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RECONNAISSANCE DES ANTIGENES DU VIH SUR UNE BANDELETTE DE WESTERN BLOT

4 LES PRINCIPAUX CAS DE WESTERN BLOT INDETERMINES


Tout profil srique montrant une ractivit vis-vis dantignes du VIH, mais ne correspondant pas aux critres de positivit, est un Western blot indtermin.
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Gros plan sur

LA SEROLOGIE DU VIH

intense, est peu inquitante si elle reste isole et stable dans le temps.
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gp160 Reconnaissance du rcepteur cellulaire gp120 (env)

Lorsquun praticien demande une srologie VIH, deux tests sont raliss avec la mthode Elisa. Au moindre doute, un second prlvement est effectu pour le Western blot, qui rend une rponse dfinitive. Claire et nette ? Pas toujours : ce test de confirmation peut ne rien confirmer du tout. On risque alors des erreurs dramatiques, comme celle

Certains profils indtermins sont plus frquents que dautres. Les ractivits anti-gag (ou anticore) isoles : anti-p24 et/ou p17, plus rarement anti-p40 et p55. Ce profil peut correspondre un dbut de sroconversion et justifie une surveillance de son volution par des Western blot successifs. Cependant, des sujets prsentant une ractivit anti-p24 isole et stable ont t observs sur des priodes variant de deux ans 40 mois sans que se produise de sroconversion ni quon puisse dtecter le virus. Les anti-p18 en smear pais (en tache, en trane) : ils sont bien connus chez des sujets sans facteur de risque et nont pas de valeur diagnostique. Une ractivit anti-gp160 isole, peu

Dans lensemble, les diffrents profils indtermins ont t classs en quatre groupes (dits groupes de Healey) :

p66 p55 p51

Polymrases de rplication du gnome (pol) Protines de core (gag) Polymrases de rplication du gnome (pol) Catalyse de la fusion des membranes virale et cellulaire (env)

1 DABORD, ELISA
Les mots Elisa et Western blot dsignent en fait des mthodes de recherche danticorps. Cest limpact mdiatique du sida qui les rend synonymes, dans le langage courant, de srologie du VIH, de mme que sropositif sous-entend en gnral aujourdhui pour le VIH. Le doux nom dElisa est en ralit un sigle dur (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay). La technique utilise un ensemble dantignes viraux qui sont mis en contact avec le srum tester. Lajout danti-immunoglobulines marques permet ensuite de rvler dventuels anticorps, mais sans prciser le ou les antignes contre lesquels ils sont dirigs : ce test est sensible mais manque de spcificit. Par scurit, afin damliorer la sensibilit, deux tests Elisa sont systmatiquement pratiqus. Prs de 70 % des rsultats positifs au premier tests ne le sont pas au second. Mais pour obtenir une rponse spcifique, il faut recourir au Western blot.

gp41

groupe 1 : ractivit certaines protines virales, mais ni p18, ni p44, ni aux glycoprotines ; groupe2 : ractivit certaines protines virales, y compris p18, mais ni p24 ni aux gp ; groupe 3 : ractivit certaines protines virales, y compris p18 ou p24, mais pas aux gp. groupe 4 : ractivit certaines protines virales, y compris les gp, mais avec moins de trois autres protines virales. Selon cette classification, la plupart des srums des groupes 1 et 2 correspondent des individus non infects, alors que les individus reprsents dans les groupes 3 et 4 seraient suivre de plus prs.

p31

Polymrases de rplication du gnome (pol)

p24 ARN viral

Capside : protines de core (gag)

5 ETIOLOGIE DES WESTERN BLOT INDETERMINES


p17 Protines de core (gag)
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Infection par le VIH

Dbut de sroconversion par les anticorps dirigs contre les protines de core ou denveloppe (les anticorps anti-polymrase se dveloppent plus tardivement), do la ncessit de contrler le srum dans un dlai de 2 semaines minimum (le profil change rapidement ce stade) 6 mois maximum (dlai conseill dans la recommandation initiale de lOMS, mais souvent raccourci pour des raisons bien comprhensibles). Infection par le VIH 2 : en particulier devant une ractivit anti-p24 ou anti-glycoprotines.
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2 LES CIBLES DU WESTERN BLOT


Pour raliser une recherche srologique par la technique du Western blot, il faut dabord sparer par lectrophorse les diffrents antignes dune culture du virus en question, puis les transfrer sur un support de nitrocellulose, sur lequel ils seront reconnaissables par leur niveau de migration. Les feuilles de nitrocellulose sont dcoupes en bandelettes. Ce sont ces bandelettes qui sont mises la disposition des biologistes par le fabricant du test. Au laboratoire, une bandelette est mise en contact avec le srum tester. Aprs lavage, des anticorps antiimmunoglobulines humaines marqus permettent de rvler la prsence (ou labsence) danticorps au niveau des diffrents antignes sur la nitrocellulose. Le Western blot HIV dtecte ainsi les anticorps dirigs contre les protines de core, dites gag (p17, p24, p55), les polymrases, ou pol, enzymes ncessaires la rplication du gnome viral (p31, p51, p66), et les glycoprotines denveloppe, ou env (gp41, gp 120, et gp160). Linventeur de ce procd dabord destin ltude de la migration de lADN sappelait Southern : il appela sa mthode Southern blot (blot ne signifie pas ici tache mais buvard et fait rfrence au support de nitrocellulose). Cest par plaisanterie que lon a baptis Northern blot lutilisation du procd pour lARN, Infection puis Southern blot son application aux par le VIH anticorps. En attendant Eastern ?

