Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Ps-Graduao Engenharia Ambiental Mestrado em Engenharia Ambiental

Cultivo de Bactrias redutoras de sulfato (BRS) e sua aplicao na remoo de sulfato e arsnio utilizando p de penas de galinha como substrato orgnico.

Autora: Patrcia Freitas Costa Orientadora: Prof. (a) Dr. (a) Mnica Cristina Teixeira Co-Orientador: Prof. Dr. Versiane Albis Leo

Fevereiro - 2012

Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Ps Graduao em Engenharia Ambiental

Patrcia Freitas Costa

Cultivo de Bactrias redutoras de sulfato (BRS) e sua aplicao na remoo de sulfato e arsnio utilizando p de penas de galinha como substrato orgnico.

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos necessrios para a obteno do ttulo: Mestre em Engenharia Ambiental rea de Concentrao: Saneamento Ambiental.

Orientadora: Prof.(a) Dr.(a) Mnica Cristina Teixeira Co-Orientador: Prof. Dr. Versiane Albis Leo

Ouro Preto, MG Fevereiro 2012

C837c

Costa, Patrcia Freitas. Cultivo de bactrias redutoras de sulfato (BRS) e sua aplicao na remoo de sulfato e arsnio utilizando p de penas de galinha como substrato orgnico [manuscrito] / Patrcia Freitas Costa - 2012. vii, 69f.: il., color; graf.; tabs. Orientadora: Profa. Dra. Mnica Cristina Teixeira. Co-orientador: Prof. Dr. Versiane Albis Leo. Dissertao (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Programa de Ps - graduao em Engenharia Ambiental. rea de concentrao: Saneamento Ambiental. 1. Resduos industriais - Teses. 2. Biorremediao - Teses. 3. Bactrias redutoras de sulfato - Teses. 4. Arsnio - Teses. 5. Efluente - Qualidade Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Ttulo.

Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br CDU: 628.39:579.846.2

Agradecimentos
Ningum trilha um caminho sozinho, e por isso, que aps uma caminhada muito bom olhar para trs e reconhecer aqueles que foram o alicerce no somente na vida profissional, mas tambm pessoal. Assim, agradeo imensamente a todos que fizeram parte dessa minha trajetria. Agradeo primeiramente minha famlia, meus pais e irmos, que compreenderam e apoiaram minha deciso. To importante quanto, agradeo aos meus orientadores, Mnica Cristina Teixeira e Versiane Albis Leo pela oportunidade e pela confiana desde a Iniciao Cientfica, momento onde foi despertado o amor pesquisa. Agradeo tambm ao Programa de Ps Graduao em Engenharia Ambiental, PROAMB, e a todos os professores pelo suporte e por complementar minha formao. Ao laboratrio de Biotecnologia Ambiental, lugar onde fiz amigas que deram o maior suporte pessoal e profissional. Agradeo imensamente ajuda de todas nos momentos em que a frustrao estava presente, que a ansiedade e o medo de falhar tomavam conta de mim. Em especial, Letcia de Paiva Matos, Mariana Moreira e Keici Guedes. Obrigada pela amizade. Pelo apoio incondicional, o despertar para a pesquisa, os conselhos e sugestes sbias; agradeo ao Leonardo de Paiva Barbosa. Agradeo tambm por estar ao meu lado nos dias difceis e compartilhar os dias bons. Sem amor nada conquistado. Obrigada aos laboratrios de Controle de Qualidade (EFAR) e Geoqumica (DEGEO) pelo suporte material e pela realizao das anlises. Em especial, o laboratrio de Bio&Hidrometalurgia (UFOP), onde encontrei pessoas queridas que sempre me ajudaram e incentivaram. Agradeo em especial Sueli Bertolino, cuja ajuda foi imprescindvel. Agradeo aos meus amigos de Ouro Preto, principalmente s amigas Utopianas, que mesmo sem entender ao certo minhas preocupaes durante a realizao desse trabalho, apoiaram sempre. Agradeo Universidade Federal de Ouro Preto, por me propiciar mais essa conquista em minha vida. E CAPES, pela concesso da bolsa de pesquisa.

NDICE
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... iii LISTA DE TABELAS .......................................................................................................... v Resumo ................................................................................................................................. vi Abstract ................................................................................................................................ vii 1. 2. 3. Introduo ...................................................................................................................... 1 Objetivos........................................................................................................................ 3 Reviso Bibliogrfica .................................................................................................... 4 3.1 Resduos lquidos e legislao brasileira ..................................................................... 4 3.2 Arsnio ........................................................................................................................ 6 3.3 Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS) ...................................................................... 11 3.3.1 Relao DQO/sulfato.......................................................................................... 19 3.4 Interaes entre micro-organismos e os metais ......................................................... 20 4. Materiais e Mtodos .................................................................................................... 23 4.1 rea de coleta ............................................................................................................ 23 4.2 Enriquecimento das amostras .................................................................................... 23 4.3 Caracterizao do p de penas................................................................................... 24 4.4 Avaliao do substrato orgnico na remoo de sulfato ........................................... 26 4.4.1 Lactato como substrato orgnico ........................................................................ 26 4.4.2 P de penas como substrato orgnico ................................................................. 27 4.5 Relao entre substrato e remoo de As3+ ............................................................... 28 4.5.1 Enriquecimento da cultura mista de BRS contendo As3+ ................................... 28 4.5.2 Lactato como substrato orgnico ........................................................................ 29 4.5.3 P de penas como substrato orgnico ................................................................. 29 4.6 Mtodos Analticos .................................................................................................... 32 4.7 Atividade metablica de BRS em condio semi-contnua....................................... 33 5. Resultados e discusso ................................................................................................ 36 5.1 Coleta e Enriquecimento das BRS............................................................................. 36 5.3 Relao entre o substrato orgnico e o metabolismo das BRS ................................. 39 5.3.1 Potencial de oxi-reduo (Eh) e pH .................................................................... 39 5.3.2 Crescimento Microbiano (Densidade ptica) .................................................... 43 5.3.4 Consumo biolgico de sulfato ............................................................................ 44 5.3.5 Imobilizao de As3+ .......................................................................................... 49

5.4 Atividade Metablica das BRS em condio semi-contnua..................................... 52 5.4.1 Avaliao do potencial de oxi-reduo (Eh) e pH do meio ................................ 52 5.4.2 Consumo de sulfato ............................................................................................ 53 5.4.3 Imobilizao do As3+ .......................................................................................... 56 6. 7. 8. 9. Concluses ................................................................................................................... 58 Sugestes para trabalhos futuros ................................................................................. 59 Produo cientfica ...................................................................................................... 60 Referncias Bibliogrficas ........................................................................................... 61

ii

LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1. Especiao do arsenito (esquerda) e arsenato (direita) em funo do pH (Teclu et al., 2008). ........................................................................................................................... 7 Figura 3.2. Principais processos de imobilizao das espcies de arsnio As3+ e As5+ e a interao com outros elementos qumicos. Extrado e adaptado de Lizama et al. (2011). ... 9 Figura 3.3. Representao esquemtica do ciclo do enxofre. Extrado e adaptado de Tang et al. (2009). ............................................................................................................................ 12 Figura 3.4. Vias de degradao microbiana de matria orgnica em ambientes anxicos na presena (a) e na ausncia de sulfato (b). Extrado de Barbosa (2009). .............................. 14 Figura 3.5. Esquema do processo de reduo de sulfato e imobilizao de zinco em sistema THIOPAQ (Paques). Extrado e adaptado de Muyzer et al. (2008). ................................... 18 Figura 4.1. Vista da Lagoa do Gamb, Ouro Preto MG. .................................................. 23 Figura 4.2. P de penas comercial. Mistura de penas, vsceras trituradas e sangue cozido. 25 Figura 4.3. Frascos de vidro (600mL) utilizados para os testes de remoo de sulfato e arsnio contendo apenas lactato como substrato orgnico. ................................................. 29 Figura 4.4. Frascos de vidro (600mL) utilizados nos testes de remoo de sulfato e As3+ contendo p de penas. .......................................................................................................... 30 Figura 4.5. Fluxograma representando desde a coleta do sedimento para obteno da cultura mista de BRS at os ensaios realizados em diferentes condies de cultivo. ......... 31 Figura 4.6. Esquema (esquerda) e foto (direita) representando o reator semi-contnuo. .... 34 Figura 5.1. Amostra LG. Cultivo em meio lquido, a 35C, pH 7,0. Presena (esquerda) e ausncia (direita) de precipitao negro, caracterstico do crescimento de BRS. ............... 36 Figura 5.2. Valores de Eh em relao s diferentes condies avaliadas: A e B Lactato, C e D Lactato (1,2g.L-1) e p de penas (diferentes concentraes), E e F P de penas (diferentes concentraes). Ausncia (linha tracejada) e presena de As3+ (linha slida). Para A e B: razo DQO/sulfato 0,67; razo 1; razo 2; razo 3; linha preta: controle abitico. Para C, D, E e F: azul: 1% de p de penas, laranja: 2%, verde: 3%, vermelho: 4% e preto: controle abitico.............................................................................. 40 Figura 5.3. Valores de pH nas diferentes condies estudadas: A e B Lactato, C e D Lactato (1,2g.L-1) e p de penas, E e F P de penas. Ausncia (linha tracejada) e presena de As3+ (linha slida). Para A e B: razo DQO/sulfato 0,67; razo 1; razo 2; razo 3; linha preta: controle abitico. Para C,D,E e F: azul: 1% de p de penas, laranja: 2%, verde: 3%, vermelho: 4% e preto: controle abitico. .......................................................... 42 Figura 5.4. Densidade ptica em meio contendo lactato de sdio, na ausncia (A) e presena de As3+ (B). Azul razo 0,67; laranja 1; verde 2; vermelho 3 e preto controle abitico. ................................................................................................................. 44 iii

Figura 5.5. Consumo biolgico de sulfato em relao s diferentes condies estudadas: A e B - Lactato, C e D Lactato e p de penas, E e F P de penas. Ausncia (linha tracejada) e presena de As3+ (linha contnua). Para A e B: razo DQO/sulfato 0,67; razo 1; razo 2; razo 3; linha preta: controle abitico. Para C,D,E e F: azul: 1% de p de penas, laranja: 2%, verde: 3%, vermelho: 4% e preto: controle abitico. ...................... 47 Figura 5.6. Remoo de arsnio em relao ao consumo de sulfato nas diferentes condies de cultivo, A: lactato (razo 3) e As3+; B: lactato (1,2 g.L-1), p de penas (4%) e As3+; C: p de penas (4%) e As3+. ..................................................................................................... 50 Figura 5.7. Relao entre os valores de pH e Eh ao longo da operao do reator semicontnuo, nas diferentes condies estudadas...................................................................... 53 Figura 5.8. Relao entre a concentrao de sulfato e os valores de Eh durante a operao do reator semi-contnuo nas diferentes condies analisadas. ............................................ 56 Figura 5.9. Relao entre a remoo de As3+ e concentrao de sulfato durante as fases 4 e 5 de operao do reator semi-contnuo ................................................................................57

iv

LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1. Composio do meio de cultura utilizado para enriquecimento da cultura mista de BRS. ................................................................................................................................ 24 Tabela 4.2. Concentrao de lactato de sdio e sulfato total presente no meio de cultivo de acordo com as razes DQO/sulfato determinadas. .............................................................. 27 Tabela 4.3. Composio da soluo condicionante utilizada para anlise da concentrao de sulfato. ............................................................................................................................ 32 Tabela 4.4. Condies de operao do reator semi-contnuo em relao aos dias de operao. .............................................................................................................................. 35 Tabela 5.1. Caracterizao fsico-qumica do p de penas quanto frao solvel e insolvel. ............................................................................................................................. 38 Tabela 5.2. Remoo biolgica de sulfato e As3+ relacionado ao tipo de substrato orgnico e sua concentrao no cultivo de BRS, na presena e ausncia de As3+. ............................ 48 Tabela 5.3. Eficincia na remoo de sulfato nas diferentes fases de operao do reator semi-contnuo. ..................................................................................................................... 54

Resumo
A presena de arsnio (As) em efluentes industriais e em guas de consumo representa um grande risco aos organismos vivos. A remoo desse metalide realizada usualmente por meio de processos fsico-qumicos e mais raramente por processos biolgicos. Neste trabalho, foi empregada uma metodologia biolgica alternativa baseada no cultivo de bactrias redutoras de sulfato (BRS), foi testado tambm um material residual de baixo custo ainda pouco explorado, o p comercial de penas de galinha. Tal material foi avaliado quanto ao seu potencial em ser utilizado simultaneamente como fonte de matria orgnica para o crescimento de BRS e material suporte slido para imobilizao de arsnio trivalente (As3+). Os experimentos em batelada e em condies semi-contnuas compararam a eficincia de remoo de sulfato e As3+ na presena de dois substratos orgnicos distintos: lactato de sdio e/ou p de penas de galinha. Em batelada, a remoo de As3+ aumentou consideravelmente quando o p de penas foi acrescido ao sistema, de 38% para aproximadamente 80%, com concentrao inicial de 4mg.L-1. A condio semicontnua foi testada utilizando um reator de fluxo ascendente, operado por 202 dias, no qual se obteve remoo de sulfato e As3+ de aproximadamente 84% e 98%, respectivamente; sendo a concentrao inicial de sulfato de 2000mg.L-1. Foram testadas duas concentraes iniciais de As, 4 e 8mg.L-1. Na condio em batelada, na presena do p de penas, a remoo de As3+ no foi fortemente relacionada remoo de sulfato, comprovando a participao ativa do material residual na imobilizao do metalide. O presente estudo demonstra que o p comercial de penas de galinha um material interessante do ponto de vista de cultivo de BRS visando remoo de As 3+ em condies redutoras, dispensando a usual necessidade da presena de um agente oxidante forte que promova a oxidao prvia das espcies trivalentes de arsnio a fim de garantir sua remoo da fase lquida.

vi

Abstract
The presence of arsenic (As) in industrial wastewater and in drinking water represents a major risk to living organisms. Removal of this metalloid is usually carried out through chemical processes and more rarely by biological processes. In this work we employed an alternative approach based on the cultivation of sulfate-reducing bacteria (SRB) using different carbon sources. A relatively unusual and low cost waste material was also tested during the experiments, the powdered chicken feathers. This material was evaluated according to its potential to be used as organic material source and/or as a solid material to guarantee the immobilization of trivalent arsenic species (As3+). The batch and semicontinuous experiments were done in order to compare the efficiencies of sulfate and arsenite removal in the presence of two different organic substrates (sodium lactate and/or powdered chicken feathers). The As3+ removal obtained during batch experiments increased considerably when the powdered chicken feathers were added to the system, from 38% to 80%, approximately. The semi-continuous experiments were done using an up flow reactor, operated during 202 days. The observed sulfate and As3+ removal were approximately 84% and 98%, respectively. In batch conditions, and in the presence of powder feathers, removal of As3+ was not strongly related to the removal of sulfate thus demonstrating the active participation of the waste material in the immobilization of the metalloid. The present study demonstrates that the powdered chicken feathers is an interesting material for improving SRB growthing and sulfate removal in the presence of arsenic trivalent ions under reducing conditions. The experimental approach for arsenic removal here described do not require the use of a strong oxidizing agent to promote the oxidation of the trivalent arsenic species in order to ensure removal of the liquid phase.

vii

1.

