fitas
5 3
O modelo prope o pareamento entre purinas e pirimidinas (A/T e C/G)
O pareamento de nucleotdeos semelhantes no se adequa ao dimetro uniforme da hlice de DNA indicado pelos Dimetro da mol. dados de difrao de DNA (2nm/20 A)
Purina + Purina: muito grandes
Pirimidina + Pirimidina: muito pequenas
Purina + Pirimidina: distncia consistente com os dados de difrao de raios-X
Pareamento A/T e C/G): explica as regras de Chargaff!!!!
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Principais caractersticas do DNA descritas por Watson e Crick.
Space Filling Model= Leva em conta o raio atmico= mais prximo do real

"We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest... ...It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material." -James Watson Francis Crick
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Um ms depois...
... Now our model for deoxyribonucleic acid is, in effect, a pair of templates, each of which is complementary to other . We imagine that prior to duplication the hydrogen bonds are broken, and the two chains unwind and separated. Each chain hen acts as a template for the formation on to itself of a new companion chain, so that eventually have two pairs of chains, where we only have one before. Moreover, the sequence of the pairs of bases will have been duplicated exactly.....
Implicaes sem precedentes na histria da gentica!!!! Explicaria como a informao gentica perpetuada
Neste trabalho Watson e Crick prope que a replicao SEMICONSERVATIVA do DNA Replicao = construo de rplicas de uma molcula
Replicao semiconservativa?
Na dupla fita de DNA, uma fita o exato complemento da outra
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No momento da diviso celular as fita me serviria de molde para a sntese de uma nova fita dupla A nova dupla fita conteria uma fita recm formada (filha) e uma fita velha (me) Metade dupla fita = velha/Metade dupla fita = nova semiconservativa (sempre conservada uma das fitas me a cada diviso celular)
Regio do DNA parental
Regio de replicao do DNA: parental. Novos nucleotdeos so pareados com os das fitas parentais
Explica como a informao gentica mantida de gerao para gerao
Regio replicada DNA
do
Fita Me
Fita Filha
Fita Me
Fita Filha
A gentica passaria a tratar as entitades genticas (A/a) como constituintes fsicos
MOLCULA FILHA
MOLCULA FILHA
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Apesar das teorias existiam cticos que questionavam dois pontos bsicos:
1) Seria realmente necessria uma fita molde para a sntese de uma nova molcula de DNA? 2) A replicao do DNA semiconservativa? Arthur Kornberg comeou a trabalhar com extratos bacterianos (E. coli) livres de clulas foi capaz de responder a primeira pergunta
Em 1954 conseguiu isolar uma nova protena que era capaz de replicar o DNA na presena de precursores de alta energia. A esta enzima se deu o nome de DNA polimerase
Arthur Kornberg
O experimento de A. Kornberg
Desoxinucleotdeos tri-fosfatados (dATP, dCTP, dTTP e dCTP)
Fita Molde
+
DNA polimerase I
Incubao em tubo de ensaio (replicao in vitro)
Replicas da molcula de DNA
A enzima s conseguia sintetizar novas fitas de DNA na presena de fitas velhas... Demonstra a necessidade de fitas me como molde para a sntese de novas fitas
Arthur Kornberg
Nobel Medicina 1959
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E a replicao semiconservativa???
Muitos no acreditavam que a replicao pudesse acontecer como descrito por Watson e Crick. Trs modelos tentavam explicar a replicao do DNA
Modelo Conservativo Clula Parental Primeira Replicao Segunda Replicao As fitas parentais permanecem inalteradas e ambas as duplas fitas filhas so novas As fitas parentais se separam e cada uma serve como molde para uma nova fita complementar Cada dupla fita nova contm uma mistura de partes velhase novas Modelo Semi-conservativo Modelo Dispersivo
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Em 1958 Matthew Meselson e Franklin Stahl descobriram como o DNA se replicava utilizando E. coli. Como todas as bactrias E. coli possui um nico cromossomo (principal) circular Em condies timas E. coli se divide a cada 20 minutos
Matthew Meselson e Franklin Stahl
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Cultura em meio contendo 14N
-Denso
Centrifugao do DNA em CsCl 50.000g por 2-3 dias

