524 Edulcorantes

Tabla 3

Produccin de edulcorantes a partir de maz 531

Producto

Edulcorantes alternativos a la sacarosa. Poder edulcorante

(Sacarosa = 1)

99r

O 320 G A U / K g

A 160 G A U / K g

120 GAU/Kg

Origen
97r-

a. Edulcorantes calricos
95

Azcar invertido Fructosa Jarabes fructosados (55%) Jarabes fructosados (90%) Jarabes maltosados (45-60%) Jarabes maltosados (70-85%) Sorbitol Manitol

1 1.4 1 1J 0.4 0.6 0.6 0.5 1 0.4 0J 0.85 varios

OP Vc E E E E 0
93 H

91

xma

89

Isomaltulosa Palatinita Jarabes de suero de leche Neoazcares

b. Edulcorantes no calricos

OE E EO gscE E

87h-

85'

10

20

30

40.

50

60

70

80

90

100

Aspartamo AHtaroo L-azcares Acesulfame K Sacarina Sucralosa Ciclamatos Dihidrochalconas Maltilol* Isomaltilol Monelina (protena) Taumatina (protena) Esteviosido Filodulcina Glicirrizina Lao Han Kuo (mogrosido) Osladina Dulcina PerilJartina Miraculina (protena) 6 metfl 6 cloro D-triptofano Hernandulcina

180 2160 1 200 300 600 30 1 800 0.9 0.9 2500 3000 300 700 50 400 3000 200 2 000 1 500 1 300 1000

QFE.FE

EO EO N

o o o OE o o

OEJE

TiemDo de reaccin {h ) Figura 5. Influencia de la dosis de amiloglucosidasa en el tiempo de reaccin y el porcentaje de glucosa obtenido (9). La obtencin de nuevas glucosas isomerasas con pH de actividad cercano a la neutralidad para evitar la produccin de psicosa (las primeras operaban en medio alcalino). La obtencin de cepas que produjesen la enzima en forma constitutiva, ya que en general se requiere de xilosa como inductor ( se-trata en realidad de la enzima xilosa isomerasa). La eliminacin del requerimiento de iones arsenato, incompatibles con una aplicacin en el sector alimentario. La eliminacin del requerimiento de iones cobalto, por la misma razn. Actualmente dos desarrollos tendran gran impacto en el proceso y son, sin duda alguna, proyectos de las grandes empresas productoras de enzimas: La modificacin del equilibrio de la reaccin, que impide obtener conversiones superiores al 42%. La eliminacin del efecto inhibitorio que tienen los iones calcio sobre la enzima. (Los iones calcio se agregan por ser requeridos por la a-amilasa en la licuefaccin de almidn y deben ser eliminados por intercambio inico antes de la reaccin de isomerizacin.) La isomerizacin de glucosa a fructosa se lleva a cabo, por lo general, en reactores de lecho fijo, donde la enzima inmovilizada se encuentra empacada. La Tabla 9 muestra algunos ejemplos de catalizadores comerciales para el proceso. La pureza del jarabe glucosado es un

NJP N N N N N

NO > v N o N

N = natoaJ, Q = sinttico va qumica, E - enzimtico, F = fermentativo o combinaciones de stos. * Absorbido en 50%.

2 Edulcorantes

Produccin de edulcorantes a partir de mah 533

D-Glucosa

D- Fructosa

D-Psicosa

1 H-C=0 H-C-OH
OH-C-H

i =o c
Enzima < ------- > | OH-C-H

CH?-OH

I'

< ------ >

0H~

c=o
H-C-OH

CH?-OH

Tabla 9 Algunos ejemplos de catalizadores formulados con la enzima glucosa isomerasa. tl/2 Compaa Catalizador
Actividad (IGIU/g) (horas) *

H-C-OH

I I

H-C-OH

I I

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

I
CH2-0H

Miles Kali-Chemie (OptsweetTSy22) Miles Laboratories (Taka-sweet) Gist-Brocades

1O0 171

Clulas de S. olivceas y S. rubiginosus enSiOj Clulas de Flavobacterium aborescens, flucoladas, extradas y reticuladas Enzima de A. missouriensis en gelatina reculada con glutaraldebdo Enzima de 5. oltvochromogenes en almina activada Enzima en DEAE-celulosa Clulas de B. coagulan* entrecruzadas Enzima de S. phaeochromogenes en resinas de Intercambio amnico. Clulas de S. violaceoniger en gelatina Enzima de S. rubiginosus en DEAE celulosa y poliestireno conTlOj Enzima de S. phaechromogenes en resinas de intercambio aninico

1200 1800

CH2-OH

CH2-OH
Figura 6. Reaccin de isomerizacin.

675 (MGIU/1)

1500

factor crtico en la estabilidad de los catalizadores, por lo que una etapa de refinado con carbn activado para eliminar pptidos, aminocidos, grasas, etc., es considerada como fundamental. La concentracin ptima de sustrato en la alimentacin al reactor empacado se sita entre el 40 y 45% de slidos (peso/pes) del jarabe glucosado con 95% de glucosa. Generalmente la alimentacin se hace por la parte superior del reactor y el diseo debe tomar en cuenta los limites en la calda de presin (por ejemplo 20 psi en los catalizadores diseados con gelatina). La alimentacin es igualmente desgasificada (cambio de presin) por los efectos desnaturalizantes del oxigeno sobre la enzima. La corriente contiene, por lo general, iones magnesio (de 104 a 10* M) necesarios para la glucosa isomerasa y el pH se ajusta entre 7.5 y 7.8. ___ El proceso por lotes no es econmicamente factible: en 1975la productividad en estos sistemas era de 900 kg de jarabe por kg de enzima y pas a 1 500 kg con la implementacin del proceso continuo. El diseo del reactor se hace considerando una concentracin de fructosa de 42% a la salida del reactor, existiendo varas polticas de operacin para mantener esta conversin constante a medida que el catalizador pierde actividad: I. Mantener la productividad constante incrementando la temperatura a pesar de acelerar el decaimiento del catalizador (hasta 65 * C). II. Mantener el ritmo de decaimiento del catalizador constante incrementando el tiempo de residencia a pesar del decremento en productividad ya sea a 60* C () o bien a 55-57 * C (b) (operacin normal y operacin de bajo costo respectivamente). La productividad es de2 500 (I), de 3 000-4 000 (Ha) y de5000(Ilb) kg de slidos procesados por kilogramo de enzima. En la Tabla 10 se comparan estas formas de operacin, as como la tecnologa puesta en marcha en 1976. . El catalizador de Industrias Novo, por ejemplo, tiene un tiempo de vida media en operacin de 1800 horas a57.5' C, disminuye a 1000 horas a 60 *C y a 350 horas a 65 *C. Una planta que procesa 100 toneladas de almidn al da emplea generalmente de 13 600 a 17 400 litros de volumen total de reactores (en al menos tres). El catalizador se emplea de 2 a 3 tieinpos.de vida media a 60 * C, por lo que el catalizador se desecha cuando slo le queda de 15 a 25% de la actividad inicial.

OP (Ketomax) CPC Int Inc. Novo Industri A/S Mitsubishi Chem.

1150-1 3S0 1487 200 222

800

1500

1200

_ Roquette Freres Finnsugar (SpezymelGI) Nagase (Sweetase )

260

IGIU: unidades definidas como la cantidad de enzima que produce una mol de fructosa por minuto (la forma de medir la actividad no es la misma en todos los casos). (De referencia 13 y manuales de productores). * Tiempo da vida media, en las condiciones ptimas de reaccin.

