Ano letivo 2012/2013 Disciplina: Bioqumica Experimental I

Purificao do Lisozima da Clara de Ovo (EC 3.2.1.17) por Cromatografia de Troca Inica

Departamento de Qumica e Bioqumica Licenciatura em Bioqumica

Docente: Ana Coutinho Turma: PL 2 Grupo: 3 Data de Realizao: 12 e 13 de Novembro de 2012 Alunos: Alina Ardel n 42628 Ana Fonseca n 41872 Joaquim Veiga n 41871 Mariana So Pedro n 41851

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Purificao do Lisozima da Clara de Ovo por Cromatografia de Troca Inica

ndice
Resumo ........................................................................................................................................3 Parte Experimental .......................................................................................................................4 Resultados Obtidos ......................................................................................................................9 Tratamento e Discusso dos Resultados ....................................................................................10 Cromatografia de Troca Inica ...............................................................................................10 Doseamento da Concentrao Proteica .................................................................................14 Doseamento da Atividade Enzimtica e Especfica ................................................................18 SDS-PAGE ...............................................................................................................................25 Purificao do Enzima ............................................................................................................28 Concluso ...................................................................................................................................30 Bibliografia .................................................................................................................................30 Anexos........................................................................................................................................31

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Purificao do Lisozima da Clara de Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Resumo
O trabalho experimental realizado tem como objetivo a exemplificao de um processo de purificao enzimtica, realizando-se para tal a purificao parcial do lisozima da clara de ovo por cromatografia de troca catinica. Esta tcnica cromatogrfica explora o pI das protenas, permitindo a reteno do enzima desejado na coluna e a eluio das demais protenas sem interesse. Em primeiro lugar, fez-se a recolha das diferentes fraes para a realizao dos posteriores ensaios de atividade enzimtica e SDS-PAGE. Atravs do processo de cromatografia de troca inica foram obtidas 31 fraes de amostra, num volume final de 225 mL. O cromatograma deste mtodo apresenta 3 picos, correspondentes s fraes 3, 8 e 16, onde o primeiro corresponde eluio de outras protenas presente na clara do ovo, o segundo corresponde avidina e o ultimo eluio do lisozima. A absorvncia de cada frao foi medida de modo a se calcular a concentrao proteica correspondente. Finalmente, a SDS-PAGE realizada serviu para se obter informao acerca do grau de pureza do lisozima isolado. Por anlise do eletroforama conclui-se que o processo de separao foi relativamente bem sucedido, pois possvel observar a separao do lisozima das restantes protenas, apesar dos erros ocorridos nesta etapa. Em suma, podemos verificar que o processo de purificao do lisozima por cromatografia de troca catinica tem bastante sucesso, uma vez que se obteve um rendimento de aproximadamente 18,42%, e um grau de purificao do lisozima de 31,55 para a frao 17, a frao com maior atividade enzimtica.

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Parte Experimental

Cromatografia de Troca Inica Materiais Coluna de cromatografia 40 x 2,6 cm; Bomba peristltica; Cronmetro; Espectrofotmetro UV-Vis; Cuvettes de quartzo e de vidro; Pipetas automticas; Aparelho medidor de pH; Gaze. Reagentes Ovos; Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,5 M com NaCl 0,5 M [10X]; Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M; Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0.02% (m/v); Tampo de carbonatos (pH 10,5) 0,4 M [2X]; Tampo de carbonatos (pH 10,5) 0,2 M; Tampo de carbonatos (pH 10,5) 0,2 M com NaN3 0.02 % (m/v); CM-Sephadex C-25. Procedimento Montagem da coluna A coluna utilizada no trabalho experimental encontrava-se j preparada mas a sua montagem deve-se fazer da seguinte maneira:

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Decantar a maior parte do tampo, deixando uma mistura com aproximadamente 75% de gel sedimentado e 25% de tampo sobrenadante

Antes de introduzir o gel na coluna, proceder ao seu desarejamento num Kitasato, por um perodo de 15-30 min, agitando de vez em quando

Guardar num recipiente bem rolhado a 4C, at este ser utilizado

Com o auxlio de um funil e de uma vareta de vidro, verter a mistura de gel em tampo na coluna at a encher completamente

Abrir a vlvula de entrada de tampo na coluna e introduzir 5-10 mL de tampo Tris-HCl, mantendo a sua sada fechada

Montar a coluna verticalmente. Verificar se a sada da coluna veda bem. Encher todos os volumes mortos da coluna com tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M

Abrir a vlvula de sada da coluna, mantendo um caudal de tampo Tris constante (aproximadamente 1,6 - 1,8 mL/min), de modo a que o empacotamento do permutador se faa gradualmente.

Medir o fluxo de tampo atravs da coluna medindo o volume eludo em 2 min. Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura.

Equilibre a coluna atravs da passagem de um volume de tampo inicial de eluio (tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M) aproximadamente igual a 2 - 3 vezes o volume total da coluna preparada.

No final, mea a altura do gel empacotado na coluna, assim como o dimetro desta.

Preparao da Amostra

Filtrar uma clara de ovo atravs de uma camada dupla de gaze para um copo de 100 mL

Comprimir suavemente o saco da gaze contra a parede do copo sem forar. O material que passa o filtrado

Transferir 5 mL de filtrado para um segundo copo de 100 mL

Mant-lo a 4C e conservar a amostra devidamente identificada

Passar a mistura atravs de uma camada de l de vidro colocada no interior d euma seringa de 10 mL. Este filtrado ser a "Preparao da Clara de Ovo (PCO)"

Diluir com 35 mL de tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com Nacl 0,05 M (diluio de 1/8)

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Bioqumica Experimental I Aplicao da Amostra

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Calibrar um aparelho medidor de pH.

Liguar a bomba peristltica e controlar o fluxo de entrada de tampo na coluna novamente para cerca de 1,6 - 1,8 mL/min.

Parar a eluio da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua sada. Aplicar um volume de PCO (amostra) na coluna igual a cerca de 8 % do seu volume total, de um modo regular.

Medir o valor de pH de cada frao recolhida antes de a colocar em gelo.

Colectar fraes de 15 mL em diferentes provetas at passar atravs da coluna um volume total de tampo aproximadamente igual ao volume da coluna preparada. Controlar o fluxo.

