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Caracterizao anatmica e perl qumico da lmina foliar de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn, de manguezais impactados e no impactados do litoral de So Paulo
Joo Marcelo Silva1, Maria Bernadete Gonalves Martins2 & Alberto Jos Cavalheiro3
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Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ESALQ/USP, Av. Pdua Dias, 11, 13418-900, CP 9, Piracicaba, SP, Brasil. joaomarcsilva@yahoo.com.br 2 Universidade Estadual Paulista UNESP Campus Experimental do Litoral Paulista, Praa Infante Dom Henrique, s/n, 11330-900, So Vicente, SP, Brasil. bernadete@clp.unesp.br 3 Universidade Estadual Paulista UNESP Instituto de Qumica, R. Francisco Degni, s/n, 14800-900, Araraquara, SP, Brasil. albjcava@iq.unesp.br

Recebido em 20.VIII.2009. Aceito em 13.X.2010.

RESUMO As diversas fontes de impacto ambiental tm causado grandes danos ora dos manguezais. Neste contexto, o estudo analisou a anatomia e a composio qumica de lminas foliares de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn, de manguezal impactado (municpio de Santos) e no impactado (municpio de Perube) do litoral de So Paulo. Para a anlise anatmica, utilizou-se de microscopia de luz e microscopia eletrnica de varredura (MEV). Para a anlise qumica, utilizou-se de cromatograa lquida de alta ecincia (CLAE). Na biometria tecidual, as folhas do manguezal impactado apresentaram menor espessura epidrmica nas duas faces foliares, no mesolo e maior largura do feixe vascular central. Ainda, foram observadas menores quantidades de estmatos e maiores quantidades de drusas. Tais resultados foram conrmados pelo teste t-Student ( = 5%). Os pers cromatogrcos revelaram maior volume de metablitos secundrios produzidos por folhas do ambiente no impactado. Palavras chaves: anatomia foliar, impacto ambiental, Santos, Perube ABSTRACT Anatomical characterization and chemical prole of Laguncularia racemosa (L.) Gaertn leaf blades, from impacted and non-impacted mangroves of the So Paulo Coast. Several sources of environmental impact have caused great damage to the ora in mangroves. Therefore, this study aimed to analyze the anatomy and chemical composition of Laguncularia racemosa (L.) Gaertn leaf blades, from impacted (Municipality of Santos) and non-impacted mangroves (Municipality of Perube) of the So Paulo Coast. For the leaf anatomy studies, light microscopy and scanning electron microscopy (SEM) were used. For chemical analysis, high performance liquid chromatography (HPLC) was conducted. The biometry revealed leaf tissues of plants from impacted mangroves with a less thick epidermis and mesophyll and higher width of the central vascular beam. A smaller number of stomata and higher amounts of druses in these leaves were also observed. Results were conrmed by the Student t-test ( = 5%). The chemical proles revealed a higher ammount of secondary metabolites in leaves from the impacted environment. Key words: leaf anatomy, environmental impact, Santos, Perube

INTRODUO
Laguncularia racemosa (L.) Gaertn (Combretaceae), conhecida como mangue branco, manso ou tinteira, uma rvore relativamente pequena, cujas folhas tm pecolo vermelho com duas glndulas em sua parte superior, prximas lamina foliar. As folhas so espessas e variam de elptica a oblonga, apresentando margem lisa.

Em plantas de mangue, a escleromora foliar est relacionada elevada salinidade (Camilleri & Ribi, 1983). O sistema radicular menos desenvolvido com relao s outras espcies de mangue, tanto em nmero quanto em altura de pneumatforos, quando presentes. A planta adulta produz grande quantidade de propgulos, que formam cachos (racemos) pendentes nas partes terminais dos galhos (Sugyama, 1995).

