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ENFERMEDAD DE NEWCASTLE
RESUMEN
La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por virus especficos del paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1) que es un serotipo del gnero Avulavirus perteneciente a la familia Paramyxoviridae. Existen nueve serotipos de paramixovirus aviar designados desde APMV-I a APMV-9. Las cepas del virus de la EN varan ampliamente en cuanto a la severidad de la enfermedad que pueden provocar en las aves. Las cepas menos patgena pueden inducir una enfermedad grave si se exacerban por la presencia de otros organismos o mediante condiciones ambientales adversas. El mtodo preferido de diagnstico es el aislamiento del virus y su subsiguiente caracterizacin. Identificacin del agente: Se preparan suspensiones en solucin antibitica de muestras traqueales o cloacales (o heces) obtenidas de aves vivas o de heces y muestras de rganos seleccionados procedentes de aves muertas que se inoculan en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios de aves de corral de 911 das de edad. Los huevos se incuban a 37C durante 47 das. El lquido alantoideo de cualquier huevo que contenga embriones muertos o moribundos, cuando surgen, y todos los huevos al final del periodo de incubacin se ensayan para detectar actividad hemaglutinante. Cualquiera de los agentes hemaglutinantes debera probarse para demostrar la inhibicin especfica con un antisuero monoespecfico frente al virus de la EN. El virus de la EN (APMV-1) puede mostrar alguna relacin cruzada antignica con algunos otros serotipos del paramixovirus aviar, particularmente el APMV-3 y el APMV-7. La patogenicidad de cualquier nuevo virus aislado se puede evaluar mediante la determinacin del tiempo medio de muerte en embriones de pollo, el ndice de patogenicidad cerebral en polluelos de 1 da de edad o mediante el ndice de patogenicidad intravenosa en pollos de 6 semanas. En algunos pases se utilizan variaciones de estas tcnicas estandarizadas. La patogenicidad de los aislados tambin se puede valorar empleando tcnicas moleculares, p. ej. la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin inversa y la secuenciacin. El aislamiento y la caracterizacin de cepas del virus sospechosas de ser patgenas se deberan llevar a cabo en un laboratorio de seguridad vrica. Pruebas serolgicas: La prueba de inhibicin de la hemaglutinacin es la ms ampliamente utilizada en la serologa del virus de la EN; su relevancia en el diagnstico depende del estado inmune vacunal de las aves a ensayar y de las condiciones predominantes de la enfermedad. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Dependiendo de la situacin de la enfermedad, se emplean virus vivos de baja virulencia (lentognicos) o de virulencia moderada (mesognicos) para la vacunacin de aves de corral. Tambin se utilizan vacunas inactivadas. Las vacunas vivas se pueden administrar a las aves por diversas vas. Normalmente se preparan mediante la extraccin de lquidos alantoideos/amniticos infectados procedentes de huevos embrionarios de aves inoculados; algunas se preparan a partir de cultivos celulares infectados. Se debera obtener el producto final de la expansin de los inculos original y de trabajo. Las vacunas inactivadas se administran por va intramuscular o subcutnea. Habitualmente se obtienen mediante la adicin de formaldehdo a preparaciones vricas infectivas o mediante tratamiento con beta-propiolactona. La mayora de vacunas inactivadas se prepara para uso mediante una emulsin con aceite vegetal o mineral.
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Si se emplean formas patgenas del virus de la EN para la produccin de vacunas o en estudios de desafo, el servicio debera cumplir los requisitos de la OIE para los patgenos del nivel de Contencin del Grupo 4.
