Prcticas de Bioqumica II

Prctica: Determinacin Cuantitativa de Protenas

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

Objetivos: Al finalizar este trabajo prctico los alumnos estarn en capacidad de: Conocer el principio que rige la determinacin cuantitativa de protenas por los mtodos de Biuret y Bradford. Comparar la sensibilidad de ambos mtodos al aplicarlo a distintas muestras biolgicas. Calcular la concentracin de protenas en muestras biolgicas.

Introduccin: El contenido de protenas de una muestra biolgica es un parmetro de gran utilidad tanto para el investigador como para profesionales del rea clnica. Este dato es importante para el bioqumico, ya que puede precisar la eficiencia de un mtodo de aislamiento proteico o la cantidad de protenas de fluidos corporales o de una determinada fraccin subcelular. Para el Veterinario, Mdico o el Bioanalista, la concentracin srica o urinaria de protenas puede reflejar la presencia de algn estado patolgico o simplemente verificar la condicin fisiolgica del animal. Para determinar la cantidad de protenas en muestras biolgicas existe una diversidad de mtodos. Unos se basan en principios fsicos como la refractometra, otros en determinar la composicin de nitrgeno total de la muestra y luego calcular la cantidad de protenas como el mtodo de Kjeldhal. Sin embargo, estos mtodos como herramientas de trabajo en el laboratorio de Bioqumica son poco precisos. El surgimiento del espectrofotmetro abri camino a un gran nmero de pruebas, basadas en la ley de Lambert y Beer, entre ellas la determinacin cuantitativa de protenas. Alguno de los mtodos para cuantificarlas son: Biuret, Lowry y Bradford.

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Todos los mtodos colorimtricos poseen distintas sensibilidades y rangos de deteccin por lo que la escogencia del mismo depender de la naturaleza de la muestra a ser analizada. Mtodo de Biuret Este mtodo recibe su nombre debido a que el color que se produce en esta reaccin, es similar al de la condensacin de dos molculas de urea, conocido en alemn como: Biuret. Se fundamenta en la formacin de un compuesto azul violeta por la reaccin del in cpicro con la protena en medio alcalino. Este in forma un enlace covalente coordinado (Figura 1). Una condicin indispensable para la positividad de la reaccin es que el compuesto analizado posea al menos dos enlaces peptdicos en su estructura. En el caso de los aminocidos y dipptidos la reaccin es negativa. Si se observa la reaccin se ver claramente porqu hacen falta dos enlaces:

C N H CH

O Cu ++ R O OH -

C H N NH

R O

CH Cu ++ C H N

2
C N H

CH C N H

R O

Enlaces Peptdicos

Enlace covalente coordinado

Figura 1. Reaccin de Biuret El color formado responde a la ley de Lambert y Beer, por lo tanto es posible la cuantificacin de las protenas presentes en una muestra desconocida, mediante la comparacin de la absorbancia de la muestra con la de los estndares de concentracin conocida. Este mtodo detecta proteinas en un rango de 0,5 a 10 mg/mL, lo que es suficiente para medir la cantidad de protenas en algunos fluidos biolgicos como el suero y el plasma, ambos con concentraciones mayores de 6 g%.

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Mtodo de Bradford ste se basa en la capacidad que presenta el azul brillante de Coomasie G-250 de unirse a las cargas positivas de la estructura proteica. El colorante presenta dos estructuras, la roja predominante en solucin (Absmax= 465 nm) y la azul, cuando se encuentra asociado a las proteinas (Absmax= 595 nm).
OC 2 H 5

NH

CH 3

CH 3

C 2H 5

N CH 2

N H5C 2 CH 2

OS 3

S3O -

Figura 2. Estructura del azul de coomasie G250

Debido a que la respuesta del mtodo es la misma para una gran cantidad de protenas, la cuantificacin se puede llevar a cabo usando cualquier estndar disponible. La interferencia de otros compuestos distintos a las protenas es mnima. La sensibilidad del mtodo esta en el rango de 0,2 a 20 g/mL. Es decir 1000 veces ms sensible que el mtodo de Biuret.

