OBJETIVO Comprobar de manera experimental la ecuacin de diseo para un fermentador microbiolgico por lotes usando levadura Sacharomyces Cerevisae

y fructosa como fuente de sustrato.

INTRODUCCIN Numerosas especies de levaduras utilizan como va metablica principal la fructosa como fuente de sustrato. Es as como en la realizacin de esta prctica utilizamos la levadura de panificacin liofilizada Sacharomyces Cerevisae de la marca Tradi*Pan. Con el objetivo de evaluar la capacidad potencial que presentan distintas levaduras de distintas marcas en la utilizacin y fermentacin de diferentes azcares (que van desde sacarosa, fructosa y glucosa) y as poder comparar sus rendimientos. Es as como la puesta en marcha de esta prctica nos proveer los datos de carcter microbiolgico y fsicoqumicos; los cuales nos permitirn encontrar los datos resultantes requeridos como: parmetros cinticos, la productividad de biomasa, rendimiento celular, etctera. Ahora bien, no debemos olvidar que es muy importante tomar en cuenta la actividad de consumo de sustrato. Por eso, que las mediciones que han de ser referidas al tiempo (como es el caso de consumo del sustrato), implica una serie cuidados: por ejemplo en ningn momento el sustrato debe llegar a hacerse limitante. Por lo que los conocimientos que implican esta levadura, nos permitirn un manejo ms factible de las fermentaciones; ya que como sabemos esta levadura se distingue por su elevada capacidad de fermentacin alcohlica.

MARCO TEORICO
La fermentacin alcohlica es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire (oxgeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono (CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados (vase Evaluacin sensorial). Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin qumica, por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico. Saccharomyces cerevisiae es un hongo ambiental levaduirforme, unicelular, sus clulas son ovoides y se reproduce por gemacin, miden entre 5 y 10 micras, vienen estado aislado hasta que adquieren el tamao necesario para dividirse, taxonmicamente pertenece al Phylum Ascomycota, a la clase Hemiascomycetes, del orden Saccharomycetales y de la familia de las Sacchacromycetaceae. Su metabolismo le permite crecer tanto en condiciones de aerobiosis como de anaerobiosis (Feldmann, 2005). Adems posee alta actividad metablica, por lo que en la fase aerobia se caracteriza por la produccin de biomasa y la fase anaerobia generalmente por la produccin de etanol, fermentando alrededor del 90% del medio. Es importante la fase aerbica, ya que la levadura presenta una fase de adaptacin para producir las enzimas necesarias (tipo invertasa) que le permitan metabolizar el sustrato y as alcanzar la biomasa adecuada para la fermentacin en donde la mayor parte del carbono se emplea como energa y slo el 2% se asimila como material celular (Snchez, 2010).

En el transcurso de la fermentacin hay 4 fases de crecimiento: 1) lag o de adaptacin en el que no hay incremento en el nmero de clulas, sino que se adaptan al medio y en ocasiones sintetizan enzimas o componentes estructurales; 2) exponencial o log, donde las clulas se reproducen sin limitacin de de sustancias nutritivas a velocidad mxima y toman sustratos, excretando productos metabolizados; 3) estacionaria, que es la estapa donde el crecimiento celular desciende

o para completamente ya que se han transformado las sustancias nutritivas, el sustrato se ha metabolizado y las condiciones el medio se han modificado y la 4) muerte, en donde las clulas mueren, debido a que su reserva de energa se ha agotado (Snchez, 2003). Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la produccin de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido de carbono y etanol durante el proceso de fermentacin (Feldmann, 2005). El crecimiento de Saccharomyses cerevisiae, con el fin de medir el cambio de diferentes parmetros, como pH, consumo de azcar, acidez y unidades formadoras de colonias, as como la duracin de cada etapa del crecimiento. Y as adquirir conocimientos para realizar experimentos de este tipo y adems aplicarlo en la elaboracin de productos fermentados. Las levaduras son cuerpos unicelulares (generalmente de forma esfrica) de un tamao que ronda los 2 a 4 m y que estn presentes de forma natural en algunos productos como lasfrutas, cereales y verduras. Son lo que se denominan: organismos anaerbicos facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones biolgicas sin oxgeno. Se puede decir que el 96% de la produccin de etanol la llevan a cabo hongos microscpicos, diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran principalmente Saccharomyces cerevisiae. La fermentacin alcohlica es llevada a cabo principalmente por la levadura Saccharomyces cerevisae, que es la levadura corriente del pan o la cerveza, quien convierte un 90% del azcar en cantidades equimoleculares de alcohol y CO2. Algunas condiciones que se requirieron para la fermentacin alcohlica fueron:.