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Este tipo de mangue est tipicamente restrito s franjas dos manguezais e conhecido por ser pioneiro em reas com condies favorveis, formando longas pores (Tomlinson, 1986). As folhas correspondem maior parte da produo primria no ecossistema de manguezal e so as principais constituintes da serrapilheira (Twilley et al., 1986; Clough et al., 2000), compondo o recurso alimentar de insetos e caranguejos arborcolas. Portanto, as plantas apresentam uma srie de defesas contra a herbivoria, destacando-se a sntese de metablitos secundrios. Dentre esses, temos os polifenis, constitudos principalmente por taninos condensados e outros fenis com atividade adstringente (Kandil et al., 2004). As reas naturais do esturio do municpio de Perube, situado ao sul do litoral paulista, apresentam um excelente estado de conservao. Isto porque na cidade, est localizada parte da Estao Ecolgica de Juria-Itatins, uma unidade de conservao que tem por objetivo promover o desenvolvimento sustentvel atravs da preservao e explorao dos recursos naturais, conforme normas especcas previstas pelo Sistema Nacional de Unidades de Conservao - SNUC (SNUC, 2000). J o esturio de Santos, localizado no centro do litoral paulista, conhecido por abrigar o maior porto da Amrica Latina, bem como por fornecer acesso ao maior polo industrial do pas, no municpio de Cubato. O fenmeno do crescimento urbano, acompanhado pelas ocupaes irregulares e pelo desenvolvimento do setor industrial a partir da dcada de 1950, resultou na gerao de mltiplas fontes de contaminao do esturio, dentre elas, o esgoto domstico dos bairros Cota, no Parque Estadual da Serra do Mar e das palatas sobre o manguezal (reas protegidas por lei ambiental). Segundo relatrio divulgado pela Companhia de Saneamento Bsico do Estado de So Paulo CETESB (Lamparelli et al., 2001), os aterros sanitrios e principalmente os lixes so considerados fontes de alto risco, contribuindo com a contaminao do sistema estuarino. Ainda, a precipitao de poluentes atmosfricos gerados nas indstrias da Baixada Santista e os passivos ambientais representados pelos aterros irregulares, pelas antigas reas de deposio de sedimentos dragados do canal do porto e pelos contaminantes originados do bombeamento de gua para a usina de Henry Borden (municpio de Cubato), constituem grande fonte de impacto ao meio ambiente (Perina, 2006).

Apesar do esforo para o controle da poluio e melhoria da qualidade ambiental, um levantamento da contaminao dos rios Cubato, Perequ, Piaaguera e Casqueiro (ambos pertencentes ao esturio santista), realizado aps a implantao do programa de controle da poluio, concluiu que a regio permanecia impactada por concentraes elevadas de metais pesados e compostos organoclorados na gua, nos sedimentos e nos organismos aquticos (Vargas - Boldrini et al., 1991). Levantamentos realizados em 1997 e 1998 revelaram a persistncia de poluentes nos sedimentos dragados dos canais porturios, que coloca em risco a sade pblica e o equilbrio ecolgico da regio (Prosperi et al., 1999). Abessa (2002) demonstrou que os nveis de alguns contaminantes em sedimentos da rea interna do esturio continuam aumentando, a despeito da diminuio da descarga industrial declarada, o que aponta para a emisso clandestina de poluentes. Muitas espcies de plantas so conhecidas por apresentarem alteraes no desenvolvimento, quando submetidas concentraes elevadas de poluentes qumicos. Kurczynska et al. (1997) detectaram diminuio no nmero de clulas do cmbio e do oema, bem como o surgimento de falsos anis nas traquedes do caule de Pinus silvestres L., situadas em reas com altas taxas de metais pesados na atmosfera. Fortes (2003) avaliou teores de or em folhas de milho (Zea mays L.), registrando sintomas que evoluam de descolorao do limbo foliar a dessecamento marginal das folhas. OrtegaVilasante et al. (2005) descobriram danos celulares e de crescimento induzidos por cdmio e mercrio, em plantas de alfafa (Medicago sativa L.). Por outro lado, Defew et al. (2005) encontraram altos nveis de elementos metlicos (Mn, Cu, Zn, Ni, Pb, Fe, Cr, Cd) no manguezal da baa de Punta Mala, Panam, e observaram que o acmulo de metais pesados no ambiente no causou impacto aparente na planta de L. racemosa, sendo notvel a presena de grandes quantidades de propgulos e mudas. Ramos e Silva et al. (2006) quanticaram oito elementos metlicos (Fe, Zn, Cr, Cu, Cd, Pb, Ni e Al) em oresta de mangue vermelho Rhizophora mangle (L.) do esturio do rio Potengi, Natal, Brasil, e encontraram as menores concentraes nas folhas desta espcie, levando-os a armar que orestas de mangue so importantes ltros bioqumicos ao transporte de metais pesados s reas costeiras, j que estes elementos estariam acumulados nos rgos perenes (ramos, trocos e razes).