Cintica Desde el punto de vista cintico, la reversibilidad de la reaccinno presenta mayor problema de modelamiento si se consideran dos reacciones: Vi G G+E<rEQ ----------- >E+F (1)

3 Edulcorantes
Tabla 10

Produccin de edulcorantes a partir de maz 535

Parmetro

Produccin de jarabes con alto contenido de fructosa (JACP). Tecnologa pasada y presente (Industrias Novo), Tecnologa Tecnologa actual
1976 Operacin alta productividad Operacin normal Uperacin bajo costo de conversin

Ke - ViKr/VrKi En general para esta enzima: Ke- 7 .81 exp(-67rr*K) Sustituyendo 4,5 y 6 en 3 y simplificando, obtenemos: vobs - v -= -dS/dt - Vmax donde: VmaxS"

(6)

(7)

Concentracin de jarabe (%p/p) pH Temperatura "C Tiempo de vida media (b) Productividad (kg jarabe/ kg enzima) Actividad al desechar el catalizador (%) = Vr
F

40-45

43-47 7.8 63-65 800 2 500

43-47 7.5-7.8 60 1200-1500 3 000-4000

43-45 7.6 55-57 1800 5000

(8)

8.4 65 500 1500

KrV (Ke + 1) Kr-Ki Ke

(9) (10)

K'm-KrKi + (Kr+KiKe)Sc Kr-Ki

25

25

10-15

10

Esta simplificacin permite entonces tratar la cintica de reacciones reversibles con una expresin como la de Michaelis Menten (ecuacin 8), simplemente mediante una nueva definicin de los parmetros cinticos (ecuaciones 9 y 10) y de la concentracin de sustrato, de la cual puede obtenerse la ecuacin del reactor empacado: VmxT -SoX-K'mln(l-X) donde: (11)

F+E<=EG -------------- > E + G Kr+F

(2)
v

'

So "So-Se X*=(So-S)/(So-Se)

donde G - glucosa y F - fructosa. Los subndices de los parmetros emticos de la ecuacin de MicbaelisMenten(iy r), corresponden a la reaccin de "ida" y de "regreso", suponiendo que la glucosa es el sustrato. La velocidad inicial observada es entonces afectada por el equilibrio de la siguiente forma: vobs = vi - vr - Vi G Vr Ki+G Si se define: S-S-Se
(4)

i = tiempo de residencia promedio

Conociendo los parmetros cinticos de la enzima, la ecuacin 11 puede emplearse para el diseo del reactor siempre y cuando el control de la reaccin no sea difusional. Con frecuencia se ha propuesto tambin (14):

F Kr+F

n\

'^mSET 3o

t -WXeSo (Km+1) ln (Xe-Xi) Xe^T

i

(12)

En este caso X se refiere a la conversin clsica definida como: X- So-S So Xi i conversin inicial Xe = conversin equilibrio W carga de catalizador Vmx = actividad enzimtica

donde "Se" es la concentracin de sustrato en el equilibrio, la ecuacin (3) puede obtenerse en trminos de "Se", ya que sabemos ademas que: O+F-Go+Fo = Ge+Fe - Ge(l + Fe/Ge)- Ge (l + Ke) (5) donde el subndice "o" corresponde a la concentracin inicial y "e" al equilibrio, siendo "Ken la constante de equilibrio. Se puede demostrar de la ecuacin (3), en el equilibrio, cuando la velocidad observada es cero que:

4 Edulcorantes Produccin En realidad cada catalizador es operado de forma distinta. Sus diversas resistencias mecnicas hacen diferir la altura mxima permisible en el reactor. El tiempo de residencia, depende de la carga de catalizador la cual a su vez es funcin de la actividad especfica de la enzima inmovilizada. La temperatura de reaccin depende de la poltica de operacin de la planta: as por ejemplo, un catalizador puede durar 2 600 h (tl/2) si se opera a 57 *C, pero slo 500 h de operarse a 65 "C. La seleccin depender de una decisin entre productividad y costo, aunque en general, el ptimo es un compromiso entre ambos que resulta en una temperatura de 60 *C (1 400 h de vida media), segn se ejemplifica en la Tabla 10. Una planta procesadora de 400 toneladas de almidn al da debe contar con unos 6 reactores de 5 metros de altura (50 m* de lecho empacado), que funcionan entre 4 y 6 meses. El arranque es importante para mantener la produccin constante y un reactor nuevo es arrancado al detener el ms usado. La estrategia de operacin puede establecerse considerando la siguiente ecuacin: P - f * FSoXdt

Produccin de edulcorantes a partir de maz 537

de donde N resulta ser de 6.9, es decir, 7 reactores. Jarabes de segunda generacin En 1978 aparecieron en el mercado los jarabes con 55% de fructosa. Son stos los que presentan un poder edulcorante equivalente al de la sacarosa y son obtenidos a partir de los jarabes con 42% de sacarosa a travs de un proceso de intercambio inico en resinas catinicas fuertemente acidas en forma de sal de calcio. El proceso es relativamente complejo pues se opera en continuo con varias alimentaciones y salidas, por lo cual ocasiona que las zonas de proceso se muevan constantemente en la columna. Se obtiene as una purificacin de la fructosa o jarabe de tercera generacin y la glucosa es recirculada al reactor. De la mezcla de jarabes de primera y tercera generacin se obtienen los de 55% de fructosa, empleados por la industria refresquera en lugar de sacarosa (en Estados Unidos y Japn) y cuya produccin correspondi en 1986 al 58% del total de JACF. La Tabla 11 presenta la composicin de los JACF y la Tabla 12 sus principales aplicaciones en la industria alimentara (14)
Tabla 11

Jo

(13)

En la ecuacin 13, "P" es la cantidad de producto a producir, digamos en gramos, "F* son los litros por hora de jarabe alimentados con "So" g/1 de glucosa, integrado del tiempo cero hasta el tiempo "1pn. La conversin debe ser sustituida por una expresin matemtica (la ecuac ion de diseo del reactor) que la relacione con los parmetros cinticos de la enzima: X-f(Km,Vmx) (14)

Jarabe

Composicin de los diversos jarabes fructosados existentes en el mercado. Glucosa (%) Fructosa (%) Oligosacridos (%) 42 55 90 51 42 9 7 3 1

Primera generacin Segunda generacin * Tercera generacin

Se deber contar adems con un modelo cintico que describa la influencia de la temperatura en la velocidad de reaccin (Arrhenius) y Otro que describa la desnaturalizacin de la enzima en funcin de la temperatura. De esta forma podr determinarse: Cmo disminuye P en el tiempo si se opera a flujo y temperatura constante (no es posible operar de esta forma en la industria). Si se desea mantener la conversin y el flujo constantes (y, por lo tanto, la productividad), cul debe ser la programacin de los incrementos de temperatura, Cul deber ser la disminucin del gasto, si se desea mantener tanto la conversin como la temperatura constantes. Finalmente, el nmero de reactores con que debe operar una planta, puede determinarse con la siguiente ecuacin: _ baja velocidad de produccin alta velocidad de produccin " PK*Wla2] (15)

Poder edulcorante igual al de la sacarosa. Tabla 12

Distribucin de las aplicaciones de loe jarabes fructosados en la industria alimentaria en Estados Unidos.
Sector Porcentaje 67.5%

Bebidas no alcohlicas Alimentos procesados Panadera Helados Confitera Otros Jarabes maltosados

14.1% 10.2% 4.4% 0.5% 33%

En esta ecuacin "Rp" representa la relac ion que se desea entre los cambios de productividad, "H" es el nmero de "tiempos de vida media" de uso del catalizador y "N** el nmero de reactores necesario. As, por ejemplo, si deseamos una variacin de ms-menos 2%, y para un uso del catalizador durante 2 veces el tiempo de vida media, tendremos:

RecientesdesairoUosbiotecnolgicos,espedficamenteenelr^ han hecho posible la produccin a gran escala de jarabes maltosados, que empiezan a ganar terreno en la industria alimentaria. La maltosa tiene un poder edulcorante equivalente a 50 a 75% del poder edulcorante de la sacarosa, pero a diferencia de la glucosa, la maltosa tiene

5 Edulcorantes
Tabla 13

Edulcorantes a partir de sacarosa 339

Principales caractersticas de los jarabes maltosadoa y de la maltosa. Alta higroscopicidad. Baja viscosidad en solucin. Resistencia a la cristalizacin. Bajo poder edulcorante. Menor tendencia al oscurecimiento. Alta estabilidad trmica. ' La maltosa presenta menor presin osmtica que la glucosa. La maltosa es adecuada para diabticos por la ms lenta liberacin de glucosa una calidad de dulzor de alta aceptabilidad. Los jarabes son principalmente usados en cervecera, panadera, bebidas no alcohlicas, confitera, etc., y su importancia radica probablemente ms en sus propiedades funcionales que en su poder como edulcorante. Estas caractersticas se presentan en la Tabla 13. Existen fundamentalmente tres tipos de jarabes maltosados: * Jarabes con alto contenido de maltosa (JACM). * Jarabes con extremadamente alto contenido de maltosa (JEACM). * Jarabes maltosados de alta conversin (JMAC). cuyas caractersticas en trminos de composicin se presentan en la Tabla 14. Los jarabes maltosados de alta conversin (JMAC), contienen ma de 85% de azcares fermcntables y son comnmente empleados como adjuntos de cervecera o aditivos de harinas para incrementar su capacidad fermentativa. Actualmente Japn es el principal mercado para los JEACM. La compaa Hayashibara produce ms de 20 0001 de maltosa cristalina al ao. El consumidor japons, a diferencia del occidental, prefiere el ms suave dulzor de la maltosa al de la sacarosa. Hasta la fecha, la principal limitante en la produccin de estos edulcorantes es el costo de las enzimas requeridas para el proceso, mismas que a continuacin son descritas. Produccin Al igual que para la produccin de jarabes glucosados, la primera etapa comprende la licuefaccin del almidn con a-amilasa tennorresistente, misma que ha sido descrita anteriormente. El pH y la temperatura del hidrolizado (ED de entre 8 y 15) se ajustan al valor ptimo para la actividad de la siguiente enzima en el proceso. Tabla 14 Composicin de los jarabes maltosados (% con respecto a los Azcar azcares totales). Jarabes con alto Jarabes con Jarabes
contenido de maltosa extremadamente alto contenido de maltosa 15-2 maltosados de alta conversin

