3.2 MICROSCOPA PTICA Historia del Microscopio ptico (M.O.

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1608 Z. Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes. 1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto. 1665 Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeos poros en forma de caja a los que l llam "clulas". Publica su libro Micrographia 1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observar bacterias por primera vez 9 aos despus. 1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada. 1849 J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio. 1838 Schleiden y Schwann proponen la teora de la clula y declaran que la clula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales. 1876 Abb analiza los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el microscopio y muestra cmo perfeccionar el diseo del microscopio. 1881 Retzius describe gran nmero de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningn otro microscopista de luz. En las siguientes dos dcadas l, Cajal y otros histlogos desarrollan nuevos mtodos de tincin y ponen los fundamentos de la anatoma microscpica.

1886 Zeiss fabrica una serie de lentes, diseo de Abb que permiten al microscopista resolver estructuras en los lmites tericos de la luz visible. 1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia. 1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia. 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases. 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, fsicos alemanes, construyen el primer microscopio electrnico. 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz. 1981 Aparece el microscopio de efecto tnel (MET).

El microscopio compuesto El diagrama siguiente muestra un microscopio compuesto. En su forma ms simple, como la que utiliz Robert Hooke, tiene una sola lente de cristal de distancia focal corta para el objetivo, y otra nica lente de cristal para el ocular.

ocular revlver objetivo mecanismo enfoque de

tornillo de enfoque fino platina espejo condensador

Principales elementos de un microscopio bsico

Los microscopios de este tipo suelen ser ms complejos, con varias lentes en el objetivo como en el ocular. El objetivo de stas lentes es el de reducir la aberracin cromtica y la aberracin esfrica. En los microscopios modernos el espejo se sustituye por una lmpara que ofrece una iluminacin estable y controlable. Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar especmenes delgados, puesto que su profundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lmina muy fina del

material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra desde abajo y usualmente son necesarias tcnicas especiales para aumentar el contraste de la imagen. La resolucin de los microscopios pticos est restringida por un fenmeno llamado difraccin que, dependiendo de la apertura numrica (AN o AN) del sistema ptico y la longitud de onda de la luz utilizada (), establece un lmite definido ( d) a la resolucin ptica. Suponiendo que las aberraciones pticas fueran despreciables, la resolucin sera:

Normalmente, se supone una de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire, la AN prctica mxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5. Ello implica que incluso el mejor microscopio ptico est limitado a una resolucin de unos 0,2 micrmetros. Poder separador, objetivos de inmersin y aumento til. Poder separador De la teora de la difraccin sobre la formacin de imgenes mediante un microscopio se tiene que la distancia mnima entre dos puntos visibles por separado es:

Donde es la longitud de onda de la luz monocromtica en la que se observa el objeto y A es la abertura del microscopio. Objetivos de inmersin: El medio ptico lquido que rellena el espacio entre el objeto y el objetivo se le denomina lquido de inmersin. El ndice de refraccin de este es prximo al del vidrio (se utiliza agua, glicerina, aceites cedral y de enebro,

monobromonaftalina, etc.) En la figura se muestra el papel del lquido: inmersion que rellena el espacio entre el objeto y el objetivo ref. Correcciones Tipos de objetivos y sus caractersticas. Aunque todos los componentes que constituyen un microscopio son importantes, los objetivos son de suma importancia, puesto que la imagen, en definitiva, depende en gran medida de su calidad. Los mejores objetivos son aquellos que estn corregidos para las aberraciones Qu son las aberraciones? Las aberraciones son alteraciones pticas en la formacin de la imagen debidas a las propias lentes del objetivo. aberraciones geomtricas aberraciones cromticas

Cmo se corrigen las aberraciones? Para evitar las aberraciones geomtricas se construyen los llamados objetivos planos o planticos, lo cual suele estar indicado en el propio objetivo con la inscripcin PLAN. Los objetivos que estn corregidos para las aberraciones cromticas se denominan acromticos (corregidos para el rojo y el azul), semiapocromticos (corregidos para el rojo y el azul y tienen una mayor apertura numrica) y finalmente los apocromticos (que son de mayor calidad y estn corregidos para el rojo, el azul y el verde).

