Qumica Analtica Avanzada

Cromatografa lquida

Jos Marcos Jurado Jurado ngela Alczar Rueda Departamento de Qumica Analtica Universidad de Sevilla http://personal.us.es/jmjurado/

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Cromatografa lquida

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (CLAR)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

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Cromatografa lquida

M. Tswett (Mikhail Semenovich Tswett) (1872-1919) chroma (color) - graphein (escritura)

DEFINICIN: La cromatografa es una tcnica de separacin de los componentes de una muestra por distribucin entre dos fases, una de ellas fija o estacionaria y la otra mvil. La fase estacionaria puede ser slida o lquida (soportada en un slido o gel) y la mvil puede ser gaseosa o lquida [EXTRACTO DE LA DEFINICIN IUPAC]

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Cromatografa lquida

FUNDAMENTOS HPLC
* Muestra se disuelve en una fase mvil (FM) lquida que se hace pasar a travs de una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna * Los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la FM y FE dependiendo de la afinidad por ambas fases, desplazndose a velocidad distinta * Debido a la distinta movilidad, los componentes se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente

FM+Muestra

Eluyente: lo que entra en la columna Eluato: lo que sale de la columna

FE

Elucin: proceso de paso de la FM a travs de la columna

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Cromatografa lquida Instrumentacin
BOMBA INYECTOR

COLUMNA FASE MVIL

SOFTWARE

DETECTOR

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Cromatografa lquida FASE MVIL (FM) La fase mvil debe microfiltrarse para evitar obstrucciones en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna muy empaquetada) Aire disuelto en la fase mvil (problemas)

Bomba (flujo inestable)

Detector (seales errticas)

burbujear helio ultrasonido valvula purga

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Cromatografa lquida BOMBA
* Construidas con materiales inertes a los disolventes empleados * Flujo entre 0.1 y 10 mL/min libre de pulsaciones con una RSD del 0.5% * Generar presiones superiores a los 6000 psi (1lb/in2). 14.7 psi = 1 atm * Las bombas pueden liberar el eluyente a una composicin fija (rgimen isocrtico) o a una composicin variable en el tiempo (rgimen de gradiente)

BOMBA RECPROCA DE DOBLE PISTN

* En el caso de una bomba, los disolventes se mezclan previamente en una cmara a baja presin * En el montaje de alta presin se emplean tantas bombas como disolventes se usen y luego se produce la mezcla

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Cromatografa lquida INYECTOR
* El inyector ms empleado es una vlvula de 6 puertas, con bucles de volumen conocido y una palanca con dos posiciones: llenado e inyeccin * En la posicin de llenado, la fase mvil pasa directamente a la columna y la muestra se introduce en el bucle mediante una microjeringa
RHEODYNETM

* Al girar la palanca a la posicin de inyeccin, la fase mvil impulsa la muestra que estaba en el bucle hasta la columna

* De este modo la varianza en la inyeccin es constante y no hay que usar patrn interno como en GC Los bucles ms habituales oscilan entre 2 y 1000 mL

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Cromatografa lquida COLUMNA
* Son generalmente de acero plstico, de una longitud de 5-30 cm y con dimetros interiores de 1-5 mm * Las convencionales tienen un dimetro interno de 4.6 mm. (L=15 25 cm y 5m tamao partcula) * Son caras y se degradan con facilidad (polvo, partculas de la muestra o disolventes) * La entrada de la columna se protege con una precolumna y que se reemplaza peridicamente Precolumna
* Elimina materia en suspensin * Satura la FM con FE para minimizar prdidas en la columna * Composicin relleno igual que columna analtica pero mucho ms corta y tamao partcula mayor para minimizar cada de presin * Retiene fuertemente a analitos con gran afinidad por F.E.

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Cromatografa lquida CLASIFICACIN DE LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS

clasificacin
segun la tcnica operativa
en en columna columna

segn mecanismo de interaccin

Segn la Fase Mvil

Segn la Fase Estacionaria

adsorcin reparto reparto intercambio inico exclusin molecular afinidad

gas lquido lquida FS

slido lquido lquida

plana

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Cromatografa lquida FASE ESTACIONARIA
El soporte ms comn en HPLC son las partculas microporosas de slice. Pueden tener un rea superficial de hasta 300 m2/g. Su superficie contiene unos 8mol/m2 de grupos SILANOL (Si-OH).

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Cromatografa lquida CROMATOGRAFA DE REPARTO
Slice enlazada
* El enlace siloxano Si-O-Si se hidroliza por debajo de pH 2. Por otro lado, la slice se disuelve en agua a pH superior a 8; por lo tanto el lmite de uso de las fases enlazadas silceas es de 2-8 unidades de pH

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Ventajas F.E. enlazada

-Amplia aplicacin -Buena reproducibilidad - Tiempos de equilibrado cortos - Orden de elucin predecible

Inconvenientes F.E. enlazada

-Rango limitado de pH -Colas en picos *aminas en F.M. *fases end-capped

Tipos de cromatografa segn polaridad de F.E.