Introduo
O crescimento da atividade industrial observado nas ltimas dcadas trouxe como

consequncia o aumento na gerao de resduos e uma maior preocupao com a interferncia que os mesmos podem causar ao ambiente se descartados de forma incorreta. A legislao brasileira responsvel por orientar aes que devem ser tomadas em relao ao descarte e tratamento de resduos, porm o impasse entre a lei e seu cumprimento ainda preocupante. de fundamental importncia que os resduos slidos e efluentes industriais, agrcolas, ou domsticos, tenham um tratamento adequado antes de serem descartados nos corpos hdricos ou nos solos. Tanto resduos gerados de forma natural quanto antropognica, contm uma srie de compostos que podem ser bastante danosos ao ambiente e ao seres vivos (Latif et al., 2011). Os metais, por exemplo, esto presentes em efluentes de indstrias metalrgicas, de produo de corantes e tintas, galvanoplastia, produo de baterias e pilhas, em Drenagem cida de Mina (DAM), entre outros. A DAM um tipo de resduo lquido gerada naturalmente, quando minerais sulfetados presentes em resduos de minerao so oxidados em presena de gua. Esta soluo age como agente lixiviante dos minerais presentes no resduo produzindo um percolado rico em metais dissolvidos, e sulfato (Neculita et al., 2007). Quando o mineral lixiviado a arsenopirita, por exemplo, h a formao de um percolado rico em sulfato e arsnio, um metalide bastante txico mesmo em baixas concentraes (na ordem de ppm). O arsnio considerado bastante txico aos organismos vivos, uma que vez que, ao ser absorvido, a maior parte dos compostos contendo arsnio, sejam eles orgnicos ou inorgnicos, acaba sendo convertida ao trixido de arsnio, o qual reage muito rapidamente com os grupos sulfidrilas (-SH) de protenas, inibindo a ao de enzimas que contenham estes grupamentos em seus stios ativos e bloqueando a respirao celular (Tsalev e Zaprianov, 1985). A remoo de sulfato contido em efluentes pode ser obtida tanto fsica e quimicamente, quanto biologicamente por micro-organismos capazes de reduzir o sulfato presente no efluente em sulfeto. Nesse sentido, so reconhecidas as Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS) como o grupo microbiano empregado nesse tipo de tratamento biolgico de efluentes (Upadhyaya et al., 2010; Teclu et al., 2009; Muyzer et al., 2008). A remoo de arsnio em guas contaminadas se d, principalmente, pela converso do arsnio solvel numa fase insolvel. Alguns mtodos fsico-qumicos so 1

utilizados, como a adsoro de espcies de arsnio em xido-hidrxidos de ferro ou alumnio, troca inica e osmose reversa (Greenleaf, et al., 2006; Badruzzaman, et al., 2004; Ning, 2002). Contudo, a utilizao de BRS nesse tipo de tratamento pode ser uma alternativa muito eficaz, uma vez que a reao entre o sulfeto e o metal (metalide) solvel produz um composto (sulfeto metlico) que possui uma solubilidade muito baixa se comparada aos oxido-hidrxidos metlicos. Alm disso, o sulfeto metlico um composto bastante estvel, sendo uma forma mais segura de imobilizao de um metal ou metalide (Lens et al., 2007). Para o sucesso do tratamento biolgico de efluentes utilizando as BRS, a escolha do substrato orgnico necessrio para o cultivo desses micro-organismos determinante. A natureza do substrato orgnico e sua concentrao devem ser levadas em considerao (Barbosa, 2009; Velasco et al., 2008). Com isso, o substrato orgnico utilizado pode representar um custo elevado ao processo. A escolha de materiais que muitas vezes so considerados resduos de outros processos industriais, como substrato orgnico para o cultivo de BRS, pode ser uma boa alternativa para diminuir os custos do processo. Alguns matrias como melao (Teclu et al., 2009), vinhaa (Martins et al., 2009), resduo da indstria de queijo (Costa e Duarte, 2005) foram avaliados como substrato orgnico para o cultivo de BRS, representando alternativas de interesse econmico. A busca de materiais alternativos para o cultivo de BRS de suma importncia para a viabilidade desse tipo de processo. Esse trabalho avalia o p de penas comercial como um possvel substrato orgnico para o cultivo de BRS, alm disso, foi analisada a influncia desse material na remoo de As3+ presente em soluo.

2.

Objetivos
O presente trabalho objetivou obter uma cultura mista de BRS capaz de remover

sulfato e arsnio trivalente (As3+) de um efluente sinttico (meio de cultura acrescido de arsenito de sdio). A possvel utilizao de um material residual abundante e pouco utilizado, o p comercial de penas e vsceras de galinha foi avaliada. Sua possibilidade de uso tanto como suporte slido, para o crescimento das BRS, como fonte de nutrientes, foi analisada e esse composto foi comparado com o lactato de sdio como fonte de carbono. Foi tambm avaliada a influncia do p de penas no processo de imobilizao do As 3+. Como objetivos especficos podem ser destacados: Selecionar uma cultura mista de micro-organismos capaz de crescer e consumir sulfato em meio de cultivo especfico para crescimento de BRS (Postgate C Modificado) com lactato de sdio e/ou p de penas como substrato orgnico. Caracterizar o material p de penas quanto a composio fsico-qumica e orgnica. Avaliar a eficincia de remoo de sulfato pelas cepas cultivadas nos substratos orgnicos estudados sob diferentes condies de cultivo. Determinar uma concentrao de substrato orgnico ideal para o processo de reduo de sulfato e utilizar essa condio para a anlise da imobilizao de As3+ em meio sinttico. Comparar a eficincia na remoo de sulfato na presena e ausncia de As3+ utilizando lactato de sdio e/ou p de penas. Utilizar as melhores condies de cultivo em batelada e compar-las s condies semi-contnuas, utilizando um mini-reator.

3.

Reviso Bibliogrfica

3.1 Resduos lquidos e legislao brasileira

recente a preocupao dos rgos pblicos em relao ao descarte de resduos com alto poder poluidor, principalmente quando esses resduos tm como destino os corpos hdricos. Em 1934, foi publicado o primeiro decreto (Decreto 24.643, Cdigo das guas) que tenta, de forma ainda tmida, dar suporte s questes ambientais. Somente em 1960 foi publicado o primeiro decreto brasileiro (Decreto 49.974-A, Cdigo Nacional de Sade) que trata de forma mais especfica sobre a poluio das guas, classificando-as de acordo com seus usos preponderantes (Von Sperling, 1998). Desde ento, a legislao brasileira tem melhorado de forma significativa, mas ainda vemos o impasse entre a lei e seu cumprimento. De 2005 a 2011 a resoluo CONAMA/357 direcionou sobre os padres de lanamento dos efluentes lquidos no Brasil e classificou os corpos de gua de acordo com sua utilizao. Em maro de 2011 foi publicada a resoluo CONAMA n 430, que alterou alguns parmetros da resoluo CONAMA anterior (357/2005) e passa a ser a vigente. Tambm em 2011 foi publicada a portaria n 2914, que dispe sobre os procedimentos de controle e de vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade. Nas ltimas dcadas, com o aumento da atividade industrial, cresce tambm a preocupao com o destino dos resduos produzidos neste setor. O efluente industrial pode ser gerado durante os processos de produo industrial, ou ainda nas etapas de lavagem de ptio, mquinas, tubulaes; assim, o efluente gerado poder conter uma diversidade muito grande em relao ao tipo de agente poluidor, dependendo, principalmente do tipo de produto formado pela indstria (Von Sperling, 2005). Os agentes poluidores podem, portanto, ser (i) de natureza orgnica, como lipdeos e protenas, encontrados em efluentes de indstrias de laticnios, matadouros, suinoculturas; pesticidas e herbicidas, utilizados na agricultura; ou (ii) de natureza inorgnica, sendo alguns metais e os metais pesados considerados como os mais danosos ao ambiente; tais compostos esto presentes em efluentes de indstrias metalrgicas, de produo de corantes e tintas, produo de baterias e pilhas, na drenagem cida de mina, entre outros. Alm dos metais pesados, outro agente poluidor inorgnico comum em efluentes industriais o on sulfato (SO42-), e este pode estar associado presena de metais pesados em alguns efluentes industriais. O sulfato est presente em guas residurias geradas por 4

indstrias de galvanoplastia, refino de petrleo, produo de papel e celulose, e por drenagens cidas de mina (DAM), dentre outras. As DAMs contm tanto sulfato como metais pesados, e constituem um grande problema ambiental vinculado a extrao de minrios sulfetados (Groudev et al., 2008). Quando h a exposio de minerais sulfetados e estes so oxidados na presena de gua, h a formao de um percolado rico em sulfato e metais pesados. Esse percolado conhecido como Drenagem cida de Mina (Von Sperling, 2005). A formao da DAM pode ser explicada pelas equaes seguintes: FeAsS + 9H2O FeOOH + H2AsO3- + SO42- + 15H+ + 12eH2AsO3- + H2O HAsO42- + 3H+ + 2e(eq.3.1) (eq.3.2)

O mineral oxidado pode ser, por exemplo, a pirita (FeS2), liberando grande quantidade de ferro na gua; ou outros minerais, como calcopirita (CuFeS2) liberando cobre e ferro, ou ainda, arsenopirita (FeAsS) liberando arsnio solvel (Von Sperling, 2005). A remoo de sulfato e de metais pesados de efluentes industriais pode ser realizada por tratamento qumico. Geralmente a remoo se d pela adio de carbonato de clcio (CaCO3) havendo formao de precipitado contendo sulfato e metais. Contudo, essa tcnica requer um alto custo operacional, alm da gerao de grande volume de lodo (Von Sperling, 2005). O tratamento biolgico, utilizando Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS) vem como uma alternativa eficiente e economicamente vivel (Kaksonen et al., 2003; Rizzo et al., 2004) a esta metodologia. Como consequncia do metabolismo das BRS, o sulfato presente em soluo utilizado como aceptor final de eltrons durante a respirao anaerbia. Com isso, o on sulfato reduzido a sulfeto, principalmente sob a forma de sulfeto de hidrognio (H2S). Em relao presena do on sulfato nos efluentes, a legislao brasileira, de acordo com a Portaria 2914/2011, determina que seu limite de lanamento nos efluentes deve ser de 250mg.L-1, a portaria em questo dispe sobre os procedimentos de controle e de vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e sobre seu padro de potabilidade. Alm disso, o lanamento de efluentes nos corpos hdricos no deve descaracteriza-los, ou seja, a concentrao mxima de sulfato nos corpos hdricos tambm no deve ultrapassar o valor de 250mg.L-1.

3.2 Arsnio
O Arsnio (As) o 20 metalide mais abundante na crosta terrestre (Livremont et al., 2009). A disponibilizao desse elemento no meio ambiente pode ocorrer de forma natural ou antropognica. Em guas naturais, o arsnio est presente principalmente na forma de compostos inorgnicos, com valncias 3+ e 5+ (Livremont et al., 2009). Em meio aquoso, o As pode ser encontrado sob a forma de arsenito (AsO3-3) e arsenato (AsO4-3), referindo-se, respectivamente a espcies trivalentes e pentavalentes. A toxicidade das diversas espcies de arsnio decresce na seguinte ordem: compostos de As3+ inorgnico>compostos de As5+ inorgnico> compostos de As3+ orgnico>compostos de As5+ orgnico. Em termos de intensidade, o As3+ inorgnico 60 vezes mais txico que o As5+ inorgnico (USEPA, 2000). O arsnio elementar no txico, mas rapidamente convertido a produtos txicos pelo organismo humano. A maior parte dos compostos contendo arsnio, sejam eles orgnicos ou inorgnicos, acaba sendo convertida pelo organismo ao trixido de arsnio, o qual reage muito rapidamente com os grupos sulfidrilas (-SH) de protenas, inibindo a ao de enzimas que contenham estes grupamentos em seus stios ativos e bloqueando a respirao celular (Tsalev e Zaprianov, 1985). As fontes naturais de contaminao por arsnio podem estar associadas a fenmenos geotermais e vulcnicos e ainda ocorrncia de rochas aurferas sulfetadas, como o caso da regio do quadriltero ferrfero em Minas Gerais. A minerao de ouro nessa regio foi a principal responsvel pela liberao de grandes concentraes de arsnio presentes em guas subterrneas e de consumo. Borba et al. (2004) avaliaram a concentrao de arsnio total em gua superficial e subterrnea em Mariana e Ouro Preto, MG. Em muitos pontos de coleta foram encontradas concentraes de arsnio superiores ao limite mximo permitido, de 50 g.L-1 (CONAMA 430). Esse dado requer ateno uma vez que parte da populao dessas duas cidades utiliza como gua de abastecimento aquela retirada direto de mina, sem nenhum tipo de tratamento. Ainda como fontes antropognica de contaminao de arsnio, podemos destacar a utilizao de pesticidas, inseticidas, produo de vidro e atividades relacionadas preservao de madeira (Borba, 2002). A exposio crnica ao arsnio pode levar ao desenvolvimento de cncer de pele, pulmo, prstata, bexiga, rim e fgado. Outras patologias tambm podem ocorrer, como:

hiperpigmentao cutnea, hemorragias gastrointestinais, arritmias cardacas, confuso mental, entre outras (USEPA, 2000; WHO, 2009). Os processos que visam remoo de As de meios aquosos tm, geralmente, por objetivo, converter o arsnio solvel numa fase insolvel. Nesse sentido, alguns mtodos fsico-qumicos so utilizados, como a adsoro de espcies de arsnio em xidohidrxidos de ferro ou alumnio, troca inica e osmose reversa (Greenleaf, et al., 2006; Badruzzaman, et al., 2004; Ning, 2002). Uma vez que os ciclos biogeoqumicos do ferro e do arsnio esto intimamente relacionados em sistemas naturais, a presena de Fe afeta a especiao do As, uma vez que o ferro pode catalisar a reao de oxidao da espcie de arsnio trivalente (mais solvel), produzindo sua espcie oxidada menos estvel (menos solvel) (Livremont et al., 2009). Os (oxi)(hidro)xidos de ferro so especialmente importantes e efetivos na soro e/ou coprecipitao de arsnio (Henken, 2009). O principal fator que determina a especiao do As o pH do meio (Lizama et al., 2011) o que pode ser observado pela figura 3.1. Em guas naturais onde o pH em torno de 6 a 9, o arsenito mais comumente encontrado como espcie neutra (H3AsO3), enquanto o arsenato encontrado como espcie carregada negativamente (H2AsO4- e HAsO4-2) (figura 3.1). Espcies carregadas so mais facilmente removidas que espcies neutras e podem ser removidas por soro, troca inica ou precipitao. Portanto, o arsenato mais facilmente removido de guas naturais que o arsenito.

Figura 3.1. Especiao do arsenito (esquerda) e arsenato (direita) em funo do pH (Teclu et al., 2008). Os processos de remoo de arsnio so considerados bem distintos aos processos de remoo de outros metais como cobre, zinco e mangans (Lizama et al., 2011). Metais 7

como Cu e Zn so ctions e precipitam facilmente em pH bsico, j as espcies de As so neutras ou nions e requerem condies ambientais mais especficas para sua remoo (Lizama et al., 2011). A natureza da espcie de As envolvida no processo de remoo de fundamental importncia, porm as condies ambientais e a interao com outros elementos qumicos tambm devem ser consideradas. Os micro-organismos podem participar dos processos de remoo de arsnio mediando reaes de oxi-reduo ou influenciando nos mecanismos de precipitao (Gadd, 2004). As Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS) podem ser efetivas no processo de remoo de arsnio, uma vez que o sulfeto produzido atravs do metabolismo desses micro-organismos pode se ligar ao arsnio solvel e precipit-lo sob a forma de sulfeto metlico. Duncan e colaboradores (apud Lizama et al., 2011) sugerem em seu trabalho que a remoo biolgica de As ocorre, em maior parte, como precipitados minerais contendo S-As. Teclu et al., (2008) utilizaram culturas mistas de BRS em estudo para precipitao de arsnio 3+ e 5+, como sulfeto metlico; conseguindo uma eficincia de remoo de 55 e 77%, respectivamente, utilizando uma concentrao inicial de 0,5mg.L-1. Em Drenagem cida de Mina, o processo inicial de remoo de As mediado por BRS ainda pouco conhecido, porm, a adsoro ou coprecipitao com outros sulfetos metlicos tm sido proposta (Lizama et al., 2011). A formao de sulfeto de arsnio insolvel deve ocorrer apenas depois que as condies de ambiente redutor forem estabelecidas (Neculita et al., 2007). Outros micro-organismos como: Bactrias Oxidantes de Arsenito, Bactrias Redutoras de Arsenato e Bactrias Oxidantes de Ferro; podem tambm mediar a remoo de As de forma direta ou indireta. Esses micro-organismos coexistem em ambientes como os solos (Macur et al., 2004). As espcies de arsnio em gua podem ter diferentes vias de transformao e remoo: (1) precipitao, (2) coprecipitao, (3) soro em slidos, (4) metilao, e (5) reaes de oxidao e reduo (figura 3.2) (Lizama et al., 2011).

