UNIVERSIDAD DE SONORA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO

BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE ANÁLISIS MICROBIOLOGICOS

*AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE
ENTEROBACTERIAS: E. COLI Y
ENTEROBACTER.*

ALUMNO:

GRIJALVA MATUS JESÚS ADAN

LUNES 14 DE MARZO DEL 2005.

E.M.B. Agar

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo

de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.

Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para
obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y
otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos
capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de
hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un
efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las
cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento
de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad
permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en
este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que
Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul
lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a
partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a
sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de
especies de Salmonella y Shigella.

Fórmula (en gramos por litro)

Peptona 10.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Fosfato dipotásico 2.0
Agar 13.5
Eosina 0.4
Azul de metileno 0.065
pH final: 7.2 ± 0.2

Instrucciones
Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos;
mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución.
Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y
distribuir agitando suavemente.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35°C

Interpretación de resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Verdosas con
brillo metálico y
Escherichia coli
centro
negro azulado
Mucosas,
Enterobacter,
rosadas,
Klebsiella spp.
confluentes
Proteus,
Incoloras
Salmonella, Shigella
Incoloras,
Enterococcus pequeñas,
puntiformes
Incoloras o
rosadas,
Candida spp.
secas,
puntiformes
Azul lavanda,
Acinetobacter spp pequeñas
a medianas.

Características del medio

Medio preparado: verde con matiz naranja, puede tener un ligero precipitado.
Placas preparadas: púrpura anaranjado verdoso.
Mac Conkey Agar

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil

desarrollo, aerobios y facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no,
lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

Fundamento
La mezcla de sales biliares y el cristal violeta inhiben gran parte de la flora Gram
positiva. Las colonias lactosa positivas son rojas debido a la caída de pH que
produce la absorción del rojo neutro con un halo turbio debido al precipitado de las
sales biliares. Las colonias lactosa negativas son incoloras. Este medio
corresponde a la fórmula recomendada por la APHA para la siembra directa en
placas de muestras de agua para el recuento de coliformes. Además es usado
para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella en variedad de muestras
clínicas. La siembra en medio Mac Conkey permite además, diferenciar bacilos
Gram negativos facultativos u oxidativos de difícil desarrollo (Haemophilus,
Actinobacillus, Capnocytophaga, Eikenella, Kingella, etc.).

Fórmula (en gramos por litro)

Peptona 17.0
Pluripeptona 3.0
Lactosa 10.0
Mezcla de sales biliares 1.5
Cloruro de sodio 5.0
Agar 13.5
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 ± 0.2
Instrucciones
Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Interpretación de resultados
Microorganismos Colonias
Rojas con halo
Escherichia coli
turbio
Klebsiella spp.,
Rosadas mucosas
Enterobacter spp.
Salmonella spp., Shigella Incoloras,
spp. transparentes
Proteus spp. Diminutas,
Enterococcus spp. opacas
Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura

AGAR ENDO

USO
Se utiliza para la comprobación de la prueba presuntiva para organismos
miembros del grupo coniforme.

FUNDAMENTO
Endo en un tiempo describió un medio utilizando un indicador de sulfito de fucsina
para diferenciar organismos fermentadores de lactosa y no fermentadores de
lactosa del aparato intestinal. En las placas de este medio en la que se a
decolorado la fucsina mediante sulfito de sodio, salmonellas y otros organismos no
fermentadores aparecen como gotas, trasparentes, incoloras y brillantes contra el
fondo de color rosa pálido del medio.
Los organismos coniformes proporcionan colonias rijas y colorean el medio
circundante. las reacciones típicas de este medio no ocasionadas por la
producción de ácido sino por el producto intermedio.

Formula:

Peptona 10g
Lactosa 10g
Fosfato di potásico 3.5g
Agar 15g
Fucsina básica .5g
Sulfito sodico 2.5g

PH final 7.5 +/- 0.2 a 25 °c.

ALMACENAMIENTO

Por debajo de 30°c.

Medio preparado de 2 a 8 °c.

RESULTADO

Después de 24 hr +/- 2hr a 35°c.

Organismos Recuperación Color de la colonia

Enterobacter aerogenes De buena a excelente Roja
E. coli De buena a excelente Rojo con brillo metálico
Salmonella tifis De buena a excelente Incolora
Shigella De buena a excelente incolora
PRUEBAS DEL IMVIC

INDOL

Principio

Se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona

con el grupo aldehido de p-dimetilaminobenzaldehido, esta es la sustancia activa
en los reactivos de kovac y Ehrlich , debe usarse un medio rico en triptofano.