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Os compostos organoclorados, comumente encontrados em pesticidas, so conhecidos por sua alta resilincia no ambiente, principalmente quando dispersos no sedimento e na gua. Segundo Marco & Kishimba (2006), as partes verdes (folhas e pecolos) de plantas superiores so cobertas por cera epicuticular hidrofbica e, portanto, absorvem componentes hidrofbicos, como pesticidas organoclorados, da atmosfera. J as razes, o fazem atravs do solo. Assim, a presena destes compostos nas folhas de L. racemosa pode representar um grande risco fauna envolvida, congurando tambm um problema de sade pblica (Prosperi et al. 1999). Neste contexto, o presente estudo teve por objetivos: caracterizar a anatomia e apresentar pers cromatogrcos da lamina foliar adulta de L. racemosa de manguezal impactado e no impactado; comparar caractersticas anatmicas e qumicas, investigando alteraes possivelmente provocadas por fontes de impacto ambiental.

um dos vinte indivduos de L. racemosa, uma altura de 1,50 m, em rea de bosque completamente exposta incidncia solar. As coletas foram realizadas no ms de maio. A amostragem da rea impactada se deu margem direita do rio Piaaguera (esturio de Santos/SP), sob as coordenadas: 235424.22 S e 462244.06 W (Fig. 1); e da rea no impactada, margem direita do Rio Una (esturio de Perube/SP), sob as coordenadas: 242556.14S e 47 426.98W (Fig. 2). Microscopia de luz O material coletado foi xado em soluo de FAA 70 (formalina, cido actico, lcool etlico 70%). Foram realizadas seces paradrmicas e transversais, das lminas foliares, na poro mediana e da nervura central. As seces paradrmicas foram claricadas em soluo de hipoclorito de sdio 5 %, e montadas com glicerina (Kaiser, 1880). J as seces transversais, passaram por processos usuais de microtomia: desidratao em srie etlica, inltrao em resina sinttica Leica (hidroxietilmetacrilato), emblocamento, seccionamento em micrtomo rotativo (5 m de espessura), colorao com azul de toluidina 1 % com borato de sdio 1 % em 100 ml de gua destilada (Gerrits, 1991) e montagem em resina sinttica Entellan (lminas permanentes).

MATERIAL E MTODOS
reas de Amostragem A terceira folha adulta, do terceiro ramo e em seu terceiro n (partindo do pice), foi coletada de cada

Fig. 1. Esturio municpio de Santos, So Paulo. * Ponto de coleta em manguezal impactado.

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Fig. 2. Esturio do municpio de Perube, So Paulo. * Ponto de coleta em manguezal no impactado.

Microscopia eletrnica de varredura As folhas foram xadas durante uma noite, sob vcuo, em soluo de Karnovsky modicada (paraformaldedo 4 %, glutaraldedo 0,5 %, em tampo cacodilato de sdio, pH 7,2, 0,1 M e gua destilada) (Karnovsky, 1965). No dia seguinte, foram realizadas lavagens com cacodilato 0,05 M e psxao com tetrxido de smio (OsO4), por uma hora. O material foi desidratado com acetona, seco at o ponto crtico e ento, metalizado (Danilatos, 1998). A anlise foi realizada em Microscpio Eletrnico de Varredura ZEISS DSM 940A. Captura de Imagens, Biometria e Anlises Estatsticas Aps a confeco das lminas, obtiveramse as imagens por meio de captador acoplado a microscpio de luz LEICA DMLB. As imagens foram digitalizadas atravs do programa IM50 (LEICA) e utilizadas na composio das pranchas ilustrativas. Para a aferio das espessuras teciduais e contagem de estruturas foliares, utilizou-se do programa KS 100, verso 3.0 (ZEISS). Foram aferidas as alturas da epiderme nas faces adaxial e abaxial, do parnquima palidico, parnquima esponjoso, largura do feixe vascular central e altura do mesolo. Quanto s anlises quantitativas, foi registrada a quantidade de

drusas (no mesolo), de estmatos e de glndulas de sal por mm2. Foram realizadas entre dezoito e vinte medies e contagens totais para cada ambiente, valor prximo ao encontrado em literatura relacionada morfometria foliar (Martins, 1989; Aranda et al., 2004). O teste W, de Shapiro-Wilkes, conrmou a normalidade das mdias, que foram ento submetidas s comparaes atravs do teste de hiptese t-Student, com 5% de signicncia. Pacote estatstico utilizado: STATISTICA 7.0 (STATSOFT). Pers cromatogrcos Foram adicionados 2 mL de metanol cerca de 100 mg de material vegetal seco e modo, pesado em balana analtica. A extrao foi realizada por sonicao, em banho de ultra-som da Elma Transsonic 700. Em seguida, a amostra foi submetida centrfuga de bancada Celm Combatea, a 500 G, para sedimentao do resduo slido. Uma alquota de 1 mL do sobrenadante foi ltrada em membrana 0,22 m e acondicionada em frascos apropriados. As amostras foram analisadas em CLAE-DAD (Cromatograa Lquida de Alta Ecincia - Varian ProStar), com sistema de bombeamento mod. 230, amostrador automtico mod. 410 e detector UV/VIS, com arranjo de diodos mod. 330), utilizando-se de