Qu indican las diferentes inscripciones que pueden leerse en un objetivo? En un objetivo deben venir especificadas una serie de datos que hacen referencia a sus caractersticas: Fabricante/Pas. Por ejemplo: Zeiss/West Germany Numero de serie. Tipo y correccin. Si no llevan ninguna especificacin es que se trata de objetivos acromticos. Denominaciones frecuentes que * pueden encontrarse son: PLAN = objetivo planacromtico; NEOFLUAR = objetivo con apertura numrica incrementada; PLANAPO = objetivo planapocromtico; ULTRAFLUAR = objetivo especial para fluorescencia; POL = objetivo exento de microscopa de polarizacin; tensiones, especial para

Ph 2 = objetivo de contraste de fases con anillo del nmero 2; m.J = objetivo con diafragma iris, apropiado para campo oscuro. Aumentos y Apertura Numrica. Por ejemplo: 25/0,8 indica un objetivo con una potencia de 25 aumentos y una apertura numrica de 0,8 Longitud de tubo/cubre-objetos. Por ejemplo: 170/0,17 indica que es un objetivo para un microscopio de tubo de 17 cm. y que est *corregido para ser utilizado con cubre-objetos de un grosor de 0,17 mm. La especificacin 170/0 indica que est corregido para poder observar preparaciones sin cubrir. Cuando se encuentra la

inscripcin Korr se indica que el objetivo puede regularse para diferentes grosores de cubreobjetos. Inmersin. La especificacin Oil indica que se trata de un objetivo que debe utilizarse con aceite de inmersin; W = Inmersin en agua; Glyc: Inmersin en glicerina. Bases de datos y Referencias: Nikon MicroscopyU Microscope Optical Systems El Microscopio Optico pg. AngleFire Monografias Muestran una variedad de tamaos obtenidos, mejorando la microscopia ptica.

Aplicaciones del Microscopio ptico Hasta ahora se da uso en laboratorio de histologa y anatoma patolgica, la microscopa permite determinadas aplicaciones diagnsticas. Numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lpidos, protenas, depsitos seos, depsitos de amiloide etc. Microscopio estereoscpico

Microscopio estereoscpico El diseo de este instrumento es distinto al del diagrama de ms arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscpica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visin binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ngulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscpicos, por definicin, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos trminos. Existen dos tipos de diseo, denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo comn (o Galileo). El diseo convergente consiste en usar dos microscopios idnticos inclinados un cierto ngulo uno con respecto a otro y acoplados mecnicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseo econmico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fciles de corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observacin durante tiempos largos resulta fatigosa.

El microscopio estereoscpico es apropiado para observar objetos de tamaos relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a travs de la muestra. Este tipo de microscopios permite una distancias que van desde un par de centmetros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy til en botnica, mineraloga y en la industria (microelectrnica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirrgicos) e investigacin, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visin estereoscpica es esencial). En la fotografa se aprecia una concha de 4 cm de dimetro. Conectar una cmara digital a un microscopio ptico

Adaptador digital LM para la Canon EOS 5D Un adaptador ptico mecnico es importante en fotografa digital. Dicho adaptador sirve de enlace entre la cmara y el microscopio. Es especialmente importante que la conexin mecnica sea firme, pues cualquier movimiento mnimo, es decir, vibraciones de la cmara, reducira la calidad de la imagen notablemente. Adicionalmente, se requiere un adaptador ptico para el trayecto de luz con el que se lograr as, que el sensor CCD/CMOS de la cmara proyecte una imagen de total nitidez e iluminacin.

