Universidad Nacional del Comahue Facultad de Ingeniera IDEPA - Instituto de Investigacin y Desarrollo de la Patagonia Norte CONICET-UNCo

rea disciplinaria: III. Competitividad y Diversificacin Sustentable de la Produccin Agropecuaria BIOTECNOLOGA DE LEVADURAS APLICADA A LA INDUSTRIA FRUTCOLA Y VITIVINCOLA DE LA PATAGONIA NORTE Autores: J. S. Saez, M. C. Lutz, M. C. Sosa, C. A. Lopes y M. P. Sangorrn Correos electrnicos: julieta.saez@conicet.gov.ar, mclutz@conicet.gov.ar

Palabras clave: biocontrol con levaduras, vinos, peras.

INTRODUCCIN En los valles irrigados de las provincias de Ro Negro y Neuqun (Patagonia Norte, Argentina), se localiza la principal rea productora de manzanas y peras de la Argentina, siendo de esta ltima produccin, primer pas exportador mundo. Otra tendencia notable de los ltimos aos es el incremento en la superficie destinada al cultivo de vides para vinificacin y la implantacin de nuevas bodegas. Ambas actividades son afectadas por la presencia de organismos indeseables que reducen la calidad y rentabilidad de los productos. En el proceso de vinificacin existen especies de levaduras contaminantes capaces de producir defectos en los vinos, siendo la ms conocida Dekkera bruxellensis. El deterioro del vino por parte de las levaduras puede relacionarse con la sntesis de altas concentraciones de sulfuro de hidrgeno u otros compuestos voltiles, cido actico, varios steres y fenoles. Estos compuestos dan aromas desagradables, disminuyen o enmascaran los aromas frutales o florales propios de la uva o aportados por las levaduras durante la fermentacin, e incluso producen cambios en el color del vino y en su estructura en la boca (Stratford, 2006). El desarrollo de levaduras indeseables puede ocurrir en distintas etapas durante la produccin del vino. En todo caso, el manejo de estas contaminaciones en la bodega es complejo debido a que es prcticamente imposible su erradicacin y su deteccin suele realizarse en forma muy tarda. Los mtodos de control ms comnmente utilizados son: la higiene de equipos, cubas y barricas (uso de ozono), filtraciones y uso de cido srbico, cido benzoico y dixido de azufre. Sin embargo la utilizacin de estos ltimos compuestos, en particular el dixido de azufre, debe estar rigurosamente controlada debido a que altos niveles de estos en el vino pueden causar cambios organolpticos indeseados e incluso han sido relacionados con riesgos para la salud humana.

La pera durante su vida postcosecha (6 7 meses a -1/0 C), es susceptible a diferentes enfermedades fngicas. Se destacan las podredumbres generadas por el moho azul y moho gris, ocasionadas por Penicillium sp. y Botrytis cinrea. El uso de fungicidas sintticos ha sido tradicionalmente la medida de control de estas enfermedades. Sin embargo, esta medida est siendo actualmente revaluada debido a los problemas de toxicidad provocados para el hombre y a la aparicin de resistencias. Segn la U.S. National Academy of Sciences, un 60% de los fungicidas usados habitualmente presentan riesgos oncognicos para los consumidores (Leverentz, 2002). En este contexto, sumado a la fuerte demanda social de alimentos sanos y con menos residuos qumicos y una gran preocupacin por la preservacin del ambiente, el control biolgico de agentes contaminantes o patgenos en los alimentos, resulta una de las alternativas ms prometedoras para la sustitucin de productos qumicos. Esta estrategia, propuesta a mediados del siglo XX, est aun hoy en desarrollo y solo unos pocos agentes de control biolgico se encuentran disponibles en el mercado mundial. Las levaduras son organismos ideales paras ser usadas como antagonistas, debido a que: 1) pueden ser aisladas de los mismos alimentos que se quieren preservar; 2) pueden utilizar un amplio rango de nutrientes y muchas pueden crecer a baja actividad de agua y bajos niveles de oxgeno; 3) son genticamente estables y efectivas en bajas cantidades; 4) tienen capacidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas y 5) no son patgenas y no producen esporas alergnicas, micotoxinas u otros metabolitos que puedan comprometer la salud humana (Wan & Tian 2006; Calvo et al. 2007). Ante las necesidades y exigencia planteadas, en este trabajo se pretende desarrollar un sistema de biocontrol basado en el uso de levaduras indgenas o de sus principios activos para ser aplicados en la industria vitivincola y en la poscosecha de frutas de pepita, dos de los ejes productivos de la Patagonia Norte.