Cromatografa Fase Reversa (RP: Reversed Phase) F.E. Apolar (C-18) F.M. Polar (MeOH-W)
Ventajas Fase Reversa
- Fcil aplicacin -Fases mviles baratas -Amplia polaridad de solutos -Puede usarse para solutos inicos

Cromatografa Fase Normal (NP: Normal Phase)

F.E. Polar (Slice) F.M. Apolar (Hexano)

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Tipos de elucin
* Elucin es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente
Elucin isocrtica: composicin constante del eluyente Elucin en gradiente: cambio continuo de la composicin del eluyente (F.M) en sentido de aumento de la fuerza eluyente * Cuanto ms semejante es el disolvente en polaridad respecto a la fase estacionaria, mejor eluye a los solutos

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Cromatografa lquida DETECTOR

Detector de absorcin UV de fila de diodos (Diode Array Detector, DAD)

La radiacin policromtica, despus de atravesar la muestra, llega a un elemento dispersor, fijo, que descompone la radiacin y la hace llegar hasta una fila de fotodiodos. Cada fotodiodo mide, simultneamente, la radiacin que le llega, y, por lo tanto, todas las absorbancias a las distintas longitudes de onda se miden simultneamente.

Espectro completo

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cromatograma

Ventajas
- Identificacin fcil de ptima para cada pico, y programar los cambios de a lo largo del cromatograma. - Identificacin de coeluatos. - Determinacin de la pureza de pico (superponiendo espectros, relacin de absorbancias a dos ). - Confirmacin de picos. El cromatograma puede reintegrarse (generar un nuevo cromatograma) sin tener que repetir la experiencia

espectro

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Parmetros caractersticos de la separacin cromatogrfica

de RETENCIN de EFICACIA de RESOLUCIN

Parmetros de Retencin Informan sobre la distribucin del analito entre las dos fases Tiempo de retencin (tR) Tiempo muerto (tm) Tiempo de retencin ajustado (tR) Velocidad lineal migracin de F.M. (u) Factor de capacidad (k) Factor de selectividad ()

N, H

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Cromatografa lquida PARMETROS DE RETENCIN
tR.- Tiempo transcurrido desde la inyeccin de la muestra hasta que el componente llegue al detector t0.-tiempo requerido para que la F.M. atraviese la columna sin retencin V0 = t0 x F VR.- volumen de FM necesario para eluir ese compuesto VR = tR x F tR.- tiempo desde el mximo del pico de la especie no retenida hasta el mximo del compuesto eluido. Tiempo en la F.E. tR = tR t0 VR = tR x F

u.- depende de la longitud de la columna: u = L / t0 tRB

tRA t0

t = minutos V = ml F = ml / minuto u = cm / s

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FACTOR DE CAPACIDAD

k.- indica la mayor o menor retencin de un componente por parte de la columna. Relacin entre el tiempo que las molculas de analito estn en la FE y el que estn en la FM. Valor constante y caracterstico de cada analito
FACTOR DE SELECTIVIDAD

k'=

t R t0 t0

0 < k < infinito k <<1 F elucin muy rpida k > 20 F elucin muy lenta 1 < k < 5 intervalo til

.- se define para dos componentes e indica la separacin que hay entre dos mximos

k 'B t 'RB = k ' A t 'RA

tRB > tRA 1

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PARMETROS DE EFICACIA Teora del plato cromatogrfico (A. J. P. Martin y R .L. M. Synge, 1941) Consiste en imaginar que en la columna tienen lugar equilibrios sucesivos de reparto en contracorriente por parte del soluto entre las dos fases r=0 r=1 La columna se divide en N estratos imaginarios llamados platos tericos. En cada plato terico se produce un equilibrio de reparto Altura Equivalente del Plato Terico: H=L/N

Volumen de fase mvil presente en un plato terico: v0 = V0 / N Llega un volumen v0 de fase mvil al plato r = 0 y tiene lugar el equilibrio del soluto entre las dos fases El eluyente se transfiere al plato r =1 y un nuevo volumen fresco v0 llega al plato r = 0 El proceso contina hasta que el eluyente llega al plato r = N y sale de la columna

r=N

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Cromatografa lquida Si el pico gaussiano se TRIANGULA trazando las tangentes por los puntos de inflexin, se obtiene un tringulo ISSCELES con la cspide en tR y base w = 4t tR Evaluacin experimental de N

2 16t R N= 2 w
w
EL NMERO DE PLATOS TERICOS ES UNA MEDIDA DE LA EFICACIA DE LA SEPARACIN

Distintos componentes de una mezcla conducen a distintos valores de N

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Bibliografa

- D.C. Harris, Anlisis Qumico Cuantitativo, Ed. Revert, Barcelona, 2001 -L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, Practical HPLC method development, 2 edicin, John Wiley & Sons, 1997 - R. Cela, R. A. Lorenzo, M. C. Casais, Tcnicas de Separacin en Qumica Analtica, Editorial Sntesis, Madrid, 2002

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