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coluna Phenomenex Luna (C18 250 x 4,6 mm, 5 m, volume de injeo de 20 L), acetonitrila (ACN) e gua com 0,1 % de cido actico, como fases mveis. As condies de eluio esto indicadas na tabela 1.
TABELA 1 Condies de eluio utilizadas em Cromatograa Liquida de Alta Ecincia

estruturas podem variar, principalmente em funo da salinidade do sedimento onde se encontram as plantas. A quantidade de glndulas de sal provavelmente est relacionada ao estresse salino sofrido pela planta, porm, ainda no h correlaes evidentes entre estresse salino e seus efeitos na superfcie foliar (Munns, 2002). Embora no se tenha analisado o teor de sais nos solos, acreditamos que as concentraes sejam semelhantes nos ambientes do estudo.

RESULTADOS E DISCUSSO
Morfologia e Anatomia A folha dorsiventral e anestomtica, com estmatos anomocticos e tricomas tectores (Fig. 3), como observado por Silva & Valente (1980). O depsito de grnulos de cera epicuticular abundante sobre a epiderme de folhas de L. racemosa de ambos os manguezais. Glndulas de sal esto distribudas em ambas as faces da folha (Fig. 4, 5. C, E, F). Estas glndulas foram descritas por Tomlinson (1986) como um grupo de

Fig. 4. Superfcie foliar abaxial de L. racemosa, de manguezal impactado (gl. glndula de sal). Barra = 10 m

Fig. 3. Vista frontal da epiderme na face abaxial da folha de L. racemosa, de manguezal no impactado (es. estmato; tr. tricoma). Barra = 30 m.

clulas com citoplasma denso, na base de uma profunda e irregular depresso epidermal e possuem funo de secreo de sal (Scholander et al., 1962; Sobrado, 2004). No foram observadas diferenas nas quantidades de glndulas em folhas dos dois ambientes estudados (Fig. 6). Segundo Tomlinson (1986), as quantidades destas

A quantidade de estmatos foi relativamente menor, em ambas as faces foliares de L. racemosa oriundas do manguezal impactado (Fig. 7). Aidar et al. (2002) registraram diminuio no nmero de estmatos em folhas de Hymenaea courbaril L. (Leguminosae Caesalpinioideae) expostas a elevados nveis de dixido de carbono, armando se tratar de uma estratgia para diminuir a passagem deste gs para o interior da planta. Alves et al. (2001) observaram reduo no tamanho dos estmatos em folhas de Tradescantia L. (Commelinaceae) cultivada em centros urbanos. O esturio de Santos (rea impactada) se encontra prximo ao maior plo industrial do pas (municpio de Cubato) e cercado pelos centros urbanos das cidades adjacentes (Santos, Cubato e So Vicente), desta maneira, embora sem a coleta de dados, pode-se inferir que o nvel de CO2 nesta regio signicativamente mais elevado que no esturio de Perube (rea no impactada). Consequentemente, acredita-se que a reduo no nmero de estmatos segue a mesma tendncia para diminuio da entrada do CO2 na folha.