Aps toda a amostra ter penetrado no gel, abrir a sada da coluna e iniciar a sua eluio (no deixe secar o gel).

Passar a proceder eluio da coluna com o tampo carbonatos de sdio (pH 10,5) 0,2 M, recolhendo fraes de 10 mL at registar um aumento brusco no seu valor de pH para cerca de 8,5.

Reduzir o volume de cada fraco recolhida para 5 mL.

Parar a eluio da coluna quando o valor de pH das fraces estabilizar perto de 10,5.

Conservar as fraes devidamente identificadas em gelo at ao final do trabalho.

Fazer tambm uma leitura de Abs(280 nm) do tampo Tris e do tampo de carbonatos usados na eluio da coluna.

Realizar leituras de Abs(280 nm). Para isso, acertar o zero do espectrofotmetro com gua destilada

Lavar a coluna com um volume de tampo de carbonatos (pH 10,5) 0,2M igual a 2 vezes o volume da coluna, abrir a sada da coluna e iniciar a eluio

Regenerar as condies iniciais passando dois volumes de soluo tampo de eluio Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0.02% (m/v) atravs da coluna.

Deixar claramente indicado na coluna qual o ltimo tampo utilizado

Doseamento da concentrao da protena Material Espectrofotmetro UV-Vis; Cuvettes de quartzo.

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Bioqumica Experimental I Procedimento

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Efectuar leituras de absorvncia a 280 nm de cada amostra aps acertar o zero do espectofotmetro com gua destilada

Se necessrio, proceder diluio prvia das amostras com a soluo tampo adequada

Medir a absorvncia a 280 nm das vrias solues tampo usadas em cada cromatografia

Doseamento da atividade enzimtica Material Homogeneizador de Potter-Elvejhem; Cuvettes de plstico; Pipetas automticas. Reagentes Tampo de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M; Substrato de parede celular 0,6 mg/mL [2X]; Substrato de parede celular 0,3 mg/mL.

Procedimento
Adicionar 0,1 mL da frao em estudo e misturar rapidamente por inverso, tapando o topo da clula com um quadrado de parafilm

Acertar o zero do espectrofotmetro a 450 nm com tampo de fosfatos (pH 7,0) 0,1M

Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma clula de absoro

Guardar as vrias fraces e a amostra PCO no frigorfico

Repetir as determinaes realizadas anteriormente com a amostra PCO

Medir o decrscimo da absorvncia a 450 nm da amostra durante um minuto

SDS-PAGE Material Sistema de polimerizao de gis Placas de vidro para electroforese (mini) Tina de electroforese vertical (mini) Espaadores (0,75 mm) e pentes (0,75 mm) Fonte de alimentao (500 V/ 150 mA) Pgina 7 de 38

Bioqumica Experimental I Pipetas automticas

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Reagentes Lisozima 2 mg/mL Mistura etanol-ter etlico (2:1, v/v) Soluo de acrilamida-bisacrilamida (30%T, 2,7% C) Tampo Tris-HCl (pH 8,8) 1,5 M - tampo do gel resolvente concentrado Tampo Tris-HCl (pH 6,8) 0,5 M - tampo do gel de concentrao concentrado Persulfato de amnio (PSA) 10% (p/v) TEMED (N,N,N,N-tetrametilnediamina) Tampo de electroforese Tris 0,025 M, glicina 0,192 M, SDS 0,1 % (p/v), pH 8,3 Tampo de aplicao de amostra [2X] Tris-HCl (pH 6,8) 0,0625 M, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% e azul de bromofenol 0,004% Dodecilo sulfato de sdio (SDS) 10% (p/v) Azul de bromofenol 0,2% (p/v) Soluo corante com Azul Brilhante de Coomassie R-250 Soluo descorante forte Soluo descorante fraca Protenas-padro de massa molecular conhecida Procedimento
Montagem das"sandwichs" de placas de vidro com os cuidados necessrios

Preparar os gis e adicionar "sandwich"

Deixar polimerizar

Aquecer no banho de gua a ferver durante 5min.

Preparao das amostras segundo protocolo

Montar a cmara electrofortica limpando os poos com seringa e tampo utilizado

Arrefecer imediatamente em gelo

Aplicar as amostras nos poos do gel com o auxlio de uma micropipeta

Colocar a tampa de cmara electrofortica

Por fim, remover o gel e medir o comprimento do gel de separao e a distncia migrada pelo azul de bromofenol

Deixar correr a electroforese at o azul de bromofenol atingir o fim do gel resolvente (cerca de 1h-1h30)

Ligar os elctrodos, regular a voltagem e registar a intensidade da corrente

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Resultados Obtidos
Tabela 1 pH e Abs280 das fraes recolhidas da cromatografia de troca inica

Fraes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Volume da Frao (mL) 15 15 15 15 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Volume Eluio (mL) 15 30 45 60 70 80 90 100 110 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225

pH 8,11 8,11 8,10 8,08 8,11 8,20 8,20 8,11 8,43 8,67 8,67 8,66 8,67 8,70 9,06 9,52 9,77 9,95 10,06 10,14 10,23 10,03 10,18 10,23 10,25 10,28 10,29 10,30 10,30 10,31 10,31

Abs280 0,012 0,174 0,332 0,035 0,019 0,011 0,038 0,050 0,008 0,005 0,007 0,004 0,006 0,010 0,133 0,214 0,189 0,162 0,140 0,119 0,101 0,097 0,069 0,052 0,031 0,031 0,019 0,012 0,008 0,001 0,000

Tabela 2 - pH e Abs280 dos tampes utilizados e da preparao da clara de ovo

pH PCO Tampo Tris-HCl Tampo Carbonatos 8,2 10,5

Abs280 1,216 0,002 0,000

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Tratamento e Discusso dos Resultados

Cromatografia de Troca Inica

Cromatograma da Abs e pH em funo do Volume de eluio

0,35 0,3 0,25 Pico 3 0,2 Abs280nm 0,15 0,1 0,05 0 0 -0,05 50 100 150 200 250 7 Volume de eluio (mL) pH=8,11 pH=8,67 Pico 1 pH=10,30 10,5 10 9,5 9

