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INSTRUMENTAO EM SISTEMAS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA 13. Instrumentao 13.a. Reservatrios para fase mvel 13.b. Sistemas de bombeamento 13.c. Injetores 13.d. Caractersticas da fase mvel 13.e. Colunas e recheios por tcnica
INSTRUMENTAO
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DESVANTAGENS: limitao de capacidade e presso de sada fluxo depende da presso de retorno da coluna e da viscosidade do solvente
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dispositivo controlado por computador para medida de vazo: determinao da queda de presso por um restritor localizado na sada da bomba diferenas detectadas em relao a um valor pr-estabelecido fazem com que a velocidade do motor da bomba seja alterada. muitos equipamentos possuem dispositivos para controle da composio do solvente: vlvula proporcional
fator limitante da preciso: repetibilidade da injeo volumes devem ser pequenos (evitar alargamento de banda e sobrecarga da coluna, overload): < 500 L conveniente injetar amostra sem despressurizar o sistema sistema mais comum: ala de injeo (loop) mediante seringa; escolha de 0,5 a 500 L; permite injeo a presses de at 7000 psi; preciso melhor que 1%
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INSTRUMENTAO colunas
em geral, tubos de ao inoxidvel, mas tubos de vidro com paredes resistentes tambm so encontrados (restritos a presses mais baixas, 600 psi) diversidade de colunas recheadas so disponveis comercialmente, com preos variando entre US$ 200 a 500
INSTRUMENTAO colunas
Colunas analticas: em geral de 10 a 30 cm; 4 a 10 mm dimetro com partculas de 3, 5 e 10 m (60000 pratos/m) Pr-coluna: introduzida antes da coluna de separao para aumentar a vida til desta remove material particulado e contaminantes provenientes do solvente serve para saturar a fase mvel com fase estacionria minimizando a sangria da coluna composio deve ser similar a da coluna analtica, com tamanho de partcula em geral maior (minimizar queda de presso) Termostatizao: em geral coluna operada a temperatura ambiente; no entanto, cromatogramas de melhor qualidade so obtidos quando a temperatura da coluna controlada; fornos aquecidos at 100-150 C esto disponveis
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n-Hexano CCL4 ter dietlico THF Clorofrmio Etanol MeOH ACN Etileno glicol gua
NDICE DE REFRAO
1,.372 1,457 1,350 1,405 1,433 1,359 1,326 1,341 1,431 1,333
0,30
81
0,04
FORA DO ELUENTE*
-0,2
0,46
66
4,0
0,57
Acetato de etila 1,370 0,54 0,34 0,89 65 82 100 5,1 5,8 10,2 0,95 0,65 grande
*sobre Al2O3
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OTIMIZAO DA SEPARAO
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OTIMIZAO DA SEPARAO
partculas porosas
partculas peliculares
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SLIDOS E SUPORTES para cromatografia lquido-slido (CLS), cromatografia lquido-lquido (CLL) e com fase ligada (CLFL)
SLIDOS PARA CLS partculas totalmente porosas de 5-10 m ou materiais maiores (30-40 m) com pelcula porosa quase todas as separaes so limitadas a alguns tipos de adsorventes: slica ou alumina componentes mais polares da amostra so retidos preferencialmente: ordem usual de eluio: hidrocarbonetos saturados < olefinas < hidrocarbonetos aromticos haletos orgnicos < sulfetos < teres < steres aldedos cetonas < lcoois aminas < amidas < cidos carboxlicos SUPORTES PARA CLL preferncia para materiais inertes; no entanto como no existem materias inertes com rigidez e uniformidade necessrias, usa-se slica, por vezes desativada, porosa ou superficialmente porosa
SLIDOS E SUPORTES para cromatografia lquido-slido (CLS), cromatografia lquido-lquido (CLL) e com fase ligada (CLFL)
EXEMPLOS slidos microporosos: slica esfrica: srie LICHROSPHERE-Si (E-Merck); dimetro de partcula (3, 5 e 10 m ) ; tamanho de poro (6, 10 e 30 nm); volume de poro (1,1-1,4 mL/g); rea da superfcie (60-400 m2/g) slica irregular alumina esfrica alumina irregular: ALOX 60D (Macherey-Nagel); dimetro de partcula (5 e 10 m ) ; tamanho de poro (6 nm); rea da superfcie (60 m2/g) carbono grafitizado polmeros de estireno divinilbenzeno; polmeros de vinilpiridina e polmeros de propilamida-6
Tabela IX-5 Collins, p199
