Bacterias Gram negativas exigentes: Aspectos prcticos

Soledad Mateos, Alicia Mattera

A. GENERO NEISSERIA Dicho gnero pertenece conjuntamente con Kingella, Moraxella y Acinetobacter, a la familia Neissereaceae. Estudios genticos recientes han demostrado que la antigua especie Branhamella catarrhalis es un subgnero de Moraxella, designndose a la especie ms comnmente hallada en el ser humano como Moraxella (Branhamella) catarrhalis. Solamente dos especies se consideran patgenas primarias, infectando al hombre exclusivamente, estas son N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Las otras especies forman parte de la flora normal orofarngea, nasal y gnitourinaria, pudiendo en ocasiones actuar como oportunistas. Se caracterizan por ser diplococos Gram negativos arrionados, catalasa y oxidasa positivos, aerobios estrictos, inmviles, que utilizan pocos carbohidratos. IDENTIFICACION MICROBIOLOGICA Se entregar a los alumnos del C.E.F.A. diferentes cepas para su identificacin. Para ello seguiremos el siguiente orden: a. morfologa microscpica b. morfologa macroscpica c. requerimientos atmosfricos d. requerimientos nutricionales e. pruebas bioqumicas f- pruebas serolgicas a. Para observar la morfologa microscpica, se deber realizar un frotis, para lo cual se tomar un portaobjetos de vidrio limpio, luego se flamea el asa, se coloca una gota de suero fisiolgico estril, se pica una colonia con el asa, emulsionndola en el suero. Se realiza secado y fijacin por calor, realizando luego la tincin de Gram. Dicha tincin nos permitir adems apreciar la forma y agrupacin. Como ya fue mencionado se presentan como diplococos Gram ne-gativos arrionados. En caso de que dicha cepa no provenga de un cultivo en agar sino de una muestra fresca como puede ser un exudado uretral, se deber de realizar una descarga sobre un portaobjeto con el hisopo en un slo sentido dado que en este caso se vern intracelularmente dentro de los polimorfonucleares mantenindose de esta forma la integridad celular y la morfologa bacteriana. b. La morfologa macroscpica difiere

dependiendo de la especie de Neisseria que se haya aislado. Neisseria gonorrhoeae presenta colonias que en agar chocolate se pueden observar mejor con ayuda de una lupa. Luego de 24 horas de incubacin las colonias adquieren un tamao de 0.5 a 1 mm de dimetro pasando del color grisceo al color blanco, siendo adems colonias opacas, convexas y brillantes. Dicho microorganismo puede producir dos tipos morfolgicos de colonias dependiendo si el aislamiento es reciente o no. Las colonias P+ y P++ (antes T1 y T2) se ven en cultivos primarios y se caracterizan por ser colonias pequeas, convexas, que reflejan la luz incidental, las colonias P(antes T3 y T4) que son ms grandes, aplanadas, menos opacas y no reflejan la luz. Dicha variacin morfolgica dependera de la prdida de la expresin de los pili. N. meningitidis presenta una morfologa macroscpica caracterizada por colonias de mayor tamao que N. gonorrhoeae, convexas, lisas, borde entero, brillantes y grisceas. c. En cuanto a los requerimientos atmosfricos son aerobios estrictos, creciendo a una temperatura ptima de 35 a 37C, en presencia de 5 a 10% de CO2 que estimula su crecimiento y con una atmsfera hmeda, dado que son muy lbiles a la desecacin. Dichos requerimientos pueden ser proporcionados en una jarra como la que se utilizan para los anaerobios, pero con la presencia de una generador de CO2 o en el caso de no contar con este sistema una jarra dentro de la cual se coloca una vela que al extinguirse proporciona el CO2 necesario. La humedad se genera por evaporacin a punto de partida de las placas. Las placas se incuban por un perodo de duracin de 24 a 48 horas. d. Las dos especies patgenas son las que tienen los requerimientos nutricionales ms complejos, por lo cual se denominan exigentes. Se requieren para su aislamiento medios ricos y complejos como el agar sangre (agar con 5% de sangre ovina) o agar chocolate (agar con 5 a 10% de sangre ovina calentada a 80C por 15 minutos). N. meningitidis crece tanto en agar sangre como agar chocolate, no as N. gonorrhoeae que crece slo en agar chocolate en los aislamientos primarios.

