Epigenetics is the study of heritable changes in gene expression that occur without changes in DNA sequence (Wolffe and

Guschin, 2000) Epigenetic mechanisms are flexible genomic parameters that can change genome function under exogenous influence The patterns of epigenetic modifications can serve as epigenetic markers to represent gene activity and expression

 Epigenetics refers to the study of changes in the regulation of gene activity and expression that are not dependent on gene DNA sequence. While epigenetics often refers to the study of single genes or sets of genes, epigenomics refers to more global analyses of epigenetic changes across the entire genome.

Epigenetics, in a broad sense, is a bridge between genotype and phenotype - a phenomenon that changes the final outcome of a locus or chromosome without changing the underlying DNA sequence

EPIGENETIC

PHENOTYPE GENOTYPE

VARIAZIONI EPIGENETICHE There are at least two kinds of epigenetic information that can be inherited with chromosomes 1 - DNA methylation 2 - Changes in chromatin proteins, usually due to modifications in histone tails

Histone modifications
Histones can be modified by acetylation, methylation, phosphorylation, glycosylation, etc..(Suganuma and Workman, 2008) The most common modifications are acetylation and methylation of lysine residues in the amino terminal of Histone 3 and Histone 4 Increased acetylation induces transcription activation, whereas decreased acetylation usually induces transcription repression Methylation of histones is associated with either repression or activation of transcription, depending on the lysine residue position (Yan and Boyd, 2006)

DNA methylation
La metilazione del DNA una modificazione post-replicativa del genoma, trasmissibile alla progenie (sia per mitosi, che per meiosi), che rientra nellambito delle regolazioni epigenetiche della cromatina, in grado di modulare lespressione genica e/o lintegrit del genoma, e dunque il fenotipo cellulare, in assenza di variazioni di sequenza nucleotidica Consiste nel legame covalente di un gruppo metilico sul carbonio in posizione 5 dellanello pirimidinico di una citosina (C) che precede una guanina (G), con formazione di 5 metilcitosina (mC)

S-adenosil metionina

DNA metiltransferasi

Nel DNA umano, i residui di mC si concentrano in sequenze contenenti un numero variabile di ripetizioni dinucleotidiche citosina-guanina (isole CpG), caratteristiche della regione 5 regolatoria di circa il 40% dei geni umani e di sequenze ripetitive e trasposoniche disperse nel genoma Il grado di metilazione delle isole CpG di sequenze geniche inversamente associato ai livelli di trascrizione in mRNA, per cui: lipometilazione si associa ad un aumento dellespressione genica, lipermetilazione si associa a silenziamento genico

La metilazione del DNA implicata nella definizione degli aggiustamenti di dosaggio genico, come osservato nellinattivazione del cromosoma X e nellespressione di geni soggetti ad imprinting genomico, ossia trasmessi ereditariamente con differente grado di metilazione (e dunque differentemente espressi) a seconda dellorigine materna o paterna

Espressione differenziata di un gene a seconda dell'origine parentale

La metilazione delle isole CpG di sequenze ripetitive genomiche con attivit ricombinogenica e trasposonica ne silenzia lattivit, con effetto stabilizzante sullintegrit genomica In humans, more than one-third of DNA methylation occurs in retrotransposons (Kochanek et al, 1993; Schmid, 1998), which represent a large portion of the human genome (Bernstein et al, 2006) Retrotransposons are mobile retroelements that utilize reverse transcriptase and RNA intermediates to relocate within the cellular genome Among these sequences, Alu and LINE-1 retrotrasposons are the most plentiful families representing approximately 30% of the human genome (Babushok and Kazazian, 2007; Grover et al, 2004; Kazazian and Goodier, 2002) and are heavily methylated (Yang et al, 2004) LINE repeat regions located on specic chromosomes have been shown to be a consistent indicator of global methylation status