La segunda etapa requerir de la seleccin de la(s) enzima(s) adecuadas en funcin del tipo de jarabe maltosado a producir. En principio, la enzima ms importante es la b-amilasa, exoenzima que libera maltosa a partir del extremo no reductor de las cadenas de anulosa y amilopectina, que al igual que la a-amilasa, no puede bidrolizar los enlaces a( 1 -6) de la ami-lopectina. La b-amilasa puede ser de origen vegetal, siendo las principales fuentes la soya, el trigo y la papa, aunque un gran nmero de b-amilasas microbianas ha sido descrito (6,7,12), principalmente de bacilos: B. megaterium, B. circulans, B. cereus, B.potymyxa. Existe igualmente una a-amilasa que es conocida como "maltognica" por la gran cantidad de maltosa que produce y es probablemente una de las ms usadas en la industria, por su menor costo en relacin con las b-amilasas. Se nata de la a-amilasa de Aspergius oryzae. En la produccin de jarabes con alto contenido de maltosa (JACM) se emplea cualquiera de estas b-amilasas, aunque en todos los casos, al no ser hidrolizados los enlaces a(l-6), el contenido de b-dextrinas en el jarabe es considerable. Para poder lograr incrementar el contenido de maltosa en los jarabes se requiere forzosamente de la hidrlisis de los enlaces al -6 lo que se logra con ayuda de una enzima "desramificadora". Existen dos enzimas para este fin: la isoamilasa (5. amyloliquefaciens, Pseudomonas amyloderamosa, Cytophaga sp.o\& puluianasa (Aerobacter aerogenes, P. stutzeri, P. scharophila, B. maceris, B. pofymyxa...). La diferencia entre las dos enzimas es que la primera no puede bidrolizar el pululano. Existen mltiples patentes y trabajos reportados en relacin con la produccin de JEACM (15,16,17), pero en general, todos combinan una p-amilasa vegetal o microbiana con una de las dos enzimas desramificadoras. El caso de B. cereus var. mycoides es especial, pues produce las dos enzimas extracelularmen-te y permite obtener hasta 80-90% de maltosa. En el caso de los JEACM producidos por la empresa Hayashibara, se emplea la P-amilasa de soya y la isoamilasa de Pseudomonas. Finalmente, los jarabes maltosados de alta conversin (JMAC), son preparados a partir del jarabe licuado con a-amilasa, adicionando cualquiera de las {i-amilasas mencionadas y glucoamilasa. Otros edulcorantes a partir de maltosa La hidrogenacin cataltica de la maltosa resulta en el maltitol, alcohol polihdrico de bajo contenido calrico pues no es adsorbido en el tracto gastrointestinal. La misma compaa que produce los JMAC en Japn, elabora ms de 3 000 toneladas anuales de maltitol como edulcorante no calrico. Potencialmente, otro edulcorante puede ser preparado a partir del maltitol, el isomaltitol, obtenido por isomerizacin. Por otro lado, la isomerizacin qumica de la maltosa, en presencia de catalizadores bsicos (reaccin de Lobry de Bruyn) o con alumninato de sodio, resulta en un edulcorante ms, la maltulosa. Es interesante sealar que otro edulcorante de estructura similar que se incluye en la Figura 7, la isomaltulosa, es elaborado a partir de sacarosa y ser descrito en la siguiente seccin. EDULCORANTES A PARTIR DE SACAROSA Produccin de isomaltulosa La isomaltulosa, conocida tambin como palatinosa o filosa es una 6-O-a-D-gIucopiranosil-D-fructofuranosa, componente natural de la miel de abeja

Glucosa Maltosa Maltotriosa ED

0.5-3 45-60 10-25 35-40

70-85 8-21 45-60

35-43 30-47 8-15 60-70

540 Edulcorantes

Edulcorantes a partir de sacarosa 541

CH2OH
A \

CH2OH Lln 0HCH2 o

OH\) ___ f

KQH .) n f a
OH

/ \, "OH2OH

. * ?VH

u. Isomaltulosa sintasa T

o
OH H J0. O H f-OH

O ---------CH

CHgOH OH-^

Isomaiiuiosa

clulas con cido tnico, polietilenimina, glutaraldehdo y un copolmero de poliamina y epiclorfdrina (21). La PPF International en Inglaterra cuenta coa Otro catalizador con clulas de Erwinia rhapontid, con un tiempo de vida media de un ao y una capacidad de producir 200 kg de isomaltulosa por litro de columna por ao (22). La enzima no ha sido an suficientemente estudiada. Se trata aparentemente de una "glucosiltransferasa" o de una 'isomaltulosa sintasa", especifica para sacarosa, sin requerimientos de iones o cofactores. Se encuentra localizada en el espacio periplsmico de las clulas y produce un subproducto hasta ahora no identificado: otro disacrido denominado trehaluosa, primer oligosacrido en el que se encuentra a la fructosa en forma pitaosa. La enzima, que cataliza un mecanismo intramolecular de transferencia de glucosa a los grupos hidroxilo primarios en C6 y Cl de la fructosa, puede considerarse como una isomerasa, debiendo clasificarse como E.C. 5.4.99 (22). Produccin de palatinita La palatinita es un edulcorante de caractersticas comparables a la sacarosa, coala diferencia de que es extremadamente estable a la hidrlisis enzimtica. Es obtenido por hidrogenacin qumica de la isomaltulosa (palatinosa), segn se ilustra en la figura 7. Se trata en realidad de una mezcla de a-D-glucopiranosil (1-6) rnanitol y a-D-glucopiranosil (1-6) sorbitol. Es de bajo contenido calrico por la dificultad para hidrolizar el enlace glucosidico y actualmente se encuentra pendiente su solicitud para ser aprobado por la FD A. Derivados clorados de la sacarosa La empresa Tale & Lyle de Inglaterra, productora de azcar de caa, encontr una va hacia la diversificacin del mercado de la sacarosa y a la vez una alternativa en la bsqueda de edulcorantessintticos al encontrar que los derivados clorados de la sacarosa, especficamente en las posiciones 4,1' y 6' posean un poder edulcorante muy superior al de la sacarosa. En particular, el compuesto 4,l',6' tricloro 4,1 ',6' trideoxigalactosacarosa, conocido como TGS o sucralosa, que no es asimilado por el organismo y es unas 600 veces ms dulce que la sacarosa (23). Neoazcares El trmino "neoazcares" se ha venido aplicando a oligosacridos de diversas estructuras, algunos conteniendo ms del 50% de fructosa. Son azcares obtenidos por procesos enzimtcos, algunos obtenidos mediante el uso de fructosiltransferasas aplicadas sobre sacarosa (24). El proceso emplea una enzima de Bacillus subtilis o de Erwinia sp. (antes Aerobacter levanicum). Se trata de una fructosil transferasa, que a diferencia de la actividad levansacarasa, produce una menor cantidad del polmero "levan", y se aprovecha su capacidad de transferir fructosa a la sacarosa o a la galactosa. Existe adems un producto comercial de nombre neosugar de la compaa japonesa Meiji Seika, que emplea fructosiltransferasas de Aspergittus sp. y de Aureobasidium sp. La reaccin que da lugar al producto es la siguiente: n(G-F)

H2/Pd

GPM cC-D-glucopiranosN (1-6) rnanitol CHg OH OH"-OH fs f-OH -OH a-D-glucopiranosil O------CH2 (T-6) sorbitol