DESARROLLO 1. Biocontrol de levaduras contaminantes en vinos 1.1. Aislamiento de levaduras contaminantes. Las levaduras de la especie Dekkera bruxellensis son responsables de serias prdidas econmicas en la industria del vino debido a su habilidad para producir compuestos fenlicos (Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2006). Para evitar el aislamiento de levaduras del gnero Saccharomyces (mayoritarias en vino), la bsqueda de especies contaminantes se bas en tcnicas descriptas para D. bruxellensis y especies relacionadas. 1.1.1. En un primer muestreo, se colectaron dos muestras de vinos con defectos provenientes de una bodega familiar (EP) del Alto Valle del ro Negro (AVNR). El aislamiento de levaduras contaminantes a partir de estas muestras se realiz por filtracin del vino problema y posterior siembra en dos medios selectivos: GPY + cicloheximida + antibitico (Medio 1) y GPY + carbonato de calcio + antibitico (Medio 2). En paralelo, alcuotas de los vinos fueron inoculadas en medios lquidos de enriquecimiento y selectivos (Roccato et al. 2001 y Couto et al. 2005). Estos cultivos se aislaron en los mismos medios slidos descriptos anteriormente. Un nmero representativo de colonias, de acuerdo a su morfologa y frecuencia, proveniente de cada vino y de cada medio de cultivo fue aislado e identificado utilizando el mtodo ITS-