Concentracin de azcares: 10 18 % pH entre 4 y 4,5 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae Ausencia de O2 y presencia de fosfatos. Temperatura de fermentacin: 15 25C, por encima de 30C se evapora el alcohol.

El empleo principal de los procesos de fermentacin por parte del ser humano ha ido dirigido, desde muy antiguo, a la produccin de etanol destinado a la elaboracin de bebidas alcohlicas como el vino, la cerveza, la sidra, etc. Dentro de los estudios de biotecnologa se ha intentado emplear el etanol resultante de la fermentacin alcohlica de los desechos agrcolas (biomasa) en la obtencin de biocombustibles empleados en los motores de vehculos.

MATERIAL Y EQUIPO
Material: 1 gradilla Tubos de ensaye Matraz Erlenmeyer de 1000 ml, 250 ml, y 125 ml respectivamente 2 probetas graduadas de 100 ml Celdas para espectrofotmetro 1 esptula 1 pizeta Pipetas volumtricas de 1, y 5 ml respectivamente 3 mecheros Bunsen Brixmetro Vaso de precipitados de 250 ml Bao termorregulador Bao mara Hielo Algodn Jeringas Crisoles Pinzas para crisol

Equipo: Espectrofotmetro Autoclave Estufa Potencimetro Balanza Analtica

Reactivos: 3,5-DNS Fructosa Levadura comercial Tradi-pan Extracto de Levadura Cloruro de Amonio Cloruro de Calcio Sulfato de Magnesio

METODOLOGIA CURVA PATRON

Despus de calcular el porcentaje de alcohol presente en nuestra muestra contenida en el matraz, se procedi a agregar 5 ml de esta muestra en nuestros tubos de ensaye. Esto se realiz con el fin de tomar unas alcuotas de nuestra levadura en intervalos de tiempo de 1 , 2, 3, 4 y 6 horas respectivamente. Se realizaron los siguientes pasos: PROCEDIMIENTO: Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos 1 Blanco 1.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 2 Patrn 1 0.5 ml 1.0 ml 1.8 ml 2.0 ml TUBOS 3 Patrn 2 0.7 ml 1.0 ml 1.6 ml 2.0 ml 4 Patrn 3 1.0 ml 1.0 ml 1.2 ml 2.0 ml 5 Patrn 4 1.5 ml 1.0 ml 0.8 ml 2.0 ml 6 Patrn 5 1.7 ml 1.0 ml 0.5 ml 2.0 ml

Fructosa 30 g/L Sacarosa 0.6 M Agua destilada 3,5-DNS

Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en bao termorregulado a 100 C. Enfri los tubos. Determine la absorbancia de cada tubo, leyendo en el espectrofotmetro a 540 nm de longitud de onda. Despus se realiz la lectura de la viabilidad de nuestra levadura.

METODOLOGA:
Se estudiar el proceso de fermentacin alcohlica que llevan a cabo las levaduras. Estos organismos llevan a cabo la respiracin aerbica en presencia de oxgeno y la respiracin anaerbica en ausencia de ste. La levadura que se uso es Sacharomyces cerevisae, la misma que se utiliza para la produccin de pan, cerveza y vino. En la fermentacin alcohlica se produce bixido de carbono y alcohol etlico (etanol). El bixido de carbono crea la efervescencia en la cerveza y hace que el pan suba dentro del horno. El etanol que se produce es el alcohol presente en la cerveza y los vinos. Se usarn varias soluciones de carbohidratos para determinar cules pueden metabolizarse mediante la fermentacin: Antes de comenzar con la realizacin de la practica; se coloc todo el material en el autoclave para esterilizarlo; incluyendo nuestros medios.

Pasado el tiempo, se retir el material esterilizado del autoclave y se dej enfriar nuestro medio que se utilizara para agregar nuestra levadura empleada en esta prctica (Tradi pan) Tiempo despus, en un campo totalmente estril; se adicionaron las sales, el extracto de levadura y una vez homogeneizada esta mezcla se agreg la levadura (11 gr) en un matraz de 1000 ml estril.

Una vez realizado esto, se midieron los grados Brix de nuestra levadura con el medio ya homogeneizado, para realizar esto, se midi en una probeta 100 ml del medio y en el matraz se qued la cantidad restante que fue de 200 ml.

NOTA: Al da siguiente se midieron de nueva cuenta los grados Brix a la solucin que quedo fermentando en nuestro matraz.

Se dej reposar un tiempo de 24 horas y pasado este tiempo, se midi el porcentaje de alcohol presente en nuestra muestra contenida en el matraz.