Medio y reactivos

Caldo de triptofano (1%)

Peptona o tripticasa 2g
Cloruro de sodio 0.5g
Agua destilada 100ml
REACTIVO DE KOVAC
Alcohol amilico o isoamilico puro 150ml
P-dimetilaminobenzaldehido 10g
HCl conc. 50ml
REACTIVO DE EHRLICH
P-dimetilaminobenzaldehido 2g
Alcohol etilico absoluto 190ml
HCl conc. 40ml

PROCEDIMIENTO

Se inocula caldo de triptofano con el organismo en estudio y se incuba 35°c

durante 18 a 24 hr. Después se agregan 15 gotas del reactivo y se dejan resbalar
por la pared interna del tubo. Si se usa el reactivo de EHRLICH este paso debe
ser precedido por el agregado de un ml de cloroformo.

INTERPRETACION

La aparición del color rosa fucsia en la interfase del reactivo y el caldo pocos
segundos después de haber agregado el reactivo es indicativa de la presencia de
indol y constituye una prueba positiva
PRECAUCIONES

*no debe emplearse para la detección del indol un medio de peptona que
contenga glucosa. La fermentación del indol se produce solo en aquellos
organismos de fermentar hidratos de carbono. Los organismos que utilizan
hidratos de carbono por un proceso oxidativo son incapaces de producir indol, la
elevada acidez producida por la fermentación de la glucosa puede inhibir el
crecimiento del organismo y de la enzima.

*algunos microorganismos producen indol pero lo descomponen con la misma

rapidez con la que es producido, por lo que puede producirse una reacción
falsamente negativa.

* el ph optimo para la triptofanasa es ligeramente alcalino(PH 7.4 a 7.8) la

disminución de ph provoca una reducción en la producción de indol. Y un posible
falso negativo.

*los cultivos que se van a someter alas pruebas de producción de indol deben ser
incubados aeróbicamente, el descenso de la tensión del oxigeno disminuye la
producción de indol

ROJO DE METILO

PRINCIPIO
Esta prueba es una prueba cuantitativa de la producción de ácidos que requiere
que los microorganismos produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, formico) a
partir de la glucosa a través de la vía de fermentación de ácidos mixtos.
MEDIOS Y REACTIVOS

El medio que se emplea con más frecuencia es el caldo rojo de metilo-voges

proskauer

Peptona 7g
Glucosa 5g
Fosfato dipotasico 5g
Agua destilada 1li

Ph final 6.9

Indicador de ph rojo de metilo

Rojo de metilo, 0.1 g en 300ml de alcohol etilico 95%
Agua destilada, 200 ml.

PROCEDIMIENTO
Se inocula el caldo MR/VP con un cultivo puro de microorganismo en estudio, se
incuba en caldo a 35°c durante 48 a 52 HR (no menos de 48 hr), al terminar ese
lapso se agregan 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al caldo.

INTERPRETACION
La aparición de un color rojo estable en la superficie del medio indica suficiente
producción de ácido para reducir el ph a 4.4 y constituye una prueba positiva.
Lado que otros microorganismos pueden producir menores cantidades de ácido a
partir del sustrato de la prueba, es posible que aparezca un color anaranjado
intermedio entre amarillo y rojo. Esto indica prueba positiva.
PRECAUCIONES

*la peptona que se encuentra en el medio puede afectar los resultados del rojo de
metilo

* la reacción del rojo de metilo no puede acelerarse aumentando la concentración

de glucosa en el medio
*no debe intentarse interpretar un resultado de rojo de metilo después de 48 hr de
incubación. Si se realiza la prueba demasiado pronto los resultados pueden ser
equívocos o falsamente positivo dado que los organismos RM negativos no
habrán tenido suficiente tiempo para metabolizar por completo los productos
ácidos iniciales acumulados por la fermentación de la glucosa. Después de solo 18
a 24 horas son los resultados positivos de la prueba.

*evitar la prueba con una mezcla caldo inoculo demasiado turbia; el crecimiento
bacteriano es inhibido si el inoculo excede la concentración celular máxima de
alrededor de 10 a la 9 células viables por ml. Con cada disminución logarítmica del
tamaño del inoculo hay un aumento en el tiempo necesario para que los
organismos RM positivos acumulen suficientes productos ácidos como para
superar el sistema amortiguador.