+ Denso
DNA leve (contendo 14N)
DNA pesado (contendo 15N)
Transferncia para meio contendo 14N
20 min. de cultura
40 min. de cultura
Extrao do DNA
Centrifugao
20 min. de cultura apresentava um DNA de massa intermediria, uma mistura de 14N e 15N
40 min. de cultura apresentava um DNA de massa intermediria , uma mistura de 14N e 15N e outro com somente 14N
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Modelo Conservativo Clula Parental Primeira Replicao Segunda Replicao Modelo Semi-conservativo Modelo Dispersivo
Resultado da centrifugao de DNA aps 20min de cultura em 14N Resultado da centrifugao de DNA aps 40min de cultura em 14N
X X
OK!
OK!
OK!
Os resultados de Meselson e Stahl comprovam que a replicao do DNA semi-conservativa
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Graas descobertas efetudas pela descoberta da estrutura do DNA e suas implicaes o pmio Nobel de fisiologia e medicina de 1962 foi para
Interprertao da estrutura do DNA e suas implicaes biolgicas Obteno dos cristais e padro de difrao
James Watson
Francis Crick
Maurice Wilkins
DESCRIMINAO SEXUAL!!!!!!
X
Rosalind Franklin
E R. Franklin? Afirmou nunca ter entregue seus dados para Watson e Crick... Entretanto o trabalho deles se baseou em seus difratogramas.. Wilkins ou Bragg passaram os dados
Prmio Nobel no pstumo Morreu em 1958 vtima da radiao-X que utilizava em seus trabalhos...
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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA

Aps todos os estudos a comunidade ainda no havia compreendido como a informao gentica poderia estar contida em um alfabeto de apenas quatro letras:
Mesmo com apenas quatro letras, as posies possveis vo depender do tamanho do genoma (4N)- onde N o nmero de letras da seqncia)

Apesar do DNA conter as informaes para a construo de uma protena estava claro que no era o DNA que construa Diversos trabalhos mostravam a sntese de protenas em locais onde no ocorria o DNA Sntese protica de eucariotos ocorre no citoplasma* enquanto o DNA se encontra isolado no ncleo Deveria haver alguma molcula capaz de transferir a informao existente no DNA para o citoplasma...
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As atenes foram concentradas para uma segunda molcula de cido nuclico ainda pouco estudada... O RNA Torbjrn Casperson e Jean Brachet, demonstraram que o RNA esta presente em altas quantidades no citoplasma
Clula de Tetrahimena cultivada com Citidina radioativa, todo o RNA sintetizado se encontra no ncleo (partculas negras)
Clula aps doze minutos de transferncia para meio contendo citidina no radioativa, o RNA se encontra no citoplasma
Demonstra que o RNA sintetizado no ncleo e migra para o citoplasma

O RNA uma molcula linear, no ramificada, tambm com quatro tipos de nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister 3 5 Possui duas diferenas quanto a molcula de DNA 1) O acar uma ribose que difere unicamente por possuir uma hidroxila no C 2
DNA
RNA
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2) Enquanto o DNA possui a pirmidina Timina no RNA existe a substituio desta base por uma Uracila, a qual tem ausncia de um grupo metila no carbono 5 da base nitrogenada.
Os polirribonucleotdeos assim como os desoxipolirribonucleotdeos podem formar molculas dupla fita

No so usuais, normalmente ocorrem entre duas partes da mesma molcula de RNA fita simples* (muitas vezes possuem carter regulatrio)

Fcil imaginar uma molcula de RNA como a detentora da mensagem gentica para o citoplasma Em 1958 era de credo geral que a informao presente no DNA cromossmico, servia de molde para a sntese do RNA que se deslocavam para o citoplasma e serviam de informao para a sntese de protena
F. Crick se referiu a este processo como o DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
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DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
DNA
REPLICAO
Transcrio Transcrio reversa
RNA
REPLICAO
Traduo
Filme
Protena

Como a informao era passada do RNA Protena? Havia uma teoria simplista que de alguma maneira a molcula de RNA formava invaginaes que reconheceria o aminocido e, de maneira tambm inexplicvel, ligaria uma aminocido outro at formar a protena... F. Crick de incio concordou, mas Como uma molcula muito hidroflica como o RNA poderia interagir com aminocidos altamente hidrofbicos (Gli, Ala, Val, etc..)
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Como distinguiria amino cidos que diferiam por somente uma grupo metila (Gli/Ala, Val/Leu, e Leu/Iso)
Gly
Ala
Val
Leu
Iso
Leu

