resultados Fermentacin A: fed-batch (lote alimentado) fermentacin con alimentacin de galactosa

Produccin de cutinasa por S. cerevisae fue estudiado por primera vez por la adopcin de una estrategia tpica de fermentacin por fed-batch: un primer perodo de crecimiento de la biomasa en glucosa. Seguido de un perodo de fed-batch en galactosa para la produccin de cutinasa. Un perfil tpico de un lote de fermentacin de S. cerevisae en glucosa se obtuvo en el periodo inicial del lote: una primera etapa en la que la glucosa es consumida con una simultnea produccin de biomasa y etanol, seguida por una segunda etapa, despus de la deplecin de glucosa, cuando el cultivo crese por la metabolizacin del etanol producido durante la etapa ms temprana. La presencia de etanol en el tiempo cero es debido al etanol introducido con el inculo. La limitacin de oxgeno nunca ocurri a lo largo de la fermentacin, dado su relativamente bajo volumen y una buena mezcla. Por lo tanto la produccin de etanol fue el resultado del efecto Crabtree (efecto glucosa). De hecho la tasa especfica de consumo de glucosa, qs, 1.75 g g h. mayor que el umbral reportado qs (0.54g g h Kappeli 1986: Cortassa y Son 1998). por encima del cual se satura la va respiratoria y etanol se produce como resultado del inicio de la va fermentativa. Cuando el metabolismo no es exclusivamente oxidativo el cociente respiratorio el cociente respiratorio (RQ) es mayor que 1 confirmado por mediciones en el inicio de la fermentacin. Concentraciones de etanol y acetato siguieron un perfil similar durante el perodo de consumo de glucosa por lotes. Despus ambas concentraciones de etanol y acetato disminuyeron hasta el casi agotamiento de acetato y, despus etanol. El RQ terico durante la oxidacin aerbica de etanol es de 0,66 obtenido experimentalmente. Tras el agotamiento del etanol RQ aument a un valor bastante constante cerca de 1. A las 17:05 horas de fermentacin de las 17:05 horas de fermentacin, la galactosa comenz a ser alimentados a una velocidad constante (160 ml / h) a partir de este momento en la acumulacin de acetato se observ hasta el agotamiento completo de etanol, momento en el cual el acetato comenz a ser hasta su agotamiento. Durante las primeras 10 h de la mayor parte de alimentacin de la galactosa es simplemente acumulada. Sin embargo, todava se produjeron tanto el crecimiento de la biomasa y la produccin de protenas. El acetato acumulado tanto en el inicio de la introduccin y la espuma en el inicio de la absorcin de galactosa. El crecimiento en galactosa mostr dos etapas diferentes: una fase exponencial seguido por el crecimiento casi lineal. Fermentacin B: lote de fermentacin en galactosa Una fermentacin por lotes de galactosa se realiz para aclarar algunas observaciones durante la fermentacin A, al saber, la tasa de absorcin de galactosa especfica limitada y la importancia aparente de etilo para interpretar el curso de tiempo de la fermentacin. Inicialmente etanol