Figura 3.2. Principais processos de imobilizao das espcies de arsnio As3+ e As 5+ e a interao com outros elementos qumicos. Extrado e adaptado de Lizama et al. (2011).

A precipitao se refere a reaes entre espcies dissolvidas formando slidos insolveis. Esse processo pode ser resultante da oxidao, reduo ou mudanas de pH do meio. Em ambientes oxidados, com altos nveis de As5+, a precipitao deste com Ca, Mg, Al e Fe3+ pode ocorrer. Em ambientes reduzidos e na presena de S e Fe, o As pode ser precipitado na forma de composto insolvel como a orpimenta As2S3, no qual o As est presente como As trivalente, e arsenopirita (AsFeS). A Orpimenta (Ouro-pigmento) precipita em ambientes contendo pouco Fe, porm ricos em sulfeto, especialmente sob condies cidas (Lizama et al., 2011). A USEPA considera que a precipitao qumica, e em particular a precipitao de arsenato frrico, s ou em combinao com outros mtodos de precipitao, a melhor tecnologia para o tratamento de efluentes contendo arsnio (Harris e Krause, 1993). A coprecipitao o processo pelo qual substncias solveis se incorporam aos precipitados durante sua formao, ela pode ocorrer por adsoro, onde um determinado composto adsorvido na superfcie do precipitado; como o caso do As coprecipitado com (oxi)hidrxidos de ferro (Gadd, 2004). O processo de soro ocorre quando adsoro e absoro esto envolvidos simultaneamente, ou quando ambos processos no podem ser distinguidos. Adsoro se refere remoo de ons ou outras espcies dissolvidas, de lquidos ou gases pela acumulao na superfcie de um material slido (Lizama et al., 2011). O processo de adsoro mais comum envolve a troca inica. O sucesso do processo de adsoro depende das propriedades da superfcie do adsorvente, da concentrao e da especiao das espcies qumicas presentes, da competio entre espcies qumicas e do pH do meio (Stollenwerk, 2003). J o processo de absoro a assimilao de espcies qumicas no interior de substncias slidas (Henken e Hutchison, 2009). Um material que seja utilizado como sorvente deve ser primariamente analisado de acordo com suas caractersticas fsicoqumicas a fim de garantir o sucesso ao se utilizar esse tipo de tratamento. A soro do arsenato com a maioria dos hidrxidos metlicos, especialmente de Fe e Mn, e com argila tem sido reportada na literatura, sendo que, xidos de ferro so melhores adsorventes para As do que argilas (Lizama et al., 2011, Gadd, 2004). A soro de oxinions arsenicais sensvel a presena de nions competidores, como por exemplo, fosfato (PO4-3, HPO4-2, H2PO4-), sulfato (SO4-2), carbonato (CO3-2), bicarbonato (HCO3-) e cloreto (Cl-) (Mukherjee et al., 2009). O fosfato possui a mesma configurao tetradrica do arsenato, e, portanto, pode desorver o As5+ de diferentes superfcies (Henken, 2009). Em guas contendo concentraes muito altas de sulfato, este 10

pode diminuir a soro de As. Porm, essa competio pode ser diminuda ao se reduzir o sulfato a sulfeto, pelo metabolismo das BRS (Lizama et al., 2011). A metilao seguida de volatilizao de metalides como o mercrio, selnio e arsnio so fenmenos que ocorrem em ambientes aquticos (Kosolapov et al., 2004). Em condies anxicas e ambientes redutores, o As pode ser convertido no gs arsina, que um composto altamente txico. Exemplos de arsinas volteis so: arsina AsH3, metilarsina CH3(AsH2), dimetilarsina (CH3)2AsH. A formao de metilarsina um processo que pode ser mediado por diferentes organismos, como fungos e bactrias (Lizama et al., 2011). Michalke et al. (2000) relatam que as BRS podem estar envolvidas no processo de metilao do arsnio.

3.3 Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS)

As Bactrias Redutoras de Sulfato (BRS) representam um grupo de microorganismos que realiza a reduo dissimilativa do on sulfato. Esse processo difere da reduo assimilativa onde os ons sulfato so reduzidos a sulfeto e este incorporado s molculas orgnicas como os aminocidos e coenzimas (Madigan et al., 2004). Na reduo dissimilativa, o on sulfato atua como agente oxidante para a metabolizao da matria orgnica, da mesma forma que atua o oxignio na respirao convencional. O sulfeto produzido pela reduo do sulfato normalmente excretado na forma de H2S livre (Postgate et al., 1984). A degradao da matria orgnica, tendo o sulfato como oxidante, pode ser resumida de acordo com a equao 2.4: Matria Orgnica (C, H, O) + SO42- HS- + HCO3-

(Eq. 3.4)

As BRS tm ampla distribuio, estando presentes em ambientes anaerbios terrestres ou aquticos. O grupo das BRS contm representantes considerados muito versteis em termos de colonizao do ambiente. possvel encontrar BRS em ambientes considerados inspitos, como fontes hidrotermais e domo de lama vulcnica, onde as temperaturas so bem elevadas (Elsgaard et al., 1994); em locais com alta presso como as fendas ocenicas e sedimentos marinhos (Jeanthon et al., 2002); em ambientes cidos como as drenagens cidas de mina (Johnson, 1995) ou em locais extremamente alcalinos, como em lagos de soda (Pikuta et al., 1997). Em contrapartida, as BRS so mais comumente encontradas em regies bentnicas de lagos, rios e mares (Gibson, 1990). A 11

diversidade microbiana referente ao grupo das BRS est intimamente relacionada com o tipo de ambiente colonizado e reflete a complexidade biolgica do grupo. A presena das BRS com alta atividade metablica facilmente revelada pela presena de precipitado negro resultante da precipitao do sulfeto de ferro, e ainda pelo cheiro do sulfeto de hidrognio caracterstico (Postgate et al., 1984). Esses micro-organismos so de fundamental importncia nos ciclos

biogeoqumicos do carbono e enxofre. Estima-se que cerca de 50% da matria orgnica despejada em ambientes marinhos possa ser degradada pelas BRS (Gibson, 1990). O enxofre pode ser encontrado em uma variedade de estados de oxidao, sendo os mais significantes: -2 (sulfeto e enxofre orgnico reduzido), 0 (enxofre elementar) e +6 (sulfato). Agentes qumicos ou biolgicos contribuem para a transformao de um estado de oxidao do enxofre para outro. Os principais micro-organismos envolvidos no ciclo do enxofre so as Bactrias Redutoras de Sulfato e as Bactrias Oxidantes de Enxofre, um esquema resumindo o ciclo do enxofre e representado a participao dessas bactrias est representado na figura 3.3 (Tang et al., 2009).

Figura 3.3. Representao esquemtica do ciclo do enxofre. Extrado e adaptado de Tang et al. (2009).

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O ciclo do enxofre consiste em reaes de oxidao e reduo dos compostos contendo enxofre. O sulfato quando reduzido, tem a funo de atuar como aceptor de eltrons em vias metablicas de alguns micro-organismos, como as BRS, sendo convertido a sulfeto. J o sulfeto pode ser doador de eltrons para o metabolismo de micro-organismos fototrficos e quimiolitotrficos, como as Bactrias Oxidantes de Enxofre, sendo convertido a enxofre elementar ou sulfato (Tang et al., 2009). Em relao aos compostos orgnicos, em ambientes aerbios, os microorganismos hetertrofos so capazes de mineraliz-los a CO2, j em ambientes anaerbios, a mineralizao da matria orgnica bem mais complexa e, muitas vezes requer a interao entre diferentes grupos de micro-organismos. Cada grupo microbiano realiza uma oxidao parcial da matria orgnica, e seus produtos metablicos so assimilados por outros grupos, at a completa oxidao do composto orgnico (Figura 3.4) (Muyzer et al., 2008, Barbosa, 2009). Os compostos de alto peso molecular como protenas, cidos nuclicos, carboidratos e lipdeos so hidrolisados a produtos de baixo peso molecular como cidos orgnicos e alcois. Esses compostos podem ser fermentados em cidos graxos volteis (actico, propinico e butrico). O processo final da oxidao dos compostos orgnicos a degradao desses cidos graxos. Em ambientes com concentrao de sulfato suficiente, a degradao dos cidos graxos realizada pelo metabolismo das BRS, podendo ocasionar o acmulo de acetato e H2, esses compostos sero, por fim, degradados pelas metanognicas e BRS acetoclsticas atuando em sintrofismo (Muyzer et al, 2008; Gibson 1990; Postgate et al., 1984). As relaes mutualsticas entre as espcies de uma comunidade microbiana so primordiais para a manuteno da estrutura e diversidade funcional do ecossistema (Mcinerney et al., 2008). Porm, em ambientes naturais, a variedade dos substratos orgnicos disponveis e a diversidade de espcies presentes, tornam complexas as interaes entre as espcies (Muyzer et al., 2008).

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Figura 3.4. Vias de degradao microbiana de matria orgnica em ambientes anxicos na presena (a) e na ausncia de sulfato (b). Extrado de Barbosa (2009).

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O ambiente favorvel ao crescimento das BRS, em geral, tm como caractersticas: condies moderadamente alcalinas (pH 7,0 7,8), mesoflicas (28 38 C) e ambientes redutores cujo os valores de Eh se encontrem na faixa de -150 a -300 mV (Madigan et al., 2004). A atividade metablica de BRS, porm, j foi observada em ambientes cidos de drenagens cidas de minas (Johnson et al., 2002; Kusel et al., 2001; Johnson, 1995), em ambientes alcalinos (Kjeldsen et al., 2007; Pikuta et al., 1997; Fry et al.,1997), termoflicos (Domingues et al., 2006; Jeanthon et al., 2002; Elsgaard et al., 1994) e psicroflicos (Vandieken et al., 2006; Knoblauch et al., 1999; Sass et al., 1998). Como dito anteriormente, o potencial de oxi-reduo (Eh) do ambiente fator importante para o cultivo das BRS, sendo esse valor determinado pela natureza qumica do ambiente ou pela influncia dos subprodutos da atividade metablica das BRS. A prpria produo de sulfeto proveniente do metabolismo das BRS j seria suficiente para atingir os valores de Eh necessrios, porm a adio de agentes redutores ao meio de cultivo pode ser realizada utilizando: ditionato de sdio, ascorbato de sdio e tioglicolato de sdio (Gibson, 1990) contudo, o tioglicolato de sdio se utilizado em altas concentraes pode inibir o crescimento de algumas espcies de BRS (Madigan et al., 2004) As BRS tm considervel capacidade de utilizar diversos compostos como doadores de eltrons, como lactato, formato, piruvato, metanol, etanol, propanol, butanol (Gibson, 1990). As BRS podem tambm utilizar fontes alternativas e mais complexas de matria orgnica e fonte de eltrons, como melao de cana (Teclu et al., 2009), resduo da indstria de vinho vinhaa (Martins et al., 2009) e resduo de indstria de produo de queijo (Costa e Duarte, 2005). Essas fontes alternativas de matria orgnica para o cultivo de BRS so de grande interesse, principalmente econmico, uma vez que muitas delas so resduos de algum tipo de processo industrial, sendo obtidas a baixos custos (Costa e Duarte, 2005). Alm dos compostos orgnicos, o H2 pode ser tambm utilizado pelas BRS como doador de eltrons. A escolha correta de um substrato orgnico crucial para o sucesso no cultivo desses micro-organismos (Gibson, 1990). Como aceptor final de eltrons, alm do sulfato, podem ser utilizados: tiossulfato, tetrationato, sulfito ou metabissulfito (Postgate et al., 1984). Os compostos orgnicos, quando utilizados como fonte de eltrons, ou seja, fonte de energia para o metabolismo, podem tambm atuar como fonte de carbono para a biossntese celular. Os micro-organismos que necessitam, como fonte de energia e fonte de carbono, dos compostos orgnicos so considerados hetertrofos, e a grande maioria das BRS heterotrfica. J aquelas BRS que utilizam H2 como fonte de energia podem utilizar 15

o CO2 do meio como fonte de carbono, sendo consideradas, portanto, auttrofas (Madigan et al., 2004) A utilizao de substratos orgnicos no metabolismo desses micro-organismos pode ser realizada de duas formas distintas. Com a sua oxidao completa ou incompleta. De acordo com isso, o lactato, um substrato amplamente utilizado, pode seguir duas vias de oxidao representadas pelas equaes seguintes (Gibson, 1990): 2CH3CHOHCOO- + SO4-2 2CH3CHOO- + 2HCO3 + HS- + H+ 2CH3CHOHCOO- + 3SO4-2 6HCO3 + 3HS- + H+
0

(Eq. 3.5)

G0= - 160kJ/mol sulfato (Eq. 3.6) G = - 85kJ/mol sulfato

A oxidao incompleta de compostos orgnicos distingue dois grupos fisiolgicos: os oxidantes completos e incompletos. Os oxidantes completos so capazes de mineralizar os compostos orgnicos at CO2, j o incompletos convertem a matria orgnica at acetato. Essas distines se referem a grupos fisiolgicos e no sistemticos (Martin et al., 2006). O metabolismo das BRS dependente da reduo de sulfato, e este processo inicia-se aps a entrada do sulfato endgeno no interior da clula. Uma vez dentro da clula a reduo do sulfato se d pela ao da ATP sulfurilase que combina o sulfato e ATP produzindo adenosina fosfossulfato (APS), bem como pirofosfato, que pode ser clivado posteriormente a fosfato inorgnico. O APS ento rapidamente convertido em sulfito (SO3-) pela enzima citoplasmtica APS redutase (Cypionka 1987, 1989). O sulfito pode ser reduzido sulfeto por diferentes sulfito redutases. Dentre as enzimas mais conhecidas esto bissulfito redutase, desulfoviridina e desulforubina (Lee e Peck 1971). Essas enzimas so semelhantes, porm, a desulfoviridina apresenta uma colorao vermelho fluorescente, e por essa razo utilizada em testes para diagnstico de Desulfovibrios (Postgate et al., 1984). Os intermedirios da reduo de sulfito a sulfeto so metabissulfito (S2O5-2), ditionito (S2O4-2), tritionato (S3O6-2) e tiossulfato (S2O3-2) (Gibson, 1990). Desde a descoberta da reduo dissimilatria do sulfato por BRS, elas tm sido descritas como micro-organismos anaerbios obrigatrios, e apenas atingindo a condio de anaerobiose seria possvel isolar essas bactrias (Postgate et al., 1984). Porm, alguns estudos tm mostrado que as BRS so capazes de sobreviver na presena de O2 (Sarti, 16