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SLIDOS E SUPORTES para cromatografia lquido-slido (CLS), cromatografia lquido-lquido (CLL) e com fase ligada (CLFL)
EXEMPLOS slidos peliculares: slica ativa: CORASIL I (Waters); dimetro de partcula (37-50 m); rea da superfcie (7 m2/g) slica inativa (somente usado como suporte): ZIPAK (DuPont); dimetro de partcula (26-37 m); rea da superfcie (1 m2/g) alumina: PELLUMINA HS (Whatman); dimetro de partcula (37-44 m); rea de superfcie (8 m2/g)
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apolar: PARTISIL ODS-1 (Whatman); grupo ligado (octadecil-polmero); %Carbono, em peso (5,0); NUCLEOSIL100-C8 (Macherey-Nagel); grupo ligado (octil); %C (7,0) polaridade mdia: -BONDAPAK CN (Waters); grupo ligado (cianopropil); %C (6,0); HYPERSIL PHENYL (Shandon); grupo ligado (fenil); %C (5,0) polaridade alta: ZORBAX-NH2 (DuPont); grupo ligado (alquilamina); ACCUSPHERE-DIOL (J&W Scientific); grupo ligado (propildiol); %C (2,5) todas as fases so ligadas a um ncleo slido (citado anteriormente) e, em geral mantm o mesmo nome a maioria contm o grupo Si-O SiRR2 onde R o grupo ligado (octadecil, octil, fenil, amino e nitrilo so os mais comuns) e R em geral o grupo metil fases apolares: grupos silanis residuais so desativados por reaes de capeamento (end-capping) com trimetilmetoxisilano ou similar
Tabela IX-7 Collins, p201 e 202
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DETECTORES PTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA 13.f. Detectores 13.f.1. Detectores de absorvncia no UV-vis 13.f.2. Detectores de absorbncia no Infravermelho 13.f.3. Detectores de fluorescncia 13.f.4. Detectores Refratomtricos 13.f.5. Outros: eletroqumicos, espalhamento, radioatividade 13.f.6. Detectores por Espectrometria de Massas
DETECTORES
monitoramento do efluente que sai da coluna ESTRATGIAS: medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas, amostras e fase mvel medidas de uma propriedade da amostra que no apresentada pela fase mvel deteco aps eliminao da fase mvel
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DETECTOR IDEAL
alta sensibilidade e baixo limite de deteco resposta rpida a todos os solutos insensibilidade a mudanas de temperatura e na vazo da fase mvel resposta independente da fase mvel pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do detector resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto no destruio do soluto segurana e convenincia para uso informao qualitativa do pico desejado
DETECTORES
2 TIPOS: SELETIVO versus UNIVERSAL UNIVERSAL: responde s propriedades da fase mvel (ndice de refrao, constante dieltrica ou densidades, moduladas pela presena do soluto) SELETIVO: responde s propriedades do soluto (absorvncia no UV-vis, fluorescncia, corrente de difuso) que a fase mvel no possui
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IRef: detector por ndice de refrao ELETR Hg: detector eletroqumico (Hg gotejante)
detector
COND E
princpio de operao tipo quantidade mnima de deteco (g/mL) faixa de linearidade volume da cela (mL) sensibilidade temperatura sensvel vazo da fase mvel til com gradientes aplicaes
Tabela IX-12 Collins p219
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DETECTORES DE ABSORVNCIA
PRINCPIO: absorvncia da luz por parte da amostra ao passar atravs desta qualquer radiao eletromagntica (normalmente do ultravileta at o infravermelho) resposta seletiva: s detecta os componentes da amostra que absorvem a radiao no comprimento de onda selecionado; grande maioria das substncias absorvem radiao UV (substncias com eltrons ou eltrons desemparelhados), por exemplo olefinas, compostos aromticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e N=N-
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volume mantido pequeno para minimizar alargamento de banda: 1-10 L comprimento: 2-10 mm P < 600 psi (redutor de presso requerido
DETECTORES DE ABSORVNCIA