METODOLOGIA

Esterilizacion de medio y levadura

Peso seco de la muestra (crisoles)

Centrifugacin

Medicin de cada tiempo

Fermentacin

Medida de reendimiento

Figura Diagrama de flujo que nos muestra la metodologa en general llevada a cabo en la prctica

Se esteriliz la fructosa en agua, y aparte la levadura tambin en agua; despus de enfriaron y se agregaron a un matraz de 1L junto con los otros tres componentes del medio que se esterilizaron (NH4CL, MgSO4 y CaCl2) se mezcl, y se prosigui a la fermentacin.

Cada uno de los reactivos utilizados para la preparacin del medio

PESO SECO Para la posterior parte de la prctica hubo un manejo de crisoles para llevar a cabo la cuantificacin del rendimiento de nuestra levadura, donde a continuacin mostramos de manera general la metodologa que se sigui:
Centrifugar y quitar sobrenadante Vortexear para que quede una mezcla homognea Tomar 5 ml y poner en cada crisol y se deja en la estufa para secar.

Tubo corning con nuestra levadura

Vortexeando

En la centrifuga

Para esta parte de nuestra prctica, lo realizado fue lo siguiente: Tomar peso seco en crisoles y poner a secar a 120C, bajar temperatura a 80C pesar cada crisol y pesar hasta que el peso sea constante. Peso seco= peso muestra + crisol peso muestra crisol.

Transportando nuestro producto de levadura final a los crisoles

Secando nuestros crisoles dentro de la estufa

FERMENTACIN

Tomando la levadura para primer tiempo

De nuevo nuestra levadura y tomando la muestra para una medicin

Tomando la muestra de nuestro ltimo tiempo

Tubos con la muestra de levadura en sus respectivos tiempos

CALCULOS Y RESULTADOS
CURVA PATRON Cs0 (g/L) 0.5 0.7 1 1.5 1.7 ABS 0.188 0.255 0.224 0.246 0.276

Una vez calculada la ecuacin de la lnea recta se calcularon las Cs y en la siguiente tabla se muestran los valores: Cs

0.194024 0.203984 0.19724 0.33517333 0.195752 0.53616533 0.196808 0.86879467 0.198248 1.001168 Con los datos obtenidos en la tabla anterior podemos calcular los parmetros cinticos a partir de de la linearizacin de Lineweaber-Burk 1/Cs 5.15400157 5.06996552 5.10850464 5.08109426 5.04418708 rmax= ks= 1/ 4.902345282 2.983530909 1.865096338 1.151019957 0.998833363

0.00653168 g/L h 0.19954278 g/L

CALCULO DEL RENDIMIENTO Yx/s=

g producidos de biomasa g consumidos de sustrato

Yx/s =

0.37111517

DETERMINACION DE Cx y Cx0 La concentracin celular se calculo mediante el peso seco: t Peso de membrana 0.0815 0.0819 0.0696 0.0907 0.0884 Peso de membrana y Biomasa 0.096 0.119 0.115 0.151 0.158 Cx Cx0

0 1.5 3 4.5 6

0.0145 0.0371 0.0454 0.0603 0.0696

0.128 0.224 0.344 0.544 0.627

COMPROBACION DE LA ECUACION DE DISEO Para este clculo se determinaron tiempos tericos, y posteriormente se proceder a llevar a cabo dichas reaccin con los nuevos tiempos calculados y con las mismas concentraciones antes mencionadas. t 32.807831 27.5589032 23.281806 17.9897795 16.3515098 Cs 0.5 0.7 1 1.5 1.7

OBSERVACIONES En el laboratorio no se encontr suficiente reactivo (fructosa) y tampoco en buenas condiciones para realizar la practica en forma adecuada, aun que se halla tratado de hacer otra replica no se hubiera podido concluir. CONCLUSIONES Debido a que los tiempos tericos fueron muy grandes, no pudimos comprobar la ecuacin de diseo, posiblemente las causas fueron que los sustratos hubieran estado contaminados, lo cual va desde nuestro mal manejo del frasco de reactivos en este caso la fructosa que ya era el resto (es decir las sobras) lo que afecto directamente nuestro resultado. Otro factor fue el tiempo de realizacin de nuestra practica (que aunque tuvimos el tiempo necesario, no se realizo en el tiempo y forma requerida), debido que todo se realizo de manera consecutiva y no se pudo hacer replicas de la misma.

BIBLIOGRAFIA:

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/32%20INVERTASA%20CIN%C3%89TICA.pdf http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis285.pdf http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap5_mi.pdf

http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v36n1/v36n1a09.pdf