Because of their high representation throughout the genome, Alu and LINE-1 have been proposed as surrogate markers for estimating global DNA methylation level (Weisenberger et al, 2005; Yang et al, 2004), but growing evidence indicates that they could have specific and distinct cellular roles (Wallace et al, 2008) Methylation levels of LINE-1 are representative of genome-wide methylation status and play an important role in maintaining genomic stability and gene expression Hypomethylation of repetitive elements favours their activity as retrotransposable sequences and has been suggested to have deleterious effects on cells, initially through insertional mutations (Kazazian, 2004), and later by introducing genome instability through deletions and genomic rearrangements (Gilbert et al, 2002; Ostertag and Kazazian, 2001; Wallace et al, 2008)

LINE-1 retrotransposons have been shown to be hypomethylated in many cancers, suggesting potential activation of LINE-1 in these cancers

Metilazione globale LINE-1

Ipometilazione

Ipermetilazione

Alterazione della stabilit genomica per riattivazione delle sequenze trasposoniche

Silenziamento dellattivit trasposonica, con effetto stabilizzante sullintegrit genomica

Promozione dellespressione genica (Oncogeni)

Ipometilazione

Metilazione gene-specifica

Ipermetilazione Silenziamento dellespressione genica (Oncosoppressori)

Nella patologia tumorale sono state evidenziate sia una ipometilazione globale del DNA, che una ipermetilazione specifica di geni oncosoppressori e di microRNA Il DNA genomico progressivamente ipometilato durante lo sviluppo tumorale, e ci contribuisce sia allinstabilit genomica, per riattivazione di sequenze ricombinogeniche (Alu) e trasposoniche (LINE-1), che alla perdita di imprinting genomico per geni critici Daltra parte, lipermetilazione di geni onco-soppressori un evento principale nella cancerogenesi (per definire i profili di ipermetilazione tumore-specifici stato coniato il termine Ipermetiloma)

LINE-1 (Long Interspersed Nucleotide Element 1)

Lepigenoma fortemente influenzato dallet dellindividuo e dalle esposizioni ambientali

-Let si associa ad una tendenza allipometilazione globale ed il fenomeno sembra essere geneticamente controllato -La dieta un importante modificatore dellepigenoma a causa, ad esempio, del ruolo essenziale svolto dai folati come donatori di gruppi metile nel metabolismo delle unit monocarboniose -Il consumo di alcool stato associato sia al silenziamento (ipermetilazione) di geni onco-soppressori nel tumore del colon, che ad iperomocisteinemia per ridotta biodisponibilit dellacido folico, con conseguente interferenza sulle reazioni DNA metiltransferasiche (ipometilazione globale) -Il fumo di tabacco stato associato sia ad ipometilazione di oncogni che ad ipermetilazione di geni oncosoppressori

In campo epidemiologico, sono stati recentemente pubblicati alcuni lavori che potrebbero portare allo sviluppo di nuovi indicatori da utilizzare in programmi di monitoraggio degli effetti biologici

Epigenetics, genetics, and environmental health could be integrated to create a new field of epigenetic epidemiology

Environmental exposure and genetic variation could be integrated by modifying the epigenome

Gene-Environment interactions
The genetic polymorphisms that modify the effects of environmental exposures are transmitted transgenerationally according to Mendelian genetics, and the trait determining effect modifications is generally assumed to follow the same genetic model as that of the levels of expression or function of the protein coded by the locus of concern A second wellestablished area of interplay includes the direct effects of environmental exposures on the genome, e.g., DNA damage and/or mutations induced by environmental exposures

In principle, the effect-modification model should apply to epigene-environment interactions as well as to gene-environment interactions

Epigene-Environment interactions
Similarly to the effect modifications demonstrated or postulated for genetic polymorphisms, epigenetic differences determining disease risk could make individuals less or more vulnerable to environmental insults In environmental studies, the flexibility of epigenetic states has generated a growing interest in evaluating the direct alterations that environmental exposures may produce on epigenetic states, including changes in DNA methylation and histone modifications

