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DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS POR PCR Y GENOTIPIFICACION DE Mycobacterium tuberculosis

Blgo. M.Sc Omar Cceres R. Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular Instituto Nacional de Salud

Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis


UTIL EN: 1. Muestras extrapulmonares liquidas: LCR, aspirado bronquial, lavado bronquioalveolar, aspirado gstrico entre otros) 2. Muestras extrapulmonares solidas: Biopsias de piel, pleura, hgado entre otros 3. Cultivo con colonias atpicas y escasas

Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis


M 1 2 3 4 5 6 7 8

M. Marcador 100pb 1. Paciente 1 Aspirado gstrico 2. Control inhibicin paciente 1 3. Paciente 2 LCR 4. Control inhibicin paciente 2 5. Paciente 3 Liquido ascitico 6. Control inhibicin paciente 3 7. Control Negativo 8. Control Positivo H37rv

Heminested-PCR para deteccion de M. tuberculosis


M 1 2 3 4 5 6

M. Marcador 100pb 1. M. avium 2. M. fortuitum 3. M. chelonae 4. Humano 5. Paciente 6. Control Positivo H37rv

Genotipificacion de M. tuberculosis

PORQUE GENOTIPIFICAR MTB?


La discriminacin de cepas patognicas es crucial; desde el punto de vista epidemiolgico, la tipificacin molecular contribuye al conocimiento de la virulencia, transmisibilidad, la efectividad de drogas, etc. (control de las enfermedades) Identificacin de relaciones no sospechosas entre casos, nuevos casos y casos inusuales de transmisin de la enfermedad Evaluacin de la transmisin de genotipos entre pacientes con o sin nexo epidemiolgico Identificacin de reactivacin de TB en pacientes con historia previa de la enfermedad Estudio de contactos de pacientes y su asociacin con cadenas de transmisin

Genotipos conocidos de M. tuberculosis

HERRAMIENTAS UTILIZADAS EN LA EPIDEMIOLOGA MOLECULAR


PCR y Variantes RFLP PCR Fingerprinting (RAPD, ERIC, DRE, AFLP, etc.) PFGE Ribotipificacin Spoligotyping (solo MTB) MIRU-VNTR (solo MTB) Secuenciamiento de ADN

Genoma de Mycobacterium tuberculosis

Genotipificacin:

RFLP IS6110 Spoligotyping MIRU SNPs

)
Tcnica de genotipificacin para MTb descrita por primera vez en 1993 Basada en las variaciones generadas por el elemento de insercin IS6110 (Transposicin) La variacin de las cepas esta basada en el numero de copias del IS6110 y en la posicin donde se inserta en el ADN bacterial

Brote Epidmico

Casos sin nexo epidemiolgico

Muestras al Azar de pacientes de una regin

Tcnica de Genotipificacin basada en PCR descrita por primera vez en 1997, identifica y tipifica a MTB en un solo paso Explota la variacin que existe en el locus DR de MTB (exclusiva de esta bacteria) El locus DR (Direct Repeat) es una regin cromosmica que consiste de regiones repetidas de 36 nucletidos muy conservados Cada DR esta separado por secuencias espaciadoras no repetitivas de 34 a 41pb

Las cepas varan en el numero de DRs y en la presencia o ausencia de los espaciadores particulares La tcnica utiliza 43 diferentes espaciadores para identificar los diferentes genotipos de MTB

Spoligotyping de 35 MTb (aislamientos clnicos) y 5 M. bovis. Presencia de seal indica la presencia del espaciador

Filas 6, 12 y 37 corresponden a genotipo Beijing

MIRU-VNTR fingerprinting
VNTR (Variable Number Tandem Repeat): Son secuencias repetitivas en Tndem similares a minisatlites de eucariotas que han sido identificados dispersos en las regiones intergenicas del genoma del complejo de Mycobacterium tuberculosis. Estos segmentos repetitivos o minisatelites contienen de 46100 bp (pares de bases) y difieren entre las cepas en su nmero de copias. Se ha demostrado que la tipificacin por VNTR es muy til para patgenos cuya poblacin es altamente clonal como MTb
MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units): VNTR localizadas en el genoma de M. tuberculosis H37Rv, se han encontrado 41 posiciones (41 locus) de los cuales 15 son polimrficos en el nmero de repeticiones de una cepa a otra.

Amplificacin por PCR de MIRU en MTb


MIRU 4
DNA

Strain 1

MIRU 10

PCR amplification

3 repeats

2 repeats

Strain 2 DNA
PCR amplification

MIRU 4

MIRU 10

2 repeats

1 repeat

Genotipos hallados hasta el momento (N=100) Comparacin por distancia gentica: 0.17 significa

una tolerancia como mximo de 4 locus de diferencia para MIRU-VNTR o 7 espaciadores en Spoligotyping.
Resultados con Da 0.17 (S=100%, E=79%) Haarlem 16%

Beijing 6% No determinado 78%

Comparacin por agrupamiento en un rbol filogentico: Haarlem 28% Beijing 8% Dehli/CAS 2% N.D EAI 3% Uganda 2% N.D Canetti 1% LAM 29% LAM/Cameroon 6% Cameroon 2% N.D Cameroon 2% No match (clster nuevo) 17%

Genotipos de MTB-XDR

Genotipos de MTB-XDR

Genotipos de MTB-XDR

Genotipos de MTB-XDR

Frecuencia de genotipos de M.Tb en Latinoamerica (%)


Per Da Fil Haarlem
LAM 16 28 29 6 8

Venezuela Para2006 2009 guay


3 74 5 53 0.4 18.2 52.3 0.5

Brazil
Paran RGS

Hondu- Sudfrica ras TB-XDR


16.5 54.9 0.5 2 7 76

17.2 26.9

16 54

Beijing
T S

13

10
9.5

11.8

22

16

No identificado
N=

78

17

9
873

0
1298 220 93

RDRio 38% 50

5
206 41

100

Importancia del genotipo Haarlem


Lopez B. et al. Clin Exp Immunol 2003; 133:3037 Ensayos de infeccin de genotipos en ratones Beijing fue el mas virulento Mostro virulencia intermedia en ratones

Elis R Dalla Costa et al. BMC Microbiology 2009; 9:39 Cepas analizadas de Per, Brasil y Argentina n=224 LAM es el mas frecuente (46.4%), Haarlem es el segundo (10%) en Sudamrica Resistencia a INH es mas frecuente en Haarlem que en LAM (82.4% n=34) en Per Haarlem ha sido asociado a la emergencia de TB-MDR en brotes ocurridos en Argentina, Republica Checa y Tnez

GRACIAS
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