8,5 Pico 2
8 7,5

pH

Abs280nm pH

Figura 1 - Cromatograma resultante das medies de pH e Abs280nm vs Volume de eluio da coluna

Atravs da anlise do cromatograma obtido (Figura 1), pela observao da linha correspondente absorvncia em funo do volume de eluio, possvel verificar a existncia de 3 picos distintos. O pico 1, com um mximo de Abs280nm=0,332, corresponde eluio da maior parte das protenas presentes na PCO, excetuando aquelas que ficam retidas na matriz, a avidina e o lisozima. Nesta etapa, a carga global das protenas referidas maioritariamente neutra ou negativa, pois todas apresentam um pI inferior ao pH do tampo Tris-HCl (pH 8,2), sendo por isso eludas em primeiro lugar. As outras duas protenas ficam retidas na matriz j que tm pI prximos (pI avidina=10, pIlisozima=10,7) e porque, ao valor de pH referido apresentam carga global positiva, interatuando assim com a matriz de carga negativa. De forma a conseguirmos eluir a protena de interesse, o lisozima, foi necessrio utilizar uma soluo tampo de carbonatos de sdio (pH 10,5). Esta tem um pH superior ao tampo anterior, o que provoca a alterao da carga global, tanto do lisozima como da avidina, para um valor quase nulo, ou seja, atingindo-se o pI e, portanto, estas eluem nas fraes seguintes. Pgina 10 de 38

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O segundo pico (pico 2), com Abs280nm=0,050, tem uma amplitude pequena, de onde se pode deduzir que seja a frao correspondente avidina, pois espera-se que a concentrao desta protena na clara de ovo seja pequena (0,051%). O ltimo pico observado (pico 3), com Abs280nm=0,214, corresponde ento eluio do lisozima, onde j se espera uma concentrao de protena mais elevada (3,4%). Para alm de se fazer o controlo da absorvncia de cada frao, fez-se paralelamente o controlo do pH das vrias fraes, tendo-se obtido graficamente a linha representada a azul. Inicialmente utilizou-se tampo Tris-HCl (pH 8,2) durante a eluio das primeiras quatro fraes (de 15 mL), o que corresponde passagem de um volume de tampo aproximadamente igual ao volume da coluna preparada (V=55,74 cm3) e verificou-se que nesta parte o pH se mantm aproximadamente constante (pH 8,11). De seguida, procedeu-se eluio da coluna com tampo de carbonatos de sdio (pH 10,5) em fraes de 10 mL, verificando-se, em primeiro lugar, um ligeiro aumento de pH e depois um aumento brusco para 8,67 (prximo de 8,5 como referido no protocolo) que determinou a reduo do volume de frao a recolher para fraes de apenas 5 mL. A partir deste momento o pH continua a subir at ao final da cromatografia, estabilizando a um valor prximo de 10,3, no nosso caso. Apesar de tudo, em alguns tubos observa-se uma pequena descida do valor de pH, em vez de este continuar a subir gradualmente como esperado. Isto aconteceu provavelmente devido a erros de medio ou talvez devido descalibrao do aparelho medidor de pH.

Clculo da fora inica De forma a se poder avaliar a compactao reversvel sofrida pelo gel durante a cromatografia realizada necessrio determinar as foras inicas dos tampes utilizados. Para calcular a fora inica de uma soluo, utiliza-se a expresso seguinte:

Onde: = Fora inica = Concentrao de cada espcie carregada = Carga da respetiva espcie

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Bioqumica Experimental I Tampo Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M NaCl 0,05 M O equilbrio da reao tampo dado por:

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Pela equao de Henderson-Hasselbalch possvel calcular a concentrao das duas espcies sabendo o pH (8,2), pKa (8,06 a 25C) e molaridade (0,05 M) do tampo.

Para alm disso, sabe-se que

e que

tem de ser igual

, de forma a neutralizar a soluo, pois atua como contra-io. Ento, substituindo na equao da fora inica, vem:

Tampo de Carbonatos de Sdio (pH 10,5) 0,2 M J para o tampo de carbonatos de sdio a reao de equilbrio :

Utilizando a equao de Henderson-Hasselbalch possvel determinar a concentrao dos ies do tampo presentes em soluo, sabendo o pH (10,5), pKa (10,33 a 25C) e a molaridade (0,2 M) desta soluo.

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Neste caso o Na+ que atua como contra-io, logo, para manter a neutralidade da soluo, a sua concentrao tem de ser igual a: e Assim, substituindo na expresso da fora inica, vem:

Atravs dos clculos realizados verifica-se que a fora inica do tampo de carbonatos de sdio ( ) dez vezes superior fora inica do tampo Tris-HCl ( ).

Isto na cromatografia de troca inica traduz-se num aumento de cargas positivas. Assim, as espcies carregadas positivamente vo competir pela ligao ao gel, que tem carga negativa, facilitando ento o processo de eluio do lisozima. Para alm disso, o aumento de ies positivos provoca tambm a diminuio da repulso entre as cargas negativas do gel, levando compactao do mesmo. No entanto esta compactao reversvel, uma vez que, ao substituirmos o tampo de carbonatos de sdio pelo tampo Tris-HCl, o gel da coluna retoma a sua altura inicial, ou seja, h uma descompactao do gel, pois a fora inica diminui, aumentando novamente a repulso entre cargas negativas. tambm por esta razo que no final da cromatografia se lava a coluna com a soluo tampo Tris-HCl.

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Doseamento da Concentrao Proteica

Para se determinar a concentrao proteica das vrias fraes e do PCO aplica-se a lei de Lambert-Beer que expressa pela seguinte expresso:

onde o absoro,

corresponde absorvncia a um dado comprimento de onda, ao coeficiente de ao comprimento da cuvette que o feixe de luz atravessa e concentrao

proteica da amostra. Tambm tem que se ter em conta s diluies que possam ter sido realizadas s fraes ou ao PCO. De seguida demonstrar-se- uma exemplificao para os clculos realizados, usando o PCO:

A concentrao proteica do PCO

. Repetiu-se estes clculos para as

restantes fraes e com os resultados obtidos construi-se a Tabela 3.