VOGES-PROSKAUER

PRINCIPIO
El ácido piruvico , un compuesto fundamental formado por la degradación de la
glucosa, es metabolizado aun mas a través de cierto numero de vías metabólicas,
según los sistemas enzimáticos de las diferentes bacterias.una de estas vías da
como resultado la producción de acetoina (acetil metil- carbinol) un producto final
de reacción neutra. En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al
40% , la acetoina es convertida en diacetilo y el alfa-naftol sirve como catalizador
para producir un complejo de color rojo.

MEDIOS Y REACTIVOS

El medio es un caldo MR/PV

Reactivos
Alfa naftol (5%) 5g
Alcohol etílico absoluto 100ml
Hidróxido de potasio 40g
Agua destilada 100ml

PROCEDIMIENTO

Se inocula un caldo MR/VP Con un cultivo puro del microorganismo en estudio.

Se incuba durante 24 horas a 35°c . Luego de este lapso se pasa una alicota de
un ml del caldo a un tubo de prueba limpio. Se agregan 0.6 ml de alfa-naftol al 5%,
seguidos por 0.2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos que se
agreguen en este orden. el tubo se sacude suavemente para exponer el medio a
oxigeno atmosférico; luego se deja quieto durante 10 a 15 minutos.

INTERPRETACION
Una prueba positiva esta representada por la aparicion de un color rojo 15min o
mas después del agregado de los reactivos,lo que indica la presencia de diacetil,
el producto de oxidación de acetoina. La prueba no debe leerse después de una
hora porque cultivos negativos deben producir un color simil cobre, lo que daria
como resultados una interpretación falso positivo.
PRECAUCIONES

• A veces un organismo acetoina positivo conocido no da una reacción no da

una reacción de vp negativo. Para superar esta posibilidad, calentar
suavemente el cultivo que contiene los reactivos vp. un reactivo vp positivo
mostrara una reacción positiva (color rojo) mientras que los que no
producen acetoina se mantendrán negativos (color amarillo).
• Todos lo miembros de la familia enterobacteriaceae son capaces de
producir acetoina partir de glucosa. Pero no todas las cepas son capaces
de fermentar acetoina.
• Las pruebas del rojo de metilo y de vp no ofrecen confianza como único
medio necesario para diferenciar la E. coli de los grupos klepsiella-
enterobacter en la identificación de rutina o en el análisis de agua. Deben
realizarse pruebas de citrato y del indol junto con las reacciones RM/VP.
Existe la posibilidad de que se destruya la acetoina. Invalidando así estas
dos reacciones para fin de identificarlos.
• Muchas personas tienen la errónea impresión de que un organismo que es
vp positivo es automáticamente RM positivo o viceversa. Es cierto que la
mayoría de los miembros de las enterobacteriaceae dan reacciones
opuestas(un aumento en la alcalinidad produce un resultado RM negativo y
VP positivo con producción de acetoina) pero algunos organismos como el
enterobacter hafniae y el proteus mirabilis pueden dar tanto una reacción
RM positiva como VP positiva, aunque esta ultima es retardada.
PRUEBA DEL CITRATO

Principio

La utilización de citrato se detecta en un medio con citrato por la producción de

intermediarios alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anion , como única
fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las
bacterias que utilizan citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio
con la producción de amoniaco llevando a la alcalinización del medio a partir de la
conversión de amoniaco en hidróxido de amonio. El indicador es azul de
bromotimol, que es amarillo y con un ph menor de 6 y azul con un ph arriba de 7.6.

Medios y reactivos

El medio con citrato que se utiliza con mas frecuencia es la formula de simmons.
El medio se vuelca en un tubo formando un pico de flauta, la formula del medio
Simmons es:

Fosfatomonoamonico 1g

Fosfato dipotasico 1g

Cloruro de sodio 5g

Citrato de sodio 2g

Sulfato de magnesio 0.20g

Agar 15g

Azul de bromotimol 0.80g

Agua destilada 1lt

pH final 6.9

Procedimiento

Se toma una colonia bien aislada de la superficie del medio de aislamiento

primario y se inocula con una estría única en al superficie de pico de flauta. El tubo
se incuba a 35°c durante 24 a 48 hr.
Interpretación

Una prueba positiva esta presentada

por la aparición de un color azul
oscuro en 24 a 48 hr, lo que indica
que el microorganismo en estudio a
sido capaz de utilizar citrato como
única fuente de carbono, con la
producción de productos alcalinos.
Una prueba también puede ser
positiva en ausencia del color azul si
hay un crecimiento de colonias
visible a lo largo de la línea de
inoculación. Esto es posible, por que
para que el crecimiento sea visible,
el microorganismo debe de ingresar
a la base de crecimiento exponencial
posible solo si ha asimilado carbono
e hidrogeno.