La fotomicrografa (fotografa realizada con la ayuda de un microscopio compuesto) es un campo muy especializado de la fotografa, para la que hay disponibles equipos de precio muy elevado, y simples equipos de estudio. Con un microscopio de calidad adecuada, como los que se encuentran en la mayora de los laboratorios cientficos, se pueden realizar fotomicrografas de una calidad razonable, utilizando una cmara de uso general, de objetivo fijo o intercambiable. Hay dos mtodos bsicos de tomar fotografas por medio del microscopio. En el primer mtodo el objetivo de la cmara realiza una funcin parecida a la del cristalino del ojo y proyecta sobre el sensor una imagen real de la imagen virtual que se ve por el ocular del microscopio. Este mtodo es el nico adecuado para utilizacin de cmaras con objetivo fijo, esto es, no intercambiable. El segundo mtodo, adecuado para cmaras con objetivo intercambiable, implica retirar el objetivo de la cmara y ajustar el microscopio de modo que el ocular forme una imagen directamente sobre el censor. La calidad de la ptica de un microscopio (objetivo y ocular) es fundamental en la determinacin de la calidad de una imagen fotogrfica. Los objetivos y oculares de microscopio se encuentran en diferentes calidades, determinadas por la precisin con que han sido corregidos de aberraciones. Los objetivos ms econmicos estn corregidos de aberracin esfrica para un solo color, generalmente el amarillo verdoso, pero no de aberracin cromtica para la totalidad del espectro visible, sino slo para dos o tres colores, primarios. Estos objetivos se llaman acromticos, y tambin muestran cierta cantidad de curvatura de campo; esto es, que la totalidad del campo de visin del objetivo no puede llevarse simultneamente a foco fino. Existen los acromticos de campo plano, en los que la curvatura de campo ha sido casi totalmente corregida, se denominan plana cromtica. Los apocromticos estn corregidos de aberracin esfrica para

dos colores y de aberracin cromtica para los tres colores primarios. Aun as, mostrarn curvatura de campo a menos que sean planapocromticos, los mejores objetivos de que se dispone. Los oculares tambin tienen diferentes calidades. Los ms simples son los de campo ancho. Los oculares compensadores se disean para compensar ciertas aberraciones cromticas residuales del objetivo, y dan su mejor resultado cuando se utilizan con objetivos apocromticos, aunque tambin pueden utilizarse con xito con los acromticos de mayor potencia. Existen los oculares foto, especiales para fotomicrografa, y cuando se utilizan con los objetivos planapocromticos dan la mejor calidad posible de fotografa. DESOR El diseo de objetivo comn utiliza dos rutas pticas paralelas (una para cada ojo) que se hacen converger en el mismo punto y con un cierto ngulo con un objetivo comn a ambos microscopios. El diseo es ms sofisticado que el convergente, con mejor modularidad y no genera fatiga en tiempos de observacin largos. Sin embargo es ms costoso de fabricar y las aberraciones, al generarse la imagen a travs de la periferia del objetivo comn y en un ngulo que no coincide con el eje ptico del mismo, son ms difciles de corregir. Los microscopios estereoscpicos suelen estar dotados, en cualquiera de sus variantes, de un sistema pancrtico (zoom) o un sistema de cambiador de aumentos que permite observar la muestra en un rango de aumentos variable, siempre menor que el de un microscopio compuesto. Tamao celular Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de pequeo tamao por lo que es

indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualizacin. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 m), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos lneas separadas 1mm de distancia; si hay dos lneas a 200 m de distancia, veremos una sola lnea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolucin. La invencin del microscopio en el siglo XVII posibilit la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio ptico simple, examin un corte de corteza, encontr que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cmaras, que llam clulas, en realidad slo vio las paredes celulares, ya que este tejido est muerto a la madurez y las clulas ya no tienen contenido. Ms tarde, Hoock y algunos de sus contemporneos observaron clulas vivas. El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio ptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio ptico ms simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios estn dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada

de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazn con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especmenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectngulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espcimen. Existen distintas variantes de observacin en MO: Microscopa ptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes especficos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera

Clula de Pisum, Traqueidas del leo de Pinus coloracin: safranina-fastColoracin: safranina green Microscopa de campo brillante: el material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se aprecian

detalles que estn naturalmente coloreados. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal. Microscopa en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear. Es ideal para especmenes delgados, o clulas aisladas. El microscopio de fase ilumina el espcimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es ms estrecho y entra en el campo de visin del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminacin provoca variaciones minsculas en el ndice de refraccin de un espcimen transparente, hacindolo visible. Este tipo de microscopio es muy til a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biologa y medicina Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective.

Nomarski, microscopa diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imgenes combinadas aparecen como si la clula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseado para observar relieves de especimenes muy difciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilizacin in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espcimen es muy grueso para usar contraste de fases

Microscopa de fluorescencia: una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayas luminosas: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante. Clulas epiteliales, triple coloracin: ncleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rejo). 200X (izq.) y 1000X (der.).