R Biopharm

XXIV Jornada s T cnic a s de laAET C | Octubre 2012 |
Anlisis de Micotoxinas en cereales

Paul Aguiar. R-Biopharm Espaa S .A.
R-Bio p harm Esp aa S.A. Tel. 902 903 355 Fax: 916 548 992 info @r-b io p har m .es w w w .r-b iop har m .com
Anlisis de Micotoxinas en cereales Int ro ducci n Legislacin Tcnicas analticas Co nclusiones
R-Biopharm Espaa S.A. Tel. 902 903 355 Fax: 916 548 992 inf o@r-biopharm.es www. r-b iopharm.com
Micotoxinas
Toxinas produc idas por mohos, de modo natural, presentes en produc tos agrc olas: cereales. Son metabolitos sec undarios. La may ora de las mic otoxinas de inters son produc idas por tres gneros de mohos: Aspergillus Penicillium Fusarium
In t ro d ucci n
Micotoxinas
S e conocen miles de metabolitos txicos producidos por mohos. Han sido detectadas ms de 200 micotoxinas e n ce re ale s.
AFLAT OXINAS
Af latoxinas B 1 G 1 B 2 G 2. Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Cere ales, frutos se cos, higos y e spe cias. Aflatoxina M 1.
OCRAT OXINA
Ocratoxina A. Penicillium verrucosum, Aspegillus ochraceous. M az, cebada, trigo, ave na, caf, uvas, cacao y e spe cias.
In t ro d ucci n
FUM ONISINAS
Fumo nis inas B 1 B 2. Fusarium verticilloides. Cere ales, principalme nte maz.
T RICOTECENOS
DON (Vomitoxina), Toxina T-2 & HT-2. Fusarium spp. Trigo, cebada y maz, en Europa y USA.
ZEARALENONA
Fusarium grammineum. Trigo, cebada ave na y maz.
ALCALOIDES DEL CORNEZUELO

Claviceps spp. Centeno, trigo y ce bada.
In t ro d ucci n
Factores que influyen en la produccin de micotoxinas Mohos

Temperatura Humedad (aw )
Micotoxinas
Biolgic os V ariedades M ohos toxignicos
Ambient ales T emperatu ra Hu medad Plagas
Cos ec ha M a du rez S ecado Dao mecni co
Almac enamient o Hu medad T emperatu ra A ireacin Plagas
Variedades resistentes Transpo rte / Almacenamiento

In t ro d ucci n
Prcticas agronm icas (G AP)
Prevenci n
Tecnologa po st-cosecha
Expo sicin a las micotoxinas
Prevenir la p resenc ia de micotoxinas en alimentos:

In t ro d ucci n
Evit ar la formacin de micotoxinas en materias primas. Anlisis de micotoxinas materias primas. Preve nir la aparicin durante transporte y almace namiento. Control de alimentos para consumo humano y piensos.
Efectos de las micotoxinas

Micotoxicosis: enfermedad provocada por la exposicin a micotoxinas. Efectos crnicos por exposicin prolongada. Efectos txicos agu dos obse rvable s en situacione s exce pcionale s. Factore s que influye n en la toxicidad: Tipo de micotoxina y su toxicidad. S inergia ent re micotoxinas. Ingest a y exposicin. Individu ales. Edad Media: En Europa: Ergotis mo. M us eo del Lo uv re ( Pars ) Producida por ingest a de Claviceps purprea. Aos 60:
Lo s lis i ados . Pie t er Bru e g h el, el v iej o. 15 68.
En Reino Unido: Enf ermed ad X de los pavos. Producida por harina de cacahuetes con Aspergillus Flavus.
In t ro d ucci n
Efectos de las micotoxinas en animales