Ambos medios se utilizan para muestras provenientes de sitios estriles como lo son la sangre, el lquido cefalorraqudeo, el lquido sinovial, etc. En el caso de que las muestras provengan de sitios que poseen flora normal como ser: orofaringe, uretra, recto o en aquellas en la que la muestra puede contaminarse fcilmente como la del endocrvix que se contamina con la flora vaginal, se utilizan medios selectivos. El ms comnmente utilizado es el medio de ThayerMartin que consiste en una base de agar chocolate a la que se agregan: Vancomicina (inhibe a los cocos Gram+), Colistina (inhibe las bacterias Gram-) y Nistatina (inhibe las levaduras). Este medio se puede modificar al agregar otro antibitico como es Trimetroprm que inhibe el desarrollo en superficie producido por Proteus. Las ventajas que proporciona este medio son: el no desarrollo de la mayora de neiserias no patgenas, microorganismos que pueden ser confundidos con ellas como Moraxella, facilitando de esta manera el crecimiento de N. gonorrhoeae y N. meningitidis. e. La identificacin presuntiva se realiza con tincin de Gram (conociendo la procedencia de la muestra y la edad del paciente), estudio de la morfologa colonial y por la prueba de oxidasa. Reaccin sta en la que se evala la presencia de la enzima citocromo oxidasa al poner en contacto a la colonia bacteriana con un disco de papel de filtro impregnado con el substrato de dicha enzima (tetrametilparafenilendiamina). Se toma una colonia de un cultivo puro, con palillo de madera y se coloca sobre el disco ya mencionado, humedecido previamente. La reaccin es positiva si dicha colonia se torna prpura oscuro o negra. La identificacin confirmatoria se realiza en primera instancia por las pruebas bioqumicas y luego por las pruebas serolgicas. Dentro de las pruebas bioqumicas contamos con la degradacin de los carbohidratos con la consiguiente formacin de cido. Para dicho objetivo de utiliza un medio de cistenatripticasa agar, medio semislido al que se le agrega 1% del carbohidrato deseado filtrado estril. Los carbohidratos ms frecuentemente usados son: glucosa, maltosa, sacarosa, fructosa, lactosa y debe incluirse un control (un tubo con medio sin carbohidrato). Debe tomarse un inculo denso de un cultivo puro, tratando de no utilizar aquellas provenientes de medios selectivos, dado que estos tienen contaminantes inhibidos y menor cantidad de colonias. Por lo tanto, primero deben subcultivarse algunas colonias tpicas en una o dos placas de agar chocolate, incubndose en atmsfera de CO2 por ms de 18 horas. Se toma del agar