F. Crick props que deveria existir uma molcula adaptadora que era capaz de se ligar ao aminocido e tambm reconhecer as bases no molde de RNA Anos mais tarde trabalhando com extratos proteicos livres foi identificada uma molcula que era capaz de se ligar aos aminocidos antes que estes fossem incorporados a protena A molcula tambm era composta por RNA e foi denominada de RNA Transportador (tRNA ou RNAt) AMINOCIDOTransferido para tRNA por uma classe de enzimas aminoacil sintetase Representa cerca de 10% de todo o RNA da clula
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RNA transportadores so pequenas molculas de RNA, em a prpria seqncia dos nucleotdeos so capazes de formar pontes de hidrognio intramoleculares resultando em um arranjo espacial complexo com estrutura Brao secundria aceptor
de AA
Representao linear de um RNA transportador. As pontes de H esto em vermelho
Estrtutura tridimensional do RNA transportados de Phe

Se o RNA somente um transportador de AA onde estava a informo vinda do ncleo que especificava a sntese de protenas? Neste momento as suspeitas da molcula que carregam a informao recaram em outra classe de RNA o RNA ribossomal (rRNA ou RNAr) Constitui aproximadamente 85 % de todo o RNA presnte na clula Entretanto a anlise de ribossomos de E. coli e dados de outros organismos sugeriam que no era o caso
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As molculas de RNA ribossomomal tambm formam estruturas secundrias atravs de pontes H
rRNA16S (E. coli)
rRNA23S de (E. coli)
Entretanto muito mais complicadas ...
Formando estruturas tridimensionais de grande complexidade ....
Subunidade 16S e 23S do ribossomo de E. coli
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Entretanto a anlise de ribossomos de E. coli e dados de outros organismos sugeriam que no era o caso
1) Os rRNA de E. coli e diversos organismos so compostos por duas subunidades diferentes que podem estar juntas ou separadas no citoplasma. Todas as cadeias de rRNA das subunidades menores apresentam tamanho ~de 1500bases Muito uniformes sabendo que protenas variam muito em tamanho era de se esperar s tamanhos de RNA 2) As subunidades maiores cerca de 3000 bases Muito uniformes 3) As cadeias de rRNA apresentam contedo de G + C muito alto Se sabia que no genoma existia grandes variaes na quantidade de AT/GC o que no se refletia nos rRNAs

Finalmente clulas de E. coli infectadas com o fago T4 forneceram o sistema para a descoberta da molcula que continha a informao para sntese de protenas Ao infectar as clulas o T4 as clulas de E. coli cessam a sntese de RNA endgeno Sintetizam somente o RNA do T4 Foi constatado que os RNAs de T4 se ligavam a ribossomos e se posicionavam para se ligar aos tRNAs O RNA do fago ento se desloca na superfcie do ribossomo posicionando suas bases para ligao de tRNAs
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Aps demonstrado que este RNA dirigia a sntese de protenas foi detectado representantes da molcula em diversos organismos Por conta de trazer a informao gentica contida no DNA ele foi denominado de RNA mensageiro (mRNA ou RNAm)
mRNA reponde por somente 4-5% de todo o RNA presente na clula Apresenta grandes variaes de tamanho o que condizente com a variao de tamanho existente entre protenas

Forma estruturas helicoidais, mas raramente estruturas secundrias Foi negligenciado por sua baixa abundncia. Entretanto um RNA pode ser lido por diversos ribossomos
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Desta forma os papeis do diversos tipos de RNA foram elucidados A informao da molcula de DNA segue o seguinte fluxo:
A transferncia da informao RNA protena ocorre no ribossomo

Ainda restavam perguntas: como a informao gentica presente no DNA e passada para o mRNA traduzida? Francis Crick, Sidney Brenner e Charles Yanosfsky fizeram as primeiras teorias Deveria haver colinearidade entres as molculas de mRNA e as protenas codificadas por estas Grupos de nucleotdeos sucessivos ao longo de uma cadeia de DNA codificavam AA sucessivos na protena
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Como apenas aminocidos ? quatro nucleotdeos especificam 20
Atravs de combinaes especficas Caso dois nucleotdeos = 4 X 4 = 16 possveis combinaes =16 aminocidos ? Caso trs nucleotdeos = 4 X 4 X 4 = 64 possveis combinaes =64 aminocidos ? Quatro nucleotdeos = 4 X 4 X 4 X 4 = 256 possveis combinaes =254 aminocidos / O consenso foi que o mais provvel seria uma trinca de nucleotdeos. 64 aminocidos? Algumas trincas deveriam especificar para o mesmo aminocido...

