Verificacin de espectrofotmetros

Introduccin Cuando un equipo fotomtrico esta calibrado se puede asegurar confiabilidad y exactitud del mismo. Para que un espectrofotmetro funcione correctamente se debe verificar: la linealidad, la sensibilidad y la calibracin. Linealidad: son pruebas preliminares acerca de la exactitud del mtodo, se realiza un anlisis de estndares de pureza conocida que abraca el rango de linealidad deseada y tiene concentraciones en determinados puntos especficos, una vez analizados se grafica la concentracin contra la media de los resultados y la linealidad se confirma cuando es posible trazar una lnea recta a travs de los datos puntuales que forma un ngulo de 45 con los ejes y no se desvi en ninguno de los extremos antes de alcanzar el rango de linealidad esperado. Sensibilidad: es la probabilidad de una prueba positiva cuando est presente la enfermedad que la prueba que se le realiza la pueda detectar. Calibracin: es el uso de estndares de concentracin conocida que sirven para evaluar el mtodo de anlisis. Se realiza una curva tipo de todos los metabolitos que se van analizar y los parmetros que indican que la curva tipo que se realiza est correcta son: coeficiente de relacin, desviacin estndar y la regla de la recta. Resultados Verificacin de calibracin y sensibilidad
LONGITUD ABSORBENCIA DE ONDA 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 0.358 0.415 0.459 0.496 0.556 0.593 0.569 0.501 0.403 0.285 0.184 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550

CALIBRACION Y SENSIBILIDAD

Tabla y grafica 1. Verificacin de la calibracin y sensibilidad del espectrofotmetro, utilizando una solucin de cloruro de cobalto (2.2% en HCl 1%).

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Verificacin de la linealidad [mg/dL] 26.5 53 106 159 212 265 318 371 424 477 530 ABSORBENCIA (500nm) 0.083 0.169 0.368 0.54 0.731 0.895 1.123 1.285 1.453 1.613 1.804 % de error -83.4 -66.2 -26.4 8 46.2 79 124.6 157 190.6 222.6 260.8

Tabla 2. Lecturas de la absorbencia de las diferentes concetraciones de cloruro de cobalto, y su porciento de error.

Linealidad
2 1.8 1.6 1.4 absorbencia 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 6 8 10 12 y = 0.1774x - 0.1497 R = 0.9981

Grafica 2.0. Linealidad del espectrofotmetro Spectronic genesys 20.

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% de error
300 250 200 150 100 % de error 50 0 -50 -100 -150 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Grafica 2.1. Representacin del porciento de error de la linealidad de espectrofotmetro Spectronic genesys 20. Conclusiones El espectrofotmetro mostro una absorbencia de 0.569 a 510nm con una solucin de cloruro de cobalto, segn la literatura la absorbencia mxima que debe tener el cloruro de cobalto es de 0.5 a 510nm. Podemos decir que nuestro espectrofotmetro tiene una sensibilidad adecuada dado que la absorbencia mxima obtenida en la prctica fue muy parecida a la absorbencia mxima conocida segn la literatura. El espectrofotmetro esta calibrado ya que la absorbencia mxima fue parecida a la ya establecida o conocida. Nuestro aparato tiene linealidad ya que, la absorbencia es directamente proporcional a la magnitud de la concentracin, por lo tanto cumple con la Ley de Beer. Se obtuvo una R2=0.9981.

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EXTRA: CONTROL DE LINEALIDAD FOTOMTRICA Mtodo: La solucin de Rojo Congo diluda 1/5 ser tomada como la solucin madre al 100% (0,060 mg/ml) A partir de sta hacer diluciones para obtener soluciones al 75; 50; 25 y 12,5% (0,045; 0,03; 0,015 y 0,0075 mg/ml respectivamente). Medir las absorbancias de las soluciones al ptimo. Finalmente, graficar Abs = f(Cc), considerando como dato el 0%. Calibracin con rojo Congo Reactivos requeridos

Solucin de Rojo Congo 14 mg/L HCl 2,5 N NaOH 2,5 N Procedimiento

1) Preparacin de las formas cida A y alcalina B del colorante. Alicuotar con una misma pipeta 5 mL de solucin de Rojo Congo 14 mg/L en dos tubos de ensayo rotulados A y B. Solucin A: al tubo A agregarle 20 uL de la solucin de HCl 2,5 N Solucin B: al tubo B agregarle 20 uL de la solucin de NaOH 2,5 N Usar una nica micropipeta para dispensar los 20 uL. Las soluciones A y B una vez preparadas son estables 1 hora a temperatura ambiente. 2) Realizacin del barrido espectrofotomtrico de las soluciones A y B entre 520 y 570 nm. Se deber realizar el espectro de las soluciones A y B contra agua destilada. Se puede trabajar a temperatura ambiente ya que el punto isosbstico es independiente de la temperatura entre 4 y 45 C. Se recomienda proceder de la siguiente manera: 2.1) Mtodo manual para espectrofotmetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor. (Mtodo que utiliza una cubeta) Llenar una cubeta con agua destilada y ajustar el cero de absorbancia a 520 nm. El regulador de absorbancias no se tocar ms durante toda la experiencia. Leer y registrar las absorbancias a las longitudes de onda indicadas en la tabla provista. Vaciar y llenar la misma cubeta con la solucin A repitiendo el mismo barrido. Vaciar, enjuagar con agua destilada y llenar la misma cubeta con la solucin B repitiendo el mismo barrido.

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2.2) Mtodo manual para espectrofotmetros con cubetas de caras paralelas de 1 cm de espesor. (Mtodo que utiliza tres cubetas) Elegir 3 cubetas iguales, sin rayaduras y perfectamente limpias. Llenar una con agua destilada y las otras con las soluciones A y B respectivamente. Ajustar el cero de absorbancia a 520 nm con la cubeta que tiene el agua destilada. Retirar dicha cubeta y medir la absorbancia de la solucin A, y luego de la solucin B registrando los valores en la tabla directamente como Abs. netas. Seleccionar luego 525 nm y repetir los pasos anteriores, es decir, ajustar primero el cero con agua destilada y luego leer las soluciones A y B. Repetir estos pasos a cada una de las longitudes de onda indicadas en la tabla adjunta, llevando a cero con la cubeta de agua destilada en cada longitud de onda. 2.3) Mtodo para los espectrofotmetros con microcubetas y bomba de succin. Aspirar agua destilada y ajustar a cero de absorbancia a 520 nm. El regulador de absorbancias no se tocar ms en toda la experiencia. Mover el selector de longitudes de onda hacia los 570 nm realizando el espectro del agua tal como se indica en la tabla adjunta, registrando todos los valores de absorbancia. Vaciar la cubeta y aspirar la solucin A realizando el mismo barrido. Vaciar la cubeta, enjuagar pasando agua destilada y aire y aspirar la solucin B realizando el mismo barrido. Nota: para realizar el barrido del agua destilada en los mtodos b1 y b3 se recomienda empezar llevando a cero de absorbancia a 520 nm con el fin de tener todas las absorbancias positivas. Si el espectro del agua da valores negativos comenzar a otra longitud de onda de manera tal de no tener valores negativos de absorbancias ya que finalmente ser restado el espectro del agua punto a punto del de las soluciones A y B.

Bibliografa http://www.altillo.com/examenes/uba/farmaciaybioquim/fisica/fisica2006tpespectrof otometria1.asp http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S032529572005000400014&script=sci_arttext