2007; Mongensen, 2005), podendo ser consideradas anaerbias tolerantes. A capacidade da respirao aerbica tem sido detectada em muitos gneros de sulfato-redutoras (Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfobacterium e Desulfococcus) (Dilling e Cypionka, 1990). A capacidade de sobreviver a longos perodos de exposio ao oxignio pode ser vista como uma adaptao para a disperso em novos ambientes. Como exemplo, pode ser citada a presena de BRS em gua de consumo, podendo sobreviver a aproximadamente 72 dias de aerao (Bade apud Barton e Hamilton, 2007). A presena de enzimas antioxidantes como superxido dismutase, NADH oxidase e catalase, tem sido reportada em muitas espcies de Desulfovibrio, e seriam as responsveis pela tolerncia ao O2 (Hatchikian apud Barton, 1995). O sulfeto de hidrognio o principal produto no processo de reduo dissimilativa de sulfato e este composto txico para muitos micro-organismos, at mesmo as BRS apresentam certa sensibilidade a ele. Espcies do gnero Desulfotomaculum so sensveis a concentraes de 4 a 7 M.L-1(Widdel e Pfennig, 1977; Klemps et al., 1985). A presena de H2S no meio pode funcionar como uma estratgia para eliminar outros grupos microbianos, fazendo com que as BRS prevaleam em determinado ambiente (Martin et al., 2006). O sulfeto de hidrognio ainda um forte agente redutor e pode reagir quimicamente com oxinions presentes em soluo, alm disso, o H2S produzido pelas BRS pode reduzir alguns metais (Cr(VI) Cr(III); SeO3-2 Se0) tornando-os menos txicos (Barton, 1995). Os gneros de BRS podem ser identificados levando-se em conta uma variedade de parmetros: oxidao de uma fonte de carbono especfica, formao de esporos, motilidade, colorao de Gram, morfologia, % mol de CG, tipo de flagelo, resistncia a antibitico e por fim as tcnicas de biologia molecular utilizando rRNA (Postgate et al., 1984; Madigan et al., 2004). O interesse biotecnolgico nas BRS est no fato de o sulfeto, produzido pelo metabolismo desses micro-organismos, ser capaz de se ligar ctions metlicos. Essa aplicao tem vantagens em relao s propriedades qumicas dos sulfetos metlicos (Lens et al., 2007). Os sulfetos metlicos, no geral, tm baixa solubilidade, portanto, eles podem ser precipitados e reutilizados. Algumas indstrias tm aplicado a imobilizao de metais atravs da formao de sulfetos metlicos aps a reduo de sulfato. De acordo com o sistema THIOPAQ (Paques), o processo de reduo de sulfato e oxidao do excesso de sulfeto foi desenvolvido para a remoo de metal pesado (Figura 3.5) O processo est em operao na Holanda para tratamento de efluente contendo Zinco. A reduo de sulfato 17

feita em um Reator tipo Gs-lift. O gs presente no reator, contendo principalmente H2 (76%), utilizado como doador de eltrons. O sulfeto de zinco que precipitado com a biomassa coletado e reutilizado. Mais de 95% de peso seco do lodo presente no reator sulfeto de zinco (Muyzer et al., 2008).

Figura 3.5. Esquema do processo de reduo de sulfato e imobilizao de zinco em sistema THIOPAQ (Paques). Extrado e adaptado de Muyzer et al. (2008).

Em alguns setores industriais a presena de BRS no desejvel. Um exemplo o setor petroqumico, onde a corroso da tubulao causada pelo H2S produzido pelas bactrias representa grandes prejuzos na produo (Silva de Arajo, 2002). As estratgias utilizadas para o controle da atividade das BRS incluem: (1) remoo do sulfato da gua utilizada na injeo da tubulao, (2) aplicao de biocidas, como glutaraldedo e diaminas, (3) exposio da gua a irradiaes de microondas e ultrasom. Portanto, de suma importncia o bom entendimento dos processos metablicos que envolvem esse grupo bacteriano bem como suas conseqncias e modificaes que realizam no ambiente em que vivem, para que a atividade das BRS seja favorecida ou no, dependendo do objetivo biotecnolgico. Os estudos e pesquisas realizados em escala 18

laboratorial devem ser considerados, a fim de darem suporte aplicao de sistemas em escala real que sejam viveis e tornem possveis as aplicaes alcanadas em laboratrio.

3.3.1 Relao DQO/sulfato

Muitas vezes, no processo biolgico de reduo de sulfato por BRS heterotrficas preciso disponibilizar matria orgnica, j que efluentes industriais normalmente apresentam baixa concentrao de substratos orgnicos. As fontes de carbono utilizadas no metabolismo do sulfato variam de acordo com o gnero das BRS, sendo os mais utilizados os sais de cidos graxos (acetato, propionato e butirato), sais de cidos com 3 e 4 carbonos (lactato, piruvato e malato), e alcois (metanol, etanol e propanol) (Gibson, 1990). Alm da natureza do substrato orgnico utilizado, a relao entre a concentrao de matria orgnica do meio - expressa pela Demanda Qumica de Oxignio (DQO) - e a concentrao inicial de sulfato no sistema, tambm um parmetro que indica a eficincia do processo no tratamento do efluente. A eficincia da atividade das BRS na remoo de sulfato est relacionada com a razo DQO/sulfato (Barbosa et al., 2009). Velasco et al. (2008) mostraram que a razo DQO/sulfato pode ser utilizada como um parmetro para o controle da produo de H2S e consequentemente para a precipitao de metais. O estudo utilizou etanol como fonte de carbono, e este foi incompletamente oxidado acetato pela cultura mista de BRS, em reator UASB. A concentrao mxima de sulfeto dissolvido foi obtida em razo DQO/sulfato de 2,5, com a converso de 94% de sulfato e 87% de etanol. J na razo DQO/sulfato de 0,67; que de acordo com a estequiometria seria o valor que garantiria a completa oxidao do etanol a CO2; foi obtido o menor valor de sulfeto dissolvido. El Bayoumy et al. (1999) avaliaram a concentrao do lactato, utilizado como fonte de carbono, em relao concentrao de sulfato em Reator Anaerbio Fixo de Fluxo Ascendente - UAFFR. A maior produo de sulfeto foi obtida utilizando uma razo DQO/sulfato entre 1,5 e 2,25. Outros parmetros tambm foram avaliados a fim de obter uma condio ideal de cultivo de BRS e consequente remoo de sulfato. A concentrao tima de nitrognio total e fsforo foi determinada em 250 e 50 mg.L1, respectivamente. Assim, foi possvel obter nesse trabalho a relao DQO:N:P de 100:5:1, como condio tima. Grandes concentraes de substrato orgnico parecem reduzir a eficincia do processo biolgico por favorecer a competio entre diferentes micro-organismos pelo 19

substrato disponvel (Choi e Rim, 1991). Em ambientes anaerbios que possuem um baixo valor de potencial redox, as BRS competem com outros micro-organismos anaerbios, como Bactrias Fermentadoras (BF), Acetognicas (BA) e Metanognicas (BM) (Barton, 1995). Essa competio se d pelos substratos comuns utilizados por esses grupos, principalmente H2 e Acetato. Chou et al. (2008) mostraram que a competio entre BRS e BM est relacionada com a relao DQO/sulfato. Utilizando acetato como substrato, os autores encontraram a razo 1,1 como sendo a mxima para prevalncia das BRS em consrcio com BM.

3.4 Interaes entre micro-organismos e os metais

Os micro-organismos so de fundamental importncia na ciclagem dos nutrientes em solos e em ambientes aquticos. A contaminao desses ambientes, seja por cargas poluidoras de origem industrial, agrcola ou domstica, pode inibir ou desfavorecer o crescimento microbiano, interferindo de forma drstica nas condies desses ambientes (Madigan et al., 2004). Os resduos industriais e domsticos podem conter altos teores de metais pesados. Esses metais, por sofrerem acmulo no ambiente, representam um enorme risco no s a sade humana, mas a todos os seres vivos. Muitos metais so essenciais para o metabolismo dos seres vivos, sendo utilizados em concentraes trao; quando absorvidos em alta quantidade, passam a exercer efeito txico nos organismos (Madigan et al., 2004). Os metais esto disponveis no ambiente em diferentes estados oxidativos, o que ser determinante para o nvel de toxidez em um organismo. A especiao de metais em ambientes de gua doce, assim como a sua concentrao, transporte, transformao e destino; controlada por fatores ambientais, como caractersticas biolgicas, qumicas e fsicas do ecossistema e as propriedades dos compostos com os quais os metais interagem (Gadd, 2004). O pH do ambiente tambm fator importante para o processo de ionizao de compostos e elementos especficos (Lizama et al., 2011). As bactrias possuem uma versatilidade muito grande no que diz respeito aos processos metablicos e os ambientes onde vivem. Esses micro-organismos so capazes de sobreviver em condies qumicas e fsicas extremas, sendo possvel encontr-los nos mais variados meios (Warren e Haak, 2001). Por serem capazes de utilizar outros compostos alm do O2 para o processo de respirao, as bactrias influenciam o comportamento de 20

elementos qumicos; como molculas orgnicas e os metais. Assim, elas podem ser consideradas como agentes primrios das mudanas geoqumicas, devido ao seu alto potencial metablico e grande capacidade de adaptao que lhe confere uma larga e abundante distribuio (Warren e Haak, 2001). Os micro-organismos podem influenciar ativamente na partio dos metais entre as fases slidas ou dissolvidas atravs do controle da formao ou dissoluo de minerais, (Nealson e Stahl, 1997, Gadd 2004). A superfcie das bactrias anloga superfcie dos minerais, no que diz respeito existncia de grupos funcionais que atraem espcies catinicas, como os metais (Fonseca, 2004). Ctions de metais podem se ligar a grupos sulfeto, por exemplo, presentes em aminocidos, causando a inibio de enzimas. Ou seja, podem exercer toxicidade interferindo em ons fisiolgicos: Cd2+ com Zn2+ ou Ca2+, Ni2+ e Co2+ com Fe2+, Zn2+ com Mg; inibindo a funo apropriada para um ction fisiolgico (Fonseca, 2004). Os processos biotecnolgicos que visam remoo de metais esto relacionados aos processos de mobilizao ou imobilizao dos mesmos. A mobilizao de metais pode ocorrer por protonao, quelao, metilao e transformao qumica, e visa a solubilizao do metal, podendo ser utilizada em matrizes slidas, como solos, sedimentos e resduos industriais. O processo de imobilizao retira o poluente da fase solvel para a fase insolvel e pode ocorrer por precipitao de compostos orgnicos ou inorgnicos; ou ainda, por soro, adsoro e absoro. As reaes redox podem mobilizar ou imobilizar metais, dependendo da espcie envolvida (Gadd, 2004). importante ressaltar que o emprego de micro-organismos na biorremediao de ambientes impactados por metais vivel e de suma importncia, porm, os metais dificilmente sero totalmente removidos do ambiente, contudo, transform-los em um estado de oxidao menos txico aos seres vivos, mobiliz-los, no caso de matrizes slidas ou imobiliz-los, representa avanos importantes para a recuperao de reas degradadas (Lizama et al., 2011) Como dito anteriormente, os metais representam um fator de estresse comunidade microbiana presente no ambiente impactado, e podem ainda, inibir completamente as atividades metablicas dos organismos. Para que esses microorganismos sejam capazes de sobreviver a ambientes com condies diferentes das ideais, muitos possuem mecanismos genticos que lhes garantem resistncia a componentes que podem causar estresse. Nesse sentido, algumas bactrias possuem genes especficos que possibilitam que essas sobrevivam em ambientes contendo altas concentraes de metais ou metalides, inclusive o arsnio (Liao et al., 2011). 21

Esses mecanismos de resistncia so muito importantes e podem ser determinantes no processo de sucesso que ocorre nos ambientes. Em bactrias, a alta resistncia ao arsnio relacionada com a presena do operon ars, este composto por trs a cinco genes (arsR, arsD, arsA, arsB e arsC), os quais esto localizados em plasmdeos (Owolabi e Rosen, 1990) ou no cromossomo (Diorio et al., 1995). Os genes arsR e arsD so reguladores, enquanto arsA e arsB so responsveis por formar um fluxo transmembrana que exporta As3+ do citoplasma, reduzindo sua concentrao intracelular (Mukhopadhyay et al., 2002). O gene arsC codifica a enzima As5+ redutase, que responsvel pela biotransformao de As5+ em As3+. Algumas bactrias tm seus mecanismos de oxidao do As3+ ou reduo do As5+ conhecidos, bem como a gerao de energia envolvida nesses processos (Liao et al., 2011). Nas bactrias que utilizam os ons arsenato no processo de respirao anaerbia, Bactrias Redutoras de Arsenato, o gene arr codifica a enzima As5+ redutase que reduz o As5+ a As3+. As Bactrias Oxidantes de Arsenito possuem o gene aox que codifica a enzima As3+ oxidase, responsvel pela oxidao do As3+ a As5+ (Livremont et al., 2009). Recentemente, outro gene que codifica uma As3+ oxidase foi identificado em Alkalilimnicola ehrlichii MLHE-1, um quimiolitoauttrofo que oxida arsenito e reduz nitrato simultaneamente (Zargar et al., 2010). Muitos estudos mostraram o sucesso no uso de marcadores genticos para o estudo dos mecanismos de transformao do arsnio, como; os genes arsB e arsC contidos no operon que garante a resistncia ao metalide (Achour et al., 2007), o gene arrA na respirao dissimilatria do As 5+ (Kulp et al., 2007) e o gene aoxB para oxidao do As 3+ (Hamamura et al., 2009). Compreender as relaes e os mecanismos bioqumicos relacionados aos organismos presentes em ambientes impactados de fundamental importncia para a manuteno e equilbrio desses ambientes, e ainda, tais estudos so necessrios para o avano biotecnolgico.

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4. Materiais e Mtodos 4.1 rea de coleta

Uma poro de sedimento foi coletada da margem da Lagoa do Gamb, em Ouro Preto-MG, a fim de obter a cultura mista a ser utilizada nos ensaios. A Lagoa do Gamb est localizada no centro de um loteamento na cidade de Ouro Preto, em Minas Gerais, a 20o4351.11 de latitude S e 43o300.63 de longitude O (figura 4.1). Esta lagoa recebe grande quantidade de esgoto residencial e do escoamento pluvial de reas perifricas. O sedimento foi analisado quanto concentrao de arsnio total por Espectrofotmetro de Emisso Atmica com Fonte Plasma, ICP-OES (Spectro / Modelo: Ciros CCD).

Figura 4.1. Vista da Lagoa do Gamb, Ouro Preto MG.

4.2 Enriquecimento das amostras

O sedimento foi enriquecido em meio de cultura lquido Postgate C modificado (Cheung e Gu, 2003) (tabela 4.1), em pH 7,0; 35C, a fim de obter a cultura mista de BRS (amostra intitulada LG). Como fonte de carbono foi utilizado o lactato de sdio. Em frascos de 50mL, 5mL de sedimento (10% v/v), foram adicionados a 45mL de meio lquido previamente esterilizado por calor mido em autoclave (120C; 1,5atm; 20min). Os frascos foram lacrados com tampa de borracha e anel de alumnio. Em seguida, 23

foram incubados em estufa microbiolgica, a 35C at a deteco do crescimento das culturas, evidenciado pela presena de precipitado negro, resultante da reao entre o sulfato ferroso e o sulfeto produzido biologicamente. As amostras foram repicadas por pelo menos trs vezes seguidas, a fim de obter uma cultura bem adaptada s condies de cultivo, antes da realizao dos ensaios. Tabela 4.1. Composio do meio de cultura utilizado para enriquecimento da cultura mista de BRS. Reagentes Lactato de sdio Citrato de sdio KH2PO4 NH4Cl Na2SO4 CaCl2 MgSO4.7H2O Extrato de levedura FeSO4.7H2O Tioglicolato de Sdio gar EDTA Quantidade (g.L-1) 0,8 0,3 0,5 1,0 4,5 0,06 2,0 0,1 0,5 0,5 0,5 0,3

4.3 Caracterizao do p de penas

O p de penas comercial utilizado como substrato orgnico foi gentilmente cedido por uma empresa de alimentos da regio (figura 4.2). Trata-se de uma mistura de penas e vsceras trituradas, acrescida de sangue cozido (Scapim et al., 2003). O material slido, pulverizado, constitudo basicamente por protenas estruturais e insolveis, principalmente queratina. O teor bruto de protenas do material em torno de 80%, sendo os teores de aminocidos, contendo grupamentos sulfeto em sua estrutura, de aproximadamente 0,67 e 3,68% para metionina e cistena, respectivamente (Scapim et al., 2003).