A. INTRODUCCIN
La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un serotipo del gnero Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los paramixovirus aislados procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas serolgicas en nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el virus de la EN se ha denominado APMV-1 (4). Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endmica en muchos pases. La vacunacin profilctica se practica en casi todos los pases productores de aves de corral a escala comercial. Una de las propiedades ms caractersticas de las cepas diferentes del virus de la EN es su enorme variacin respecto a la patogenicidad para los pollos. Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la base de los signos clnicos observados en los pollos infectados (13). Estos son: 1. 2. 3. 4. 5. Velognico viscerotrpico: es muy patognica en la que se observan frecuentemente lesiones intestinales hemorrgicas; Velognico neurotrpico: se presenta con mortalidad elevada, habitualmente seguida de signos respiratorios y nerviosos; Mesognico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos ocasionales pero baja mortalidad; Lentognico o respiratorio: se presenta con una infeccin respiratoria leve o subclnica; Entrico asintomtico: normalmente consiste en una infeccin entrica subclnica.
Raramente los agrupamientos en patotipos son claros (6), e incluso en infecciones de aves libres de patgenos especficos (SPF), se puede apreciar un considerable solapamiento. Adems, puede tener lugar una exacerbacin de los signos clnicos inducida por las cepas ms benignas si se superponen infecciones de otros organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales adversas. Como los signos de la enfermedad clnica en pollos varan ampliamente y el diagnstico puede complicarse posteriormente por las respuestas diferentes a la infeccin en los distintos hospedadores, los signos clnicos por s solos no presentan una base fiable para el diagnstico de la EN. Sin embargo, los signos clnicos y las lesiones asociadas con los patotipos virulentos proporcionarn una fuerte sospecha de enfermedad.
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.
a)
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Se tendran que colocar las muestras en solucin salina isotnica tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0 7,4, que contenga antibiticos. Los antibiticos pueden variar de acuerdo a las condiciones locales, pero podra ser, por ejemplo, penicilina (2.000 unidades/ml); estreptomicina (2 mg/ml); gentamicina (50 g/ml); y micostatina (1.000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a concentraciones cinco veces superiores para frotis cloacales y de heces. Es importante reajustar la solucin a pH 7,07,4 despus de la adicin de los antibiticos. Las heces y los tejidos tomados finamente deberan prepararse como suspensiones al 1020% (p/v) en la solucin de antibitico. Las suspensiones deberan procesarse tan pronto como fuera posible despus de una incubacin durante 12 horas a temperatura ambiente. Cuando es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4C hasta 4 das.
b)
c)
d)
ndices de patogenicidad
La variacin extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos vricos de la EN y el uso generalizado de vacunas vivas implica que la identificacin de un aislamiento como virus de la EN a partir de aves que muestren signos clnicos no confirma un diagnstico de la EN, por lo que tambin se requiere una valoracin de la virulencia del aislado (vase Seccin B.1.f. bajo el ttulo Definicin de la enfermedad de Newcastle). Se investigan por parte de varios grupos en todo el mundo varias pruebas in vitro potenciales para establecer la virulencia normalmente relacionada con la base molecular de la patogenicidad (Seccin B.1.e. ms adelante). Hasta la fecha, una valoracin definitiva de la virulencia del virus se basa habitualmente en una o ms de las siguientes pruebas in vivo, aunque la definicin actual de la OIE (Seccin B.1.f. abajo) permite una valoracin molecular de la virulencia: i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Tiempo medio de muerte en huevos Se diluye el lquido alantoideo infectivo, estril y fresco en solucin salina estril para preparar diluciones decimales en serie comprendidas entre 106 y 109. Para cada dilucin se inocula 0,1 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de cinco huevos embrionarios de aves SPF de 910-das de edad y entonces se incuban a 37C. Las diluciones vricas restantes se mantienen a 4C y se inoculan otros cinco huevos con 0,1 ml de cada dilucin 8 horas ms tarde y se incuban a 37C. Cada huevo se examina dos veces al da durante 7 das y se registran los tiempos a los que muere cada embrin. La dosis letal mnima es la dilucin vrica ms alta que causa la muerte de todos los embriones inoculados con ella. El tiempo medio de muerte (MDT) es el tiempo medio en horas en el que la dosis letal mnima provoca la muerte de todos los embriones inoculados. El MDT se ha utilizado para clasificar las cepas del virus de la EN dentro de los grupos siguientes: velognico (tarda menos de 60 horas en matar); mesognico (tarda entre 60 y 90 horas en matar) y lentognico (tarda ms de 90 horas en matar).