Marshal Niremberg e Heinrich Matthei trabalhando com transcrio in vitro comearam a responder as perguntas
Heinrich Matthei e Marshal Niremberg
rRNA (16 e 23S) UUUUUUUU....3)
tRNAs
poli
Uracila
(5
Sintetizava peptdeo Phe-Phe-Phe-...
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Logo aps este experimento o qumico orgnico, Har Gobin Kohrana sintetizou o mRNA 5 AGUAGUAGUAGU 3 O poli mRNA AGU resultava em um peptdeo poliCys Kohrana fez diversos mRNAs sintticos com todas as possibilidades existentes para as trincas
Har Gobin Kohrana
Provou que a trinca de nucleotdeos levava a informao para os 20 AA constituintes da protena 61 dos 64 grupos de trincas possveis codificam AA sendo que a maioria codificada por mais de uma trinca

Trs trincas polipeptdeos no produziam
Se adicionadas em alguma combinao que gerava polipeptdios fim da cadeia C

Nobel Medicina 1968
As trincas ficaram denomidas de cdons
Cdons que determinavam o fim da cadeia = cdons de terminao
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Quem responde transcrio DNA RNA pela
Hurwitiz e Samuel B. Weiss isolaram uma enzima que era capaz de sinetizar in vitro fitas de DNA utilizando um molde de DNA e nucleotdeos trifosfatados (ATP, CTPG, GTP e UTP) como precursores
Samuel B. Weiss e Jerard Hurwitiz
Aps a sntese a razo AU/GC da fita de RNA era ~igual razo AT/GC ao trecho de DNA utilizado
Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA Enzimas capazes de sintetizar molculas de RNA a partir de molculas de DNA so denominadas de RNA polimerases Em bactrias somente uma RNApol sintetiza as trs classe de RNA. Em eucariotos.... Mais complicado!!!!!
A sntese de RNA ocorre sempre em uma direo fixa iniciando na extremidade 5 com trmino em um nucleotdeo 3 (5 3)
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Existe uma polaridade 5 3 na sntese de molculas do RNA (e tambm na replicao do DNA)
Existe polaridade na sntese de protena ???

Carboxi terminal (C-terminal) Amino terminal (Nterminal) ou vice versa?
Esta pergunta foi respondida utilizando uma tcnica de marcao radioativa denominada de pulso ou marcao pulsada
Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA Cultura de reticulcitos de coelho (eritrcitos imaturos) produzindo grande quantidade de e - globina
Tratados com Cys (35S) por alguns segundos
Somente Globinas com cadeias completas foram isoladas e digeridas com Tripsina (K-R) Deteo de radiao dos fragmentos tripticos
50

Azulr adioativo
Setas= stios de tripsina
Regio Nterminal baixo teor de radiotividade
Vermelhosem radio
Regio Cterminal alto teor de radiotividade
Sntese proteca N-terminal Carboxi terminal
51

1 - Introdução Ao DNA

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GENTICA MOLECULAR

Biomol Qumica Fsica

BIOLOGIA MOLECULAR - CBNC 22

BIOLOGIA MOLECULAR O DNA COMO MATERIAL GENTICO

Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

O DNA Como Material Gentico

O DNA Como Material Gentico

O DNA Como Material Gentico

Princpio Transformante -DNA Frederick Griffith - 1928

Os resultados de seus esforos foram publicados em 1941

Qual o componente celular responsvel pela informao?

Princpio transformante - Griffiths

O DNA Como Material Gentico

O DNA Como Material Gentico Bacterifagos vrus que infectam bactrias

Cauda Fibras da Cauda Clula bacteriana

Bacterifago T2 Infectando uma clula de E. coli

O DNA Como Material Gentico

Injeo do material gentico

O DNA Como Material Gentico

O DNA Como Material Gentico

O experimento de Hershey e Chase

Material gentico injetado pelo fago o DNA

O DNA Como Material Gentico

O experimento de Hershey e Chase

5. Radioat. encontrada no meio slido

PROVA DEFINITIVA DNA O MATERIAL GENTICO

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Os carbonos com maior importncia estrutural so:

C5 - Se liga o grupamento fosfato

Na outra extremidade termina com OH (ligado do carbono 3 )

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Linus Carl Pauling

Nobel 1954 e 1962

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Enquanto isso no Kings College

R. Franklin, sob orientao de M. Wilkins, obtinha o padro de difrao de cristais de DNA

Cristal de DNA (fibras)

Difrao de raios X de fibras de DNA

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Equipamentos do tamanho de prdios

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Voltando a Rosalind Franklin e ao padro de difrao obtido

Difrao de raios X de fibras de DNA

Padro sugeria uma molcula helicoidal

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

E proporam uma teoria utilizando os dados de Franklin....

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

James Dewey Watson e Francis Crick

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

A dupla hlice apresenta raio de 1nm. Distncia entre as bases de 0.34nm.

As bases nitrogenadas pareadas no

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

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