Tabela 3 - Doseamento Proteico do PCO e das vrias fraes recolhidas atravs de cromatografia de troca inica

Frao PCO 1 2 3 4 5 6 7

Vfrao 15 15 15 15 10 10 10

Veluio 15 30 45 60 70 80 90

pH

Abs280 1,216 0,012 0,174 0,332 0,035 0,019 0,011 0,038

Diluio 1:10 1 1:10 1 1 1 1 1

[prot] (mg/mL) 12,160 0,012 1,740 0,332 0,035 0,019 0,007 0,024 Pgina 14 de 38

8,11 8,11 8,10 8,08 8,11 8,20 8,20

Bioqumica Experimental I 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 100 110 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 8,11 8,43 8,67 8,67 8,66 8,67 8,70 9,06 9,52 9,77 9,95 10,06 10,14 10,23 10,03 10,18 10,23 10,25 10,28 10,29 10,30 10,30 10,31 10,31

Purificao do Lisozima da Clara de Ovo por Cromatografia de Troca Inica 0,050 0,008 0,005 0,007 0,004 0,006 0,010 0,133 0,214 0,189 0,162 0,140 0,119 0,101 0,097 0,069 0,052 0,031 0,031 0,019 0,012 0,008 0,001 0,000 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,032 0,005 0,005 0,007 0,004 0,006 0,010 0,050 0,081 0,071 0,061 0,053 0,045 0,038 0,037 0,026 0,020 0,012 0,012 0,007 0,005 0,003 0,0003 0,000

Ainda tem que se esclarecer o facto de se ter usado trs coeficientes de absoro para calcular a concentrao proteica e o seu valor aproximado:

No caso do avidina e do lisozima, para se saber o calcular este a partir do

de cada protena, tem que se .

tabelado (Tabela 4) que corresponde ao

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correspondente

Tabela 4 - Protenas presentes na clara de ovo e o seu

Protena Ovalbumina Ovotransferrina Ovomucoide Lisozima Ovoinibidor Ovogliprotena Avidina 7,5 11,6 4,55 26,35 7,4 3,8 15,7

Como tal, para determinar a concentrao proteica nas fraes que contenham avidina e lisozima utiliza-se os valores anteriores. Em relao s fraes que so compostas por uma mistura de protenas, utiliza-se , j que resulta de uma aproximao utilizando o mdio para a mistura de protena que constitui a clara do ovo. Sabendo o das protenas presentes na clara de ovo (Tabela 4) pode-se calcular o : de cada uma

Conhecendo o

mdio, pode-se chegar ao

mdio:

Note-se que o clculo do feito para a mistura proteica da clara de ovo uma mera aproximao, visto que se fez uma mdia aritmtica de todos os valores de das protenas,

o que implicaria que as propores destas protenas na clara de ovo so iguais, algo que no verdade. Assim, utiliza-se o valor de para as fraes que contenham uma mistura

de protenas. Essas fraes so as primeiras fraes recolhidas at ao segundo pico, frao 5 inclusive, onde se prev que comece a sair a protena avidina. Nesse pico utiliza-se o valor de Pgina 16 de 38

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. A seguir ao segundo pico, frao 9, volta-se a utilizar o para a mistura de protenas at frao 15. A partir desta frao e at ao final, usa-se o j que se

suspeita que ser aqui que a nica protena presente (ou em maior abundncia) seja o lisozima. A aproximao alternativa a um ensaio espectrofotomtrico direto consiste em ensaiar o contedo proteico de cada frao recorrendo-se a um mtodo qumico do tipo do de Lowry ou de Bradford. No mtodo de Lowry, utiliza-se o reagente de biureto que tem como funo detetar a presena de ligaes peptdicas originando um complexo de cor violeta. Ento possvel determinar a concentrao das protenas nas substncias atravs de medidas

espectrofotomtricas a um determinado comprimento de onda. O mtodo de Bradford usa-se para determinar o teor de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250. Este corante interage com as macromolculas da protena que contm aminocidos nas cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH timo da reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente a 595 nm, podendo assim analisar espectrofotometricamente. Em qualquer um dos mtodos utilizados necessrio construir uma reta de calibrao para que com esta se saiba a concentrao das protenas presentes na clara de ovo. Os maiores valores de absorvncia, isto , com cor mais intensa, iro corresponder frao com maior concentrao j que h maior nmero de ligaes peptdicas.

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Doseamento da Atividade Enzimtica e Especfica

A atividade enzimtica uma medida da quantidade de enzima de interesse existente numa dada frao, mas no fornece informao sobre as protenas contaminantes que tambm possam estar presentes. Ento necessrio introduzir um novo parmetro, a atividade especfica da amostra. A atividade especfica do enzima que se pretende purificar ser baixa no extrato original e dever aumentar progressivamente durante a sua purificao, at se atingir um valor mximo quando o enzima se encontra puro. A atividade especfica uma medida do grau de pureza final do enzima.

Agora procede-se ao clculo da atividade enzimtica atravs de um ensaio enzimtico do PCO e das diferentes fraes obtidas (Frao 3, 8, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21). Isto tem como objetivo verificar em que fraes existe lisozima. Estas fraes tero maior atividade enzimtica. Clculo da concentrao proteica (PCO) Para se calcular a atividade enzimtica tem que se saber primeiro a concentrao proteica das diferentes amostras. A concentrao j foi calculada anteriormente, a partir da Lei de Lambert-Beer. A concentrao proteica do PCO e a concentrao das

restantes fraes encontra-se na Tabela 3. Em relao concentrao das protenas nas diferentes diluies feitas ao PCO, tem que se ter em ateno ao fator de diluio e multiplicalo pela concentrao proteica da amostra de PCO no diluda. Por exemplo, para o PCO 1:10, tem se:

Para o resto das amostras o clculo anlogo e encontra-se na Tabela 5. Ensaio Enzimtico Traou-se vrios grficos da retiram-se os valores de em funo do tempo e atravs da usa anlise para cada amostra. Estes grficos

encontram-se em anexo, mas fez-se uma condensao desses, que se encontra na Figura 2.