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Figura 4.2. P de penas comercial. Mistura de penas, vsceras trituradas e sangue cozido. O material foi separado quanto distribuio granulomtrica, sendo utilizada nos ensaios e nas anlises posteriores, apenas a poro com granulometria inferior a 0,71mm. Para a caracterizao da frao slida do p de penas foi avaliada a rea superficial e volume de microporos, utilizando a tcnica de BET do material in natura. Para a anlise qumica da frao solvel do material, o sobrenadante de uma suspenso aquosa contendo p de penas - 2% (p/v) foi preparada para as anlises posteriores. Essa suspenso foi esterilizada em autoclave (120C; 1,0atm; 20min) a fim de promover uma melhor solubilizao do material e mimetizar as condies observadas no preparo dos frascos para inculo. A suspenso autoclavada foi filtrada em membrana de celulose (0,45 m, Sartorius) e o filtrado foi analisado quanto a DQO (Demanda Qumica de Oxignio), DBO (Demanda Bioqumica de Oxignio) (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 1998), e ainda quanto aos teores de carbono orgnico total (TOC), realizada pelo mtodo persulfato em equipamento HiperTOC analyzer (Thermo Scientific). Foram tambm analisadas as concentraes de glicose, protenas e sulfato. A anlise de glicose foi realizada pelo mtodo enzimtico colorimtrico da glicose oxidase, utilizando-se o kit Laborlab. A concentrao de protenas solveis totais foi mensurada pelo mtodo colorimtrico. Ambas as anlises foram realizadas pelo Laboratrio de Anlises Clnicas, da Universidade Federal de Ouro Preto. A concentrao de sulfato foi obtida de acordo com a metodologia descrita por Kolmert et al. (2000). Foram analisados ainda os 25

elementos qumicos solveis presentes no filtrado, por meio de Espectrofotometria de Emisso Atmica com fonte Plasma (Spectro/Modelo Ciros CCD com Viso Radial). Ainda para caracterizao da frao solvel, o p de penas foi adicionado (2% p/v) ao meio de cultivo (Postgate C modificado) na presena do inculo obtido de acordo com o item 4.2. Aps 240 horas de incubao, a frao solvel do meio contendo o p de penas, mais o inculo foi filtrada em membrana de celulose 0,45 m (Sartorius) e avaliada quanto a concentrao de cidos orgnicos, que foi obtida utilizando Cromatografia de ons Metrohn; com coluna de cidos orgnicos de cadeia curta, com eluente H2SO4 0,001M. Utilizando essa anlise, possvel obter a concentrao dos cidos orgnicos ltico, actico, propinico, butrico, isovalrico e isobutrico; intermedirios ao processo de respirao anaerbia.

4.4 Avaliao do substrato orgnico na remoo de sulfato

Ensaios foram realizados a fim de verificar a relao entre o tipo de substrato orgnico utilizado para o cultivo das BRS e a atividade bacteriana, indicada pela remoo de sulfato. O p de penas foi testado como um possvel substrato orgnico utilizado para o cultivo de BRS. Dessa maneira, foram feitos testes contendo apenas o p de penas como matria orgnica (condio PP), p de penas acrescido lactato de sdio (condio PL) e apenas o lactato de sdio (condio L), visto que o lactato de sdio um substrato amplamente utilizado no cultivo de BRS. O consumo biolgico de sulfato foi demonstrado em termos de Eficincia de Remoo de Sulfato (ERS) que foi calculado como se segue: ERS = [(Sin Sf)/ Sin] x 100% Eq. 4.1

Onde Sin representa a concentrao de sulfato inicial, e Sf a concentrao de sulfato final.

4.4.1 Lactato como substrato orgnico

A cultura mista obtida de sedimento da Lagoa do Gamb, previamente enriquecida em meio de cultura Postgate C modificado, foi utilizada para os testes de remoo de sulfato utilizando apenas o lactato de sdio como substrato orgnico. Para este ensaio e os posteriores, o sulfato ferroso foi retirado da composio do meio de cultura, visto que a formao de um precipitado negro obtido atravs da reao com o sulfeto produzido

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biologicamente, poderia interferir nas anlises de densidade ptica e concentrao de sulfato. Para obter razes DQO/sulfato de 0,67; 1; 2 e 3, a concentrao de lactato foi calculada de acordo com a demanda qumica terica (DQO), que obtida a partir da sua estequiometria de oxidao, e o valor de sulfato total do meio de cultura foi fixado em 2g.L-1, como mostra a tabela 4.2. Tabela 4.2. Concentrao de lactato de sdio e sulfato total presente no meio de cultivo de acordo com as razes DQO/sulfato tericas determinadas. Razo DQO/sulfato 0,67 1,0 2,0 3,0 Lactato de sdio (g.L-1) 1,2 1,8 3,7 5,6 Sulfato total (g.L-1) 2,0 2,0 2,0 2,0

Frascos de vidro de 170mL de volume til, contendo 142,5mL de meio de cultura, em pH 7,0 e previamente esterilizados em autoclave (120C; 1,0atm; 20min) acrescidos de 7,5mL de inculo (5% v/v) foram utilizados para os ensaios em duplicata. Em condies semelhantes, foram utilizados dois frascos como controle, estes no continham o inculo. Os frascos eram lacrados com tampa de borracha. O ensaio teve tempo de durao de 240 horas, sendo que alquotas de aproximadamente 3mL eram retiradas, diariamente, para as anlises de crescimento microbiano (Densidade ptica), concentrao residual de sulfato, valor de pH e potencial de oxi-reduo (Eh).

4.4.2 P de penas como substrato orgnico

Para analisar a possvel utilizao do p de penas comercial como um substrato orgnico para o cultivo de BRS foram realizados ensaios avaliando a remoo de sulfato em meio de cultura Postgate C Modificado, com e sem lactato de sdio, e concentraes variveis de p de penas. Quando utilizado o lactato de sdio, a concentrao empregada foi de 1,2 g.L-1, que a menor concentrao utilizada nos ensaios do item anterior (4.4.1). Outro ensaio avaliou a remoo de sulfato tendo apenas o p de penas como fonte de matria orgnica.

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Frascos de vidro de 170mL contendo 142,5mL de meio de cultura Postgate C modificado, com e sem lactato, em pH 7,0 (previamente esterilizados em autoclave 120C; 1,0atm; 20min), 7,5 mL de inculo (5% v/v) e 1%, 2%, 3% ou 4% (p/v) de p de penas foram utilizados para os ensaios em duplicata. Como controle foram utilizados frascos nas mesmas condies (p de penas com e sem lactato), no inoculados. O controle tambm foi realizado em duplicata, e a concentrao de p de penas era de 2% (p/v). Todos os frascos eram lacrados com tampa de borracha. Os experimentos tiveram durao de 240 horas. Diariamente, uma alquota de aproximadamente 3mL era retirada para as anlises da concentrao de sulfato, Eh e pH. Nesses ensaios nos quais o p de penas foi adicionado, no foi possvel obter os valores de D.O, j que o p de penas em suspenso interferiria nesse tipo de anlise que leva em conta a turbidez do meio.

4.5 Relao entre substrato e remoo de As3+ 4.5.1 Enriquecimento da cultura mista de BRS contendo As3+
As culturas mistas obtidas para os ensaios de remoo de sulfato, contendo: (1) lactato de sdio; (2) lactato de sdio e p de penas; e (3) somente p de penas como substrato orgnico, foram adaptadas ao meio de cultura Postgate C modificado contendo As3+. Uma soluo estoque foi preparada utilizando NaAsO2, a concentrao de As3+ nessa soluo era de 1000mg.L-1. Depois de autoclavada (120C; 1,0atm; 20min), a soluo foi mantida estril e acondicionada em geladeira. A adaptao da cultura foi iniciada utilizando 0,5mL.L-1 de As3+. Aps o crescimento microbiano, evidenciado pela formao de precipitado de cor negra (devido precipitao de FeS), a cultura passou a ser cultivada em 1mg.L-1 de As3+. O mesmo procedimento foi repetido, dobrando-se a concentrao de As3+ a cada ciclo de trs repiques, at obter uma cultura capaz de crescer e remover sulfato em uma concentrao de 4mg.L-1 de As3+. Essas culturas adaptadas foram utilizadas para os testes de remoo biolgica de sulfato e As3+. Assim, foram testadas trs condies diferentes: lactato de sdio mais As3+ (condio LAs); lactato, p de penas e As3+ (condio PLAs) e p de penas mais As3+ (condio PPAs).

28

4.5.2 Lactato como substrato orgnico

A remoo de As3+ foi analisada em ensaios contendo o meio de cultura (Postgate C modificado) e inculo previamente adaptado em uma concentrao de 4mg.L-1 de As3+. As mesmas relaes DQO/sulfato utilizadas no item 4.4.1 foram tambm utilizadas nos testes de remoo de As3+. Ou seja, razes 0,67; 1; 2 e 3. Frascos de vidro de 600mL contendo 473mL de meio de cultura (Postgate C modificado), pH 7,0; previamente esterilizados em autoclave (120C; 1,0atm; 20min), 25mL (5%v/v) de inculo e 2,1mL da soluo estoque contendo As3+ foram utilizados para os ensaios em duplicata (figura 4.3). Os frascos eram lacrados com tampa de borracha. O ensaio teve tempo de durao de 240 horas, sendo que diariamente, uma alquota de aproximadamente 13mL era retirada para as anlises de crescimento microbiano, concentrao de sulfato, valor de pH, potencial de oxi-reduo (Eh) e concentrao de arsnio. Como controle foi utilizado um frasco preparado nas mesmas condies, porm, no inoculado.

Figura 4.3. Frascos de vidro (600mL) utilizados para os testes de remoo de sulfato e arsnio contendo apenas lactato como substrato orgnico.

4.5.3 P de penas como substrato orgnico

A cultura mista utilizada nos ensaios de remoo biolgica de sulfato, contendo o p de penas com e sem lactato de sdio, foi previamente adaptada em meio de cultivo (Postgate C modificado) contendo As3+ (4mg.L-1) para utilizao nos ensaios de remoo de As3+. 29

Dois ensaios diferentes foram realizados para avaliar a remoo de As 3+. No primeiro, foi utilizado apenas o p de penas como substrato orgnico (condio PPAs) em diferentes concentraes; no segundo, alm do p de penas, foi utilizado tambm o lactato de sdio (condio PLAs). Neste ltimo, a concentrao de lactato era fixa (1,2 g.L-1), variando-se apenas a concentrao do p de penas. Em ambos os ensaios foram utilizados frascos com volume til de 600mL onde eram adicionados 473mL de meio de cultura Postgate C modificado (pH 7,0), previamente autoclavado (120C; 1,0atm; 20min), 25mL de inculo; 2,1mL de soluo estoque contendo As3+ e concentraes variadas de p de penas: 1%, 2%, 3% ou 4% (p/v) (figura 4.4). Um frasco contendo o mesmo volume de meio de cultura (com 1,2g.L-1 de lactato), soluo estoque de As3+, 2% de p de penas (p/v), sem adio de inculo, foi utilizado para fins comparativos como controle. Os frascos foram lacrados com tampa de borracha. No tempo de 240 horas de cultivo, alquotas de 13mL eram retiradas a cada 24h para realizao das anlises de concentrao de sulfato, pH, Eh, e concentrao de As3+. Todos os testes foram realizados em duplicata.

Figura 4.4. Frascos de vidro (600mL) utilizados nos testes de remoo de sulfato e As3+ contendo p de penas. A figura 4.5 representa os ensaios realizados em batelada na presena e ausncia de As , e esquematiza as condies de cultivo utilizadas em relao ao substrato orgnico utilizado apresentado nos itens anteriores.
3+

30

Figura 4.5. Fluxograma representando os procedimentos experimentais. 31

4.6 Mtodos Analticos

Os parmetros avaliados durante os experimentos foram: valor de pH, potencial de oxi-reduo (Eh), concentrao de sulfato, concentrao de arsnio, e densidade tica (somente para o cultivo contendo lactato). O crescimento microbiano foi determinado pelo mtodo indireto baseado na medida da turbidez do meio. O aumento do nmero de clulas bacterianas durante o tempo foi estimado pela densidade ptica (D.O). A variao na absorbncia da amostra, analisada em comprimento de onda de 600nm, est relacionada com o aumento no nmero de clulas. Para a obteno da Densidade ptica foi coletada uma alquota de 2mL de amostra que foi analisada em um espectrofotmetro uv/vis (Micronal B582). A concentrao de sulfato foi estimada atravs do Mtodo Turbidimtrico (Kolmert et al., 2000). De acordo com esse mtodo, o sulfato presente em soluo precipitado atravs da adio de cloreto de brio na presena de soluo cida, assim, a concentrao de sulfato pode ser mensurada pela determinao da absorbncia em 420nm em espectrofotmetro uv/visvel (Micronal B582). Para a determinao da concentrao de sulfato no meio, 1mL de amostra era diluda em balo de 10mL, em seguida essa soluo era centrifugada em centrfuga (Thermo Multifuge X1R rotor FIBERLite F155-8x50cy, 10000rpm, 15 min). Do sobrenadante eram retirados 1mL e transferidos para um tubo cnico contendo o mesmo volume de soluo condicionante (tabela 4.3). Em seguida, o cloreto de brio, em excesso, era adicionado, sendo ento a soluo levada ao espectrofotmetro para leitura da absorbncia em 420nm. Tabela 1.3. Composio da soluo condicionante utilizada para anlise da concentrao de sulfato. Composio Cloreto de Sdio Glicerol cido Clordrico Etanol (95%) 150 g 126 g 60 mL 200 mL

gua destilada q.s.p 1000mL

32

As medidas de pH e Eh foram realizadas em um potenciostato digital DIGIMED, com eletrodo combinado de platina. Para a determinao da concentrao de As3+, era retirada uma alquota de 10mL de amostra a qual era centrifugada (Centrfuga Thermo Multifuge X1R; rotor FIBERLite F155-8x50cy; 10000rpm, 15min). Logo em seguida a amostra era filtrada em membrana de celulose 0,45m (Sartorius) e o filtrado acondicionado em frascos mbar com volume de 10mL, acrescidas de cido ntrico (50L) para preservao da amostra. A anlise da concentrao de A3+ foi realizada em Espectrofotmetro de Emisso Atmica com fonte Plasma (Spectro/Modelo Ciros CCD com Viso Radial), pelo laboratrio de Geoqumica Ambiental do Departamento de Geologia da UFOP. Utilizando-se esta tcnica era possvel determinar apenas a concentrao de arsnio total, porm, como era introduzido apenas o As3+ nos meios de cultivo, e, alm disso, os frascos eram mantidos em condies redutoras, foi admitido que a concentrao de arsnio total representava a concentrao de As3+.