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MATERIALES Y REACTIVOS Reactivo de Biuret: 1,5 g de CuSO4 : 5 H2O y 6 g de tartrato de sodio y potasio se disuelven en 500 mL de agua. Aadir 300 mL de NaOH al 10% y aforar a 1L. Reactivo de Bradfrod: 100 mg de azul brillante de Coomasie G 250 se disuelven en 50 mL de etanol al 95%. Aadir 100 mL de H3PO4 al 85% (concentrado) y aforar a 1 L con agua destilada. Filtrar a travs de papel filtro Whatman N 1. Para probar el reactivo medir la absorbancia contra un blanco de agua destilada a 595 nm, el valor debe estar entre 0,4 y 0,6 UA. Standard de protena 2 g% Espectrofotmetro Cubetas para espectrofotometra Azul brillante de Coomasie G-250 NaCl 0,9% Pipetas volumtricas de 1, 2 y 5 mL. 12 tubos de ensayo.

PARTE EXPERIMENTAL: Experimento N 1 Determinacin de protenas por el mtodo de Biuret Procedimiento: Preparar una dilucin 1:10 de plasma bovino en un tubo de ensayo (muestra problema) Prepare los estandares, blanco y muestra como se indica en el siguiente cuadro: Blanco ___ 1 mL ___ 5 mL Estndar 0,2 g% 0,1 mL 0,9 mL ___ 5 mL Estndar 0,6 g% 0,3 mL 0,7 mL ___ 5 mL Estndar 1,0 g% 0,5 mL 0,5 mL ___ 5 mL Estndar Muestra 1,2 g% problema 0,6 mL 0,4 mL ___ 5 mL ___ ___ 1 mL 5 mL

Reactivos Estndar albmina 2 g% NaCL 0,9% Plasma diluido 1:10 Reactivo de Biuret

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Una vez agregado el reactivo de Biuret, espere 10 minutos y proceda a leer la absorbancia a 545 nm con ayuda del espectrofotmetro. Anote los resultados en la tabla anexa para el posterior anlisis. RESULTADOS TUBO Estndar 0,2 g% Estndar 0,6 g% Estndar 1,0 g% Estndar 1,2 g% Muestra problema Experimento N 2 Determinacin de protenas por el mtodo de Bradford Procedimiento: A partir del estndar de protenas (2 g%) prepare por dilucin 100 mL de una solucin que contenga 100 mg%, y a partir de sta prepare 100 mL de estndares que contengan 10, 25, 50 y 100 mg% de protena. Prepare 100 mL de una dilucin de plasma bovino 1:100 que se utilizar como muestra problema. Prepare la siguiente serie de tubos: Reactivos Estndar NaCl 0,9 % Plasma diluido 1:100 Reactivo de Bradford blanco ___ 0,1 mL ___ 5 mL Estndar 10 mg% 0,1 mL ___ ___ 5 mL Estndar 25 mg% 0,1 mL ___ ___ 5 mL Estndar 50 mg% 0,1 mL ___ ___ 5 mL Estndar Muestra 100 mg% problema 0,1 mL ___ ___ 5 mL ___ ___ 0,1 mL 5 mL ABSORBANCIA

- Mezclar bien y leer la absorbancia con un espectrofotmetro a 595 nm dentro del lapso de 15 a 20 minutos despus de agregar el reactivo de Bradfrod.
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Una vez obtenidos los resultados antelos en la tabla que se suministra a continuacin para su posterior anlisis y discusin. RESULTADOS TUBO 10 mg% 25 mg% 50 mg% 100 mg% Muestra problema ABSORBANCIA

Con los datos de cada tabla construya una curva patrn para cada mtodo (graficando la concentracin de proteinas en el eje x contra absorbancia en el eje y) y mediante extrapolacin, estime la concentracin de protenas de la muestra. Considere la dilucin realizada en el procedimiento de cada mtodo. Discuta las diferencias encontradas entre ambos mtodos, as como sus ventajas y desventajas en el anlisis de muestras biolgicas. Auto evaluacin 1. Establezca diferencias entre el mtodo de Kjelhdal y los estudiados en esta prctica. 2. Que ventaja representa el hecho de que el reactivo de Bradford posea absorbancia a dos longitudes de onda distintas, una libre y otra asociado a las protenas. 3. En base a la sensibilidad que presentaron los mtodos estudiados, que aplicaciones prcticas tiene cada uno de stos. 4. Las proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptdicos hasta llevar las protenas a aminocidos libres. Si una protena es incubada con estas enzimas

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que suceder con la absorbancia en el tiempo al medir la concentracin de stas por alguno de los mtodos estudiados. En cul la absorbancia se hace cero primero? Bibliografa A.V. Chechetkin, V.I. Voroniaski, G.G. Pokusay. Prcticas de Bioqumica del ganado y aves de corral. Boyer, Rrodney. Modern Experimental Biochemistry. 2da Edicin. Benjamin Cummins Editores. 1993. Bradford, M. A rapid and sensitive meted for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. 1976.

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