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Fig. 5. A-F. Estrutura da folha adulta de Laguncularia racemosa, em seces transversais. A, C, E. manguezal impactado; B, D, F. manguezal no impactado. A, B, E, F. regio mediana. C, D. nervura central (ad. face foliar adaxial; ab. face foliar abaxial; ct. cutcula; pp. parnquima palidico; pe. parnquima esponjoso; gl. glndula de sal; fv. feixe vascular; xi. xilema; . oema; dr. drusa). Barras = 10 m.
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A epiderme unisseriada e coberta por cutcula espessada (Fig. 5. A). A espessura deste tecido foi menor em plantas do ambiente impactado, em ambas as superfcies foliares. Laakso & Huttunen (1998), registraram aumento da espessura epidermal em folhas de conferas submetidas intensidades gradativamente maiores de radiao ultravioleta-B (UVB). A regio metropolitana do municpio de Cubato, rea prxima ao manguezal impactado, apresentou ndices de partculas totais em suspenso e de oznio muito acima do Padro Dirio de Qualidade do Ar (PQAr), estabelecido pela CETESB (CETESB, 2007), o que pode ter diminudo a quantidade de radiao incidente nas folhas e consequentemente, a espessura da epiderme. O mesolo constitudo pelo parnquima palidico, com uma ou duas camadas de clulas, e pelo parnquima esponjoso, com dez a quatorze camadas de clulas, onde ocorrem drusas e cloroplastos, localizados na regio subjacente face abaxial (Fig. 5. A, B). O parnquima palidico e o parnquima esponjoso so menos espessos, nas folhas do manguezal impactado (Fig. 8). Alves et al. (2001) observaram a diminuio da espessura do parnquima palidico em folhas de Tradescantia sp sujeitas poluio area em centros urbanos, e sugeriram que esta reduo resulta da diminuio dos espaos intercelulares, com a nalidade de dicultar deslocamento dos poluentes no interior da folha. Isto o que possivelmente tambm ocorre no clornquima de L. racemosa. O mesolo de folhas do manguezal impactado tambm foi, portanto, menos

espesso, reetindo a diminuio do clornquima (Fig. 8). A largura do feixe vascular central, da folha da rea impactada, foi maior (Fig. 8). Castro et al. (2007) avaliaram a largura do feixe central de folhas de Mikania glomerata Springel (Asteraceae) expostas a diferentes niveis de sombreamento, e registraram variaes correlacionadas com as diferentes taxas de radiao solar incidente. Visto que as folhas de L. racemosa do estudo foram coletadas em reas com condies de luminosidade aparentemente idnticas, podemos atribuir de maneira indireta, como no caso da epiderme, o enlarguecimento dos feixes da regio impactada a uma reduo da incidncia de radiao solar, provavelmente bloqueada pelos poluentes acumulados na atmosfera local. A quantidade de drusas por milmetro quadrado foi maior em folhas do manguezal impactado (Fig. 6). A maioria das plantas vasculares estoca algum tipo de material mineralizado, sendo a cristalizao de oxalato de clcio (drusa) a forma mais comum (Baran, 1995). Monje & Baran (2002) reviram as vrias funes j atribudas s drusas e observaram que estas vo desde regulao de pH intracelular e controle de ons de clcio percepo de gravidade, suporte mecnico e defesa contra herbivoria. Ruiz & Manseld (1994) apresentaram evidncias de que a deposio de oxalato de clcio nas clulas da folha seria necessria para manter uma baixa concentrao de clcio nas adjacncias das clulas-guarda dos estmatos, uma vez que este elemento fundamental nos vrios processos relacionados abertura

Fig. 6. Comparao entre mdias e desvios padro das espessuras teciduais de folhas de L. racemosa, provenientes de manguezal no impactado e impactado. Diferenas signicativas esto representadas por letras diferentes (p < 0,05; t-Student).
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Fig. 7. Comparao entre mdias e desvios padro das quantidades de estmatos em folhas de L. racemosa, provenientes de manguezal no impactado e impactado. Diferenas signicativas esto representadas por letras diferentes (p < 0,05; t-Student).

Fig. 8. Comparao entre mdias e desvios padro das quantidades de glndulas de sal e drusas nas folhas de L. racemosa provenientes de manguezal impactado e no impactado. Diferenas signicativas esto representadas por letras diferentes (p < 0,05; t-Student).

estomtica. Desta maneira, a maior quantidade de drusas observada em plantas impactadas pode estar relacionada a variaes metablicas diversas, no necessariamente relacionadas poluio. Pers Cromatogrcos Os pers cromatogrcos das amostras do manguezal impactado e no impactado mostraram-se bastante semelhantes. Porm, o volume dos compostos maior em folhas do manguezal no impactado (Fig.

9). Este tipo de anlise fornece um retrato do estado metablico das folhas analisadas, atravs dos grupos e volumes de metablitos secundrios produzidos que, segundo Mithfer et al. (2004), compem o principal mecanismo de resistncia herbivoria. Assim, de se esperar que este processo esteja ocorrendo em maior intensidade em um ambiente mais preservado, com fauna herbvora abundante e ativa, justicando a maior quantidade de metablitos secundrios encontrada nas folhas.

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Fig. 9. Cromatogramas registrados em 380 nm, obtidos dos extratos metanlicos de folhas de L. racemosa, provenientes de manguezal impactado (acima) e no impactado (abaixo).

REFERNCIAS
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