ANLISIS HISTOLGICO.

El anlisis histolgico se lleva a cabo mediante la realizacin de las tcnicas de perfusin, extraccin de cerebelo, corte de tejido, tincin histolgica con la tcnica de Nissl e inmunohistoqumica calbindina como marcadores de las clulas de Purkinje para su posterior conteo y comparacin entre los tres grupos de estudio. Perfusin Para el anlisis histolgico en el da 21 de vida de las cras, se realizar una perfusin, que consiste en anestesiar a la rata con una sobredosis de pentobarbital con 0.15 ml a una concentracin 6.3 g/100ml. Una vez anestesiado el individuo se procede a localizar el esternn y realizar un corte transversal y se pinza. Se corta lateralmente el diafragma por ambos lados hacia la cabeza por las costillas y paralelo a los pulmones, y se hace una puncin intracardial a travs del ventrculo izquierdo para realizar la perfusin. En este punto se introduce la aguja hasta que se vea a travs de la aorta ascendente y se hace una incisin en la aurcula derecha para drenar la sangre. Se pasarn 100150 ml de solucin salina 0.9% (heparinizada), y posteriormente 100 150 ml de paraformaldehdo 4% en BF 0.1M con cido pcrico 1% (1g de ac. Pcrico/100 ml de H2O; fotosensible) verificando que el pH sea de 7.4. Extraccin de cerebelo Al trmino de la perfusin se decapita a la rata y se extrae el cerebelo. El tejido se coloca en un recipiente con solucin de paraformaldehdo 4% por 12h

aproximadamente y despus el tejido se cambia a un recipiente con solucin de sacarosa con diferentes concentraciones 10% 24 hrs, 20% 24 hrs y 30% 24 hrs. Una vez que el tejido se va al fondo del recipiente, indica que est listo para ser cortado. Corte de tejido Se realizarn cortes sagitales de 40 m de grosor a nivel del vermis cerebelar a una temperatura de -25 C, mediante la utilizacin de un Cristato (LEICA CM 1850). Posteriormente el tejido se guarda en una concentracin de PB 0.1M o crioprotector a -4 C para su posterior montaje en porta objetos gelatinisados. Una vez que se monta el tejido, se deja secar por 24hrs.

Tincin histolgica Para la tincin del tejido se utiliza la tcnica de tincin de Nissl (violeta de cresilo). El tejido ya montado en portaobjetos gelatinizados, se sumerge en agua destilada durante 1 minuto, 5 minutos en solucin de violeta de cresilo al 5%, posteriormente en diferentes concentraciones de alcohol al 70%, durante 10 segundos y despus por 1min en concentraciones de 90% y 100% respectivamente, posterior a esto, se sumergen los cortes en xileno durante 15 segundos y finalmente se coloca permount y cubreobjetos para su posterior anlisis. Inmunohistoqumica Calbindina

La calbindina es una protena que tienen una amplia distribucin y exhibe un modelo de expresin de tipo especfico en las clulas, estas pueden ser bien localizadas inmunocitoqumicamente en clulas selectas de muchas estructuras del SNC, se piensa que actan como amortiguadores intracelulares o en el transporte de Ca +2 . La calbindina es un atractivo marcador nuronal. Los anticuerpos monoclonales reaccionan especficamente con calbindina D-28K que es utilizada como instrumento en la localizacin de calbindina en diferentes tejidos y poblaciones de clulas.

1.- Se realizan 3 lavados con buffer de fosfato (PB) 0.1M y de 6 a 8 si estn en crioprotector, durante 5m c/u y 1 lavado con buffer de fosfato con Tritn (PBT) al 0.1% por 15m, todos en libre flotacin y agitacin constante; de esta forma se abre la membrana para la primera incubacin. 2.- Para la eliminacin de peroxidasas endgenas, se prepara una solucin de perxido de hidrgeno (H202) = 10 ml de PB 0.1M +180 L H202 al 30%, durante 10m. 3.- Realizar 4 lavados con PB 0.1M durante 5m c/u y uno con PBT 0.1% por 10m en agitacin constante. 4.- Preparar la solucin de pre-bloqueo con suero de caballo al 5% en PB 0.1, aplicar al tejido en agitacin constante y dejar por 1hr. De esta forma se bloquean protenas y se evita el marcaje inespecfico. Anticuerpo 1 5.- Para la incubacin del anticuerpo primario anti -calbindina hecho en ratn se prepara una dilucin de Ab: 1:500, disuelto en PBT 0.3%, adicionado con suero de caballo al 5% durante 48h a 4C (1:= L Ab + LPBT 0.3% + L Suero). 6.- Hacer 3 lavados con PB 0.1 durante 5m c/u y 1 lavado con PBT 0.1% durante 10m

Anticuerpo 2 7.- Incubacin del anticuerpo secundario anti-mouse en caballo proporcin 1:400 por 90m en agitacin constante a temperatura ambiente. (L Ab + L PBT 0.3%). 8.- Hacer 3 lavados con PB 0.1M durante 10m c/u y 1 lavado con PBT 0.1% por 10m. Complejo A-B 9.- Se utiliza el complejo avidina-biotina (Kit ABC, PK-6100 Ellite-Estndar Vector Laboratories Inc.) el cual se prepara en una dilucin 4:1000= 72L A + 72LB + 17928L PB 0.1M, 30 a 50 m antes y una vez aplicado se mantiene en agitacin a temperatura ambiente durante 90m. 10.- Hacer 3 lavados con PB 0.1M durante 10m c/u y 1 lavado con PBT 0.1% por 10m. Revelado 11.- Para el revelado del tejido se utiliza diaminobencidina (DAB) kit DAB, SK4100 Vector Laboratories Inc. En una solucin de 5ml PB 0.1M + 4 gotas de DAB + 2 gotas de H202 los cuales se agregan al tejido por 5m para su revelado sin Niquel. 12.-Hacer 8 lavados con PB 0.1M durante 5m c/u. 13.-Se monta el tejido en portaobjetos gelatinizados y se deja secar durante 24h. Deshidratacin de tejido 14.- Se realiza un lavado sumergiendo las laminillas en agua destilada por un minuto, posteriormente se pasan a diferentes concentraciones de alcohol al 70%, 95%, y 100% respectivamente durante 1m c/u y 20 segundos en xileno al 100%. Se deja secar las laminillas para aplicar posteriormente permount y cubrir el tejido con cubreobjetos y dejarlo secar a temperatura ambiente. Anlisis de Imagen Se eligen tres cortes por cra, a los cuales se les toman tres microfotografas digitales a 10x cubriendo en su totalidad el rea de los lbulos VIa, VIb y VII individualmente, del rea ms ventral del vermis, mediante un microscopio ptico (LEICA DME) con cabezal triocular, cmara de 3MP, conectado a una computadora Mac con el programa Leica application Suite (LAS EZ) versin 16.0. Para obtener 3 fotos por corte y en total 9 por cada cra, de las cuales se realiza el conteo de las clulas de Purkinje manualmente, utilizando el programa Image J; mediante la estandarizacin de una cuadrcula a 78640 2 (324.75 x 242.5). Para su posterior comparacin y anlisis con respecto a los grupos de control y sham.