4.7 Atividade metablica das BRS em condio semi-contnua

A atividade metablica da cultura mista contendo BRS, utilizada nos itens anteriores, foi avaliada em condio semi-contnua. Os mesmos parmetros analisados anteriormente, na condio de cultivo em batelada, foram avaliados: pH, Eh, concentrao de sulfato e As3+, em relao diferentes concentraes de substrato orgnico: lactato de sdio e p de penas. Para o emprego da condio semi-contnua, um reator foi construdo utilizando uma coluna de condensao, comumente utilizada em destiladores. A coluna com 80cm de altura e 4cm de dimetro possui dimenses internas de 60cm de altura e 2cm de dimetro (figura 4.6). A coluna interna continha o meio de cultura (Postgate C modificado) inoculado com a cultura obtida no item 4.2. Atravs da coluna externa era recirculada gua destilada em uma temperatura de 32C ( 2C) para manuteno da temperatura no interior do reator. A gua recirculante era mantida aquecida com a ajuda de um aquecedor de bancada (Fisatom) e a circulao da gua era garantida por uma bomba peristltica. Para a construo do reator, foi acoplada uma seringa de 10mL poro inferior e outra de mesmo volume poro superior da coluna de condensao, de modo que o volume til utilizado no reator (coluna interna) era de 120mL. Atravs das seringas era possvel alimentar o reator e retirar alquotas para a realizao das anlises de interesse. 33

Cerca de 10mL era introduzidos ao reator para a alimentao e o mesmo volume era retirado para a realizao das anlises rotineiras. A alimentao do reator era realizada na poro inferior, enquanto a retirada de alquotas para anlises se dava na poro superior, gerando assim, um fluxo ascendente do afluente.

Figura 4.6. Esquema (esquerda) e foto (direita) representando o reator semi-contnuo. O reator pode ser considerado semi-contnuo uma vez que a alimentao no ocorria de forma continuada, mas sim em ciclos, em dias alternados. Para a partida do reator, cerca de 120mL de meio Postgate C modificado foram previamente inoculados com a cultura de BRS e introduzido no reator. O meio de cultura continha p de penas (2% p/v) e lactato de sdio (1,2 g.L-1) como substrato orgnico. Durante 32 dias o reator foi mantido em fase de estabilizao, para proliferao da biomassa, sendo que nesse perodo a alimentao e retirada de alquota do reator ocorria a cada 7 dias. Decorrido o prazo de estabilizao, o reator passou a ser avaliado em dias alternados. No perodo de 35 a 67 dias de operao, o afluente sinttico (meio de cultura) sofreu acrscimo na concentrao de lactato para 5,6g.L-1, correspondendo ao valor 34

utilizado para a razo DQO/sulfato 3, porm, o p de penas deixou de ser introduzido nesse perodo. A partir do 70 dia de operao, houve o inicio de perda do p de penas que foi introduzido durante a fase de estabilizao do reator. Assim, no perodo de 70 a 93 dias de operao, foi introduzido meio contendo lactato (5,6g.L-1) acrescido de p de penas (2% p/v). A perda de p de penas ocorreu uma vez que este no estava imobilizado no interior do reator, e o prprio fluxo do afluente carreava o p de penas que era perdido quando se retirava alquotas do efluente. No 95 dia de operao, o meio introduzido no reator sofreu nova modificao, deixou de ser adicionado o p de penas e adicionou-se arsnio3+ (4mg.L-1). Desde o perodo de estabilizao do reator, o mesmo foi monitorado em relao ao valor de pH, Eh e concentrao de sulfato, que foi apresentada como Eficincia de Remoo de Sulfato (ERS), onde a concentrao de sulfato inicial do reator era subtrada concentrao final de sulfato de cada fase, definida na equao 4.1. A avaliao da concentrao de As3+ remanescente s foi iniciada no 113 dia de operao, j que a alimentao do reator era realizada em ciclos e no continuamente. A tabela 4.4 representa de forma resumida as condies de operao do reator. Todos os parmetros analisados no efluente do reator seguiram a metodologia descrita no item 4.6. Tabela 4.4. Condies de operao do reator semi-contnuo em relao aos dias de operao. Reator semi-contnuo Dias de Fase Operao Condio 1 1-32 Estabilizao. Meio contendo lactato (1,2g.L-1) e p de penas (2% p/v) 2 3 4 5 35-67 70-93 95-174 Meio contendo apenas lactato (5,6g.L-1) Meio contendo lactato (5,6g.L-1) e p de penas (2% p/v) Adio de As3+ (4mg.L-1). Meio contendo apenas lactato (5,6g.L-1)

176-202 Concentrao de As3+ de 8mg.L-1. Meio contendo lactato (5,6g.L-1)

35

5.

Resultados e discusso

5.1 Coleta e Enriquecimento das BRS

Barbosa (2009) realizou estudos com BRS coletadas tambm da Lagoa do Gamb, Ouro Preto (MG), obtendo remoes satisfatrias de sulfato e alguns metais pesados como nquel, cobre e mangans. Por este motivo, esse local foi escolhido para a coleta de sedimento que originaria o consrcio microbiano a ser utilizado no presente trabalho. O sedimento coletado na Lagoa do Gamb, e utilizado para o enriquecimento das culturas de BRS, foi avaliado quanto concentrao total de arsnio, no sendo encontrado tal metalide no sedimento. Assim, os micro-organismos presentes nesse ambiente no estavam previamente adaptados ao contato com o elemento. Ao realizar o enriquecimento da cultura, a presena de BRS pode ser indiretamente evidenciada pela formao de precipitado no meio. Esse precipitado de cor escura se deve formao de sulfeto de ferro (FeS) resultante da reao qumica entre o ferro presente no meio e o H2S produzido microbiologicamente. Com isso, o meio de cultura enegrecido foi usado como indicativo da presena de BRS. Antes de cada ensaio, as culturas foram adaptadas, atravs de sucessivos repiques, s condies testadas: presena de p de penas, presena de lactato de sdio e de arsnio trivalente. A figura 5.1 mostra frascos contendo cultura de BRS com a formao de precipitado negro de sulfeto de ferro, caracterstico do crescimento microbiano.

Figura 5.1. Amostra LG. Cultivo em meio lquido, a 35C, pH 7,0. Presena (esquerda) e ausncia (direita) de precipitao negro, caracterstico do crescimento de BRS.

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5.2 Caracterizao do p de penas

O p de penas utilizado nos ensaios de remoo de sulfato e As3+ foi caracterizado, objetivando avaliar seu potencial para uso como substrato orgnico para o cultivo de BRS bem como sua influncia no processo de imobilizao de As3+ solvel. A relao DQO/DBO indica o quanto o material seria biodegradvel. O valor obtido, 1,14 (tabela 5.1), aponta para a biodegradabilidade do material de acordo com dados tericos (Aziz e Tebbutt, 1980). Os compostos orgnicos presentes na frao lquida da suspenso, produzida de acordo com o item 4.3, e que estariam disponveis para serem usados no processo de respirao anaerbia pela cultura de BRS foram mensurados atravs da anlise de TOC, revelando uma concentrao de 2302mg.L-1 de carbono. Esses compostos orgnicos, muito provavelmente, so, em sua maioria, protenas, uma vez que o material analisado (p de penas) tem uma grande constituio protica (Scapim et al., 2003). A anlise da concentrao de protenas solveis e glicose foi realizada na mesma soluo utilizada para a anlise de TOC, apontando uma concentrao de 23mg.L-1 de protenas e 6mg.L-1 de glicose. Foi ainda avaliada a concentrao de sulfato solvel a partir da suspenso contendo o p de penas. O sulfato liberado por esse material poderia ser utilizado no processo metablico das BRS. Porm, a concentrao de sulfato obtida foi pequena, 84mg.L-1, e pode ser considerada insuficiente para suprir o sulfato necessrio para o cultivo de BRS, visto que os meios de cultura mais comumente utilizados contm concentraes bem maiores de sulfato, da ordem de 2 a 4 gramas (Postgate e Gal, 1973). Sendo assim, mesmo ao se utilizar o p de penas no cultivo de BRS necessrio a adio de sulfato ao meio. Os cidos orgnicos encontrados aps 240 horas de cultivo de BRS em meio contendo p de penas foram lactato e acetato, porm em concentraes muito baixas, apenas 12,5 e 4mg.L-1, respectivamente. A ausncia de cidos orgnicos como propinico, butrico, isovalrico e isobutrico, parece indicar que no houve uma utilizao significativa dos compostos orgnicos presentes no p de penas no processo de respirao pelas BRS.

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Tabela 5.1. Caracterizao fsico-qumica do p de penas quanto frao solvel e insolvel. Frao solvel Frao insolvel Granulometria Densidade rea superficial Volume de microporos rea de microporos <24 mesh (0,71mm) 1,242 g.cm-3 0,787 m2.g-1 0,00037 cm3.g-1 1,038 m2.g-1 Sulfato DBO DQO DQO/ DBO TOC Composio qumica (mg.L-1) 84 6661 7607 1,14 2302 Cobre Fsforo Potssio Magnsio Mangans 0,013 71,1 163 36,65 0,67 Ferro Enxofre total Silcio Zinco Clcio 0,47 340 3 0,94 15,6

Os principais elementos qumicos presentes em soluo aquosa contendo o p de penas esto listados na tabela 5.1. Apesar de a grande maioria estar presente em baixas concentraes, esses dados podem indicar que o p de penas poderia ser utilizado como uma fonte de nutrientes para o crescimento dos micro-organismos, uma vez que esto presentes elementos importantes aos processos metablicos, como: clcio, potssio, magnsio, fsforo e enxofre. Alm disso, o alto teor de enxofre presente no material pode influenciar positivamente na imobilizao de As, tal aspecto ser discutido posteriormente no item 5.3.5. Em relao frao slida do p de penas, esta foi analisada pela tcnica de BET, que fornece parmetros como rea superficial e volume de microporos do material. Esses parmetros so importantes para materiais que sero utilizados como adsorventes, uma vez que a relao entre a rea superficial do material e sua capacidade de adsoro so diretamente proporcionais enquanto o oposto ocorre com relao sua granulometria. A rea superficial obtida foi de 0,787 m2.g-1, e o volume de microporos observado foi de 0,00037 cm3.g-1 (tabela 5.1). Apesar de possuir uma rea superficial e volume de microporos bem inferior ao encontrado em outros materiais adsorventes, o p de penas pode ser utilizado como material adsorvente para a remoo de As3+, o que foi comprovado por Teixeira e Ciminelli (2005), que obtiveram remoes de cerca de 170 molAs/g biomassa.

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5.3 Relao entre o substrato orgnico e o metabolismo das BRS 5.3.1 Potencial de oxi-reduo (Eh) e pH
O valor do potencial de oxi-reduo (Eh) do meio de extrema importncia para o cultivo de BRS, uma vez que esse grupo microbiano requer um ambiente redutor para seu crescimento, o que significa valores de Eh em torno de -100 a -300mV (Postgate et al., 1984). A prpria produo de sulfeto gerada pelo metabolismo das BRS responsvel por manter baixo o Eh (Gibson, 1990), e esse, por sua vez, pode ser um bom indicativo da atividade metablica das BRS. Assim, o Eh tem a tendncia de diminuir com o passar do tempo, quando h a predominncia de BRS em um cultivo microbiano. A figura 5.2 mostra os valores de Eh obtidos durante os cultivos em que foram utilizados substratos orgnicos diferentes, na presena e ausncia de As3+. Tanto a utilizao de lactato quanto de p de penas, ou mesmo a mistura entre os dois, como substrato orgnico para o cultivo de BRS propiciou uma diminuio considervel do valor de Eh no meio. Indicando que ambos os substratos promovem um ambiente adequado ao crescimento desses micro-organismos em termos de condies redox. O mesmo efeito no foi observado para os frascos de controle abiticos. Assim, a diminuio do valor de Eh nas condies estudadas totalmente dependente do metabolismo das BRS.

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Figura 5.2. Valores de Eh em relao s diferentes condies avaliadas: A e B Lactato, C e D Lactato (1,2g.L-1) e p de penas (diferentes concentraes), E e F P de penas (diferentes concentraes). Ausncia (linha tracejada) e presena de As3+ (linha slida). Para A e B: razo DQO/sulfato 0,67; razo 1; razo 2; razo 3; linha preta: controle abitico. Para C, D, E e F: azul: 1% de p de penas, laranja: 2%, verde: 3%, vermelho: 4% e preto: controle abitico. No que diz respeito ao pH do meio de cultivo de BRS, sabido que esses microorganismos tem capacidade de crescer em uma ampla faixa de pH, porm os valores onde geralmente so obtidas as melhores remoes de sulfato so em valores prximos neutralidade (Postgate et al., 1984). Alm disso, Barbosa (2009) ao utilizar uma cultura mista contendo BRS, que foi proveniente do mesmo ambiente que a cultura utilizada pelo 40

presente trabalho (Lagoa do Gamb), encontrou remoes de sulfato mais satisfatrias ao se utilizar meio de cultura em pH neutro (7,0) do que em pH cido (5,5). Assim, foi utilizado o valor inicial de pH 7,0 nos ensaios; a fim de garantir um ambiente favorvel atividade metablica desses micro-organismos. A figura 5.3 apresenta os valores de pH obtidos, nas diferentes condies estudadas, em relao ao tempo de cultivo. Ambos os resultados, Eh e pH, foram obtidos partir das mdias das duplicatas. No decorrer dos ensaios, os valores de pH de todas as condies, apresentaram um decrscimo bem acentuado nas primeiras horas. Tal efeito foi mais marcante naquelas condies de cultivo que empregavam o p de penas de galinha como fonte de nutrientes e material suporte, a acidificao do meio diretamente proporcional massa de material slido empregado. Alm disso, este fenmeno parece depender da participao dos micro-organismos visto que a reduo de pH menor nos frascos controle. Os baixos valores de pH muito provavelmente esto relacionados ao processo de respirao celular, onde a metabolizao dos compostos orgnicos tem como produto intermedirio os cidos orgnicos de cadeia curta. Com o passar do tempo, entretanto, tais valores se aproximaram novamente do valor inicial, muito provavelmente, devido presena de ons bicarbonato gerados pela degradao biolgica do substrato orgnico (Kaksonen et al., 2003), como pode ser observado em todas as condies de cultivo, exceto para os frascos de controle abiticos. Ao se comparar as condies de cultivo estudadas, possvel perceber que a introduo de As3+ no sistema no foi prejudicial ao metabolismo das BRS, o que pode ser percebido pelos valores de pH e Eh que foram bem semelhantes tanto na presena quanto ausncia do metalide. Em relao s concentraes de substrato orgnico utilizado nos testes, a variao ocorrida nesses ensaios no foi suficiente para interferir de forma substancial o comportamento do pH e Eh do sistema.

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Figura 5.3. Valores de pH nas diferentes condies estudadas: A e B Lactato, C e D Lactato (1,2g.L-1) e p de penas, E e F P de penas. Ausncia (linha tracejada) e presena de As3+ (linha slida). Para A e B: razo DQO/sulfato 0,67; razo 1; razo 2; razo 3; linha preta: controle abitico. Para C,D,E e F: azul: 1% de p de penas, laranja: 2%, verde: 3%, vermelho: 4% e preto: controle abitico.