Gold standard

Il DNA cos pre-trattato pu essere valutato tramite PCR (polymerase chain reaction) con primers specifici per le sequenze metilate e non metilate, o mediante microarrays o in spettrometria di massa La valutazione sia qualitativa (sequenza metilata vs non metilata) con definizione dellepigenotipo della/e sequenza/e indagata/e, che quantitativa (% sequenze metilate vs non metilate) Possono essere caratterizzate sia la metilazione specifica a carico di uno o pi geni, che la metilazione complessiva, a livello genomico In questo caso la caratterizzazione pu essere sia indiretta, valutando come surrogato il grado di metilazione di sequenze ripetitive disperse nel genoma [sequenze Alu (circa il 10% del genoma umano) e LINE-1 (lunghi elementi nucleari disseminati - famiglia 1; circa 17% del genoma umano)] che diretta ramite microarrays genomici

Epitect Bisulfite Sequencing Kit (Qiagen)

- starting material: DNA 1 ng - 2 g - good sensititvity for most applications - faster (cca 6 hours)

http://www1.qiagen.com/Products/Epigenetics/Epitect/EpitectBisulfiteKit.aspx?ShowInfo=1

Clean-up

PyroMark PCR Kit

Primer

M | 1 | 12| 13| 18| 19| 21|22|

~ 290 bp

M | 24| 41 | 43 | C | M |UM|K-|

Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing

Location of L1 pyrosequencing sites 1-3. CpG island region of the human L1 transposon (GenBank accession no. X58075, nucleotide position 1 to 1147) Yellow highlights represent single CpG sites, and red highlights (Site1, Site 2 and Site 3) represent the CpG sites analyzed by pyrosequencing. Horizontal arrows indicate the location of primers (F, forward primer; R, reverse primer; -bio, biotinylated primer) The sequencing primer is underlined, the complementary strand was analyzed

Forward primer (5-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG-3) Reverse biotinylated primer (5-biotin-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3) pyrosequencing primer (5-GGGTGGGAGTGAT-3) Dispensing Order: GTCGATTAGTAGTCAGTCGCT Sequence to analyze: TYGATTTTTTAGGTGYGTTYGTTA (Y=C/T)

Piyathilake et al., 2011

Immobilization of PCR Products to Streptavidin Sepharose HP Beads

Chimica del saggio Pyrosequencing

http://www.qiagen.com/media/producttools/flash/Pyrosequencing/20120106/index.html

http://www.qiagen.com/Knowledge-and-Support/Videos-and-VirtualDemos/Videos/Pyrosequencing%20Cascade%20Reaction/

In gruppi di lavoratori esposti a medie (61 g/m3, benzinai), basse (22 g/m3, vigili urbani) e molto basse concentrazioni di benzene (6 g/m3, impiegati, gruppo di controllo) sono state osservate associazioni significative tra livelli di esposizione a benzene e profili di metilazione al DNA in cellule linfomononucleate del sangue periferico Lesposizione era significativamente correlata ad ipometilazione delle sequenze Alu e LINE-1 (riduzioni dell1% e del 2.3%, rispettivamente, per incrementi di concentrazione del benzene di 10 volte), e del gene MAGE-1 (antigene 1 del melanoma; riduzione dello 0.5%) e ad ipermetilazione del gene p15INK4B (inibitore della chinasi ciclina dipendente; aumento dello 0.35%) Il gene H19 presentava una perdita dimprinting genomico nei soggetti a maggiore esposizione esposti ma non nel gruppo di controllo

Dal punto di vista pratico, lapplicazione dei nuovi indicatori epigenetici (epigenoma, epigenotipi) allo scopo di monitorare gli effetti biologici precoci in gruppi di lavoratori esposti ad agenti chimici/cancerogeni, richieder ulteriori studi di validazione, di tipo anche prospettico, per una migliore definizione delle specificit rispetto sia allesposizione, che allendpoint da prevenire Occorre inoltre valutare e caratterizzare gli eventuali fattori di suscettibilit, che, a parit di esposizione, possono modificare le relazioni dose-risposta In ogni caso, dato il coinvolgimento dei disordini della metilazione al DNA nello sviluppo della patologia non solo neoplastica ma anche degenerativa, lutilit preventiva dei nuovi indicatori epigenetici potr essere rivolta agli effetti derivanti dallesposizione ad agenti cancerogeni, ma non solo