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Absorvncia a 450 nm em 60 segundos

1

0,9 Abs (450nm)

Diluio(1:1) Diluio(1:2) Diluio(1:5)

0,8

Diluio(1:10)

0,7

Diluio(1:20) Diluio(1:40)

0,6 0 10 20 30 Tempo (s) 40 50 60

Figura 2 - Doseamento da atividade enzimtica do PCO

A partir da anlise do grfico podemos dizer que o PCO 1:1 e 1:2 so os que tem maior atividade j que quanto maior a atividade enzimtica, maior o declive da reta. Os grficos obtidos para a anlise de cada frao de interesse (e respetiva diluio) esto representados de forma condensada na Figura 3. Os outros grficos podem ser encontrados, de forma individual em Anexo.

1,02 1 0,98 Abs (280 nm)

absorvncia vs tempo - fraes

Frao 3 Frao 8 Frao 14

0,96
0,94 0,92 0,9 0,88 0 10 20 30 Tempo (s) 40 50 60

Frao 15 Frao 16 Frao 17 Frao 18 Frao 19 Frao 20 Frao 21

Figura 3 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo relativamente aos ensaios enzimticos para as diferentes fraes de interesse recolhidas da coluna

Uma vez analisados os grficos possvel constatar, tanto empiricamente como analiticamente, pelo declive das equaes de regresso linear de cada curva, que os tubos que Pgina 19 de 38

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apresentam maior atividade so os tubos 16, o que corresponde ao 2 Pico, e 17. Tambm podemos concluir que no primeiro e segundo pico, frao 3 e 8, respetivamente, no h praticamente atividade, pelo que podemos afirmar que no existe lisozima nessas fraes. Estes grficos apresentam uma variao de absorvncia negativa, j que o lisozima promove a lise celular, visto que o meio da clula hipertnico em relao ao exterior. Por outro lado, o decrscimo da absorvncia nas fraes em que est presente o lisozima deve-se diminuio da turbidez da suspenso celular, devido hidrlise do substrato por parte do enzima. Clculo da atividade A atividade enzimtica calculada pelo nmero de unidades enzimticas por quantidade de volume aplicado da amostra. Tomando como exemplo o clculo da atividade da frao 16, Pico 3, iremos demonstrar como procedemos ao clculo da atividade enzimtica. Sabendo a concentrao proteica da frao 16 0,081 mg/mL e que uma unidade enzimtica do lisozima igual ao nmero de centros catalticos que conduzem a uma variao de absorvncia a 450 nm de 0,001 unidades por minuto, nas condies do ensaio realizado (pH 7,0, T= 25 C, volume total do ensaio igual a 3 mL). Para tal, necessrio saber a variao de absorvncia em cada ensaio. Tal conseguido atravs do declive das retas de regresso linear dos grficos obtidos. O declive das retas dado em variao de absorvncia por segundo. Como a definio de unidade pede que a variao seja num minuto, ento: regresso. No caso da Frao 16, o declive da reta . Pela definio, uma unidade enzimtica aquela que leva diminuio de 0,001 de absorvncia a 450nm (devido ao consumo de reagente parede celular de levedura). Assim, tem que se dividir a variao obtida anteriormente por 0,001 e usar o valor simtrico, pois est a ocorrer consumo do substrato, levando a uma variao logicamente negativa. , sendo m o declive da reta da . Ento,

A atividade enzimtica calculada pelo nmero de unidade enzimtica por quantidade de volume aplicado de amostra, que, neste caso, foi 0,1mL. Assim, temos:

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Para as restantes fraes utilizadas procedeu-se da mesma forma para o clculo da atividade.
Tabela 5 - Resumo dos ensaios da atividade enzimtica para o PCO e para as vrias fraes recolhidas com interesse

Diluio [Prot]inicial Abs450nm/t Atividade realizada (mg/mL) (UA/min) (U/mL) 1/1 12,160 -0,228 2280 1/2 6,080 -0,144 1440 1/5 2,432 -0,072 720 PCO 1 / 10 1,216 -0,036 360 1 / 20 0,608 -0,012 120 1 / 40 0,304 -0,0048 48 Frao 3* 0,332 0 0,00004 Frao 8* 0,032 0 0,00001 Frao 14* 0,010 0 0,000003 Frao 15 0,050 -0,024 240 Frao 16 0,081 -0,036 360 Frao 17 0,071 -0,042 420 Frao 18 0,061 -0,036 360 Frao 19 0,053 -0,024 240 Frao 20 0,045 -0,024 240 Frao 21 0,038 -0,018 180 *No caso das fraes 3, 8 e 14 no se calculou a sua atividade enzimtica pois a variao de absorvncia registada nestas fraes era positiva, o que implicava que no ocorre se a degradao da parede celular, e a sua concentrao estivesse a aumentar, algo que no faz sentido. Deste modo iremos considerar a atividade nula, uma vez que no h indcios de haver lisozima nas fraes em questo. Amostra

Clculo da atividade especfica (SA) A atividade especfica a atividade enzimtica expressa em quantidade de protena na frao a analisar. Tomando novamente como exemplo a frao 16:

O procedimento foi igual para as restantes fraes e para a PCO, sendo a Tabela 6 o resumo dos valores obtidos.

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Tabela 6 - Concentrao de protena, atividade enzimtica e atividade especfica presentes nas fraes de interesse e nas diferentes diluies de PCO

Amostra

Diluio 1 /1 1/2 1/5 1 / 10 1 / 20 1 / 40 -

[Prot]inicial (mg/mL) 12,160 6,080 2,432 1,216 0,608 0,304 0,332 0,032 0,010 0,050 0,081 0,071 0,061 0,053 0,045 0,038

Atividade (U/mL) 2280 1440 720 360 120 48 0 0 0 240 360 420 360 240 240 180

PCO

Frao 3* Frao 8* Frao 14* Frao 15 Frao 16 Frao 17 Frao 18 Frao 19 Frao 20 Frao 21

Atividade especfica (U/mg) 187,5 236,842 296,053 296,053 197,368 157,895 0 0 0 4800 4444,44 5915,49 5901,64 4528,3 5333,33 4736,84

De modo a estabelecer o intervalo de linearidade entre a atividade enzimtica e a concentrao de enzima usado no ensaio, construram-se o seguinte grfico:

Atividade vs [proteica]
3000 2500 Atividade (U/mL) 2000 1500

y = 187,44x + 115,71 R = 0,9746

1000
500 0 0 2 4 6 8 10 12 14 [proteica] (mg/mL)