Artfact technique

6 LES CHIFFRES DE LINDETERMINATION


ARBRE DECISIONNEL : LA SEROLOGIE DU VIH
(daprs Celum et coll.)

Le risque de contamination par un srum fortement positif dun autre patient est minimis par le deuxime prlvement systmatique. La technique de fabrication des kits de diagnostic doit tre compltement matrise : on a montr, dans des kits commerciaux, des multimres de gp41 qui migraient au niveau des gp 120 et gp160, si bien que des sujets non infects mais possdant une antigp41 ont t diagnostiqus tort comme sropositifs.
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Elisa

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Western blot

Elisa

Elisa

Tout va bien

Parmi les Western blot effectus pour confirmation dElisa positifs ou douteux, 4,5 % entrent dans la catgorie des Western blot indtermins (le chiffre va de 3,2 48 % selon les tudes, mais les tests les plus rcents apportent cependant une spcificit meilleure sans perte de sensibilit). Dans 82 % des cas de Western blot indtermins, la srologie de dpistage est dissocie (positive ou douteuse pour un test, ngative pour lautre). Il est trs rare que le Western blot soit indtermin si les deux Elisas sont franchement positifs. Chez les sujets risque, 4 6 % des sujets ayant un Western blot indtermin feront une sroconversion dans les six mois : la probabilit de la sroconversion dpend surtout des facteurs de risque pidmiologiques. Dans les populations faible risque dinfection par le VIH, la prvalence globale des srums avec un Western blot indtermin, indpendamment du dpistage du sida, est de 15 20 % !

Hors du contexte VIH

Indtermin

Nouvel Elisa 1 6 mois plus tard

3 LES CRITERES DE SEROPOSITIVITE DU WESTERN BLOT


Six huit semaines aprs une contamination par le VIH, plusieurs types danticorps dirigs contre les protines du virus apparaissent dans le srum. Un individu est dclar sropositif lorsque plusieurs tests sont trouvs positifs : au moins un test de dpistage sur deux et le test de confirmation, le Western blot. Originellement, le CDC (Center for Diseases Control, Atlanta) avait tabli pour critre de positivit du Western blot la seule prsence dun anticorps anti-p24 et/ou anti-gp41. Mais il en dcoulait de nombreux faux positifs, dus la prsence relativement frquente de ractions non spcifiques (surtout avec la p24), si bien que le CDC puis dautres organismes et institutions ont tent de dterminer des critres de positivit plus prcis. Malheureusement, lheure actuelle, il nexiste pas de consensus quant aux critres de positivit retenus par les uns et les autres : France : minimum deux bandes, dont une gp. Bnlux : p24, p31 et gp41 ou 160. FDA : p24, p31 et gp41 ou 120/160 (gp 120 et 160 peuvent tre confondues). CDC : au moins deux bandes parmi les suivantes : p24, gp41, gp120/160. American Red Cross : trois bandes, dont une gag, une pol, et une env.
Elisa positif ou douteux Elisa ngatif

Une kyrielle de cas ponctuels de Western blot indtermins ont t dcrits, en cas de parasitose, de bilirubinmie leve, dhmolyse in vitro, de gammapathie polyclonale, de protinurie massive, de prsence du facteur rhumatode ou danticorps anti-HLA, dans les maladies auto-immunes, dans le psoriasis, au cours des hpatites alcooliques La liste nest sans doute pas close.

7 CONDUITE A TENIR DEVANT UN WESTERN BLOT INDETERMINE


2e Western blot Risque lev Risque faible

Si toujours indtermin ou ngatif : Tests supplmentaires

2e Western blot

Rassurer. On arrte l.

Si ngatifs : Bande autre que p 24 : on arrte l. p 24 : suivre 3 et 6 mois surtout si sujet risque.

Si indtermin ou ngatif : Suivre tous les 3 6 mois. Tests supplmentaires si ncessaire pour rassurer le patient.

La dcouverte dun Western blot indtermin va videmment provoquer un sentiment bien comprhensible dangoisse, face cette incertitude vis--vis dune maladie transmissible et encore incurable. Suivant le profil srologique et suivant le risque dinfection couru par le patient (vie sexuelle, drogues), le discours doit sefforcer davertir et, si possible, de rassurer de faon prcise. De toute faon, une nouvelle srologie complte sera prescrite dans un dlai de quinze jours (minimum) six mois. Il faut

galement envisager la possibilit dune infection par le VIH 2 en cas de ractivit contre la protine p24 ou des protines denveloppe, et en fonction du contexte pidmiologique (contamination ventuelle dorigine africaine ou asiatique). A ce moment, pour en finir avec une ventuelle indtermination persistante, on prescrira des tests supplmentaires, principalement la culture de virus partir des lymphocytes du sujet et la recherche du gnome viral par PCR, qui pourra dtecter des cibles aussi petites quune seule molcule dARN viral dans 10 l de sang (voir AIM 11).

Si le sujet est haut risque dinfection, il sera suivi au moins six mois aprs la date de la dernire exposition (et de faon itrative si lexposition est permanente). Du point de vue srologique, cest lexistence dune ractivit dirige contre les protines denveloppe ou la protine p24 qui demande la surveillance la plus rapproche. A linverse, le discours pourra tre trs rassurant dune faon gnrale en labsence de risque, surtout pour les sujets des deux premiers groupes de Healey.