chocolate un inculo denso depositndolo unos milmetros por debajo de la superficie del medio, incubndolo a 35 a 37C durante 24 horas en ausencia de CO2, dado que la presencia del mismo puede determinar falsos positivos ya que el gas se disuelve en el medio para dar cido carbnico. Los tubos tienen como indicador de pH rojo fenol por lo que al ser utilizado el carbohidrato pasan del color naranja-rosado inicial al amarillo. Existen Kits comerciales que contienen 7 hoyos, 4 de los cuales contienen buffer y rojo fenol que se encuentran deshidratados ms un carbohidrato (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa), un hoyo control, otro contiene rojo fenol y Penicilina para la determinacin acidomtrica de la produccin de -lactamasas. El ltimo hoyo contiene un test de DNAsa, la que es positiva solamente para M. catarrhalis. Este Kit comercial se inocula con una suspencin bacteriana correspondiente a una suspencin Mc Farlan 3, se incuba 2 ho-ras a 35C. (Ver tabla 1 en captulo de Bacterias Gram negativas exigentes) f. Dentro de las pruebas serolgicas para confirmacin diagnstica: N. gonorrhoeae, puede realizarse aglutinacin de partculas de ltex, coaglutinacin, test inmunoenzimticos, o inmunofluorescencia dirigidos contra diferentes protenas de membrana externa de dicho microorganismo. Para N. meningitidis, existen kits comerciales con aglutinacin de partculas de latex o coaglutinacin, estos reactivos reconocen antgenos capsulares de N. meningitidis de los grupos ms frecuentes. B. GENERO HAEMOPHILUS Gnero este constituido por parsitos obligados que forman parte de la flora normal del tracto respiratorio en humanos, existiendo adems varias especies animales. Algunas de las especies humanas se comportan como patgenos primarios. Ejemplo de ello lo son H. influenzae, H. ducreyi, agentes de infeccin respiratoria, meningitis el primero y ETS el segundo. La especie tipo es H. influenzae que puede ser capsulado o no. Basaremos el practico en esta especie. IDENTIFICACIN MICROBIOLGICA a. Respecto a la morfologa microscpica ya sea a punto de partida de una muestra clnica como lquido cefalorraqudeo o de un cultivo, con la tincin de Gram se observan microorganismos Gram- pleomrficos predominantemente cocobacilares pequeos, muy finos, pudiendo presentarse tambin como bastones cortos, largos y formas filamentosas. En la preparacin de la tincin de Gram se debe tener

sumo cuidado en el paso de decoloracin dado que la forma cocobacilar es fcilmente confundible con S. pneumoniae ya sea que la muestra provenga de un esputo o del lquido cefalorraqudeo. b. En cuanto a la morfologa macroscpica luego de 18 a 24 horas de incubacin en agar chocolate se observan colonias pequeas, convexas, de aspecto spero o rugoso, con dimetro de 0.5 a 1mm en el caso de ser no capsuladas, dado que las capsuladas se presentan como colonias brillantes, mucoides, pudiendo alcanzar 3 a 4mm en medio enriquecido. c. La temperatura ptima es de 37C y el pH es de 7.4-7.8 en condiciones aerobias, pero crecen mejor con el agregado de atmsfera de CO2 al 10%. dSon muy exigentes en sus requerimientos nutricionales necesitan dos factores para su crecimiento que son hemina (X) y NAD (V). No desarrollan en placas de agar sangre ya que dichos factores se encuentran incluidos en los glbulos rojos, no as en el agar chocolate donde por calentamiento se produce la ruptura de los hemates con liberacin de dichos factores. Otra forma de proveer los factores ya mencionados es el cultivo conjunto de H. influenzae con S. aureus productor de -lisina. Esta prueba se realiza en una placa de agar sangre en la que se siembra H. influenzae para que tenga un crecimiento uniforme en toda la placa, luego se realiza una estra con la cepa de S. aureus ya mencionada, se incuba a 37C durante 24 horas. Se observa un crecimiento predominante de H. influenzae alrededor de la estra de S. aureus, fenmeno ste denominado satelitismo. La separacin de las cepas de H. influenzae en biotipos (biovariedades I al VI) se logra por una serie de pruebas bioqumicas basadas en las caractersticas fenotpicas de la bacteria. Estas pruebas son: las pruebas de indol, ureasa, ornitina descarboxilasa, produccin de cido a partir de glucosa y reduccin de nitratos. Los aislamientos a partir de LCR. frecuentementem pertenecen a la biovariedad I que es poco frecuente en el tracto respiratorio superior. Las cepas no capsuladas a menudo implicadas en conjuntivitis, sinusitis y otitis media habitualmente pertenecen a la biovariedad II y III que son las mismas que colonizan la nasofaringe de personas sanas. f. Los mtodos serolgicos para la deteccin de los diferentes tipos de H. influenzae estn dirigidos contra los antgenos capsulares; pudiendo utilizarse partculas de ltex, tcnicas de coaglutinacin con S. aureus e inmunofluorescencia. Siendo muy importante el completar la identificacin con la serotipificacin, sobre todo desde que en Uruguay se vacuna en forma sistemtica a todos los nios pequeos con vacuna anti H. influenzae tipo b.