ESPECTROSCOPA DE

FLUORESCENCIA
MOLECULAR
Introduccin
Principios tericos
Instrumentacin
Aplicaciones
Introduccin: Fenmenos luminiscentes
moleculares
Fotoluminiscencia
Quimioluminiscencia
Bioluminiscencia
Termoluminiscencia
Radioluminiscencia
Triboluminiscencia
emisin de radiacin por
parte de determinadas sustancias que se
encuentran en un
estado electrnico excitado
E
m
i
s
i

n

d
e

E

p
r
o
c
e
d
e
n
t
e

d
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v
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-
V
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a
:

A
b
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c
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n

y

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n

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1
0
-2
-
1
0
-9
s

F
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A
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n

>

1
0
-2
s

-
s
e
m
a
n
a
s
Emisin de E procedente
molculas, producto de una
reaccin qumica
Emisin de E procedente
molculas, producto de una
reaccin en un sistema
biolgico
E
m
is
i
n
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E
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f
r
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c
c
i

n
Emisin de E procedente
molculas excitadas
partculas de alta energa
Fotoluminiscencia
Emisin
luminiscente
Se divide en dos categoras:
fluorescencia y fosforescencia dependiendo
de la naturaleza del estado excitado.
ESPN DEL ELECTRN:
SINGLETES Y TRIPLETES
hv
Molculas en estado
fundamental
OM con 2 e
-

espines opuestos
SINGLETE
e
-

en nivel
energtico
superior con
espines opuestos
SINGLETE
e
-

en nivel
energtico
superior con
espines paralelos
TRIPLETE
Fluorescencia y fosforescencia
Estado excitado SINGLETE
Transicin PERMITIDA FLUORESCENCIA
Rpido retorno al
estado fundamental
Tiempo de vida 10 ns
Estado excitado TRIPLETE
Transicin PROHIBIDA FOSFORESCENCIA
Velocidad de
emisin lenta
Tiempo de vida ms

a s
Diagrama de Jablonski
Diagrama tpico de los niveles energticos para una molcula
luminiscente
Excitacin
Tiempo requerido
para el proceso de
absorcin del
fotn: 10
-15

10
-14

s
- + Molcula h Molcula v
Relajacin vibracional

y Conversin
interna y externa
Relajacin vibracional:
Prdida de E vibracional

excesiva en forma de choques
entre la especie excitada y
otras (T mnimo)
Muy rpido (10
-10

10
-13

s)
Ocurre siempre.
Todos los procesos pueden
considerarse originados desde
el nivel vibracional

ms bajo
de un estado electrnico
excitado
La emisin fluorescente se
produce a >

excitacin
Conversin interna:
Nivel vibracional

inferior de un estado electrnico excitado
Nivel vibracional

superior de un estado electrnico de E inferior
(Sin emisin de radiacin)
Conversin interna
Espectros de excitacin y
emisin de quinina
Fluorescencia
excitado
h l fundamenta Estado SINGLETE inferior
al vibracion Nivel
v +
Proceso inverso a la absorcin
Relacin inversa entre c y
tiempo de vida del estado
excitado
c= 10
3

-10
5
tiempo de vida de S* = 10
-7

-10
-9

s
c

< 10
3
tiempo de vida de S* = 10
-5

-10
-4

s
Cruce entre sistemas
Nivel vibracional

inferior de
singlete

excitado
Nivel vibracional

superior
de un triplete
(Sin emisin de radiacin)
(Seguido de relajacin
vibracional)
Cruce entre sistemas Cambio en el spin del e-
Velocidad < C.I.
Espectros de excitacin y emisin
Espectros de excitacin y emisin
Espectro de
excitacin
Variacin de I
F

al variar la
exc. a una em

= cte
Eficacia de las diferentes exc. para
producir fluorescencia
Espectro de emisin
Variacin de I
F

al variar la em

a
una exc

= cte
Intensidad de la radiacin
emitida a diferentes
Factores que afectan a la fluorescencia
Del compuesto:
Rendimiento cuntico
Estructura molecular
Del entorno qumico:
Disolvente
Temperatura
pH
Presencia de O
2
Rendimiento cuntico (0 < |
F

< 1)
absorbidos fotones No.
cia fluorescen como emitidos fotones No.
=
F
|
... + + +
=
CS CI F
F
F
K K K
K
|
Funcin de la velocidad del proceso de desactivacin por
emisin/velocidad de otros procesos de desactivacin
Estructura molecular
Estructura molecular: Transiciones
electrnicas
t

t* mayor rendimiento cuntico > fluorescencia
n o*
t o*
o

t*
o

o*
o* anti-enlazante
t* antienlazante
n no-enlazante
t-enlazante
o-enlazante
Energa
n t*
t

t*
Tiempos de vida media
ms cortos (mayor K
F
)
Menor probabilidad de cruce
entre sistemas (menor K
IC
)
Estructura molecular: Aromaticidad
No presentan fluorescencia
Presentan fluorescencia
Estructura molecular: Aromaticidad
Estructura molecular: Sustituciones en
el anillo aromtico
Longitud de onda de excitacin (exc)
Longitud de onda de emisin (em)
Rendimiento cuntico de fluorescencia (
F