Estudios expe rimentale s han pe rmitido determinar dive rsos efectos: Inmunolg icos Aflatoxinas, Tricotecenos, Ocratoxina A. Hemo rrg icos Aflatoxinas, Tricotece nos. Hepatotxicos Aflatoxinas, Ocratoxina A, Fumonisinas. Nef rotxicos Ocratoxina, Tricotece nos, Fumonisinas. Reprod uctivos Fumonisinas, ciertos Alcaloide s del cornezuelo. Teratgenos Aflatoxina B1, Ocratoxina A, Toxina T-2, Ze arale nona. Neurotxicos Deoxinivale nol, Fumonisinas, Alcaloide s de l cornezuelo. Cancergenos Aflatoxinas, O cratoxina A, Fumonisinas. Dermatolgicos varios Tricotece nos.
In t ro d ucci n
Efectos de las micotoxinas en humanos

Existen evidencias de los ef ectos en humanos pero en muchos casos los posibles ef ectos son consecuencia de extrapolar los ef ectos en animales. Los efectos dependen de la toxicidad y la exposicin. Agenc ia I nternac ional para la I nvestigac i n del Cncer (IARC)
Clasificacin de las mi cotoxinas Clasificacin de IARC
Grupo 1: cancer geno Grupo 2A: pro bablement e cance r geno Grupo 2B: po siblement e cance rge no Grupo 3: no cl asificado co mo cance r geno Grupo 4: pro bablement e no cance rge no Aflat oxinas B1 B2 G1 G2 Aflat oxina M 1 Deoxini val enol Fumo nisi nas B1 B2 Ocrat oxina A Zea ral enona Toxinas T- 2 & HT- 2
In t ro d ucci n
Grupo 1 Grupo 2B Grupo 3 Grupo 2B Grupo 2B Grupo 3 Grupo 3
Legislacin so bre micotoxinas
Legisl aci n
Legislacin euro pea so bre micotoxinas

Af latoxinas
Todos los cereal es y todos los productos a base de cerel es. Maz y arroz. Aliment os a base de cereales t ransformados y aliment os para lactan t es. Semillas o leaginosas, fr utos sec o s, frut a s pasas, especias Leche cruda, leche para l a fabricaci n de pro d uc tos lcteo s.
REGLAMENTO (EU) N 165/2010 de la COM ISIN de 26 de febrero.
Ocratoxina A
Cereal es no elaborados. Todos los produ ctos derivados de cereal es no elaborados, in cluidos los productos t ransformados a base de cereal es y los cereales dest inados al consumo humano direct o. Glut en de t rigo no dest inado a la ven t a directa al consumidor. Aliment os elaborados a base de cereal es y alimentos infan t iles para lactan t es. Uv as pasas, vinos y bebida s a base de v ino , m osto de uv a, zum od e uv a. Especias, caf tost ad o y so luble, regaliz.
REGLAMENTO (EU) N 594/2012 de la COM ISIN de 5 de julio. REGLAMENTO (EU) N 1881/2006 de la COM ISIN de 19 de diciemb re.
Legisl aci n

Deoxinivalenol (DON)
Cereal es no elaborados que no seant rigo duro, avena y maz. Trigo duro y avena no elaborados. Maz n o elaborado, excepto el dest inado a molienda por va hmeda. Cereal es dest inados al consumo humano directo, harina de cereal es, salvado y germen como produ cto final comercializado para el consumo humano directo. Past a seca. Pan, past eles, gallet as, aperit ivos de cereal es y cereal es para desay uno. Aliment os elaborados a base de cereal es y alimentos infan t iles para lactan t es. Fracciones de molienda del maz.
Zearalenona
Cereal es no elaborados dist in tos del maz. Maz n o elaborado excepto el dest inado a m olienda por va hmeda. Cereal es dest inados al consumo humano directo, harina de cereal es, salvado y germen como produ cto final comercializado para el consumo humano directo. Aceit e de maz refinado. Pan, past eles, gallet as, aperit ivos de cereal es y cereal es para desay uno. Maz dest inado al consumo humano direct o, aperit ivos de maz y cereal es para desay un o a base de maz. Aliment os elaborados a base de cereal es y alimentos infan t iles para lactan t es. Fracciones de molienda del maz.
Legisl aci n