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i) ii)
ndice de patogenicidad intracerebral El lquido alantoideo infectivo y fresco con un ttulo HA >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solucin salina isotnica estril sin aditivos, tales como antibiticos. Se inyectan por va intracerebral 0,05 ml del virus diluido en diez polluelos procedentes de huevos de un grupo de aves SPF. En el momento de la inoculacin, estos polluelos deben tener ms de 24 horas y menos de 48 horas. Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 das. En cada observacin, las aves se puntan: 0 si es normal, 1 si est enferma y 2 si est muerta. (Los individuos muertos deben puntuarse como 2 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la muerte). El ndice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la puntuacin media por ave y por observacin durante el periodo de 8 das.
iii) iv)
v)
Los virus ms virulentos presentarn ndices que se aproximan a la puntuacin mxima de 2,0, mientras que las cepas lentognicas presentarn valores prximos a 0,0. i) ndice de patogenicidad intravenosa El lquido alantoideo infectivo recogido en fresco (que no debera tener ms de 2448 horas y que debera demostrarse que est exento de contaminacin bacteriana) con un ttulo HA de >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solucin salina isotnica estril. Se inyecta por va intravenosa 0,1 ml del virus diluido en diez pollos SPF de seis semanas. Se examinan las aves a intervalos de 24 horas durante 10 das y se punta cada observacin: 0 si es normal, 1 si est enferma, 2 si est paralizada o muestra algunos signos nerviosos y 3 si est muerta. (Los individuos muertos deben puntuarse como 3 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la muerte). El ndice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuacin media por ave y por observacin durante el periodo de 10 das.
ii) iii)
iv)
Las cepas lentognicas y algunas cepas mesognicas tendrn valores IVPI de 0, mientras que los ndices de las cepas virulentas se aproximarn a 3,0. Se han recomendado algunas variaciones en estas pruebas. El muestreo de la cloaca y de la conjuntiva de pollos de 8 semanas con lquido alantoideo no diluido se ha sustituido por la prueba IVPI (23). La intencin es distinguir entre los virus velognicos viscerotrpicos y los velognicos neurotrpicos. Interpretacin de los ndices de patogenicidad
No resulta sencilla la interpretacin de los ndices de patogenicidad obtenidos con vistas a un comercio impositivo, o a restricciones en el movimiento u otras polticas. El objetivo es controlar las cepas que son significativamente ms virulentas que las cepas lentognicas, tales como la Hitchner-B1 o La Sota. Como los virus capaces de producir una enfermedad bastante severa pueden tener valores IVPI de 0, se utiliza la prueba ICPI con ms frecuencia para tales valoraciones. Sin embargo, como en esta prueba cepas diferentes muestran un rango de valores desde 0,00 hasta 2,00, est claro que cualquier valor utilizado para definirlas debe regirse por el sentido prctico.