Figura 7. Produccin de palatinosa y palatinita a partir de sacarosa. potencial en la produccin de alimentos de humedad intermedia, ya que permite su preservacin sin el alto dulzor que ocasiona la sacarosa. Su aplicacin en alimentos para diabticos y para deportistas es tambin posible por la lenta liberacin de glucosa. No provoca caries dental y es mas resistente ala hidrlisis acida que la sacarosa. Es un excelente excipiente para tabletas y finalmente es un azcar fermentable por bifidobacterias y no enterobacterias, desfavoreciendo el desarrollo de microorganismos de la putrefaccin con tendencia a causar diarrea (18). Primeramente fue producido en Alemaniapor la South German Co., como un intermediario en la produccin de otro edulcorante, la palatinita (Figura 7). Utilizaba un proceso fermentativo con Serrata plymuthica o Protaminobacter rubrum. Estos mismos microorganismos fueron empleados ms tarde por Bayer AG. Se trataba de un proceso de bioconversin con las clulas recirculadas hasta en 7 ocasiones para convertir una solucin con 20% de sacarosa, para posteriormente purificar' y cristalizar la isomaltulosa (19). Actualmente se emplean procesos con clulas inmovilizadas, a partir de las primeras patentes solicitadas por la Tate and Lyle en Inglaterra. Por ejemplo, la Mitsui Sugar Co., emplea un proceso con las clulas de S. plymuthica crecidas en sacarosa, agua de cocimiento de maz, Na2HP04 y NaCl y posteriormente atrapadas en alginates y reticuladas con polietilenimina y glutaraldehdo. El tiempo de vida media del catalizador es del orden de un mes, operando con soluciones de sacarosa al 40% p/p que son convertidas en 85% en isomaltulosa (20). La Miles Laboratories emplea una tcnica similar pero inmovilizando las

r Q.Fn + (n-l)Q

donde el oligosacrido (G - Fu) contiene de 2 a 4 molculas de fructosa unidas en 2>1 (nestosa, kestosa,...). Estos oligosacridos promueven las bifidobacterias, son de baja

7 Edulcorantes asimilacin y no ocasionan caries dental. Actualmente son empleados en diversos productos alimenticios por la industria japonesa. EDULCORANTES DE NATURALEZA PROTEICA Aspartamo As como los jarabes fructosados representan un desarrollo biotecno lgico de trascendental impacto en el sector de los edulcorantes calricos, el aspartamo lo constituye en el de los no calricos. En esta seccin slo nos ocuparemos de detallar algunos desarrollos biotecnolgicos en relacin con la sntesis del dipptido, puesto que el origen de las dos unidades que lo constituyen, el cido asprtico y la fenilalanina, ha sido cubierto en la produccin de aminocidos. El aspartamo: N-L- a -aspartil-L-fenUalanina-1 -metil ster, cuya estructura se muestra en la figura 8, fue descubierto en 1965 por J. Schatter de la compaa de Searle, durante la sntesis de un tetrapptido para un bioensayo (25). Fue aprobado por la FDA en 1981 para productos secos y en 1983 para refrescos. Es de 165 a220 veces ms dulce que la sacarosa. Al igual que en el caso de sacarina, el aspartamo fue descubierto cuando una porcin del producto cay en los dedos del investigador (C.Fahlberg en 1878 en el caso de la sacarina), quien posteriormente los llev a la boca: aunque exitosa en estos dos casos, esta metodologa no es recomendada al joven estudiante en bsqueda de nuevos edulcorantes, pues el nmero de intentos fatales es desconocido. Su solubilidad en agua es baja (10 g/1 a 25 *C) y tiene el principal inconveniente de ser poco estable a la temperatura y al pH. En la figura 9 se presentan los principales productos de descomposicin del aspartamo. El pH ptimo de estabilidad es entre 3 y 5, aunque a pH de 4 donde tiene alta estabilidad, a 80 * C en 24 horas se pierde un 20% del edulcorante. Sntesis qumica de aspartamo La sntesis del aspartamo se ha venido haciendo en forma qumica. Aunque existen 3 procesos, el mtodo clsico es efectuar la condensacin del cido N-benziloxicarbonil

Edulcorantes de naturaleza proteica 543

o o

CH3-0H +

OH-C -CHe-CH-C-NH-CH-C.

II

/(

S
0H-C-CH2-CH-C-NH-CH-C ci NH2 Aspartamo

I
i CH2

y Asportllfemidonino(gj

\^

h8

1 <* . g
. Acospartico +

8
NH ^

1J 3
4

(S)[

^ nC

'

NH2-CH-C

.0

H Dicetopiperazina Figura

Fenilalanina

9.

Descomposicin del aspartamo. (fj-benzil) -L-asprtico y el stermetilico de la femlalanina con reactivos tales como elN,N-diciclohexilcarbodimida. El producto obtenido es reducido a aspartamo mediante hidrogenacin cataltica. El mtodo ms comn se ilustra en la Figura 10. Una de las desventajas de la sntesis qumica es la obtencin de los a y 0 ismeros. Se produce al acoplar el anhdrido del cido asprtico con el ster metlico de la fenilalanina Como puede observarse el grupo amino del asprtico est protegido, mientras que, al estar merjlada, la fenilalanina est protegida tambin. La separacin del ismero es relativamente simple al disolverse en cido clorhdrico diluido y cristalizarse posteriormente. Produccin enzimtica de aspartamo Existen varios procesos enzimticos desarrollados para la sntesis de aspartamo, nuevas plantas empiezan a usar esta ruta en vez de la qumica (por ejemplo Tosoh Corp. en Japn, la Toyo Jozo y la DSM en Holanda ). De las materias primas, el /--\ Cloruro de Alcohol benclico CHg-COCHg( (J > q

Asp
I

Fen
O 5

Melanol

Carbobenzoxilo LAsp | ------- 7->

NH CH2

CH-3

!.. _ NH2- CHCOOH

\J

-------------------->

C =0
o

+ NH - C H - C i I l CH2 I I

OCH :

CH2-COOCH2-<(0)

L fen 0 Me

(O^CrfeocoNHHcooH \0)_ CH2OCONHCHCONHCH-COOCH3

I
CH2C0OCH2-<<5>
CH

-^T. NN diciclohexilcorbodijmino
H /pd

2-<0)

-------------------------- *" cCAspfenOMe (Aspartamo!

Figura 8.

Estructura del aspartamo.

Figura 10.

Sntesis qumica del aspartamo.

544 Edulcorantes barato (de 2 a 4 dlares/kg), siendo la fenilalanina el componente ms costoso. De los mtodos de produccin el desarrollado por Genex, usando la enzima fenilalanina amoniolasa y como sustratos cido transeinmicoy amoniaco, el de la Purification Engineering Inc. que implica la rranseininacin de cido fenilpirvico con la enzima aminotransferasa de Paracoccus denitrificans (el fenilpirvico obtenido a su vez de cido acetamido cinmico con una aminohidrolasa de Corinebacterium sp.) o la fermentacin directa de glucosa (Searle, Ajinomoto, Biotechnica...), el ultimo resulta ser el ms econmico. De hecho el desarrollo fermentativo ocasion la cada del precio de la fenilalanina de 66 dlares/kg a alrededor de 22 dlares/kg para finales de 1985 y se espera que el precio disminuya an ms. Como resultado de estos procesos el costo de manufactura del aspartamo cay tambin de 180 dlares/kg a 90 dlares/kg (26). La sntesis enzimtica del dipptido involucra la condensacin por accin inversa de endoproteasas que catalicen la reaccin: Rj-COOH+NH,-^ =====*>R,-CONH*,+HaO donde R, y Rj son los aminocidos protegidos:el cido asprtico en su funcin amino y la fenilalanina, metilada en su funcin corboxilo. La secuencia de reacciones es la siguiente: a) Proteccin del grupo amino del cido asprtico (Z = cloruro de carbobenzoxlo) L-asp +Z-C3 ; Z-L-asp

Edulcorantes de naturaleza proteica 545

evitar llegar al equilibrio. Esto slo es posible mediante la seleccin adecuada del grupo protector del carboxilo del asprtico, para disminuir la solubilidad del producto. En este caso la inmovilizacin de la enzima no es conveniente pues el producto se recupera en forma insoluble. La segunda alternativa es operar en medio orgnico, en realidad un medio bifsico con agua y un solvente orgnico inmiscible, donde la reaccin se efecta en medio acuoso y el producto es solublepreferencialmente en el solvente orgnico. Para el efecto se ha probado acetato de etilo con excelentes resultados. Si P es el coeficiente de particin correspondiente a la concentracin en la fase orgnica entre la concentracin en la fase acuosa, para el producto es de 580 en acetato de etilo, de 550 en cloroformo y de230 en 1,2 dicloroetano, mientras que para el asprtico por ejemplo es de 14.7,0.035 y 0.032, respectivamente es decir, muy poco soluble en la fase orgnica (26). De esta forma, la reaccin se desarrolla en agua y el producto es eliminado al ser preferencialmente soluble en la fase orgnica. Aunque an en sus inicios, la tecnologa enzimtica de sntesis del aspartamo presenta atractivos tcnicos y econmicos que hacen pensar que las futuras plantas optarn por esta alternativa. De igual forma, el desarrollo de otros edulcorantes basados en pptidos, deber tomar en cuenta la alternativa enzimtica de sntesis.