RFLP descripto por Esteve-Zarzoso et al. (1999). Slo dos especies de levaduras fueron detectadas en ambos vinos y en los diferentes medios de cultivo utilizados: Pichia manshurica y Saccharomyces cerevisiae. No se encontr ningn aislamiento de D. bruxellensis en el muestreo realizado. La levadura P. manshurica no haba sido caracterizada hasta el momento como contaminantes de vinos. Por ello, se procedi al estudio de esta especie como agente contaminante de vinos (produccin de compuestos fenlicos y resistencia a factores de stress tpicos en vinificacin, punto 1.4.), como as tambin a conocer la fuente de contaminacin (viedo o superficie de bodega). 1.1.2. Para evaluar la presencia de levaduras contaminantes en el viedo, en un segundo muestreo se tomaron racimos sanos y daados (daos por pjaros, Botrytis, granizo, etc.) en el viedo, tanto de zonas sombras como luminosas. Se recolectaron 12 bayas por racimo que se incubaron en el medio selectivo antes mencionado. Para el aislamiento a partir de superficies de bodega, se procedi al hisopado de la superficie de 13 tanques de fermentacin vacos. Los hisopos fueron posteriormente colocados en tubos con Medio 1 e incubados en agitacin a 26 C. Alcuotas del cultivo fueron sembradas en los medios selectivos utilizados previamente. La identificacin de los aislamientos se realiz por ITS-RFLP. Se detectaron las mismas especies tanto en racimos sanos como daados provenientes de las zonas luminosas del viedo: Hanseniaspora uvarum y Zygoascus hellenicus. En los racimos sanos de zonas sombras slo se aisl Hanseniaspora uvarum, mientras que en los racimos daados de estas zonas, H. uvarum, Z. hellenicus y Pichia guilliermondii. En el 38% de las piletas no se obtuvieron aislamientos de levaduras. Candida boidinii se detect en el 62% de las piletas, en cambio las especies P. guilliermondii, Rhodotorula mucilaginosa y H. uvarum fueron detectadas nicamente en una pileta cada una (8%). Por otra parte, se aislaron a partir de superficies de los filtros utilizados en la bodega las especies P. manshurica y P. membranifaciens. Estos resultados indicaran que la especie P. manshurica, probablemente relacionada a defectos en los vinos analizados, est radicada en la bodega. Result necesario evaluar si exista una nica cepa o varias las causantes de esta alteracin y si stas podran desarrollarse en vino y producir fenoles voltiles de manera diferencial (punto 1.4.). 1.1.3. Para enriquecer el estudio con levaduras contaminantes poco estudiadas, se incorporaron al trabajo 23 aislamientos de P. guilliermondii del cepario NPCC (North Patagonian Culture Collection) aislados de superficie de uvas y diferentes mostos de fermentacin, ya descritos por el grupo de investigacin como productores de caractersticas indeseable en vinos. Esta especie encuentra ampliamente extendida en la regin vitivincola Patagnica, aislndose con frecuencia de uvas, mostos y equipos de bodegas (Lopes et al. 2007; Sangorrn et al. 2008). Nosotros hemos comprobado en que est relacionada con la produccin de etilfenoles en mostos (Lopes et al. 2009). 1.2. Bsqueda de nuevas levaduras killer adaptadas a condiciones de vinificacin. Si bien el laboratorio ya contaba en la NPCC con una amplia coleccin de levaduras aisladas de ambientes de bodega con capacidad killer (Sangorrn et al. 2001), se procedi a la bsqueda de nuevos aislamientos de levaduras killer distintas a S. cerevisiae capaces de tolerar las condiciones de stress producidas durante la fermentacin, como fuente de potenciales antagonistas de las levaduras contaminantes. En una bodega (HC) del AVRN se muestrearon ocho tanques de fermentacin: dos en estadios iniciales, cuatro en estadios medios y tres en el final de la fermentacin. Se utilizaron medios slidos selectivos para levaduras noSaccharomyces: Agar lisina (YCB + lisina + antibitico) y GPY + cicloheximida + antibitico. Se obtuvieron

51 aislamientos que fueron identificados por ITS-RFLP como: Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomala, Schizosaccharomyces pombe y H. uvarum. 1.3. Caracterizacin de levaduras. Se caracterizaron a nivel intraespecfico los aislamientos de P. manshurica, P. membranifaciens y P. guilliermondii mediante RFLP-mtDNA. Se obtuvo un perfil nico de RFLP-mtDNA para todos los aislamientos de P. manshurica, tanto los provenientes de ambas muestras de vino como as tambin de las muestras de filtro. Por otro lado, para P. guilliermondii tambin se obtuvo un perfil nico de RFLP-mtDNA, mientras que para P. membranifaciens se obtuvieron 4 perfiles (A,B,C,D), siendo el perfil B el mayoritario. 1.4. Evaluacin de caractersticas indeseables de las levaduras contaminantes. Frascos conteniendo 70 mL de vino (12,6% etanol) esterilizados por filtracin y adicionados con 100 mg/L de cido p-cumrico (precursor de fenoles voltiles 4-vinilfenol y 4-etilfenol) se inocularon independientemente con tres aislamientos de P. manshurica y cuatro de P. membranifaciens representativos de cada perfil mitocondrial. Se evalu por HPLC la produccin de compuestos fenlicos derivados del cido p-cumrico luego de dos meses de incubacin (Salameh et al. 2008). Se detectaron valores promedio de 0,60,074 mg/L de 4-etilfenol y 2,73,4 mg/L de 4-vinilfenol, evidenciando por primera vez la capacidad de estas especies de levadura de producir estos compuestos en condiciones de vinificacin. Para evaluar la capacidad de producir compuestos fenlicos en condiciones ms controladas y homogneas, se realizaron cultivos en 20 mL en medio sinttico (YNB, 1% fructosa, 10% etanol, 0,003 ppm de biotina, 0,3 ppm de tiamina y 100 ppm de cido p-cumrico) de todos los aislamientos de P. membranifaciens, P. manshurica y P. guilliermondii aislados de la regin. Se midi el crecimiento cada 20 das por DO a 640 nm. A los 60 das pudo corroborarse el crecimiento de la mayora de los aislamientos de P. membranifaciens y P. manshurica mientras que ninguno de P. guilliermondii logr desarrollar. Se evaluar prximamente el consumo del precursor cido p-cumrico y la produccin de fenoles voltiles por HPLC. Por otro lado, los aislamientos de P. manshurica, P. membranifaciens y P. guilliermondii (Lopes et al. 2009b), fueron evaluados en su capacidad tolerar las condiciones de estrs presentes en el proceso fermentativo por medio de ensayos en placa (Belloch et al. 2008). Los parmetros evaluados fueron: pH, temperatura, azcar, SO2 libre y etanol. Los datos obtenidos fueron procesados mediante Anlisis de Los patrones de Coordinadas Principales (ACoP) para evaluar las relaciones entre los aislamientos.