e)
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misma regin de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y un residuo de L (leucina) en la posicin 117. Algunos de las variantes vricas de la paloma examinadas (PPMV-1) tienen la secuencia 112G-R-Q-K-R-F117, pero tienen valores ICPI altos. De modo que parece que existe el requerimiento de al menos un par de aminocidos bsicos en las posiciones 116 y 115 ms una fenilalanina como residuo 117 y un aminocido bsico (R) en la posicin 113 si el virus muestra virulencia hacia los pollos. Se han realizado diversos estudios empleando tcnicas moleculares para determinar la secuencia del punto de escisin de F0 mediante la reaccin en cadena de la polimerasa de trascripcin inversa (RT-PCR), bien en virus aislados o bien en tejidos y heces procedentes de aves infectadas, realizndose a continuacin el anlisis del producto mediante el anlisis con enzimas de restriccin, la hibridacin con sonda o la secuenciacin de nucletidos al objeto de establecer una prueba in vitro rutinaria para determinar la virulencia (para una revisin vase ref.2). La determinacin de la secuencia de escisin de F0 puede proporcionar una indicacin clara de la virulencia del virus y esto se ha incorporado a la definicin de la EN (vase Seccin B.1.f.). En el diagnstico de la EN es importante entender que la demostracin de la presencia del virus con mltiples aminocidos bsicos en el punto de escisin de F0 confirma la presencia de virus virulentos o potencialmente virulentos, pero la falta de deteccin de virus o la deteccin de virus de la EN sin mltiples aminocidos bsicos en el punto de escisin de F0 empleando tcnicas moleculares no confirma la ausencia de virus virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en una misma poblacin estn mezclados virus virulentos y avirulentos, implica que todava ser necesario el aislamiento del virus y una valoracin in vivo de la virulencia. Los anlisis recientes de virus aislados en Irlanda en 1990 y los realizados durante los brotes de la EN de 19982000 en Australia han proporcionado una clara evidencia de que los virus virulentos pueden surgir a partir de virus progenitores de baja virulencia (5, 39). Tambin se ha generado de manera experimental un virus virulento de la EN a partir de un virus de baja virulencia mediante pases en pollos (34).
f)
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En esta definicin, los residuos de aminocidos se numeran desde el extreme N-terminal de la secuencia de aminocidos deducida a partir de la secuencia de nucletidos del gen F0 donde las posiciones 113116 corresponden de la 4 a la 1 a partir del punto de escisin.
g)
Anticuerpos monoclonales
Se han utilizado anticuerpos monoclonales de ratn (MAbs) dirigidos contra cepas del virus de la EN en pruebas HI para conseguir una identificacin rpida del virus de la EN sin las posibles reacciones cruzadas con otros serotipos APMV que pueden tener lugar con sueros policlonales. Se han creado MAbs que dan reacciones en pruebas HI y que son especficos para cepas particulares o variantes de aislados del virus de la EN (4, 9). Se han empleado tablas de MAbs para establecer perfiles antignicos de aislamientos del virus de la EN basndose en si reaccionan o no con los virus. Se ha demostrado que es un mtodo valioso para agrupar y diferenciar los aislados del virus de la EN y ha sido particularmente de valor para entender la epidemiologa de los brotes (9).
h)
Estudios filogenticos
En los ltimos aos el desarrollo de tcnicas mejoradas para la secuenciacin de nucletidos, la disponibilidad de datos de la secuencia de ms virus de la EN en bases de datos informatizadas y la demostracin de que incluso longitudes de secuencia relativamente cortas pueden dar resultados significativos en anlisis filogenticos, han conducido a un incremento considerable en tales estudios. Se ha detectado una diversidad gentica considerable, pero los virus que comparten parmetros temporales, geogrficos, antignicos o epidemiolgicos tienden a encuadrarlos en linajes o grupos taxonmicos especficos, y se ha comprobado que esto es importante para valorar tanto la epidemiologa global como la propagacin local de la EN (3, 8, 16, 24, 27, 28, 33, 3638). Aunque en el pasado los estudios filogenticos han sido impracticables como herramienta rutinaria, en la actualidad la mayor disponibilidad y el incremento en la velocidad de obtencin de resultados empleando kits sofisticados y disponibles comercialmente para la RT-PCR y secuenciadores automticos permite que tales estudios se encuentren dentro de los equipamientos de muchos ms laboratorios de diagnstico y que puedan proporcionar resultados significativos que sean contemporneos en lugar de retrospectivos (2).
i)
La EN, como se define en la Seccin B.1.f. de este captulo, est sujeta a un control oficial y el virus tiene un riesgo elevado de propagacin a partir del laboratorio; en consecuencia, debera llevarse a cabo una valoracin del riesgo para determinar el nivel de bioseguridad necesario para el diagnstico y la caracterizacin del virus. El servicio debera cumplir los requisitos para el apropiado Grupo de Contencin, como se determina mediante la valoracin del riesgo y como lo recoge el Apndice I.1.6.1 del Captulo I.1.6. de este Manual de animales terrestres. Los pases que carezcan de acceso a tales laboratorios especializados, nacionales o regionales, deberan enviar las muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.