2 TIPOS: comprimento de onda fixo (fotomtrico): sensvel e econmico comprimento de onda varivel (espectrofotomtrico): verstil ambos, relativamente insensveis a variaes de vazo ou temperatura; sensiblidades de at 0,001 unidades de absorvncia; possvel a deteco de dcimos de nanograma (10-10g) muitos instrumentos so de duplo feixe: um feixe passa pela cela da amostra/eluente, e outro passa por um filtro que reduz sua intensidade; detectores piezoeltricos geminados so usados para comparar a intensidade dos dois feixes; alternativamente, um sistema de recorte de feixe usado em conjuno com um nico fototubo; cromatogramas: grficos do log da razo dos sinais dos transdutores em funo do tempo instrumentos de feixe simples tambm so encontrados: medidas da intensidade do solvente so armazenadas em memria e depois recuperadas para o clculo da absorvncia
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a maioria dos detectores de comprimento de onda fixo opera em 254 nm (filtro) e 280 nm
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cobrindo a faixa de 190 a 800 nm; atravs de monocromador que seleciona o desejado do feixe de luz emitido por lmpadas de deutrio (UV) ou tungstnio (vis) VANTAGENS sobre os instrumentos de onda fixo: maior versatilidade: atravs da escolha apropriada do possvel trabalhar nas regies de alta absorvncia dos componentes da amostra (alta sensibilidade) maior seletividade: possvel escolher onde um determinado componente da amostra absorve e outros no otimizar eluies por gradiente: selecionar onde a fase mvel no apresenta variao de absorbncia com a concentrao obteno do espectro de absorvncia de cada componente da amostra durante sua eluio (arranjo de diodos) ou interrompendo a vazo da fase mvel no momento de deteco
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alto custo relativamente complexo toda a luz da fonte passa pela cela da amostra a luz emergente dispersada por uma grade hologrfica (rede de difrao a radiao dispersada resultante (comprimentos de onda distintos) focalizada sobre uma fila de fotodiodos (256-512nm) todo o espectro da substncia passando pelo detector armazenado no microcomputador
possvel exibir um cromatograma para cada comprimento de onda selecionado possvel exibir o espectro em cada tempo determinado, ou seja, o espectro do pico cromatogrfico
Figura IX-13 Collins p223
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DETECTORES DE FLUORESCNCIA
deteco especfica para compostos que fluorescem e uma das mais sensveis tcnicas de deteco (picogramas, 10-12g); comparvel ao detector por captura de eltrons em GC alta intensidade de fluorescncia esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que no podem produzir estruturas fortemente inicas reaes de derivao ps-coluna (esterides podem produzir fluorescncia quando aquecidos com cido sulfrico) aplicaes: rea farmacutica, alimentos, caracterizao de destilados do petrleo de alto p.e. fase mvel deve ser criteriosamente selecionada (intensidade de emisso depende do meio; efeito quencher)
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filtro primrio escolhido para deixar passar somente o comprimento de onda de excitao filtro secundrio escolhido para eliminar o comprimento de onda excitante, e deixar passar o comprimento de onda emitido pela amostra
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a cela tem os compartimentos de amostra e referncia separados por um pedao de vidro quando a composio da fase mvel muda na cela da amostra, a mudana do ndice de refrao causa uma deflexo na posio final do raio de luz no fotodetector
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P4. PR-TRATAMENTO DE AMOSTRAS PARA CROMATOGRAFIA 1. Introduo 2. Tipo de amostras 3. Processamento preliminar de amostras slidas e semi-slidas 3.a. Reduo do tamanho de partcula 3.b. Secagem da amostra 3.c. Filtrao 4. Pr-tratamento de amostras lquidas 4.a. LLE 4.b. SPE 4.c. SPME 4.d. MSPD (matrix solid-phase dispersion) 4.c. Membranas 5. Pr-tratamento de amostras slidas 5.a. Mtodos tradicionais de extrao 5.b. SFE 5.c. Microwave-assisted Solvent Extraction 5.d. Accelerated Solvent Extraction 6. Column switching 7. Derivatizao 7.a. Detectabilidade (UV e fluorescncia) 7.b. Derivatizao pr e ps-coluna
Snyder p100; anotaes Emanuel Carrilho
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princpios e comentrios