respuesta a estrs permitieron conocer la capacidad potencial como contaminantes de las cepas de estas especies para la industria vitivincola, y en conjuncin con su produccin de fenoles voltiles, se identificaron las cepas ms peligrosas. 1.5. Ensayos de biocontrol por interacciones killer. Se evalu la sensibilidad de las especies contaminantes frente a las levaduras killer aisladas del punto 1.2. (51 aislamientos) y a otras provenientes de la NPCC (43 cepas) con el objetivo de seleccionar potenciales levaduras antagonistas. De la NPCC se emplearon 14 cepas de M. pulcherrima, 13 de T. delbrueckii y 16 de W. anomala. Como levaduras contaminantes se emplearon tres cepas de D. bruxellensis (cepa tipo y de otros orgenes), cuatro cepas de P. guilliermondii, una de P. manshurica y cuatro de P. membranifaciens seleccionadas por su alta capacidad de producir fenoles voltiles y por su alta tolerancia a las condiciones

de stress enolgico. Se utiliz el mtodo de inhibicin de crecimiento en placas de GPY-MB (Sangorrn et al. 2001). Al finalizar los ensayos se seleccionaron las cepas: M. pulcherrima NPCC 1144 (aislada en el punto 1.2.), T. delbrueckii NPCC 1032 y W. anomala NPCC 1027 por su capacidad inhibitoria frente a varias cepas de las diferentes especies contaminantes evaluadas. En particular W. anomala NPCC 1027 presenta una actividad killer superior al 90% frente a las doce cepas contaminantes (Tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las levaduras contaminantes de vinos frente a las levaduras killer seleccionadas.
Pichia guilliermondii Cepa killer
NRRL Y-2075 USACH L3003 NPCC 1055 NPCC 1070

Dekkera bruxellensis
NRRL Y-1411 CECT 2113 INTA VC20

P. membranifaciens
NRRL Y-2026 INTA K21 USACH L2810 NPCC 1099

P.ma.
NPCC 1038

W. anomala NPCC 1027 T. delbruekki NPCC 1032 M. pulcherrima NPCC 1144 % Sensibilidad

+ + 67

+ + 67

+ + + 100

+ + 67

+ 33

+ + + 100

+ + + 100

+ + 67

+ 33

+ + 66

+ + 66

+ + + 100

NRRL: ARS Culture Collection, Peoria, USA; USACH-L: Coleccin Univ de Santiago, Chile; INTA: Collecion INTA, L. de Cuyo, Mendoza; CECT: Coleccin espaola de cultivos tipo. P.ma: P. manshurica