2.
Pruebas serolgicas
El virus de la EN puede emplearse como un antgeno en una variedad amplia de pruebas serolgicas, lo que permite que se utilicen las tcnicas de neutralizacin o de enzimoinmunoensayo (ELISA) para el diagnstico. En la actualidad, la prueba HI es la ms ampliamente utilizada. Los sueros de pollo raramente dan reacciones positivas no especficas en esta prueba y es innecesario cualquier pretratamiento de los sueros. Los sueros procedentes de especies distintas a las de los pollos a veces pueden causar aglutinacin de los eritrocitos (RBC) de pollo, as que esta propiedad debera determinarse primero, y posteriormente extraer mediante adsorcin del suero con RBC de pollo. Esto se realiza adicionando 0,025 ml de RBC de pollo empacados a cada 0,5 ml de antisueros, agitando suavemente y dejndolos durante al menos 30 minutos; a continuacin los RBC se precipitan mediante centrifugacin a 800 g durante 25 minutos y se decantan los sueros adsorbidos.
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En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulacin de plstico y fondo en V en las que el volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS isotnico (0,1 M), pH 7,07,2, y RBC procedentes de un mnimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen igual de solucin de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al virus de la EN). Las clulas se deberan lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensin al 1% (clulas empacadas v/v). Debera realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antgenos y de los antisueros.
a)
vii)
vi)
vii)
El valor de la serologa en el diagnstico est relacionado claramente con el estado inmune esperado de las aves afectadas. Los ttulos de HI pueden considerarse positivos si hay inhibicin a una dilucin del suero de 1/16 (24 o log2 4 cuando se expresa como el recproco) o superior contra 4 HAU de antgeno. Algunos laboratorios prefieren usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectar a la interpretacin de los resultados de modo que un ttulo positivo ser 1/8 (23 o log2 3) o superior. Se debera incluir una nueva titulacin del antgeno en todas las pruebas para verificar el nmero de HAU utilizadas. Los ttulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de un grupo de aves. En grupos vacunados que estn siendo controlados serolgicamente, es posible identificar respuestas anamnsicas
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como resultado de una infeccin de desafo con el virus de campo (11), pero se debera proceder con gran cautela porque se pueden producir variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el virus de la EN darn por resultado ttulos sustancialmente elevados frente al virus de la EN (7). Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas ELISA que se basan en diversas estrategias para la deteccin de anticuerpos contra el virus de la EN, incluyendo ELISA indirecto, tipo sndwich y de bloqueo o competitivo, que emplean MAbs. Al menos uno de los kits utiliza una subunidad antignica. Habitualmente estas pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es importante que para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones especificadas.