Figura 4 - Grfico da atividade enzimtica vs concentrao proteica das diferentes diluies de PCO

Pela anlise do grfico da Figura 4, regista-se um aumento da atividade enzimtica de forma quase linear com o aumento da concentrao da protena. Este facto demonstra-se ser Pgina 22 de 38

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lgico, pois com maior quantidade de protena em soluo, maior sera quantidade de lisozima presente. Com maior percentagem de lisozima presente em soluo, maior ser a velocidade de reaco registada, e, consequentemente, maior actividade enzimtica. Depois dos clculos anteriores, procedeu-se ao preenchimento do quadro resumo do doseamento proteico e enzimtico (Tabela 7).
Tabela 7 - Resumo do doseamento proteico e enzimtico

Frao
PCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

Vfrao
15 15 15 15 10 10 10 10 10 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Veluio
15 30 45 60 70 80 90 100 110 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225

pH

Abs280
1,216 0,012 0,174 0,332 0,035 0,019 0,011 0,038 0,050 0,008 0,005 0,007 0,004 0,006 0,010 0,133 0,214 0,189 0,162 0,140 0,119 0,101 0,097 0,069 0,052 0,031 0,031 0,019 0,012 0,008 0,001 0,000

Diluio
1:10 1 1:10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

[prot] (mg/mL)
12,160 0,012 1,740 0,332 0,035 0,019 0,007 0,024 0,032 0,005 0,005 0,007 0,004 0,006 0,010 0,050 0,081 0,071 0,061 0,053 0,045 0,038 0,037 0,026 0,020 0,012 0,012 0,007 0,005 0,003 0,0003 0,000

Abs450nm/t (UA/min)

Actividade (U/mL)

Actividade especfica (U/mg)

0,228
0,00004

2280
240 360 420 360 240 240 180 -

187,5
4800 4444,44 5915,49 5901,64 4528,3 5333,33 4736,84 -

8,11 8,11 8,10 8,08 8,11 8,20 8,20 8,11 8,43 8,67 8,67 8,66 8,67 8,70 9,06 9,52 9,77 9,95 10,06 10,14 10,23 10,03 10,18 10,23 10,25 10,28 10,29 10,30 10,30 10,31 10,31

0,00001 0,000003 -0,024 -0,036 -0,042 -0,036 -0,024 -0,024 -0,018 -

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Com os dados da Tabela 7, pode-se ento traar o cromatograma que apresenta a concentrao de protena e a atividade especfica em funo do volume de eluio. A atividade especfica das restantes fraes, para as quais no foram feitos ensaios enzimticos, considerase nula dado o pouco contedo proteico presente nas mesmas.

[prot] e SA vs Veluio
2 1,8 1,6 1,4 [proteica] (mg/mL) 1,2 1 3000 2000 1000 0 0 50 100 150 Veluio (mL) 200 5000 4000 7000 6000 Atividade Especfica (U/mg)
[prot] (mg/mL)

0,8 0,6 0,4

Actividade especfica (U/mg)

0,2
0

Figura 5 - Cromatograma resultante da concentrao proteica e da atividade especfica com o volume de eluio

Atravs da anlise da Figura 5, pode-se concluir que nas fraes que correspondem lavagem da coluna, onde ocorre o primeiro mximo de concentrao proteica, no ocorrendo eluio de lisozima. Isto justifica-se porque no houve registo de qualquer atividade especfica na frao com maior quantidade de protena deste pico. O mximo de atividade especfica dse entre as fraes 15 e 21, onde existe tambm um segundo mximo de concentrao proteica embora no seja to grande como o primeiro. A localizao equivalente da atividade especfica com a regio onde se suspeita que o lisozima tenha sido eludo d a ideia de este estar com um elevado nvel de pureza.

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SDS-PAGE

Figura 6 - Eletroforama obtido experimentalmente SDS-PAGE

De forma a se poder comentar o eletroforama, importante indicar que amostras foram colocadas em cada poo.
Tabela 8 - Amostras colocadas em cada um dos poos

Poo Amostra
.

1 PCO

2 Pico 1

3 Pico 2

4 Pico 3

5 Lisozima

6 Frao 15

7 Pico 3

8 Padro

9 PCO

O grau de pureza final da preparao enzimtica pode ser avaliado ao sequenciar o contedo da amostra. Um mtodo rpido e simples para esse efeito o SDS-PAGE electroforese unidimensional em gel de SDS-policrilamida. No poo 8 foi inserida uma amostra de mistura padro, contendo 6 protenas (Tabela 9). Analisando as bandas obtidas para este poo, obtiveram-se 7 bandas em vez de 6 o que leva a pensar que uma das protenas dissociou-se em 2 subunidades levando ao aparecimento de 2 bandas em vez de 1 para esta. Perante esta situao, considerou-se que as bandas 3 e 4 pertencem mesma protena ovalbumina pois, esta protena a nica que constitui tanto a amostra padro como o PCO bandas 1 e 9, verificando-se que para o PCO (olhando para os 2 poos correspondentes) existe uma certa correspondncia entre a sua primeira banda e as 2 bandas do padro. Assim sendo, para a amostra padro tem-se as seguintes bandas, lidas de cima para baixo, do electroforama: Fosforilase B, Albumina, Ovalbumina, Anidrase carbnica, Inibidor de tripsina e Lactalumina. Esta concluso fcil de retirar, pois, quanto menor a massa molecular maior o alcance da banda.