Fumonisinas
Maz n o elaborado excepto el dest inado a m olienda por va hmeda. Maz y aliment os a base de maz dest inados al consum o humano directo. Cereal es para el desay uno a base de maz y aperit ivos de maz. Aliment os elaborados a base de cereal es y alimentos infan t iles para lactan t es. Fracciones de molienda del maz.
REGLAMENTO (EU) N 1126/2007 de la COM ISIN de 28 de sept iemb re.
Legislacin de micotoxinas en alimentaci n animal

Af latoxina B 1
Co n t enido m xim o en mg /kg en p ienso s calcu lado sob re la b ase d e un co n t enid o d e hum ed ad d el 12%. Ma terias primas para pienso s. Pienso s c o mplem ent arios y c o mpletos. Pienso s c o mp uestos para v acas lecheras y terneros, ovejas lecheras y c o rdero s, cabras lecheras y cabritos, lecho nes y a ves d e co rral jv enes. Pienso s c o mp uestos para bov ino s, ovinos, caprino s, po rcinos y a v es de c o rral.
Cornezuelo del centeno

Ma terias primas para pienso s y piensos co mp uestos q ue co ntienen cereales no m o lid o s.
REGLAMENTO (EU) N 574/2011 de la COM ISIN de 16 de junio.

Legisl aci n
Legislacin euro pea so bre toma de muest ras

REGLAMENTO (EU) N 401/2006 de COM ISIN de 23 de febrero Control oficial del contenido de micotoxinas en lo s productos alim enticios. El muestreo tiene un papel fundamental en la precisin de la determ inacin del contenido de micotoxinas. Definiciones: Lote Sublote Muestra elemental Muestra global Muestra de labo ratorio Mtodo de muestreo para los cereales y productos a base de cereales. Mtodo de muestreo para alim entos infantiles y alimentos elabo rado s a base de cereales para lactantes y nio s de corta edad. Guidance document for the sampling of cereals for mycotoxins (EC, 2010).
Legisl aci n
To ma de muestras
Legisl aci n
To ma de muestras
30.000 t
300 g
Muestra: 300 g
Legisl aci n
30.000 t >>> 300 g
To ma de muestras: dist ribuci n hetero gnea
500 ppm
Dist rib uci n real en el lote

Co r t esa de K. Esbensen (AAU E) Legisl aci n
1000 ppm

5000 ppm


10000 ppm (1%)
Dist rib uci n real en el lote Af latoxina B 1 en cereales y productos a base de cereales: 2 ppb (0,002 ppm).
To ma de muestras
Procedimie nto para el control de micotoxinas en un lote
Lote Error TM To ma de muest ra Error
P M
Preparac i n de muest ra Error A
Anlis is
Error T ot al
El error asociado a la toma de muestra es notablemente mayor que los errores asociados a la preparacin de la muestra y el anlisis de la misma. La reduccin de la variacin asociada a cada etapa permite realizar una estimacin ms precisa de la concentracin verdadera de micotoxinas en un lote. La variabilidad asociada al control de productos en grano, para determinar mi cotoxinas, no permite determinar la verdadera concentracin de un lote con un 100% de certeza.
Legisl aci n
Tcnicas analticas para determinar micotoxinas

Recuento de mohos
Recuento Micotoxinas Recuento Micotoxinas Recuento Micotoxinas Recuento Micotoxinas
Deteccin bajo luz UV

Deteccin de fluo rescencia verde-am arillenta, producida por un metabolito co-sintetizado con las Aflatoxinas.
Tcni cas an alt icas

Cromatograf a en capa f ina
(TLC)
Enzimoinmunoensayos
(LFD, ELISA)
Fluorimetra
Cromatograf a de lquidos
(H PLC-FLD, HPLC-UV, LC-MSMS)

Enzimoinmunoensayos (formato tarjet a)
AFLACARD B1 AFLACARD Total OCHRACARD
Aflato x ina B1 Ant icuerpo s mo no clo nales Aflato x inas B1, B2, G1, G2 Ant icuerpo s mo no clo nales Ocrat ox ina A Ant icuerpo s mo no clo nales
Rpido: result ados e n 15 minutos. Sencillo: prueba c ualitativa de interpretacin visual de resu ltados. Flex ib le: diferentes lmites e n diversas matrice s ( 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20 y 30 ppb) Fiab le: buena correlacin de result ados con HPLC.