300
La duracin de la inmunidad depende del programa de vacunacin elegido. Una de las consideraciones ms importantes que afectan a los programas de vacunacin es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jvenes que puede variar considerablemente de granja a granja, de lote a lote y entre pollos individuales. Por esta razn, se emplean diversas estrategias. O los pjaros no se vacunan hasta las 2-4 semanas de vida cuando la mayora de ellos ser susceptible, o se vacunan con 1 slo da de vida por instilacin conjuntival o mediante la aplicacin de un spray grueso. Se establecer una infeccin activa en algunas aves que persistir hasta que la inmunidad maternal decrezca. Entonces, se llevar a cabo una revacunacin 3-4 semanas ms tarde. Se ha demostrado que las vacunas inactivadas tambin pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 da que tienen cierto grado de inmunidad maternal (15), y los mejores resultados se han obtenido cuando a los polluelos maternalmente inmunes de 1 da se les da una combinacin de vacunas viva e inactivada, comparada con vacunas vivas o inactivadas dadas de forma separada (14). La vacunacin de aves de 1 da totalmente susceptibles, incluso con las vacunas vivas ms suaves, puede provocar en enfermedad respiratoria, especialmente si estn presentes en cantidad significativa bacterias patgenas comunes. Normalmente se practica una vacunacin despus de 3 semanas de vida slo en gallinas de crianza y gallinas de puesta. Se debera llevar a cabo con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad adecuada. Los programas de vacunacin emplean con frecuencia vacunas con virus vivos un poco ms patognicos para reforzar la inmunidad de las usadas inicialmente. Tambin pueden usarse estas vacunas vivas ms patognicas despus de una vacunacin inicial con vacunas inactivadas en emulsin de aceite. Cuando se disea un programa de vacunacin, debera tenerse en consideracin el tipo de vacuna utilizada, el estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de proteccin requerido en relacin a cualquier posibilidad de infeccin con el virus de campo bajo las condiciones locales (11). Aqu se indican dos ejemplos de programas de vacunacin que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de enfermedad. Para el primer ejemplo, cuando la enfermedad es leve y espordica se sugiere que se adopte el siguiente orden de vacunacin: vacuna viva Hitchner-B1 mediante administracin conjuntival o de spray a 1 da de edad; vacuna viva Hitchner-B1 o La Sota a los 1821 das de vida en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de bebida a las 10 semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsin de aceite en el momento de la puesta. Para el segundo ejemplo, cuando la enfermedad es severa y ms extendida, se adopta el mismo protocolo ya indicado hasta los 21 das de vida y a esto le sigue la revacunacin a los 3542 das de vida con la vacuna viva La Sota en el agua de bebida o como spray; esta revacunacin se repite a las 10 semanas de vida con una vacuna inactivada (o una vacuna viva mesognica) y de nuevo se repite en el momento de la puesta (11).
1.
a)
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virulentos as como el peligro de una inactivacin inadecuada y la posible contaminacin consiguiente. Este riesgo est contemplado en la Decisin de la Comisin 93/152/EEC (18), que restringe el uso de virus para la fabricacin de vacunas inactivadas en los estados miembros de la Unin Europea a partir del 1 de enero de 1995 a aqullos para los cuales se ha probado el inculo original y muestra tener un ICPI <0,7 si se administra a cada ave no menos de 108 EID50. Algunas cepas lentognicas crecen hasta niveles muy altos en los huevos. Se pueden obtener ttulos excepcionalmente elevados mediante la cepa Ulster 2C, la cual se recomienda como inculo para la vacuna inactivada (22). Sin embargo, cuando se usan como inculos las cepas Hitchner B1, La Sota o F se consiguen vacunas inactivadas con xito comercial.
b)
Mtodo de cultivo
Se establece un inculo original y a partir del mismo un inculo de trabajo. Si la cepa se ha clonado mediante dilucin limitante o seleccin en placa, el establecimiento de un cultivo maestro slo puede implicar la produccin de un gran volumen de lquido alantoideo infectivo (como mnimo 100 ml), que puede conservarse en forma de alcuotas liofilizadas (0,5 ml).