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Tabela 9 - Protenas constituintes da mistura padro e correspondentes massas moleculares

Protena/Fonte Fosforilase B/ msculo de rato Albumina/ soro de boi Ovalbumina/ clara de ovo Anidrase carbnica/ eritrcitos bovinos Inibidor de tripsina/ soja Lactalbumina/ leite bovino

O poo 1 e 9 contm PCO e isto confirma-se pela semelhana das bandas apresentadas. O PCO constitudo pelas protenas apresentadas na Tabela 10.
Tabela 10 - Protenas constituintes do PCO e correspondentes massas moleculares

Protenas Ovomacroglobina Ovotransferrina Avidina Ovoinibidor Ovoalbumina Ovomucoide Ovoglicoprotena Lisozima

Mr (por subunidade) 780 000 76 600 68 300 49 000 43 000 28 000 24 000 14 300

Analisando no eletroforama os poos 1 e 9 vemos a existncia de duas banda bem definidas e por uma mancha. Ora analisando a primeira banda e comparando-a mistura padro, vemos que esta no coincide com nenhumas das bandas da mistura padro, estando localizada entre a primeira (banda do fosforilase B com Mr=94 000) e a segunda banda (Albumina com Mr= 67 000) da amostra padro. Ora isto leva a penar que a protena correspondente a essa banda do PCO uma protena com um valor da massa molecular localizado entre as massas do fosforilase B e da albumina. Olhando para a Tabela 10, poder ser a ovotransferrina (Mr= 76 600) por a banda do poo 1 estar mais prxima da banda 1 do padro. A 3 banda corresponde ovalbumina tal como referido anteriormente e a terceira e ltima banda corresponde ao lisozima. Esta afirmao provada pelos seguintes fatos: a mistura padro no contm lisozima logo no existe nenhuma banda para esta protena na mistura que possa corresponder a esta banda e, para alm disso, sabendo que no poo 5 temse lisozima purificado, a banda obtida coincide perfeitamente com a ltima banda do PCO.

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No poo 2 tem-se a frao correspondente quela que, aquando da leitura no espectrofotmetro, originou o primeiro mximo de absorvncia no grfico absorvncia vs frao. Ora, esta frao possui as protenas que no aderiram matriz da coluna, sendo eludas em primeiro. Na Figura 6, olhando para o poo 2, observam-se 2 bandas. Sabendo que no poo 8 foi colocada uma amostra de mistura padro (ver Tabela 9) de massa molecular conhecida, ao fazer a correspondncia entre as bandas deste poo com as bandas do poo 2 facilmente consegue-se identificar as protenas deste ltimo: fosforilase B para a 1 banda e ovalbumina para a 2 banda. No poo 3 no se obteve nenhuma banda, no entanto a amostra inserida era de avidina, pois a protena que corresponde a esse pico do grfico absorvncia em funo da frao obtida. No poo 4 tem-se a frao correspondente ao pico 3 do grfico da absorvncia. Ora nessa frao tem-se apenas lisozima sendo esta afirmao confirmada pela existncia de apenas uma banda coincidente com a banda do poo 5 que contm lisozima purificado. O que se constata para este poo a mesma coisa que para o poo 6, correspondente frao imediatamente aps a frao a partir do qual se obteve o pico 3.

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Purificao do Enzima
Com o objetivo de resumir todo o processo de purificao do lisozima provindo da clara de ovo, apresentaremos um quadro resumo dos resultados obtidos, Tabela 11, utilizando os mesmos para a anlise do rendimento e do grau de purificao. O pool de fraes que iremos apresentar o conjunto de fraes que apresenta atividade enzimtica medida experimentalmente, ou seja, das fraes 15 21.
Tabela 11- Resumo da purificao do lisozima da clara de ovo para a cromatografia de troca catinica Volume Prot Atividade Passo de [Prot] Atividade SA Rendimento Purificao total Total total purificao (mg/mL) (U/mL) (U/mg) (%) (x) (mL) (mg) (U) PCO 5 12,16 60,8 2280 11400 187,5 Frao 1 15 0,012 0,18 0 0 0 0 0 Frao 2 15 1,74 26,1 0 0 0 0 0 Frao 3 15 0,332 4,98 0 0 0 0 0 Frao 4 15 0,035 0,525 0 0 0 0 0 Frao 5 10 0,019 0,19 0 0 0 0 0 Frao 6 10 0,007006 0,070064 0 0 0 0 0 Frao 7 10 0,024204 0,242038 0 0 0 0 0 Frao 8 10 0,031847 0,318471 0 0 0 0 0 Frao 9 10 0,005096 0,050955 0 0 0 0 0 Frao 10 10 0,005 0,05 0 0 0 0 0 Frao 11 5 0,007 0,035 0 0 0 0 0 Frao 12 5 0,004 0,02 0 0 0 0 0 Frao 13 5 0,006 0,03 0 0 0 0 0 Frao 14 5 0,01 0,05 0 0 0 0 0 Frao 15 5 0,085 0,423567 240 1200 4800 10,52632 25,6 Frao 16 5 0,081 0,403774 360 1800 4444,44 15,78947 23,70368 Frao 17 5 0,071 0,356604 420 2100 5915,49 18,42105 31,54928 Frao 18 5 0,061 0,30566 360 1800 5901,64 15,78947 31,4754133 Frao 19 5 0,053 0,264151 240 1200 4528,3 10,52632 24,1509333 Frao 20 5 0,045 0,224528 240 1200 5333,33 10,52632 28,4444267 Frao 21 5 0,038 0,190566 180 900 4736,84 7,894737 25,2631467 Frao 22 5 0,037 0,183019 0 0 0 0 0 Frao 23 5 0,026 0,130189 0 0 0 0 0 Frao 24 5 0,020 0,098113 0 0 0 0 0 Frao 25 5 0,012 0,058491 0 0 0 0 0 Frao 26 5 0,012 0,058491 0 0 0 0 0 Frao 27 5 0,007 0,035849 0 0 0 0 0 Frao 28 5 0,005 0,022642 0 0 0 0 0 Frao 29 5 0,003 0,015094 0 0 0 0 0 Frao 30 5 0,0003 0,001887 0 0 0 0 0 Frao 31 5 0,000 0 0 0 0 0 0

Para sabermos a massa de protena e a sua atividade fazemos os seguintes clculos, tomando como exemplo o PCO:

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O clculo do rendimento para cada frao faz-se usando a seguinte frmula:

Exemplificando para a frao 15, vem

Por sua vez, a purificao calculada com o recurso seguinte equao:

Exemplificando novamente para a frao 15:

Os clculos para as restantes fraes so anlogos, e encontram-se na Tabela 11, e conseguimos tirar informao do rendimento e do grau de purificao.