)
carcter aceptor de e- carcter donor

de e-
INFLUYE SOBRE
Estructura molecular
Rigidez
estructural
Reduce el grado de interaccin con el
medio
Aumenta |
F
en quelatos
Factores que afectan a la fluorescencia:

Entorno qumico
Efecto del solvente
Viscosidad y polaridad
Efecto de la temperatura
Variacin de la viscosidad y el nmero de colisiones
Efecto del pH
Longitud de onda e intensidad diferenciada para la forma cida y
bsica
Presencia de oxgeno disuelto
Amortiguacin de la seal fluorescente
Efecto del solvente
En general, un aumento de la viscosidad, aumenta |
F
Efecto del tomo pesado
|
F
disminuye
Solventes con tomos pesados
Solutos con tomos pesados
Favorecen tripletes
Aumento de la polaridad,
Transiciones t t*
Transiciones n

t*
Desplazamiento de
(mx)
em

hacia el rojo
Desplazamiento de
(mx)
em

hacia el azul
Efecto del solvente
Fotografa y espectros de
fluorescencia del 4-

dimetilamino-4'-

nitroestilbeno
(DNS) en solventes de
polaridad creciente.
H, hexano; CH, ciclohexano;
T, tolueno; EA, acetato de
etilo; Bu, n-butanol.
Temperatura
Aumento de temperatura Colisiones entre molculas
Procesos de
desactivacin no
radiativos
Disminuye |
F
Efecto del pH
Afecta a |
F
y a (mx)em

de compuestos con sustituyentes

cidos o
bsicos
El pH

del medio afecta la carga y las formas resonantes del fluorforo
Oxgeno disuelto
Disminuye |
F
Oxidacin del fluorforo
Carcter paramagntico del O
2
Cruce entre sistemas
Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin
Relacin entre I
F

y
concentracin
Base de las aplicaciones
analticas
I I K I
0 F F
=
I
0

= intensidad incidente
I = intensidad transmitida
K = cte. de proporcionalidad (depende del instrumento)
|
F
= rendimiento cuntico de fluorescencia
ec. 1
Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin
De acuerdo a la ley de Beer:
bc
0
10 I I
c
=
Reemplazando en la ec. 1: ) 10 1 ( I K I
bc
0 F F
c
u

=
Desarrollando en serie:
(

+
+ + + =
)! 1 n (
) bc (
) 1 ( ...
! 3
) bc (
! 2
bc
1 bc 3 . 2 I K I
n
n
2
0 F F
c c c
c u
A bajas concentraciones cbc

< 1 y es posible despreciar todos los trminos
frente a 1:
bc 3 . 2 I K I
0 F F
=
Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin
Anlisis Cuantitativo: Efecto de la

concentracin
Instrumentacin
Instrumentacin
Fuente de energa: lmpara de Xe
Monocromadores

de red de difraccin
Detectores: tubos fotomultiplicadores
Cubetas de cuarzo con las 4 caras
transparentes a la radiacin
Aplicaciones de la fluorescencia
Campo de aplicacin
Anlisis cualitativo y estructural
Anlisis cuantitativo
Auxiliar en otras tcnicas
Mtodos analticos
Fluorescencia directa
Fluorescencia indirecta
Analito fluorescente
Analito no fluorescente
Anlisis cualitativo y estructural
Identificacin de sustancias con espectros de emisin muy
caractersticos
Hidrocarburos aromticos y compuestos heterocclicos
Identificacin de iones inorgnicos
Con fluorescencia nativa (sales de uranio y tierras raras)
No fluorescentes por formacin de quelatos

fluorescentes
Anlisis cuantitativo
Muy til en la determinacin de trazas de iones inorgnicos y compuestos
orgnicos
Lmite de deteccin: ppb
Determinacin de iones inorgnicos
Formacin de quelatos

luminiscentes con reactivos orgnicos
no luminiscentes
Formacin de complejos
luminiscentes con reactivos
inorgnicos (HCl, HBr)
Fluorescencia del propio in
(tierras raras, U(VI))
Determinacin de compuestos
orgnicos y biolgicos
Por fluorescencia directa (PAHs,
hormonas, etc.)
Por fluorescencia inducida por
reaccin qumica (N-metilcarbamato)
Auxiliar en otras tcnicas
Indicadores fluorescentes en volumetras
Deteccin fluorescente en cromatografa
Bibliografa

BSICA

Principios de Anlisis Instrumental, D. Skoog, F.
Holler, T. Nieman.

Fundamentos de Qumica Analtica, D. Skoog, D.
West, F. Holler, S. Crouch.

AVANZADA

Photoluminiscence

of

solutions, C. Parker.

Principles

of

fluorescence

spectroscopy, J.
Lakowicz