c)
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de la vacuna, primero se establece un inculo de trabajo, a partir de cualquiera de los lotes de vacuna producidos, mediante la expansin de una alcuota del inculo original hasta un volumen suficiente para permitir la produccin de la vacuna durante 1218 meses. Es mejor conservar el inculo de trabajo de forma lquida a una temperatura de 60C o inferior porque el virus liofilizado no siempre se multiplica hasta un ttulo alto en el primer pase subsiguiente (11). La mayora de las vacunas de la EN se producen en huevos embrionarios de ave y las vacunas de virus vivos deberan producirse en huevos SPF. El mtodo de produccin es la propagacin del virus asptica y a gran escala; todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad. Es habitual diluir el inculo de trabajo en PBS estril, pH 7,2, de modo que aproximadamente se inoculan 103104 EID50/0.1 ml en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios SPF de 9 o 10-das de vida. A continuacin se incuban a 37C. Se deberan desechar los huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El tiempo de incubacin depender de la cepa vrica utilizada y se predeterminar para asegurar una produccin mxima con el nmero mnimo de muerte de embriones. Los huevos infectados deberan enfriarse a 4C antes de recogerse. Se quitan las partes superiores de los huevos y se aspiran los lquidos alantoideos despus de la eliminacin del embrin. Debera evitarse la inclusin de cualquier resto de yema o de albmina. Se deberan conservar todos los lquidos inmediatamente a 4C y comprobar la ausencia de contaminacin bacteriana antes de preparar grandes cantidades para la liofilizacin o inactivacin. Normalmente, las vacunas vivas se liofilizan. La metodologa depende de los aparatos utilizados y de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa muy importante ya que una liofilizacin inadecuada resulta tanto en prdidas de ttulo como en un periodo de validez reducido. En la produccin de vacunas inactivadas, se trata el lquido alantoideo recogido con formaldehdo (una concentracin final tpica es 1/.1.000) o beta-propiolactona (una concentracin final tpica es 1/2.0001/4.000). El tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que est libre de virus vivos. La mayora de vacunas inactivadas no se concentran; el lquido alantoideo inactivado normalmente se emulsiona con aceite mineral o vegetal. Generalmente, las frmulas exactas son secretos comerciales. Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan como emulsiones primarias de agua en aceite. Habitualmente, la fase oleosa consiste en nueve volmenes de aceite mineral altamente refinado, tal como Marcol 52, Drakeol 6VR y BayolF, ms un volumen de agente emulsionante, tal como Arlacel A, Montanide 80 y Montanide 888 (31). La fase acuosa es el virus inactivado al que se le adiciona un emulsionante no inico como Tween 80. Normalmente la relacin fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4. Los fabricantes se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la viscosidad y la estabilidad. Si la viscosidad es demasiado alta, la vacuna ser difcil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es inestable.
3.
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Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su viabilidad y potencia. Para aqullas producidas en huevos, el control ms importante del proceso es comprobar la ausencia de contaminacin bacteriana y fngica. Esto es necesario debido a la aparicin ocasional de huevos en estado de putrefaccin que pueden no ser detectados hasta el momento de la recogida. Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de inactivacin en huevos embrionarios, tomando 25 alcuotas (0,2 ml) de cada lote y realizando pases cada tres veces a travs de embriones SPF (11).
4.
Control de lotes
La mayora de los pases han publicado especificaciones para el control de la produccin y comprobacin de las vacunas del virus de la EN (p. ej. ref. 29), que incluyen la definicin de las pruebas obligatorias en vacunas durante y despus de su manufactura. Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para conseguir que se administren los niveles adecuados de virus. Habitualmente se titula el virus en huevos embrionarios de aves hasta conseguir la EID50. Esto implica realizar diluciones a la dcima del virus; se inoculan 0,1 ml de cada dilucin en entre cinco y siete huevos embrionarios de aves de 910 das de vida. Despus de 57 das de incubacin a 37C, los huevos se enfran y se prueban para demostrar su actividad hemaglutinante, que es una indicacin de la presencia del virus vivo. La EID50 a punto final se calcula empleando una formula estndar tal como la de SpearmanKrber (10).