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Purificao do Lisozima da Clara de Ovo por Cromatografia de Troca Inica

Concluso
Na realizao deste trabalho experimental, usou-se uma cromatografia de permuta catinica, obtendo-se trs picos de absorvncia mxima. O primeiro pico (frao 3) corresponde eluio das protenas que no se ligaram coluna. Este facto foi confirmado pelo eletroforama, onde, para esta frao, s se registavam protenas cujo pI era inferior ao pH do tampo de lavagem da coluna. Mudando o pH e a fora inica do tampo de eluio obtm-se os picos 2 e 3. O segundo pico (frao 8), tem uma altura pequena, logo corresponde eluio da avidina, que pode se pode encontrar na PCO em concentraes pequenas. O terceiro pico (frao 16) corresponde eluio do lisozima da coluna, que tem um pI superior ao da avidina. Pelo cromatograma no possvel analisar a pureza destas fraes, sendo esse facto apurado pelo SDS-PAGE. Atravs do electroforama, verifica-se que esta frao tem, de facto, lisozima, mas tambm alguma poro de ovalbumina e ovotransferina. Pela informao das medies da absorvncia a 280nm e a 450nm das diferentes fraes e do PCO, consegue-se obter informaes acerca da concentrao proteica e da atividade enzimtica. Pela relao destes dois valores, obtm-se a atividade especfica do PCO e do pool de fraes em que se espera ter o lisozima. Acrescenta-se ainda que nesta atividade laboratorial no obtivemos uma boa purificao do lisozima pois o grau de purificao obtido para a frao com maior atividade foi de 31,55, com um rendimento correspondente de 18,42%. Isto pode ser explicado pela presena de outras protenas contaminantes, baixando a atividade especfica das fraes com lisozima.

Bibliografia
Boyer RF (1993) Modern Experimental Biochemistry 2nd ed, Benjamin/Cummings Co, Redwood City. Clark JM Jr, Switzer RL (1977) Experimental Biochemistry, 2nd ed. W. H. Freeman & Co, San Francisco. Alexander R, Griffiths JM, Wilkinson ML (1985) Basic Biochemical Methods, John Wiley and Sons, New York.

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Anexos
Grficos

PCO (1:1)
1 0,9 0,8 0,7 Abs(450nm) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 Tempo/s 40 50 60 Abs vs Tempo

y = -0,0038x + 0,9006 R = 1

Figura 7 - Grfico da variao de absorvncia com o tempo do PCO no diludo

PCO (1:2)
0,98 0,96 Abs (450 nm) 0,94 0,92 0,9 0,88 0,86 0,84 0,82 0,8 0 10 20 30 40 Tempo / s 50 60 Abs vs Tempo y = -0,0024x + 0,9577 R = 0,9995

Figura 8 - Grfico da variao de absorvncia com o tempo do PCO diluda 1:2

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0,94 0,93 0,92 Abs (450nm) 0,91 0,9 0,89 0,88 0,87 0,86 0,85 0 10 20

PCO (1:5)
y = -0,0012x + 0,932 R = 0,9993

Abs vs Tempo

30 40 Tempo / s

50

60

Figura 9 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo do PCO diluda 1:5

PCO (1:10)
0,93

0,925
0,92 Abs (450 nm) 0,915 0,91 0,905 0,9 0,895 0,89

y = -0,0006x + 0,9264 R = 0,981

Abs vs Tempo

0,885
0 10 20 30 40 Tempo / s 50 60

Figura 10 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo do PCO diluda 1:10

PCO (1:20)
0,942 0,94 0,938 Abs (450 nm) 0,936 0,934 0,932 0,93 0,928 0,926 0,924 0 10 20 30 40 Tempo / s 50 60 y = -0,0002x + 0,9393 R = 0,7713

Abs vs Tempo

Figura 11 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo do PCO diluda 1:20

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PCO (1:40)
0,944 0,942 Abs (450 nm) 0,94 0,938 0,936 Abs vs Tempo y = -8E-05x + 0,9407 R = 0,3028

0,934
0,932 0,93 0 10 20 30 Tempo / s 40 50 60

Figura 12 - Grfico da varincia da absorvncia com o tempo do PCO diludo 1:40

Pico 1 (Frao 3)
1 y = 4E-05x + 0,9565 R = 0,3684 0,8 Abs (280 nm)

0,6 Abs vs Tempo

0,4

0,2

0 0 10 20 30 40 Tempo / s 50 60

Figura 13 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 3, que corresponde ao pico 1

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Pico 2 (Frao 8)
1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 y = 1E-05x + 0,9521 R = 0,1589

0,4
0,2 0 0 10 20 30 Tempo /s 40 50 60

Abs vs Tempo

Figura 14 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 8, que corresponde ao pico 2

Frao 14
1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 Tempo / s 40 50 60 Abs vs Tempo y = 3E-06x + 0,9659 R = 0,0017

Figura 15 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 14

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1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20

Frao 15
y = -0,0004x + 0,9502 R = 0,9629

Abs vs Tempo

30 Tempo / s

40

50

60

Figura 16 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 15

Pico 3 (Frao 16)

1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 y = -0,0006x + 0,9521 R = 0,9892

0,4
0,2 0 0 10 20 30 40 Tempo / s 50 60

Abs vs Tempo

Figura 17 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 16, que corresponde ao pico 3

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Frao 17
1,2 1 Abs (280 nm) 0,8 0,6 0,4 0,2 Abs vs Tempo y = -0,0007x + 1,0163 R = 0,9978

0
0 10 20 30 Tempo / s
Figura 18 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 17

40

50

60

Frao 18
1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 0,4 0,2 Abs vs Tempo y = -0,0006x + 0,9449 R = 0,9947

0
0 10 20 30 40 Tempo / s 50 60

Figura 19 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 18

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Frao 19
1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 Tempo /s
Figura 20 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 19

y = -0,0004x + 0,9356 R = 0,9344

Abs vs Tempo

40

50

60

1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20

Frao 20
y = -0,0004x + 0,9308 R = 0,926

Abs vs Tempo

30 Tempo /s

40

50

60

Figura 21 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 20

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Frao 21
1 0,8 Abs (280 nm) 0,6 0,4 0,2 Abs vs Tempo y = -0,0003x + 0,9193 R = 0,7821

0
0 10 20 30 Tempo /s
Figura 22 - Grfico da variao da absorvncia com o tempo da frao 21

40

50

60

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