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5.3.2 Crescimento microbiano (Densidade ptica)

O acompanhamento dos valores de D.O ao longo do cultivo foi realizado apenas nos cultivos contendo somente o lactato de sdio como substrato orgnico. Como essa anlise depende da turbidez do meio, as amostras contendo p de penas tinham sua turbidez afetada pelas partculas do p em suspenso, havendo portanto, interferncias na anlise indireta do crescimento microbiano por meio da medida da turbidez do meio. Assim, foram comparadas as condies contendo o lactato na presena/ausncia de As3+. Atravs da figura 5.4 (mdias das duplicatas) possvel perceber que ambas as condies apresentaram valores mximos de produo de biomassa semelhantes, contudo, os picos relativos ao final da fase exponencial de crescimento apresentaram-se deslocados em funo do tempo. Na ausncia de As3+ a fase exponencial foi mais curta, sendo o crescimento microbiano mais acentuado que na presena do metaloide. No experimento que continha As3+ o crescimento microbiano mais lento indica que esse metaloide interfere no cultivo dos micro-organismos. Teclu et al. (2009) observaram comportamento semelhante; na presena de As3+ o crescimento celular das BRS foi ligeiramente afetado, ocorrendo um aumento na fase lag e um crescimento mais lento dos micro-organismos. Em relao s razes DQO/sulfato, ambas as condies apresentaram o mesmo comportamento, sendo a maior relao (razo 3,0) aquela na qual se que obteve maior crescimento microbiano. Diversos autores (Barbosa et al., 2009; Velasco et al., 2008; El Bayoumy et al., 1999) reportam a importncia da relao DQO/sulfato para o cultivo de BRS e como essa relao pode ser determinante para o processo de remoo de sulfato, uma vez que, ao se modificar esta relao, observa-se variao na densidade de clulas, principalmente em consrcios microbianos mistos. A relao DQO/sulfato importante para assegurar a prevalncia de BRS em um ambiente misto e varivel em relao ao consrcio utilizado, visto que culturas mistas contm diversidade e riqueza distintas de micro-organismos (Chou et al., 2008). O predomnio dos grupos microbianos determinado pela relao DQO/sulfato, se deve competio entre BRS e Bactrias Metanognicas pelos produtos intermedirios do metabolismo do substrato orgnico (lactato) como acetato e H2 (Oremland e Polcin, 1982).

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Figura 5.4. Densidade ptica em meio contendo lactato de sdio, na ausncia (A) e presena de As3+ (B). Azul razo 0,67; laranja 1; verde 2; vermelho 3 e preto controle abitico.

5.3.4 Consumo biolgico de sulfato

O consumo de sulfato foi relacionado ao tipo de substrato orgnico utilizado (lactato e/ou p de penas) e suas concentraes (razo DQO/sulfato ou porcentagem do p de penas). A razo DQO/sulfato terica, de 0,67 foi comparada com as razes 1,0; 2,0 e 3,0. A razo terica considerada ideal, porque nessa concentrao todo o substrato orgnico metabolizado pela clula a dixido de carbono (pelos micro-organismos capazes de realizar a oxidao completa da matria orgnica) via reduo dissimilativa de sulfato, de acordo com a equao 5.1: 2CH2O + SO42- H2S + 2HCO3-

(5.1)

Em relao ao cultivo contendo apenas lactato de sdio, ntida a influncia da razo DQO/sulfato em relao ao consumo de sulfato (tabela 5.2). Cada razo obteve um consumo distinto, sendo a razo terica a que promoveu a menor remoo de sulfato nas condies testadas. Alguns autores j mostraram que a razo DQO/sulfato considerada ideal (0,67) no a mais eficiente para o processo de remoo de sulfato (Cao et al., 2008; El Bayoumy et al., 1999). Alguns grupos de BRS no so capazes de consumir a matria orgnica completamente, ou seja, oxid-la a CO2, assim, a razo 0,67 no representaria de fato a concentrao de matria orgnica necessria para todo o consumo de sulfato. A maior razo (3,0) obteve o maior consumo de sulfato, tanto na presena, quanto na ausncia de As3+, sendo 84,3% e 56,2%, respectivamente. 44

A presena de metais pesados ou metalides em um cultivo microbiano so geralmente txicos para BRS porque so capazes de substituir ons essenciais que compem a estrutura celular e bloquear grupos funcionais de molculas importantes como enzimas, promovendo danos a integridade da membrana celular, desnaturao e inativao de enzimas celulares (Sani et al., 2001), assim, a presena desses compostos podem afetar a atividade metablica e, consequentemente, diminuir a eficincia de remoo de sulfato pelos micro-organismos (Martins et al., 2009; Cabrera et al., 2006). Um comportamento antagnico, contudo, foi observado nos testes de remoo de sulfato onde o lactato era utilizado como substrato orgnico. Nesses testes, como mostra a figura 5.5, a remoo de sulfato foi maior na presena do que na ausncia de As3+. Tal fato pode ser explicado pela diminuio da concentrao de sulfeto presente no sistema, visto que este composto, em altas concentraes, pode inibir o metabolismo das BRS (Madigan et al., 2004). O As3+ ao reagir com o sulfeto precipitado, diminuindo suas concentraes na frao solvel do meio, favorecendo a atividade metablica das BRS. Na ausncia do As3+ o sulfeto estaria presente em maior concentrao na frao solvel do meio do que na presena de As3+. Nas concentraes empregadas neste trabalho, o sulfeto solvel parece possuir maior efeito inibitrio sobre as BRS do que os ons arsenicais trivalentes. Outra hiptese para o maior consumo de sulfato na presena do As seria a presso seletiva exercida por esse composto durante o crescimento microbiano. Na presena do metaloide os micro-organismos ali presentes teriam a necessidade de estarem mais ativos metabolicamente para conseguirem vencer esse estresse em sua condio de cultivo. Assim, o consumo de sulfato consequentemente seria maior. Quando o lactato foi utilizado juntamente com o p de penas, sua concentrao era de 1,2g.L-1, essa era a menor concentrao utilizada nas razes DQO/sulfato analisadas, escolhida pelo fato de disponibilizar pequenas concentraes de matria orgnica para o metabolismo das BRS, forando assim, que esses micro-organismos metabolizassem a matria orgnica presente no p de penas. Nas condies onde o p de penas estava presente, a remoo de sulfato no sofre variao em relao concentrao do p de penas, ou seja, nas condies experimentais empregadas, pequenas variaes na concentrao desse material no so suficientes para que se observem alteraes no processo de remoo biolgica do sulfato. Esse comportamento foi percebido tanto na presena quanto na ausncia de As 3+. Ao contrrio do que foi observado na condio contendo apenas lactato (figura 5.5 A e B), nos frascos

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contendo alm do lactato, o p de penas (figura 5.5 C e D) a remoo de sulfato foi baixa e semelhante tanto na presena quanto na ausncia de As3+. Ao se utilizar apenas o p de penas como substrato orgnico (figura 5.5 E e F), a remoo de sulfato foi ainda menor, inferior a 20%, tanto na presena quanto na ausncia de As3+. O inculo utilizado nos ensaios, apesar de conter uma cultura mista de microorganismos, muito provavelmente contm poucos grupos microbianos alm das BRS, uma vez que a produo de sulfeto gerado pelo metabolismo das mesmas pode inibir o crescimento de outros grupos bacterianos (Gibson, 1990). Assim, a ausncia de grupos como bactrias fermentadoras e hidrolticas pode ter sido crucial para a disponibilizao de compostos orgnicos que pudessem ser utilizados no metabolismo das BRS. As BRS utilizam como fonte orgnica, em sua maioria, compostos orgnicos de cadeia curta, que podem ser gerados atravs da oxidao da matria orgnica por outros grupos microbianos (Muyzer et al., 2008). Ou seja, a matria orgnica presente na soluo contendo o p de penas pode ser complexa e a participao de outros grupos microbianos, alm das BRS, seria fundamental para a degradao dessa matria orgnica. Assim, possvel admitir que o p de penas, utilizado como fonte de matria orgnica nas condies aplicadas nesse trabalho, no suficiente como fonte exclusiva de matria orgnica para garantir o crescimento satisfatrio das BRS e o processo metablico de reduo e remoo de sulfato. Como evidenciado pela tabela 5.2, o p de penas um material interessante do ponto de vista nutricional para o cultivo de BRS, porm, sua utilizao como nica fonte de matria orgnica requer estudos mais aprofundados. Seu uso pode ser mais interessante se aliado a outros compostos orgnicos j conhecidos, como o lactato de sdio. O baixo custo ao se empregar um resduo como o p de penas representa interesse econmico. A economia alcanada substituindo-se parte da matria orgnica lquida (etanol ou lactato de sdio) usualmente empregada nos processos de tratamento de sulfato, por um material slido e de baixo custo pode ser interessante para o setor industrial.

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Figura 5.5. Consumo biolgico de sulfato em relao s diferentes condies estudadas: A e B - Lactato, C e D Lactato e p de penas, E e F P de penas. Ausncia (linha tracejada) e presena de As3+ (linha contnua). Para A e B: razo DQO/sulfato 0,67; razo 1; razo 2; razo 3; linha preta: controle abitico. Para C,D,E e F: azul: 1% de p de penas, laranja: 2%, verde: 3%, vermelho: 4% e preto: controle abitico.

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Tabela 5.2. Remoo biolgica de sulfato e As3+ por BRS em relao ao tipo de substrato orgnico e sua concentrao inicial. *ERS: Eficincia da Remoo de Sulfato Cultivos sem Arsnio Sulfato consumido ERS* (mg.L-1) (%) Condio L - Lactato Razo 0,67 343 16,5 Razo 1 548 24,7 Razo 2 862 39,7 Razo 3 1267 56,2 Condio PL P de Penas + Lactato 1% 2% 3% 4% 582 24,5 941 37,2 928 36 854 34 Condio PP P de Penas 141 172 423 361 6,8 8,2 20 17,1 Controle Razo 0,67 Razo 1 Razo 2 Razo 3 Controle 1% 2% 3% 4% Controle 1% 2% 3% 4% Cultivos com Arsnio Sulfato consumido (mg.L-1) ERS* (%) As removido (mg.L-1) As removido (%) 3,5 38 49,1 87,4 86,2 5,5 91,7 87,3 80 70,3 4,2 76,3 72,9 73,6 85

1% 2% 3% 4%

Condio LAs - Lactato + As3+ 23 1,1 0,147 29 1,3 1,69 102 4,4 1,90 1444 63,7 3,55 1911 84,3 3,54 Condio PLAs - Lactato + P de Penas + As3+ 72 3,2 0,182 327 15,9 3,80 647 29,4 3,53 612 27,2 3,45 559 27,0 3,11 3+ Condio PPAs P de Penas + As 12 0,3 0,184 208 8,9 3,21 141 6,8 3,15 298 10,9 3,34 397 13,4 3,55

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5.3.5 Imobilizao de As3+

O As3+ um metalide considerado txico para diversos organismos, e dependendo de sua concentrao no meio, ele pode ser fator determinante para a inibio do metabolismo de micro-organismos (Lizama et al, 2011). A concentrao analisada nesse estudo de 4mg.L-1 parece ser insuficiente para inibir a atividade metablica das BRS. O cultivo de BRS empregado parece ser tolerante presena do metalide nessa concentrao, uma vez que no houve prejuzos ao processo de reduo do sulfato sulfeto, processo este dependente da atividade metablica das BRS. Para tratamentos biolgicos que visem remoo de metalides como o As3+, de suma importncia que os micro-organismos envolvidos no processo sejam capazes de, no somente tolerar sua presena, mas tambm, de permanecerem metabolicamente ativos. Sendo assim, necessria, para qualquer tipo de tratamento onde sero utilizados organismos vivos, uma etapa de adaptao dos mesmos s condies a que sero submetidos posteriormente. Na condio LAs as maiores remoes de As3+ estavam relacionadas s maiores remoes de sulfato e consequentemente s maiores razes DQO/sulfato. Nessa condio possvel perceber que quanto maior a remoo de sulfato, ou seja, produo de sulfeto, maior a remoo de As3+. Possivelmente nessa condio a remoo de As3+ estava associada formao de sulfetos arsenicais insolveis, resultantes da interao com o sulfeto biognico produzido pelas BRS. Conforme demonstrado na tabela 5.2, nas condies PLAs e PPAs, a remoo de sulfato no foi fortemente influenciada pela concentrao de p de penas, e a remoo de As3+ foi bem semelhante em todas as concentraes de p de penas avaliadas. Por outro lado, quando se comparam as remoes de As obtidas na condio LAs (razo DQO/sulfato 0,67) com aquelas obtidas nas condies PLAs observa-se que a remoo de sulfato aumentou consideravelmente de 38% para aproximadamente 80%. A utilizao do p de penas nos cultivos contendo BRS no representou melhorias em relao reduo do sulfato (tabela 5.2), porm, foi determinante para a imobilizao do As3+. A concentrao de As removido apresentado pela tabela 5.2 foi calculado partir da concentrao inicial, menos a concentrao final, presente no meio lquido de cultivo. A figura 5.6 mostra a remoo de As3+ em relao ao consumo biolgico de sulfato. Esse perfil mostrado apenas para as condies: LAs razo 3; condio PLAs 4% e condio PPAs 4%. Nas condies PPAs e PLAs, a concentrao de sulfato quase 49

no se altera ao longo do tempo de cultivo, enquanto que a concentrao de As3+ bastante diminuda, principalmente nas primeiras horas de cultivo. Nessas condies, possvel que outro mecanismo de imobilizao do As3+ esteja presente, ao invs da precipitao como sulfeto metlico. Na condio LAs possvel observar que medida que houve a remoo de sulfato, o As3+ tambm teve sua concentrao diminuda, sendo esses dois processos, portanto, relacionados. A menor concentrao de As3+ presente em soluo foi obtida nas ltimas horas de ensaio, quando foram obtidas as menores concentraes de sulfato. A remoo de As3+ ocorreu de forma gradual na condio LAs, contudo o mesmo comportamento no ocorreu nas outras condies. Esses resultados indicam que, possivelmente, o processo de remoo de As3+ tenha ocorrido de forma distinta nas diferentes condies estudadas.

Figura 5.6. Remoo de arsnio em relao ao consumo de sulfato nas diferentes condies de cultivo, A: lactato (razo 3) e As3+; B: lactato (1,2 g.L-1), p de penas (4%) e As3+; C: p de penas (4%) e As3+. 50

Nos ensaios que visavam avaliar a remoo do As3+, foram utilizados frascos controles, cultivados em condies semelhantes, porm sem a adio de inculo (BRS). Os testes controles apresentaram remoo de As3+ insignificante em todas as condies (tabela 5.2), se comparada s remoes obtidas quando na presena de BRS, fato este que evidencia a importncia dessas bactrias para o processo de imobilizao de As3+. Todavia, a figura 5.6 mostra claramente que o processo de imobilizao de As3+ no est diretamente relacionado com a remoo de sulfato. Assim, possivelmente os processos envolvidos na imobilizao do As3+ na presena do p de penas sejam a precipitao como sulfeto metlico; e a adsoro na superfcie do material. O p de penas foi testado pela primeira vez por Teixeira e Ciminelli (2005), como um material biossorvente para o As3+. A eficincia e a seletividade do material foram comprovadas, com capacidade mxima de 170 molAs3+/g biomassa, em pH 5,5. A baixa remoo de As3+ nos testes controle pode estar associada ao potencial redox do meio. Teixeira e Ciminelli (2005) mostraram ser necessrio o tratamento prvio do p de penas com agentes redutores, para que as interaes entre os grupos sulfidrila, presentes na superfcie do p de penas, e o As3+ ocorressem. Esse tratamento no foi realizado durante os testes desse trabalho, j que o prprio metabolismo das BRS forneceria o agente redutor necessrio - o sulfeto. Quando utilizado o inculo juntamente com o p de penas, a remoo de As3+ bem superior que quando utilizado o p de penas sem inculo (controle). Esse fato permite admitir que a maior parte da imobilizao do As3+ obtida nas condies PPAs e PLAs devida ao processo de adsoro ocorrido na superfcie do p de penas e no atravs de precipitao como sulfeto metlico. Outro fato que vem corroborar com esta hiptese o fato de que os processos de adsoro geralmente ocorrem de maneira rpida, sendo a superfcie do material adsorvente saturada nas primeiras horas de contato com o adsorvato (Mantell, 1951). Esse perfil foi observado neste trabalho, nas condies PPAs e PLAs (figura 5.6), indicando mais uma vez a ocorrncia de tal fenmeno. A literatura aponta que as melhores remoes de As3+ quando associado presena de enxofre, ocorrem em condies com baixos valores de pH, em torno de 2 e 5,5 (Lizama et al, 2011; Battaglia-Brunet et al, 2009, Teixeira e Ciminelli, 2005). Porm esses valores de pH no so ideais para o cultivo de BRS, sendo que nessas condies, a grande maioria dos gneros de BRS tem sua atividade metablica diminuda (Battaglia-Brunet et al, 2009; Gibson, 1990). O presente trabalho utilizou um valor de pH inicial de 7,0; por ser esse um valor adequado para garantir a atividade metablica das BRS. Assim, as condies 51

de cultivo utilizadas neste trabalho no foram as ideais, em termos de pH, no que diz respeito ao processo de imobilizao de As3+, apesar de ainda ter sido possvel obter remoes bem satisfatrias do metalide. A adaptao das BRS em condies moderadamente acidfilas, em pH em torno de 5,5 por exemplo, poderiam resultar em remoes de As3+ mais satisfatrias. O aumento considervel na remoo de As3+ observado nas condies em que h a presena de p de penas (PPAs e PLAs), se comparado ao obtido na condio que no h a presena desse material (condio L), revela que o material em questo exerce influncia na remoo do metalide. Uma vez que a produo de sulfeto bastante pequena nas condies PPAs e PLAs, possvel dizer que outro processo de imobilizao do As3+ esteja ocorrendo simultaneamente com a precipitao, nessas condies. Os testes realizados no presente trabalho indicam que, possivelmente, a imobilizao do As3+ ocorreu por precipitao qumica, ao reagir com o sulfeto, e por adsoro na superfcie do p de penas.