a)
Esterilidad
Las pruebas para determinar que los materiales biolgicos estn estriles y libres de contaminacin se encuentran en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
El uso de pollos para la comprobacin de las vacunas supone la inoculacin de diez o ms aves de la edad indicada que procedan de un grupo SPF. Se administrarn diez dosis de vacuna viva por va supraconjuntival a cada ave y a continuacin las aves se mantendrn en observacin durante 21 das. Ningn pollo debera mostrar signos clnicos serios y ninguno debera morir por causas atribuibles a la vacuna (19). En el caso de las vacunas inactivadas, se administrar una dosis doble por la va recomendada a diez aves de 3 semanas de edad y se mantendrn en observacin durante 2 semanas para comprobar la ausencia de signos clnicos de enfermedad o lesiones locales.
c)
Potencia
Se han propuesto varios mtodos para comprobar la potencia de las vacunas del virus de la EN. Se ha subrayado la importancia de usar una adecuada cepa de desafo para la valoracin (11). Una cepa adecuada es la Herts 33. Para las vacunas vivas, el mtodo recomendado (19) supone la vacunacin de 20 aves SPF u otras completamente susceptibles a la mnima edad recomendada por la va sugerida, empleando la dosis mnima recomendada. Despus de 1421 das, cada ave vacunada y diez aves control se desafan por va intramuscular con 105 LD50 (dosis letal 50%) del virus de desafo de la EN. La vacuna pasa la prueba si al cabo de 10 das el 90% de los pollos vacunados sobrevive sin sntomas de enfermedad, pero todos los controles mueren en 6 das. Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF o susceptibles de 2128-das. Se inyectan por va intramuscular tres grupos de 20 aves con volmenes de vacuna equivalentes a 1/25, 1/50 y 1/100 de una dosis. Se mantiene un grupo de diez pollos como control. Se desafan todas las aves mediante inyeccin intramuscular de 106 LD50 del virus de desafo de la EN, 1721 das ms tarde. Se observan los pollos durante 21 das. La PD50 (dosis protectora 50%) se calcula mediante mtodos estadsticos estndar. La prueba slo es vlida si todas las aves control de desafo mueren en 6 das. La vacuna cumple con la prueba si la PD50 no es menos que 50 por dosis y si el lmite de confianza menor no es menos que 35 PD50 por dosis. Algunas autoridades de control aceptan una prueba slo a 1/50, por razones de sanidad animal. No es necesario repetir la prueba de potencia en cada lote si se ha demostrado que ha pasado la prueba un lote representativo del producto final procedente del inculo original.
d)
Duracin de la inmunidad
El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis nica o rgimen de vacunacin de la EN, variar enormemente tanto con la vacuna como con la especie hospedadora. Es extremadamente complejo y difcil de evaluar el nivel de inmunidad requerido en un hospedador dado (p. ej. para proteger contra la muerte, la
303
enfermedad, las prdidas de produccin de carne o huevos). Generalmente, se debera hacer alguna evaluacin de la longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regmenes de vacunacin para mantener stos por encima de un nivel aceptable (11).
e)
Estabilidad
El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, debera mantener su potencia durante al menos 1 ao. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como la reduccin de la infectividad seguida de la incubacin a 37C durante 7 das (26), pueden utilizarse como una gua para las capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva. Las vacunas en emulsin de aceite, tambin deberan someterse a un agente acelerador mediante almacenamiento a 37C, durante un mnimo de un mes, sin separacin de las fases acuosa y oleosa. Las vacunas con virus vivos deben emplearse inmediatamente despus de su reconstitucin. Las vacunas inactivadas no se deben congelar.
f)
Conservantes
Para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el producto liofilizado, pero los conservantes antimicrobianos pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la vacuna.
g)
Precauciones (riesgos)
Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los humanos. Se ha informado de que los virus de la EN, tanto los virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado a humanos, causando normalmente conjuntivitis aguda despus de la introduccin directa en el ojo. Habitualmente, las infecciones son transitorias y no afectan a la crnea. Las vacunas en emulsin de aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La inyeccin accidental de humanos debera tratarse con prontitud mediante la incisin y el lavado de la zona, como para el caso de una herida por inyeccin de grasa.
5.
a)
b)
Potencia
Vase Seccin C.4.c. arriba.
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