Enzimoinmunoensayos (LFD: dispositivo de flujo lateral)
Rida QUICK DON Qua nt
Rida QUICK Af latoxin Rida QUICK DON Rida QUICK Fumonis in Rida QUICK Zearalenone

Enzimoinmunoensayos (LFD: dispositivo de flujo lateral)
Rida QUICK Af latoxin DON Fumo nis in Zearaleno na Extraccin 10 min. 10 min. 10 min. 10 min. Incubacin 5 min. 5 min. 5 min. 5 min. Rango de me dida 4 ~ 75 ppb 0,25 ~ 5,50 ppm 0,8 ~ 10 ppm 75 ~ 500 ppb
Rpido: result ados e n 15 minutos. Sencillo: ensayo cuantitat ivo emple ando lector. Flex ib le: amplio rango de me dida. Fiab le: buena correlacin con ELISA y HPLC.

Enzimoinmunoensayos (ELISA)
Enzyme-Linked Immunoso rbent Assay

RIDAS CREEN
Aflatoxinas Totales Aflatoxina B1 Aflatoxina M1 Ocratoxina A Citrinina Zearalenona DON (Vom itoxina) Toxina T2 & HT-2 Fumonisinas (48 pocillos/5 pat rones): piensos y cereales (mat erias primas)
RIDAS CREEN FAST RIDAS CREEN

(96 pocillos/6 pat rones): aliment os y aliment acin infant il.

Enzimoinmunoensayos (ELISA S andwich)
Detecta y cuantifica la concentracin de micotoxinas. Anticuerpo de captura y un anticuepo conjugado con un enzim a. Sustrato cromognico para detectar el anticuerpo conjugado. Medida espectrofotomtrica mediante lector de placas (45 0 nm). Cuantifica resultado s respecto a curva de calibracin. Anticuerpos
Negativ o
Positiv o

Muestra/Standard Incubar Lav ado Conjugado Incubar Lav ado Sustrato Incubar
E
Anticuerpos Micotoxina Matriz Conjugado Sustrato
E E E E E
E E E
E E E
Negativ o
Positiv o

Muestra/Standard Incubar Lav ado Conjugado Incubar Lav ado Sustrato Incubar Solucin parada Lectura
RIDASCREEN
Det ermi nacin cuant it at iva de micotoxinas en ali ment os y aliment acin infa nt il.
RIDASCREEN Aflatoxin B1 Aflatoxin Total Ochratoxin A Zearalenone Deox iniv alenol T-2 Toxin Fumonisin
L.O.D para cer eal es. Tcni cas an alt icas
(96 p.)
L.O.D. 1,00 ppb 1,75 ppb 1,25 ppb 1750 ppt 18,5 ppb 3,50 ppb 25 ppb.
Valo res de patrones 0 /1/5/10/20/50 ppb 0/0,5/1,5/4,5/13,5/40,5 ppb 0/50/100/300/900/1800 ppt 0/50/150/450/1350/4050 ppt 0/3,7/11,1/33,3/100 ppb 0/0,1/0,2/0,4/0,8/1,6 ppb 0/0,025/0,074/0,222/0,666/2 ppm
RIDASCREEN FAST
Det ermi nacin cuant it at iva de micotoxinas en pi ensos y cereal es (mat erias p ri mas)
RIDASCREEN FAST Aflatoxin Ochratoxin A Zearalenone
(48 p.)
L.O.D. 1,70 ppb 5,00 ppb 50,0 ppb 222 ppp 50,0 ppb 222 ppb
Valo res de patrones 0 /1,7/5/15/45 ppb 0/5/10/20/40 ppb 0/50/100/200/400 ppb 0/0,222/0,666/2/6 ppm 0/50/100/200/400 ppb 0/0,222/0,666/2/6 ppm
Deox iniv alenol (DON) T-2 Toxin Fumonisin

L.O.D para cer eal es.