Sntesis de dodecanucle'tidos
fd(TCGAAATCGAAG) d (TTTCGACTTCGA)

b) Mediacin de la fenilalanina

DL-fen + OiOH

; DL-fen-O-Me
v

ADN poiimerosa

c) Condensacin enzimtica (especfica de la forma L)

Z-L-asp + DL-fen-O-Me
d) Hidrogenacin

*, Z-L-asp-L-Fen-O-Me + D-fen-O-Me

ADN sinttico (polmeros) Enlace c . con

transformado

Vector pWT 121

Z-L-asp-L-Fen-0-Me=i> L-asp-L-Fen-O-Me+Z-H
) Racemizacin

D-fen-O-Me

, DL-fen-O-Me

Fermentacin V Poli (L-asp-L-fen) Enzima proteoltica

v

La termolisina (EC 3.4.24.4) de Bacillus thermoproteolyticus Rokko ha sido la enzima ms utilizada en los procesos de sntesis (27) o la termoasa, una forma menos pura de la misma enzima, aunque otras han sido igualmente propuestas; por ejemplo, una proteasa de Micrococcus caseolyticus (28). Son en general las metaloproteasas (EC 3.4.24), las que por hidrolizar enlaces peptdicos en el grupo amino de un aminocido hidrofbico, parecen adecuadas para el proceso. Es importante que la proteasa no contenga actividad esterasa, como las tiolproteasas, por actuar sobre el ster de la fenilalanina. En medio acuoso la reaccin procede hasta rendimiento del 95% cuando la fenilalanina metilada se agrega en exceso y el producto es precipitado a medida que es producido para

L-asp-L-fen
Figura 11. Sntesis del aspartamo por ADN recombinante (19).

9 Edulcorantes

Edulcorantes de naturaleza proteica 547

ADN recombinante Finalmente, es conveniente sealar que se ha logrado sintetizar el dipptido asp-fen mediante el uso de la tecnologa del ADN recombinante, de acuerdo con la secuencia descta en la Figura 11; sin embargo, el proceso no parece mejor que los ya descritos, sobre todo debido a los bajos rendimientos de produccin y la complejidad del proceso de purificacin (26,29). Otros pptdos edulcorantes Existen 20 aminocidos comnmente en la naturaleza, 39 si se incluye a sus ismeros pticos, lo que implica ms de 1 500 combinaciones de dipptidos y ms de SO 000 para trpptidos, sin contar derivados qumicos. Esto implica que el potencial biotecnolgico no slo para los edulcorantes, sino tambin para otras propiedades (pptdos amargos, pptdos salados...) es basto. De hecho Searle examin ms de 200 anlogos del aspartamo antes de decidirse por la opcin originalmente descubierta (25), y se han efectuado decenas de modificaciones al aspartamo para incrementar su poder edulcorante. La Figura 12, resume los cambios en la estructura que incrementan el poder edulcorante. El modelo de Ariyoshi propone al cido asprtico acoplado a una amina sustituida con un grupo pequeo en R, y otro grande en IL. Todos los dipptidos con alto poder edulcorante (mas de 1000) contienen un grupo ster o amida en R, o Rj. Sin embargo, no se ha encontrado ningn sustituto para el enlace peptdico (30). Existe actualmente otro dipptido ya en pruebas en la FDA (Food and Drug Adminis-tration) de Estados Unidos para ser autorizado como aditivo en alimentos. Se trata del alitamo, desarrollado por la Pfizer y constituido por una amida del cido asprtico y la alanina (30). En la Figura 13 se muestran una sene de amidas de este dipptido y su poder edulcorante correspondiente. El alitamo (2,2,4,4-tetrametiltietanoamida), es la ms dulce No se conocen sust fufos Sustituir por grupos pequeos (Ri >
HOOC
\

HC / ***
NH Asprtico NH '

CH I
NH -

Alanina Poder edulcorante relativo o la sacarosa

-o

100 250 600 800 500

\ S

alitamo

2000 1000 1200

-02C(CH2)n
/ NHJ n*l,2

H A f H

Figura 13. Amidas del dipptido L-aspartil-D-alanina. de ellas (2 000 veces la sacarosa) y presenta mayor estabilidad que el aspartamo. Dada la facilidad de produccin, de la alanina (va enzimtica a partir del cido asprtico), es muy probable que los costos de produccin sean menores que los del aspartamo. Se ha encontrado igualmente que algunos derivados del triptofano son igualmente edulcorantes. Especficamente, los derivados en las posiciones 5 O 6, aunque esta propiedad se limita al D-ismero. El 6 metil y el 6 cloro triptofano son hasta 1 300 veces ms dulces que la sacarosa. La taumatina o tana La relacin entre estructura y funcin de los compuestos biolgicos est muy lejos de ser completamente elucidada y es en este rengln donde la biotecnologa seguramente an nos

0 NHC0R

Sustituir por o u n grupo_ grupos grandes alquilo pequeo ^R ^

Figura 12. Resumen de las modificaciones al aspartamo que incrementan su poder edulcorante.

10 Edulcorantes depara impactantes desarrollos. En la seccin anterior se analizaba el poder edulcorante de un dipptido, 2 000 veces ms dulce que la sacarosa. Ahora se trata de una protema, ms de 2 500 veces ms dulce que el azcar de mesa, que adems es potenciador del sabor pues reduce el umbral al que son detectados muchos compuestos del aroma. Se trata de la taumatina, comercializada con el nombre de talina, por la compaa inglesa Tate & Lyle, quien desde 1976 inici explotaciones de la fruta Thaumatococcus daniellii en Ghana, mismas que se fueron extendiendo a otros pases africanos y posteriormente al sudeste asitico. La protena era tradicionalmente obtenida mediante extraccin acuosa,filtracin, ultrafltracin y secado. Para 1982 los avances biotecnolgicos, especficamente en el rengln de la ingeniera gentica, marcaron otra fecha en el sector de los edulcorantes y de la tecnologa del ADN ' recombinante: despus de varios aos de trabajo, la transnacional del agro Unilever, solicit la patente correspondiente a la introduccin del gene de la planta en la bacteria husped, E. coli. Para 1985 la INGENE (International Genetic Engineering) anunci la clonacin del gene en S. cerevisiae. Hasta la fecha se ha clonado el gen enl?. coli,B. subtilis, Streptomyces lividans, S. cerevisiae, K. lactis, aunque hasta la fecha la limitante sigue siendo la baja concentracin en la que se obtiene la protena, asi como el lograr que la protena sintetizada adquiera la estructura tridimensional de la talina y por ende el sabor dulce. La talina vegetal es comercializada e Inglaterra por la Tate & Lyle. Est aprobada para su uso en Japn (1979), Inglaterra (1983) y en Mxico y Australia como potenciador del sabor, con excepcin de alimentos para beb. En Estados Unidos es GRAS como adjunto de goma de mascar, pero ningn otro uso est permitido (32). Aunque elreporte de referencia no lo especifica, esta aprobacin sin duda alguna se refiere al producto natural. En Japn, la compaa San-E Chemical Co. tiene varias formulaciones del producto: San Sweet T-100 como edulcorante, Neo San Maric(NSM) como potenciador del sabor y Neo San Mark C como aditivo para caf. El grupo de investigadores de Unilever realiz extensos trabajos sobre la estructura de la protena (33). Se trata en realidad de dos protenas: la taumatina I y U, cuya composicin en aminocidos se muestra en la tabla 15, de donde puede observarse que slo existen 5 aminocidos diferentes. La Taumatina I tiene un peso molecular de 22,209 y la Taumatina II de 22,293, con 8 puentes de azufre. 10% de la protena se encuentra en a-hlice, 70% en p'-plegada y 20% al azar. Las dos son igualmente dulces. Para ser una protena es extremadamente soluble (hasta 60%) y extremadamente estable: apH menores de 5.5, puede pasar varias horas a 100 * C sin perder el dulzor. En la Tabla 15 se incluyen modificaciones qumicas efectuadas a la protena y su efecto en el dulzor. Finalmente, conviene sealar que el gene de la taumatina se ha clonado tambin en plantas superiores (Solanum tuberosum), generndose el sabor dulce en tejido de las vellosidades de la raz: 3 x 10"* M como concentracin promedio en el tejido. Las posibilidades de incrementar la palatabilidad de alimentos, tanto para humanos como en forrajes para animales, va la modificacin genrica de plantas para incluir la taumatina, es una de tantas potencialidades de la biotecnologa vegetal (34). Otras protenas edulcorantes Existen otras protenas con poder edulcorante, aunque ninguna con las caractersticas de la taumatina Ninguna es producida industrialmente por procesos biotecnolgicos siendo extradas de los productos naturales en que se encuentran. Todas son evidentemente, objetivos potenciales de la ingeniera gentica. A continuacin se describen dos ejemplos (35):
Tabla 15