Precauciones
• Puede haber variaciones en el color de una prueba citrato positiva, debido
a la diferencia de los lotes indicadores de ph que se encuentran en el
mercado.
• Si se usa un inoculo grande para estriar el cultivo en pico de flauta, puede
obtenerse en este un color amarillo claro a cobrizo, sin afectar el medio de
mas abajo. Sin embargo esto no significa una reacción positiva, también un
inoculo espeso puede dar una reacción falsa positiva.
• Después de 24hr de incubación, un organismo citrato positivo puede
mostrar una ligera alcalinidad, apenas visible en el pico de flauta, si se
tienen dudas en la interpretación, compararlo con un tubo de citrato no
inoculado. Algunos organismos citrato positivos necesitan la incubación
durante 48 hr o mas para que se produzca el cambio de ph

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DEL IMVIC.

PRUEBA DEL ONPG

Principio

Las bacterias que fermentan lactosa poseen lactosa permeasa y b-galactosidasa,

dos enzimas necesarias para la producción de ácidos en la prueba de
fermentación de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de
lactosa ingrese en la célula bacteriana, donde la b galactosidasa puede clivar la
unión galactosido, produciendo glucosa y galactosa. Las bacterias no
fermentadoras de lactosa carecen de permeasa pero si poseen beta galactosidasa
Y dan la prueba ONPG positiva. Los denominados fermentadores tardíos de
lactosa pueden demorarse en producir ácidos a partir de lactosa debido a una
actividad de permeasa lenta.
Medio y reactivos

Fosfato de sodio, buffer 1M. ph 7

O-fenil-b-galactosido (ONPG), 0.75 M
Solución fisiológica
Tolueno

Procedimiento

Las bacterias que han crecido en un medio con lactosa, como agar hierro de
klinger (KIA) o agar hierro triple azúcar (TSI), producen resultados óptimos en la
prueba de ONPG. Un asa de crecimiento bacteriano que emulsiona en 0.5 ml de
solución fisiológica y se mezcla enérgicamente durante unos segundos para
liberar la enzima. Se agrega una cantidad igual de de solución de ONPG
amortiguada a la suspensión y la mezcla se coloca en el baño de agua a 37°c..
Interpretación

la tasa de hidrólisis de ONPG a

ortonitrofenol puede ser rápida para algunos
microorganismos, produciendo un color
amarillo visible en 5 a 10 minutos, muchas
pruebas son positivas en una hora; sin
embargo las reacciones no deben
interpretarse como negativas hasta después
de 24 hr de incubación. El color amarillo por
lo común es evidente e indica que el
microorganismo ha producido orto nitrofenol
partir de ONPG a través de la acción de la
betagalactosidasa.

Precauciones

• En cualquiera de los métodos es necesario un inoculo espeso para obtener

una alta concentración de enzima, si esta se encuentra presente y
aumentar la velocidad de una reacción positiva.
• Antes de su empleo, deben colocarse la solución o caldo de ONPG en un
baño de agua de 37°c para redisolver el fosfato que se crea durante su
conservación.
 • Si la solución de ONPG no esta convenientemente amortiguada puede
producirse resultados falsamente negativos o falsamente positivos. Pueden
producirse un resultado falsamente negativo (incoloro) si la solución es
ácida. El ortonitrofenol liberado es un ácido débil y su tautomero
bencenoide ácido casi incoloro. Por lo tanto la determinación de
ortonitrofenil liberado debe hacerse en alguna de estas dos condiciones:1)
una solución bien amortiguada , ph 7 a 7.5 con lo cual se disocia una
proporción fija produciendo un color amarillo, o 2) con un ph fuertemente
alcalino, de 10 o mas , en el cual una porción insignificante queda sin
disociarse e incolora.
• La solución de ONPG, preparada debe ser incolora antes de su empleo
para la determinación de la actividad enzimatica. en el caldo de ONPG, la
misma peptona debe impartir un color amarillo a la suspensión célula caldo
cuando solo se encuentra en una concentración de 1 %. Una reacción es
capaz de variar en la intensidad del color amarillo producido, por lo tanto se
aconseja efectuar simultáneamente un control negativo cuando se usa la
suspensión célula caldo ONPG.
BIBLIOGRAFIA

www.britanialab.com _agar EMB y Mac Conkey

Diagnostico Microbiológicos; texto y atlas, Elmer Koneman, 3ra edición,

paginas 257-261.

Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia

clínica, J. F. Mac Faddin , paginas: 45,78,104,134,190.

Manual Difco , pagina: 337-339

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