EXTRAO LQUIDO-SLIDO: amostra colocada em um frasco fechado e solvente adicionado para dissolver o analito de interesse; soluo separada do slido por filtrao (shaker/filter method); solvente algumas vezes aquecido ou usado sob refluxo para aumentar a solubilidade; amostra deve ser finamente dividida; amostra pode ser agitada manualmente ou automaticamente; amostra filtrada, decantada ou centrifugada para separar slidos insolveis EXTRAO EM SOXHLET: amostra colocada em um reservatrio poroso descartvel (thimble (dedal) ou papel); refluxo constante de solvente passa pelo dedal e dissolve os analitos de interesse que so coletados continuamente em um frasco de destilao; extrao ocorre em solvente puro; amostra deve ser estvel no p.e. do solvente; lento, mas o processo no necessita superviso (extrao exaustiva); barato; recuperaes excelentes; em geral usado como mtodo de referncia
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princpios e comentrios
ACCELERATED SOLVENT EXTRACTION (ASE): amostra colocada em um frasco apropriado fechado e aquecida acima do seu ponto de ebulio, causando um aumento de presso no frasco; amostra extrada removida automaticamente e transferida para um vial para tratamento posterior; aumenta grandemente o processo de extrao slido-lquido; automatizado; amostra extrada diluda, portanto deve ser posteriormente concentrada; questes de segurana EXTRAO EM SOXHLET AUTOMATIZADA: combinao de solvente aquecido e extrao em Soxhlet; amostra colocada no thimble (dedal?) e imersa em solvente aquecido; em seguida procede-se extrao por Soxhlet convencional; usa menos solvente que a extrao convencional; solvente recuperado para uso posterior; diminui o tempo de extrao devido ao processamento em duas etapas
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SOLVEL EM GUA NO-INICA ANINICA AEX amino (WAX); 1,2-diamino (WAX); quat. amino (SAX) tampes bsicos
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SOLVEL EM GUA NO-INICA MODERADAMENTE POLAR LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA APOLAR RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; MeOH; H2O
MODERADAMENTE POLAR LSC SiO2; florisil; alumina C6; CHCl3; CH2Cl2; EtOAc; MeOH; IPA
APOLAR
RPC C18; C8; ciclohexil; fenil; C2; C4; -CN C6; CH2Cl2; acetona; ACN; MeOH; H2O
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P2. INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA 17. Aplicaes 17.a. Fases tpicas 17.b. Exemplos
< 2000
AMOSTRA
> 2000
Figura IX-2 Collins p 194
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> 2000
MODALIDADE
CE
CE
CTI CTI
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NO POLAR MODERADAMENTE POLAR POLAR BASE FORTE BASE FRACA CIDO FORTE CIDO FRACO
INSOLVEL EM GUA
FR: fase reversa FN: fase normal CN-nitrilo silca*=slica desativada ACN=acetonitrila MeOH=metanol pr-OH: propanol CLFL: cromatografia em fase ligada CLS: cromatografia lquido-slido
MODALIDADE
CLS CLFL/FR
n-C7H16/ CHCl3/C6H5CH3 MeOH/H2O ACN/H2O MeOH/H2O n-C7H16/CHCl3 n-C7H16/CHCl3 n-C7H16/ CHCl3/pr-OH ACN/H2O
POLAR
CLFL/FN CLFL/FR
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FR: fase reversa pi: pareamento inico MeOH: metanol ACN: acetonitrila AHS: c. hexanossulfnico TBA: hidrxido de tetrabultilamnio CLFL: cromatografia em fase ligada CTI: cromatografia por troca inica
< 2000 SOLVEL EM GUA NOINICO INICO BASE FORTE BASE FRACA
MODALIDADE
CLFL/FR
C18
MeOH/H2O ACN/H2O
P2. INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS EM FASE LQUIDA P10. DETECTORES PTICOS DE USO COMUM EM CROMATOGRAFIA 14. Mtodos qualitativos 15. Mtodos quantitativos 16. Validao
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MTODOS QUALITATIVOS
Spiking com padres Razo de comprimentos de onda (antigas anotaes de CE) Coleta de fraes para IR, NMR e MS (MS como detector)
MTODOS QUANTITATIVOS
MEDIDA DO SINAL: rudo (constante de tempo) altura de pico rea de pico MTODO QUANTITATIVO Normalizao da rea Fator de resposta Calibrao externa Padronizao interna Adio de padro FONTES DE ERRO ANLISE DE TRAOS
Collins p168; Snyder p 643
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VALIDAO EXATIDO comparao com padro de referncia recuperao adio de padro PRECISO LINEARIDADE INTERVALO LINEAR LIMITE DE DETECO LIMITE DE QUANTIFICAO ESPECIFICIDADE spiking com interferentes degradao da amostra aquisio de dados cross-check
Snyder p685; artigos: Ira Krull, Anal Chem,, USP25
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