Edulcorantes de naturaleza proteica S49

Aminocido

Estructura primaria de la taumatina (18). Nmero de residuos

Taumatina I Taumatina H

Glicina Treonina raffi Alanina

Cisteina

24 20 16 16 14 12 12
12

24 / 20 16 16 13 13 12 13 11 11 8 10
9

Senna Asprtico Prolina Arginina Fenil alanina Lisina Asparagina Valina Leucina Isoleucina Tirosina Glutmico Glutamina Triptofano Metionina Total

11 11 10 10
9

8 8 6 4 3 1 207

8 8 6 5 1 207

Monelin a Extrada de una fruta africana conocida como "serendipiti berry*: Discoreophylhm cumminsit. Tiene un peso molecular de 11000 y es de 2 000 a 25 000 veces ms dulce que la sacarosa. Hasta 15 g de protena se extraen por kg de fruta, pero su inestabilidad dificulta la comercializacin. Se encuentra a nivel de desarrollo en el Monell Chemical Senses Center en Filadelfia Miraculina Se trata de una glicoproteina extrada de la fruta milagro: Richardella dulcifiea, del oeste africano. Lo interesante de esta protena es que aparentemente no produce dulzor sino hasta que es activada en la boca por sustancias acidas. Tiene un peso molecular de 42 000. En Estados Unidos la peticin de sustancia GRAS fue denegada en 1974, lo que llev a la quiebra a la compaa Miraculin Corp., donde se desarroll el mtodo para su extraccin y estabilizacin. Conclusiones En el presente captulo se muestra la importancia de los procesos biotecnolgicos en la produccin de nuevos edulcorantes. Es evidente que existe otro nmero importante de estos

11 Edulcorantes

Bibliografia 551

compuestos, actualmente producidos por sntesis qumica, que no han sido descritos, pero que igualmente podrn ser afectados por los desarrollos biotecnolgicos futuros. Tal es el caso de los L-azcares, que podran producirse con isomerasas o el de un alcohol amplia-mente empleado como edulcorante como lo es el xilitol: el desarrollo de xilanasas para la obtencin de xilosa a partir de hemi celulosa y su hidrogenacin posterior podra rpidamente sustituir al proceso qumico actual. De igual forma, es importante sealar que as como desarrollos biotecnolgicos vinieron a desplazarampliamentea la sacarosa de sus aplicaciones, la biotecnologa misma ofrece alternativas para su revalorizacin. En este capitulo hemos visto cmo en el mismo sector de los edulcorantes la sacarosa puede ser materia prima para nuevos productos obtenidos mediante procesos biotecnolgicos; otros captulos abren el panorama a toda una gama de productos. Finalmente los edulcorantes provenientes de peptidos y protenas constituyen el mayor impacto de la dcada de los ochentas en este sector: aunque el aspartamo tiene la ventaja de haber sido el primero en alcanzar el nivel comercial, existen hoy da cientos de productos de la misma naturaleza con mejores propiedades tanto fisico-qumicas, como de poder edulcorante; el alitamo ser sin duda el segundo pptido dulce en alcanzar el nivel comercial. Cuando se plantea aplicar las tcnicas que han dado lugar a la biotecnologa vegetal al sector de los edulcorantes, se pone de manifiesto un rengln de impacto sin precedentes: mejorar la palatabilidad de forrajes e inclusive frutas para consumo humano, va la expresin en el vegetal de protenas como la taumatina. Es probable que la dcada de los noventa nos depare desarrollos en esta direccin.. BIBLIOGRAFA 1. Azcar, S. A., Estadsticas Azucareras. 2. USDA, United States Department of Agriculture, Sugar and Sweetener Outlook ana' Situation, 1981. 3. Arroyo, G., R. Rama y F. Relio, Agricultura y alimentos en Amrica Latina, ICI-UNAM, Mxico, 1985. 4. Jacob sson, S., A. Jamison y H. Rothman, The Biotechnological Challenge, Cambridge University Press, Nueva York, 1986. 5. Barry, R.D., Outlook for Sugar and Sweeteners, ERS, USDA, 1987. 6. Van Beynum, G.M.A. y J.A. Rois, Starch Conversion Technology, Marcel Dekker Inc., Nueva Yode, 1985. 7. Reed, G., Enzymes in Food Processing, Academic Press, Nueva York, 1975. 8. Segard, E., "Les Enzymes, Outiies de Valorisation des Produits Naturels", Biofutur, pp. 43-48,1985. 9. Bos, C, "Engineering Technology for the Manufacture of Sugars from Cereals", Cereals for Food and Beverages, Academic Press, Nueva York, 1980. 10.Marc, A., J.M. Engasser y R. Flayeux, "A Kinetic Model of Starch Hidroly sis by a and p-amylase during Mashing", Biotechnol. Bioeng., 25, pp. 481-496,1983. ll.Linko, P., "Recent developments in the utilization of starch converting enzymes". Proceedings of Bio Fair, Tokio, Japn, 1986. 12.Helde, S. y B.E. Norman, "Enzyme Technology for die Manufacture of Sugars from Cereals", Cereals for Food and Beverages, Academic Press, Nueva York, 1980. 13.Bucke, C, "Glucose transforming enzymes", Microbial Enzymes and Biotechnology, W.M.Fogarty (comp.), Applied Sci. Pub., Londres, 1983.

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CAPTULO

cidos orgnicos

Eduardo Brzana Garca

La produccin de cidos orgnicos mediante el uso de microorganismos constituye una fuerza motriz de gran importancia para el estudio de regulaciones metablicas, lo cual a su vez, na sido clave para el desarrollo de la biotecnologa en su sentido ms amplio. En este captulo se revisan las rutas bioqumicas y los procesos de produccin de los cidos orgnicos de mayor importancia para la industria alimentaria.

INTRODUCCIN El uso de compuestos acidulantes en la conservacin y mej ora de prop iedades rgano I pn cas en alimentos es extenso. En particular, los cidos que contienen uno o ms carboxilos son aditivos alimentarios importantes. Estos cidos, genricamente denominados "cidos orgnicos", son intermediarios o productos terminales de ciclos metablicos bsicos por lo cual ocurren en una gran variedad de organismos vivientes. Tales compuestos incluyen los cidos ctrico, mlico, lctico, actico, tartrico, fumrico y glucnico. Su produccin industrial, salvo el caso del cido tartrico, se realiza mayoritariamente por mtodos biolgicos lo que los ubica como prototipo de la biotecnologa alimentaria. Los cidos orgnicos en la industria de alimentos La incorporacin de cidos en alimentos cumple diversas funciones dependiendo de la aplicacin particular. Tales aplicaciones se inscriben en la explotacin de una o varias de las siguientes propiedades de los cidos orgnicos, o sus sales: 1) poder acidulante, 2) capacidad amortiguadora o reguladora del pH, 3) agente quelante de iones metlicos, 4) emulsificante, 5) efectos organolpticos. El principal uso es la acidificacin y control del pH en el producto final. Un pH bajo, retarda el crecimiento de microorganismos indeseables (principalmente bacterias)y aumenta la efectividad de conservadores como benzoatos y sorbatos. Asimismo, reduce la necesidad de tratamientos trmicos drsticos durante la esterilizacin de frutas y verduras enlatadas, o promueve la inactivacin de enzimas
553