Se procedi a la produccin de los extractos crudos extracelulares de las tres cepas seleccionadas. Se utiliz el mtodo de precipitacin de protenas con 80% de sulfato de amonio, y se corrobor la actividad killer sembrando una alcuota de este extracto en well en medio YPD-MB slido inoculado con Candida glabrata 1x10
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cl/mL. Debido a la dificultad que present la produccin del extracto crudo de M.

pulcherrima NPCC 1144, y considerando que esta especie fue la menos eficaz frente a las especies contaminantes (Tabla 1), se continu el estudio de las toxinas producidas por T. delbrueckii NPCC 1032 y W. anomala NPCC 1027. Se evalu la actividad y estabilidad de las dos toxinas a parmetros de inters enolgico: etanol, pH, azucares. temperatura y dixido de azufre. Las dos toxinas fueron estables a las condiciones de vinificacin de estos parmetros. Estos datos nos permiten asegurar que ambas toxinas resultarn interesantes para ser utilizadas en enologa, aunque se continua profundizando el estudio en condiciones de fermentacin.

2. Biocontrol de Penicilium expansum y Botrytis cinerea con levaduras antagonistas en pera 2.1. Aislamiento de levaduras antagnicas. Para la obtencin de levaduras con potencial antagnico se emple un protocolo de aislamiento selectivo basado en la metodologa propuesta por Wilson et al. (1993). Se utilizaron peras de los cvs. Packhams Triumph y Beurre DAnjou, procedentes de dos sistemas productivos distintos (produccin orgnica y transicin) luego de 150 das de conservacin frigorfica (0/-1C). A partir de estas peras, se tomaron muestras tanto de heridas sanas (realizadas artificialmente en el momento de entrada de la fruta al frigorfico) como de superficie de frutos. Las aguas de lavado obtenidas de las distintas muestras se inocularon en heridas de frutos sanos desinfectados superficialmente en las que posteriormente se coloc una suspensin de 10 conidios/mL de Penicillium expansum. Los frutos se conservaron a 4 C durante 50 das. Se consider cada fruto como una unidad experimental y se realizaron 4 rplicas de cada agua de lavado. Se evalu la incidencia de la enfermedad (nmero de frutos enfermos con respecto al total de frutos inoculados) y la severidad (dimetro promedio de la lesin). Los criterios de seleccin fijados en esta etapa
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fueron: 1) reduccin en ms del 50 % de incidencia de la enfermedad y 2) reduccin en ms del 60% del dimetro de la lesin. El 23,28 % de las aguas de lavado empleadas respondieron a los criterios fijados. De ese total, el 65% fueron obtenidas de heridas, lo que demuestra que la probabilidad de encontrar microorganismos con capacidad antagnica aumenta cuando el aislamiento original procede de heridas sanas. Un total de 107 levaduras fueron aisladas a partir de heridas sanas previamente inoculadas con las aguas de lavado (Tabla 2). No se encontraron diferencias en la proporcin de levaduras recuperadas con respecto al cultivar ni al tipo de procesamiento productivo de origen. El 57,44% de los aislamientos provino de heridas.
Tabla 2: Aguas de lavado que respondieron al criterio de seleccin.
Origen H eridas sanas Superficie T ransicin Packham s 8,62 0,86 9,48
a b
b a b

Organic Packhams 0,86 1,72 2,59

b

DAnjou 2,59 1,72 4,31

D Anjou 3,45 3,45 6,9

TO TAL 15,52 7,76 23,28

. Tipo de Produccin. Cultivar de pera.