Columnas de inmunoaf inidad
Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS .
A nt icu erpos Ma t riz M icot oxinas
Ext ra ct o de mu est ra se pasa por la colu mna
A nt icu erpos ret ienen y con cent ran las micot oxinas
S olv ent e qu e desnatu raliza los anticu erpos y eluy en las micot oxinas
Fiab le: anticuerpos monoclonale s. Rpido: purifica el extracto de muestra e n 20 minutos. Flex ib le: aplicacione s espe cficas para diferentes matrice s. Sensib le: Baj o %CV , buenas re cupe racione s y LOD < legislacin EU.

Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS .
HPLC-FLD
LC-MSMS
AFLAPREP
DZT MS-PREP

Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS . AFLAPREP ( Aflatox inas B1 B2 G1 G2) AFLAPREP M ( Aflato x inaM 1) OCHRAPREP ( Ocrat ox ina A) AFLAOCHRA PREP (Aflatox inas y Ocrat ox ina A) EASI-EXTRACT Zearalenone ( Zearaleno na) DONPREP ( Deox iniv aleno l/Vo mito x ina) EASI-EXTRACT T-2 & HT-2 ( Tox inas T- 2 & HT- 2) FUMONIPREP ( Fumo nisinas) AO ZON PREP (Afla t ox inas, Ocrat ox ina A y Zearale no na) DZT MS-PREP ( Deox iniv aleno l, Zearaleno na y To x inas T- 2 & HT- 2)
TRILOGY Pat ro nes de mi co tox inas TRILOGY M a t eriales de referenci a
Co nclusio nes
La presencia est condicionada por el tipo de moho, sustrato y fa ctores externos. La contaminacin puede ocurrir en el campo, durante la cosecha, el transporte y el almacenamiento. La reduccin es posible aplicando buenas prcticas agrcolas (GAP) y buenas prcticas defabricacin (GMP). Consecuencias econmicas en el comercio decereales y en la productividad de los animales. Las micotoxinas pueden causar efe ctos adversos en la salud humana y animal. Los efectos en humanos son generalmente crni cos no agudos. La toma de muestra repercute de manera significativa en la determina cin del contenido de micotoxinas en un lote. La muestra debe ser representativa del lote. R-Biopharm dispone de diversas t cnicas para el anlisis de micotoxinas en cereales.
Co nclusio nes
Gracias
por su at encin
p.aguiar@ r- biopha rm. es
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Factores que influyen en la produccin de micotoxinas Mohos

Biolgic os V ariedades M ohos toxignicos

Ambient ales T emperatu ra Hu medad Plagas

Cos ec ha M a du rez S ecado Dao mecni co

Almac enamient o Hu medad T emperatu ra A ireacin Plagas

Variedades resistentes Transpo rte / Almacenamiento

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Prevenir la p resenc ia de micotoxinas en alimentos:

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Grupo 1 Grupo 2B Grupo 3 Grupo 2B Grupo 2B Grupo 3 Grupo 3

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Cornezuelo del centeno

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30.000 t >>> 300 g

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To ma de muestras: dist ribuci n hetero gnea

Dist rib uci n real en el lote

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To ma de muestras: dist ribuci n hetero gnea

Dist rib uci n real en el lote

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To ma de muestras: dist ribuci n hetero gnea

Dist rib uci n real en el lote

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To ma de muestras: dist ribuci n hetero gnea

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Preparac i n de muest ra Error A

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Deteccin bajo luz UV

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