558 cidos orgnicos

cido ctrico 559

nombres de las enzimas relevantes a la produccin de cido ctrico ion indicadas, asi como los cofactores que requieren. Es importante notar que todas las rcnccioneg del ciclo, excepto la condensacin de ctrico son reversibles. Como primer palo pin loumular ctrico es necesario bloquear su transformacin. Esto se puede lograr reduciendo a un mnimo la presencia de iones fierro, cofactor de aconitasa. Ciertamente la eliminacin de fierro en fuentes industriales de carbono es prctica comn. Ante la ruptura del ciclo al nivel de la formacin de cisaconitato, se interrumpe la formacin de los dems intermediarios esenciales en biosintesls. En consecuencia, se requieren reacciones adicionales, llamadas anaplertcas o de rcabnatecim lento que regeneren dichos intermediarios. Estas reaccione s cumplen tal propsito aprovechando la reversibilidad del ciclo. Tres reacciones anaplertcas son posibles y sus puntos de accin, as como las enzimas que las catalizan y sus factores, se indican Glucos a

citrica de A. niger es controvertida, aunque su participacin en levaduras ha sido demostrada (10). El cido oxlico es un contaminante comn en fermentaciones concontroles ambientales defectuosos. Por ejemplo, un pH superior a 4 aumenta el contenido de oxlico en el producto final. Su formacin es catalizada por oxaloacetato hidrolasa de acuerdo con la siguiente reaccin: Oxalacetato Oxalato + acetato Para contrarrestar su accin, la fermentacin se conduce a pH menor a 3.5 al cual, muy probablemente, esta enzima no es activa. Glucosa I 1

I
Fructosa 6 fosfato

CO2

NH

4 ----------

Fosfofructoquinasa (~)^ ------------- 1

Fructosa 1-6 difosfato

Oxaloacetat o
CoA

Acet-CoA

Oxaloacetato

Acetil-CoA

AcetlI-CoA

'/I? ^Glyoxilato
Ji080 _^ISOCJFRJCO

CITRICO -----------------------Isocitrato

1 Isocitrato i
Isocitrato deshidrogenase

-Succlnoto-^' Figura 2. Reacciones anaplertcas del ciclo de los cidos tricarboxilicos. De estas reacciones la nica comprobada en A. niger es la carboxilacin de piruvato (9). La piruvato carboxilasa es constitutiva y permite la fijacin del C0 3 removido de piruvato durante su descarboxilacin a acetil-CoA. Este hecho explica los altos rendimientos experimentales de cido ctrico a partir de glucosa (70-90% w/w). El rendimiento mximo terico es de 112%. La conversin de fosfoenol-piruvato a oxaloacetato ha sido an mera posibilidad. De igual manera, laparticipacin del ciclo del glioxilato durante la fermentacin

__ I

Cetoglutarato Figura 3. Mecanismos importantes de regulacin en la formacin de cido ctrico. Indica activacin 0 malea inhibicin

560 cidos orgnicos Como se mencion previamente los componentes del CAT participan activamente en la regulacin del flujo de degradacin catablica de carbohidratos. Este sistema de control es complejo. El mecanismo relevante a la fermentacin ctrica es el erecto inhibitorio de altos niveles de ctrico en la actividad de la fosfofructocinasa, segn se ilustra en la Figura 3. Resulta evidente que este punto de regulacin es de suma importancia para la fermentacin ctrica debido a que poco producto se obtendra si este mecanismo no es eliminado o por lo menos atenuado. Pata lograr un continuo catabolismo de azcares, a pesar de la acumulacin de ctrico, existe la posibilidad de insensibilidad de la fosfofructocinasa presente en cepas productoras a tal inhibicin (11). Estudios recientes indican que la sensibilidad de la fosfofructoquinasa a citrato es nulificada en presencia de iones NH4 en concentraciones superiores a las fisiolgicamente usuales (7), segn se indica en la Figura 3. La acumulacin de NH4 parece resultar de una deficiencia de manganeso en el medio que disminuye la velocidad con que protenas y aminocidos son reciclados dentro de la clula (12). Asimismo, el manganeso ha sido implicado en la modificacin de la sntesis normal de lpidos. Esto trae como consecuencia la existencia de membranas celulares defectuosas con una mayor permeabilidad al ctrico (12) as como un mayor flujo de carbono hacia el cido ctrico producto de la disminucin de lpidos en los componentes celulares. Finalmente, ante el potencial de las levaduras como agentes productores de cido ctrico, es importante sealar que las levaduras se distinguen de A. niger en varios aspectos: la fermentacin con levaduras es independiente de los niveles de Mn 2t, requieren de un pH menos cido, entre 4.5-6.5, requieren de amina y la acumulacin de ctrico ocurre nicamente en condiciones de limitacin de nitrgeno. Factores ambientales Antes de adentrarse en este terna es sumamente importante sealar que cada cepa productora es nica en su respuesta metablica a un medio ambiente dado. A pesar de que las generalidades bioqumicas descritas en la seccin anterior pueden considerarse como aplicables, las cepas actualmente usadas en la industria son el resultado de mltiples modificaciones que evitan una homogeneidad en su caracterizacin. An ms, buena parte del conocimiento relativo a dichos superproductores es mantenido en secreto con gran celo por parte de las industrias que los usan. En consecuencia, los factores ambientales para caa. cepa deben ser optimizados de manera particular y, por lo tanto, los aspectos cubiertos en esta seccin se reducen a lincamientos generales. Aspectos nutricionales En general la cantidad de cido ctrico producido est en relacin inversa con el crecimiento celular. Al inicio de la fermentacin, sin embargo, se requiere un balance apropiado de nutrientes que permita la propagacin adecuada del micelio. Los factores nutricionales ms importantes para una produccin exitosa son la concentracin y tipo de carbohidratos y el contenido de metales. Los carbohidratos deben ser simples y de fcil transportacin a travs de la membrana, gracias a la presencia de invertasas extracelulares asociadas a la membrana. Estas hidrolasas desdoblan la sac ararosa a hexosas y son sumamente activas a las condiciones de fermentacin. Gracias a ello el medio industrial ms usado son las melazas, tanto de caa como de remolacha. Estas ltimas son en ocasiones preferidas por presentar un mayor contenido de nitrgeno. Se requiere una concentracin particularmente alta de azcares

Acido dirico 561

entre 140-240 g/1. Concentraciones menores conllevan a acumulacin de cido oxlico y una baja relacin ctrico/biomasa. aacLa fuente de nitrgeno debe ser baja, del orden de 0.1 -0.4 g/1 y proporcionado preferentemente por sales de amonio como sulfato o nitrato. Se ha reportado que un consumo total del nitrgeno en el medio es prerrequisito para el inicio de la acumulacin de cido ctrico (13). En ocasiones, el contenido de nitrgeno puede ser alto en tanto el fosfato se mantenga bajo. El fosfato juega un papel regulador importante de reacciones metablicas. El contenido recomendado se encuentra entre 0.1 y 0.2%. Concentraciones mayores promueven el crecimiento vegetativo a costa del rendimiento en cido ctrico. La presencia de metales en el medio de cultivo es indispensable para el crecimiento celular. Estos niveles se encuentran a nivel de unas cuantas ppm. Sin embargo, niveles ligeramente superiores afectan el rendimiento de ctrico dramticamente (14). El contenido de metales es critico pues medios optimizados en fuentes de C, N y P no promueven la produccin de ctrico si los metales no estn ajustados adecuadamente. Los ms importantes son Fe y Mn segn se describi en la seccin de bioqumica. Otro metal de importancia es Zn (15), aunque su relacin bioqumica no ha sido descrita. Cu funciona como antagonista de Fe y Mn reduciendo el efecto negativo de excesos de estos metales. Finalmente, un medio bajo en metales favorece el crecimiento del hongo en forma de partculas opellets. En cultivo sumergido esta morfologa es preferible porque resulta en un medio de menor viscosidad, en comparacin al crecimiento filamentoso, que se traduce en menores costos de aireacin y agitacin. La importancia de niveles bajos de metales obliga a efectuar un pretratamiento de las materias primas usadas. Esto es particularmente el caso de las fuentes industriales de carbono, como melazas, por ser el componente fundamental del medio de cultivo y por tener un contenido elevado de cenizas. Varios procedimientos pueden usarse para remover iones metlicos y su seleccin esta dictada por criterios econmicos. Entre los ms comunes estn la precipitacin con agentes quelantes como hexacianoferrato o ferrocianuro de potasio, EDTA y polietilenamina. Es factible el uso de resinas de intercambio catinico pero se considera demasiado costoso para fines industriales. Una gran variedad de aditivos han sido recomendados en la fermentacin ctrica. Ejemplos incluyen el uso de alcoholes como metanol y propanol, aceites y cidos grasos de hasta 15 carbonos altamente insaturados o antiespumantes como ocatadecanol (6). Es posible que estos compuestos incidan en la permeabilidad de la membrana celular favoreciendo la excrecin de ctrico. Finalmente, AMP cclico ha sido reportado como estimulante de cido ctrico (15). Aspectos fislcoqumicos Una vez definido el medio de cultivo y los pretratamientos adecuados en las materias primas utilizadas es necesario establecer las condiciones de la fermentacin. sta se debe controlar entre 25-30' C. Temperaturas mayores favorecen la acumulacin de oxlico. El pH al inicio de la fermentacin se ajusta a 3.5-4.5 para favorecer el desarrollo celular y se mantiene en 2 durante la etapa productiva. Un pH superior a 4 favorece la formacin de oxlico y glucnico, este ltimo debido a la accin de glucosa oxidasa extracelular activa a pH alto. La aireacin del medio es de suma importancia. Una abundante oxigenacin es necesaria para garantizar una produccin adecuada. El uso de aire enriquecido en oxgeno permite lograr altas productividades pero el alto costo de esta prctica no resulta compensado. Curiosamente, breves interrupciones en el suministro de oxigeno de tienen irreversiblemente