5.4 Atividade Metablica das BRS em condio semi-contnua 5.4.1 Avaliao do potencial de oxi-reduo (Eh) e pH do meio
A estabilizao do reator foi realizada utilizando o meio de cultura contendo lactato e p de penas como substrato orgnico, e o inculo obtido no item 4.2, previamente adaptado a uma concentrao de 4mg.L-1 de As3+. Durante aproximadamente 32 dias o reator foi alimentado e houve a retirada de amostra a cada 7 dias. Durante as duas primeiras fases de operao do reator (aproximadamente 60 dias), tanto os valores de pH quanto de Eh oscilaram com frequncia, durante esse perodo havia a aclimatizao da biomassa, e o sistema ainda no havia alcanado a estabilidade. A figura 5.7 mostra a relao entre o pH e o Eh obtido durante a operao do reator. Aps a segunda fase, depois do 67 dia de operao, os valores de pH e Eh tornaram-se mais constantes. Desde o incio dessa fase o Eh permaneceu baixo (em torno de -300 mV) indicativo de ambiente propcio ao crescimento das BRS. Um ambiente redutor se deve, provavelmente, produo de sulfeto gerada pelo metabolismo das BRS (Gibson, 1990; Madigan et al., 2004). Por outro lado o pH continuou oscilante, mesmo na segunda fase de operao, variando entre 7,6 e 8,6, esses valores ligeiramente alcalinos, provavelmente se devem produo de bicarbonato gerado pela degradao do substrato 52

orgnico pelas BRS (Kaksonen et al., 2003). Tais valores, contudo, encontram-se dentro do esperado e de acordo com a legislao brasileira para lanamento de efluentes. Durantes as fases 4 e 5, nas quais havia a presena de 4 e 8mg.L-1 de As3+, respectivamente, os valores de Eh e pH no sofreram alteraes, permanecendo com o mesmo comportamento obtido nas fases anteriores; indicando que a presena do metalide, nessas concentraes, no estaria inibindo a atividade metablicas das BRS presentes no reator semi-contnuo.

Figura 5.7. Relao entre os valores de pH e Eh ao longo da operao do reator semicontnuo, nas diferentes condies estudadas.

5.4.2 Consumo de sulfato

Na fase de estabilizao o consumo biolgico de sulfato foi bem moderado, devido aclimatizao da biomassa no interior do reator e provavelmente devido baixa disponibilidade de matria orgnica, uma vez que a concentrao de lactato empregada foi de apenas 1,2g.L-1. Na condio em batelada, essa concentrao de lactato juntamente com o p de penas (condio PL) no promoveu remoes de sulfato muito satisfatrias. Assim, na segunda fase de operao do reator, o meio de cultura passou a conter a maior concentrao de lactato testada em batelada, 5,6g.L-1, porm, sem introduo de p de

53

penas. Considerando-se a lenta dissoluo do material slido, o reator continha ainda o p de penas remanescente da primeira fase de operao. A tabela 5.3 mostra as porcentagens de remoo de sulfato nas diferentes fases de operao do reator. Para clculo da porcentagem foi considerada a concentrao de sulfato ao final de cada fase em relao concentrao de sulfato inicial do reator. Assim, na segunda fase de operao a concentrao de sulfato teve um decrscimo mais acentuado que na primeira fase, sendo removido em torno de 56,1% ao final dessa fase, no 67 dia de operao. A partir do 70 dia de operao a alimentao ocorreu com meio contendo alm do lactato (5,6g.L-1), 2% (p/v) de p de penas. Ao longo dessa fase a remoo biolgica de sulfato foi ainda mais acentuada, em torno de 78,8 %. O aumento do consumo de sulfato alcanado nessa fase evidencia a importncia da concentrao do substrato orgnico fornecido para o metabolismo das BRS alm de mostrar a melhora no processo de remoo de sulfato ao se introduzir o p de penas. A reintroduo de p de penas no reator foi necessria pelo fato de ter ocorrido perda desse material como consequncia das retiradas de alquotas. Como o reator encontrava-se em fluxo ascendente de alimentao, o prprio fluxo carreava o material, que era perdido. Durante a montagem do reator no foi introduzido nenhum dispositivo que pudesse reter o p de penas em seu interior, e ao longo do seu funcionamento foi percebido a importncia deste. Uma alternativa seria a utilizao de uma barreira fsica no interior do reator para a reteno do p de penas, o que provavelmente aumentaria tambm a reteno celular, podendo aumentar a eficincia do reator (Silva et al., 2006; Ory et al., 2004). Tabela 5.3. Eficincia na remoo de sulfato nas diferentes fases de operao do reator semi-contnuo. Reator semi-contnuo Sulfato inicial Sulfato final Fase (mg.L-1) (mg.L-1) 1 1902 1702 2 1902 835 3 1902 403 4 1902 296 5 1902 3409 *ERS: Eficincia na Remoo de Sulfato.

ERS* (mg.L-1) 200 1067 1499 1606 -

ERS* (%) 10,5 56,1 78,8 84,4 -

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Os testes realizados em condio semi-contnua permitem uma comparao com os dados obtidos na condio em batelada, realizada anteriormente. No reator no h a presena de head space, presente nos frascos em batelada, portanto, o experimento semicontnua oferece uma condio de anaerobiose mais adequada que aquela obtida em batelada. Esse fato pode ter influenciado positivamente o processo de remoo de sulfato e explica os maiores consumos de sulfato observados durante a operao do reator se comparado aos testes em batelada. A partir do 95 dia de operao, foi iniciada a introduo de As3+ (4mg.L-1) ao meio de cultivo do reator. Nessa fase, o meio de cultura empregado no continha p de penas, devido capacidade deste material em adsorver As3+ (Teixeira e Ciminelli, 2005). O p de penas deixou de ser utilizado nessa fase para que no houvesse uma remoo de As3+ antes mesmo da entrada do meio no reator, o que afetaria a avaliao de remoo do metalide ocorrida no interior do reator. Durante os perodos de 113 a 134 dias de operao, a concentrao de sulfato no efluente do reator foi ligeiramente mais alta que nos dias anteriores, o que pode ser explicado pela presena do metalide. Durante esse curto perodo os micro-organismos ali presentes estavam se adaptando nova condio com a presena do As3+ (figura 5.8). Aps esse perodo a concentrao de sulfato voltou a diminuir, sendo bem prxima encontrada na fase de operao anterior, que no continha As3+. No sistema semi-contnuo a presena de As3+ na concentrao de 4mg.L-1 aparentemente, no alterou o metabolismo do consrcio microbiano presente no reator. O que difere da condio em batelada, visto que nessa condio, a presena de As3+ aumentou consideravelmente a eficincia de remoo do sulfato. Contudo, com a introduo de 8mg.L-1 de As3+ no reator, fase 5, a concentrao de sulfato aumentou abruptamente, indicando que a atividade metablica das BRS foi comprometida (figura 5.8). Em contrapartida, os valores de Eh e pH obtidos durante essa fase, no sofreram grandes alteraes. Ainda assim, parece que essa concentrao de As3+ pode ser considerada prejudicial ao metabolismo do consrcio microbiano empregado. necessria uma maior observao sobre a influncia do As3+ nessa concentrao no processo de remoo de sulfato, possivelmente depois de alguns dias de operao, os valores de sulfato voltem a cair, indicando um restabelecimento da atividade microbiana no reator, tal qual ocorreu durante a fase 4, com a concentrao de As3+ de 4mg.L-1. Ao longo das fases de introduo de As3+ no reator houve a perda de p de penas ao longo da retirada de amostra, portanto a influncia desse material ficou comprometida nessas fases (4 e 5). 55

Figura 5.8. Relao entre a concentrao de sulfato e os valores de Eh no efluente do reator semi-contnuo nas diferentes condies analisadas.

5.4.3 Imobilizao do As3+

Do 95 at o 174 dia de operao (fase 4), o reator foi alimentado com o efluente sinttico contendo As3+, inicialmente a concentrao do metalide era de 4mg.L-1, ocorrendo uma remoo de aproximadamente 98% durante essa fase de operao, com concentrao de As residual de 0,073mg.L-1. Do 176 ao 202 a concentrao de As introduzida no reator passou a ser de 8mg.L-1, e durante essa fase (5 fase) a remoo de As tambm foi da ordem de 98%, sendo o menor valor de As obtido no efluente de 0,062mg.L-1, no ultimo dia de operao da 5 fase. A figura 5.9 mostra a relao entre a remoo de As3+ e a concentrao de sulfato no reator durante as fases 4 e 5. Devido ao carater semi-contnuo do reator, onde no havia mistura completa do meio em seu interior (meio estratificado), a presena do metaloide no detectada imediatamente sua adio, mas sim aps algumas coletas (figura 5.9). Alm disso, no foi possvel indicar a concentrao de As3+ no efluente do reator em todos os dias de coleta, visto que a metodologia utilizada para a anlise do As3+ (item 4.6) era capaz de detectar somente concentraes maiores que 0,0408mg.L-1 e alguns pontos encontravam-se fora do limite de deteco, provavelmente abaixo do valor mnimo detectvel. Sendo assim, pode-se considerar que quase todo o As presente foi removido da fase lquida. Esses pontos no

56

foram representados na figura 5.9, e a ausncia desses dados limita as discusses sobre os mecanismos de remoo de As3+ no reator. Diferentemente da condio batelada, na condio semi-contnua no possvel diferenciar claramente os processos de remoo de As por precipitao qumica na forma de sulfeto ou adsoro na superfcie do p de penas. Nessa fase a concentrao de p de penas no reator era bem pequena, visto que esse material estava sendo carreado juntamente com o efluente retirado do reator, portanto, provvel que a maior porcentagem da remoo de As3+ tenha ocorrido por precipitao qumica, entre o sulfeto e o As3+. De todo modo, as condies oferecidas pelo reator semi-contnuo, (pH, Eh, anaerobiose, substratos orgnicos) foram eficazes no processo de imobilizao do As3+, sendo este quase que completamente removido do sistema. O reator continua em operao e maiores concentraes de As3+ sero gradativamente adicionadas ao sistema, o que pode revelar mais detalhes sobre o processo de imobilizao do metalide ocorrido nesse sistema especfico.

Figura 5.9. Relao entre a remoo de As3+ e concentrao de sulfato durante as fases 4 e 5 de operao do reator semi-contnuo.

57

6.

Concluses
Os resultados obtidos no presente trabalho, que relacionam o metabolismo

microbiano das BRS ao uso de diferentes substratos orgnicos em diferentes concentraes, indicam que o p de penas um material de interesse biotecnolgico e econmico para o cultivo de BRS, oferecendo nutrientes importantes ao metabolismo dos mesmos. A adio de p de penas ao meio de cultivo contendo pequenas concentraes de lactato de sdio aumentou significativamente a reduo de sulfato pelas BRS. Ao se utilizar, contudo, exclusivamente o p de penas como substrato orgnico, os mesmos resultados no foram observados. Assim, o p de penas pode ser utilizado no cultivo de BRS, porm, sua utilizao concomitante a de outro substrato orgnico, como o lactato, seria mais interessante do ponto de vista da eficincia do processo. Ao utilizar-se exclusivamente o lactato de sdio como fonte de matria orgnica, observou-se que a remoo de As3+ foi diretamente proporcional remoo de sulfato (produo de sulfeto), indicando que o metalide fora removido por precipitao, como sulfeto metlico. Todavia, na presena do p de penas, a remoo de As3+ independe da reduo de sulfato e ocorreu, em maior parte, devido adsoro do mesmo na superfcie do material. A adio do p de penas aumentou significativamente as porcentagens de remoo de As3+, sendo que pequenas variaes na sua concentrao no foram suficientes para interferir nas remoes de As3+. O p de penas representa, portanto, um interessante material no processo de imobilizao biolgica do As3+ em pH neutro, ou prximo da neutralidade, em condies redutoras. Os parmetros analisados em sistema batelada ao serem comparados com o sistema semi-contnuo mostraram que comportamentos semelhantes ocorreram em ambas condies, indicando a possibilidade de extrapolar os dados aqui trabalhados para uma condio mais prtica, como a construo de reatores em maior escala que possam tratar volumes maiores de efluente com maiores teores de arsnio. Dados como esses so de extrema importncia para difundir os conhecimentos gerados dentro da academia deixando-os ao alcance de toda a sociedade, principalmente do setor minero-metalrgico, grande interessado nos tratamentos de efluentes ricos em sulfato e metais.

58

7.

Sugestes para trabalhos futuros

O presente trabalho foi importante para o incio de uma discusso cientfica para o

uso de um resduo industrial ainda pouco explorado, o p comercial de penas de galinha. Como visto anteriormente, esse material representa um potencial biotecnolgico e econmico na utilizao de tratamento de efluentes contendo sulfato e arsnio. Assim, algumas propostas de trabalho so sugeridas como: Avaliar mais detalhadamente os componentes do p de penas, tanto da frao slida quanto solvel. Investigar mais detalhadamente a capacidade de adsoro do As3+ pelo p de penas na presena de BRS, atravs de isotermas de adsoro. Alm de testar a possibilidade de adsorver outros metais ou poluentes. Investigar a imobilizao de As3+ em maiores concentraes. Adaptar consrcios microbianos contendo BRS em condies moderadamente acidfilas, e avaliar a remoo de As3+ por esses micro-organismos. Associar o p de penas a outros substratos orgnicos e avaliar a remoo de sulfato por BRS. Utilizar reator de fluxo contnuo inoculado com BRS e acrescido de p de penas para a remoo de sulfato e As3+ em maior escala. Alm disso, otimizar as condies de operao do reator avaliando diferentes mtodos para reteno da biomassa e do p de penas. Identificar os micro-organismos presentes no consrcio microbiano.

59

8.

Produo cientfica

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60

9.

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