prorrogados del inculo se consume. La concentracin de acetato fue aparentemente aumentando en el momento de la primera muestra. La tasa de produccin de dixido de carbono RCP muestra un pico en los primeros 5,5 horas no fue acompaado por ningn pico detectable en la tasa de consumo de oxgeno OUR, lo que sugiere que el cultivo se fermenta la glucosa presente en el inculo. Se observa un pico grande en ambos perfiles OUR y CPR durante el perodo en el que el cultivo creca en etanol. La brusca cada de OUR y RCP en alrededor de 16 horas coincide con el agotamiento de etanol. Debido a un problema en la calibracin del espectrmetro de masas, el OUR fue consistentemente superior a la RCP, y por lo tanto no existe informacin cuantitativa se pueden extraer del anlisis de gases de escape. Los resultados muestran claramente que el crecimiento fue lineal y fue acompaado por una disminucin lineal en la concentracin de galactosa, aunque no se produjo la limitacin de oxgeno. El acetato estuvo presente en una concentracin muy constante a lo largo de la fermentacin a pesar del bajo flujo a travs de la gluclisis. Fermentacin C: fermentacin fed-batch alimentada con la glucosa y galactosa La tasa de absorcin de galactosa que conduce a mayores tiempos de crecimiento y de produccin (es decir, baja productividad volumtrica) cuando se utiliza galactosa como nica fuente de carbono. Sera ventajoso si la cepa pudiera crecer en glucosa y, al mismo tiempo producir cutinasa debido a la presencia de galactosa. El transporte de galactosa en la clula, es necesario para la induccin de la galactosa que se produzca es reprimida por la presencia de glucosa (zcan y Johnston 1999). Adems, las cepas silvestres de S. cerevisiae continuo crecimiento en galactosa dejan metabolizar la galactosa tras la adicin de un pulso de glucosa, pero se reinician metabolizar la galactosa cuando se deja caer la concentracin de glucosa en gotas (. Sicrkstra et al 1992). Para investigar la influencia de la glucosa en la absorcin de galactosa y la produccin de protena de un lote alimentado con una alimentacin mixta de glucosa y galactosa se realiza. Un lote de crecimiento se llev a cabo para la biomasa acumulacin antes del perodo de alimentacin. En un medio que contiene glucosa y galactosa de manera que cuando se inici la fase de alimentacin por lotes las clulas ya eran capaces de metabolizar la galactosa. El comportamiento del cultivo durante las primeras 12h seguido de cerca que se obtenga cuando el crecimiento de la cepa sobre la glucosa en forma discontinua. La glucosa se consume fcilmente, con la produccin concomitante de etanol y acetato. Tras el agotamiento de glucosa no se observ consumo de galactosa inmediata, la fuente de carbono es etanol. La sntesis de las enzimas necesarias para la utilizacin de galactosa explica este retraso en la absorcin de galactosa. La concentracin de acetato aument hasta alrededor de 15 horas de fermentacin, 3 h despus de agotamiento de la glucosa, y slo entonces se inici el consumo de galactosa. En esta etapa, la galactosa y etanol se consumieron simultneamente. Un ligero incremento en la concentracin de protena tambin se absorbi tras el agotamiento de glucosa. Es decir, cuando el cultivo se convirti en no reprimido y fue capaz de tomar hasta galactosa.

Al comienzo del perodo de alimentacin exponencial, la concentracin de galactosa disminuye alrededor de 20 horas y se detecta una ligera acumulacin de la glucosa. La galactosa se comienza a acumular a partir de entonces, mientras que casi toda la glucosa se consume alimentados con la consiguiente formacin etanol adicional a la masa celular. Se alcanza la concentracin de galactosa entre 4 y 4,5 g / l a pesar de la entrada creciente galactosa. Este nivel de concentracin tambin se mantiene cuando la tasa de alimentacin se mantiene constante. Durante el perodo de alimentacin, tanto el etanol y el acetato se acumulan. La RCP aumenta bruscamente mientras que la alimentacin es exponencial, lo que indica que la fuente de carbono se metaboliza principalmente a travs de la va fermentativa. Durante el perodo de alimentacin constante, la RCP disminuye como resultado de una absorcin de carbono especfico inferior al aumento de las concentraciones de biomasa. Esto significa que el flujo de carbono a la clula individual disminuye y por lo tanto est fermentado fraccin tambin disminuye. Durante este perodo se observ un aumento en la concentracin de protena. De 32h a 52h disminuye la concentracin de etanol y galactosa y el RQ se mantiene cercano al 1g/ml. aunque similares hacia el final de la fase de lote. al final de este perodo, la tasa de absorcin de galactosa es muy baja, aunque la concentracin de galactosa es todava 1 g / l. Entre 52h y 63.5h el etanol restante se consume totalmente, lo que resulta en un aumento significativo en la concentracin de la biomasa a partir de 12,7 g / l a 19,3 g / l. la concentracin de protena se mantuvo constante. Durante este perodo la disminucin QR (a un valor promedio de 0,65) como ya se observ cuando el cultivo se estaba apoderando de etanol. Una vez se agot el acetato del etanol se consumi hasta su agotamiento a 67h. Posteriormente, aunque cerca de uno galactosa permaneci en el caldo, tanto el crecimiento como la produccin de protenas cesaron.