Los aislamientos fueron identificados mediante PCR-RFLP de la regin ITS1-5.8S-ITS2 rDNA, siguiendo la tcnica de Esteve Zarzoso et al. (1999). Las especies identificadas y la frecuencia de las mismas respecto del total fueron: Aureobasidium pullulans (31,78%), Cryptococcus victoriae (15,89%), Cryptococcus albidus (14,02%), Cryptoccocus weringae (8,41%), Cryptococcus tephrensis (7,48%), Rhodothorula laryngis (5,61%), Cystofilobasidium infirmonimatum (4,67%), Candida patagnica (3,74%), Rhodotorula glutinis (3,74%), Pichia membranifaciens (2,80%) y Rhodotorula mucilaginosa (1,87%). La identidad de un aislado representativo de cada especie fue confirmada por secuenciacin del dominio D1/D2 del gen del 26S del rDNA. 2.2. Seleccin de las levaduras antagnicas. Bioensayo. Se evalu la actividad antagnica individual de 33 aislamientos de levaduras: 10 de superficie de fruta y 23 de heridas, representantes de las 11 especies identificadas. Para ello, se inocularon 20 l de una suspensin de 10 clulas/mL de la levadura a analizar en una herida (3x3 mm) realizada en la zona ecuatorial de peras sanas con madurez fisiolgica sanitizadas del cv. Packham's Triumph. Posteriormente, 10 l de una suspensin de conidios de P. expansum o B. cinerea (aislamientos DP23 y DB16, que fueron seleccionados por su virulencia y resistencia a fungicidas) fueron inoculados en las mismas heridas a la CMI de cada uno. Adems, dos tratamientos qumicos (Tiabendazol y Captan) fueron llevados a cabo con fines comparativos. Se emplearon 5 frutos por tratamiento, con una herida por cada uno de ellos. Los frutos se incubaron en cmaras de almacenamiento comercial (-1/0C) y se evalu peridicamente la incidencia y severidad de la enfermedad correspondiente. Debido a que la velocidad de desarrollo de la podredumbre causada por B. cinerea es mayor que la de P. expansum a la temperatura de conservacin de la fruta, se consideraron distintos tiempos de incubacin en cada caso. En frutas inoculadas con B. cinerea la evaluacin del efecto antagnico se evalu hasta los 100 das, mientras que en frutas inoculadas con P. expansum hasta los 210 das.
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Al final del perodo de incubacin, el 29% de los aislamientos de levaduras mostr valores de 40%-68% de reduccin de la severidad de la enfermedad causada por B. cinerea. Entre ellos, los aislamientos NPCC 1249 (C. patagonica), NPCC 1259 y NPCC 1263 (C. victoriae), NPCC 1248 (C. albidus), NPCC 1268 (C. weringae) y NPCC 1250 (P. membranifaciens) lograron los porcentajes ms altos (60-68%). Los fungicidas mostraron 0% de incidencia de esta enfermedad. Frente a P. expansum, el 30 % de los aislamientos logr controlar totalmente el desarrollo de la enfermedad (0 % de incidencia). A los aislamientos antes mencionados, con excepcin de C. patagnica, se les suman: A. pullulans NPCC 1262, 1273 y 1274; C. victoriae NPCC 1260; C. tephrensis NPCC 1254 y R. glutinis NPCC 1264. Los tratamientos con fungicidas presentaron 100% de incidencia de la enfermedad y menos de 10% de reduccin de la severidad. Por los resultados obtenidos, se seleccionaron los cinco aislamientos con mejor comportamiento frente a B. cinerea para los estudios posteriores, dado que todos ellos a su vez protegieron totalmente de la enfermedad producida por P. expansum. Estos aislamientos estn siendo actualmente re-evaluados bajo las mismas condiciones experimentales en la actual temporada de conservacin (2009-2010). Los resultados mostrados en este trabajo y la profundizacin a futuro de los ensayos en condiciones de las industrias correspondientes permitirn desarrollar estrategias de biocontrol de organismos indeseables mediante el uso de levaduras o de sus principios activos.

CONCLUSION

Los resultados mostrados en este trabajo y la profundizacin de los ensayos en condiciones de las industrias pertinentes permitirn desarrollar a futuro estrategias de biocontrol de organismos indeseables mediante el uso de levaduras o de sus principios activos.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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