562 cidos orgnicos la produccin de cido ctrico sin afectar notoriamente el crecimiento. Este efecto se relaciona con la edad del cultivo, siendo ms marcado en fermentaciones cercanas a su trmino. Esta observacin ha abierto la posibilidad a la existencia de una ruta alterna de respiracin independiente de la fosforilacin oxidativa (16). Dicha ruta no es inhibida por cianuro y requiere de altos niveles de oxgeno disuelto para funcionar. Proceso industriales Existen dos mtodos principales de produccin de cido ctrico, el cultivo superficial y el cultivo sumergido. En ambos casos se emplean cepas seleccionadas deA. niger. Recientemente se inicila operacin delprimerproceso que usa levadura en un medio de carbohidratos (17). En cualquier caso, es importante que los equipos usados sean de acero inoxidable o impregnados con recubrimientos resistentes. Esto es debido a las propiedades corrosivas del cido ctrico y a la gran sensibilidad de la fermentacin a trazas de metales. El cultivo superficial nene la ventaja de ser simple en su operacin y menos sensible a variaciones ambientales que el cultivo sumergido. Sin embargo, las bajas productividades tienden a volver obsoleta esta tcnica. Seguramente su empleo resulta an econmico por el aprovechamiento de la capacidad instalada. El medio de melazas se prepara diluyendo a un contenido de 14-20% (p/v) en azcares y se pasteuriza. El ferrocianuro requerido para precipitar metales es entonces agregado, as como el suplemento de fsforo. El medio se vierte en charolas de aluminio con capacidad de 500 a 10001 y una profundidad de lquido de no ms de 200 cm para promover un buen intercambio de gases. La inoculacin se efecta con esporas depositada! por aspersin en la superficie del medio. Las charolas son posteriormente colocadas en anaqueles dentro de la cmara de fermentacin y ventiladas con aire filtrado. El aire renueva el oxgeno necesario, remueve el C02 producido y permite controlar la temperatura dentro de la cmara La germinacin de las esporas ocurre a los dos das de inoculacin y la fermentacin dura un total de 9 a 12 das. Al final de esta, elmicelio es separado por filtracin, lavado para remover el cido ctrico adherido y el lquido obtenido se mezcla con el licor residual antes de enviarse a las reas de separacin. Las productividades tpicas de este proceso son del orden de 0.4 kg/m 3-br con rendimientos del 70-75%. En los procesos de cultivo sumergido se pueden usar tanques agitados con mltiples turbinas o fermentadores de torre tipo air-lifi. Estos ltimos son favorecidos por mantener una buena oxigenacin a escalas mayores que las obtenidas econmicamente con tanques agitados. Asimismo, los air-lifi favorecen el crecimiento compacto del micelio en forma de pellets con las consecuentes ventajas en la hidrodinmica del medio discutidas previamente. En tanques agitados la friccin de las aspas sobre el micelio mantienen un crecimiento fragmentado y poco compacto. En todas las plantas actualmente en operacin el proceso es intermitente (por lotes). Despus de los pretratamientos para remover metales es necesario esterilizar el medio de melazas con vapor a un mnimo de 120* C debido a la sensibilidad del proceso a contaminaciones por bacterias. La inoculacin se realiza indistintamente con esporas o con cultivo vegetativo crecido separadamente en un tanque de alrededor del 10% el volumen del fermentador. Cuando se inocula con esporas es recomendable agregar surfactantes que garanticen su rpida suspensin en el seno del medio. Durante la fase de crecimiento se presenta un espumado excesivo que es controlado con el uso de rompedores mecnicos o agentes qumicos. La fermentacin se lleva a cabo a25-30 *

cido ctrico 563

mtodo de cultivo sumergido es ms eficiente y menos intensivo en mano de obra que el de superficie pero requiere de un monitoreo constante y un control preciso. Existe un tercer mtodo de produccin de cido ctrico, basado en el uso de sustratos en fase slida, de uso comn en el sudeste asitico. Este estilo es tambin conocido como Proceso Koji y tiene su origen en Japn. Ms que un proceso industrial, su nivel de uso se restringe a escalas pequeas y su operacin es fundamentalmente emprica. Estametodologia emplea materias primas de desperdicio como bagazo de caa, cascarilla y otros residuos de arroz y frutas humidificados al 65-70% de agua. Los sustratos son degradados por amilasas y celulasas presentes en las cepas de A. niger usadas y la operacin se termina en 3-5 das. Estos cortos tiempos estn ligados a la eficiente aireacin en medios slidos. Los fundamentos de este proceso son la base de nuevas investigaciones en fase slida dirigidas a la produccin de metaboh'tos. Un ejemplo es el uso de slidos inertes impregnados con nutrientes para la produccin de cido ctrico permitiendo el empleo de medios definidos (18). Esto evita los costosos pasos de pretratamiento para eliminacin de metales. Recuperacin del producto El primer paso en la recuperacin del cido ctrico consiste en la filtracin del micelio usando filtros rotatorios o similares. En caso de que la concentracin de cido oxlico sea significativa es necesario separar este cido como oxalato de calcio agregando Ca(OH)2 a 80 *C. Este paso es importante debido a la toxicidad del oxlico cuando el producto final se dedica a la alimentacin. La cristalizacin directa del cido ctrico no es posible debido a la presencia de residuos micelares y polisacridos originalmente presentes en la melaza. Consecuentemente varias purificaciones son necesarias. La primera consiste en precipitar el cido en forma de citrato triclcico por adicin de cal a 90' C. El precipitado es filtrado y lavado para ser posteriormente acidificado a 50 'C con ILSO,, generando el cido libre. El CaSO< formado es separado por filtracin y el lquido que contiene el cido ctrico es desionizado en columnas de intercambio y decolorado con carbn activado. La solucin obtenida es concentrada al vacio. En Europa la cristalizacin final se produce a temperaturas de20-25 * C para generar el cido monohidratado que es separado por centrifugac ion. En Estados Unidos la cristalizacin se efecta por evaporacin dando como resultado la forma anhidra del cido. Para su uso en alimentos se requiere una cristalizacin final en agua. Asurdsmo, existen varios mtodos de separacin por extraccin con solventes (6,16). El diagrama de flujo del proceso completo, ilustrado para el caso de una fermentacin sumergida, se presenta en la Figura 4. En fermentaciones con levadura el cido isoctrico es producido paralelamente. En tal caso se efecta una precipitacin secuencia! (19). El cido ctrico es precipitado primeramente agregando 33 partes de Ca(OH), por parte de medio y manteniendo la mezcla a 85-95 *C por 2 horas. El cido isoctrico se precipitaposteriormente con 2 partes ms de Ca(OH)2 a la misma temperatura. El resto del proceso es similar al caso de A. niger. El micelio obtenido puede secarse y usarse como alimento de ganado o como mejorador { de suelos en formulaciones de fertilizantes. Un uso potencial con atractivo es el uso del micelio como fuente de quitina. Este biopolmero cuenta con amplias aplicaciones como biosorbente debido a sus caractersticas potcatinicas. Un desglose aproximado de los costos de produccin de cido ctrico en cultivo

564 cidos orgnicos Futuros desarrollos

Otros cidos carboxilicos de inters 565

Almaceno-mi ento dal caldo

Micelio te desecho rCfl(OH)2

CaS O Cristalizacin

Figura 4. Diagrama simplificado del proceso de produccin de cido ctrico por cultivo sumergido a partir de melazas.

A pesar de los espectaculares avances en la gentica de microorganismos y la madurez alcanzada por la tecnologa de fermentaciones los mtodos de produccin de cido ctrico no diferennotablemente de aquellos usados 30 o 40 aos atrs. Varios intentos se han hecho de producir cido ctrico por cultivo continuo, ms la tendencia del hongo a adherirse a las paredes y la complejidad de las variables ambientales han retrasado su aplicacin industrial. Muchos esfuerzos se realizan encaminados a encontrar nuevas metodologas. Ciertos desarrollos merecen especial atencin por ser los orgenes de posibles innovaciones. Algunos ejemplos incluyen el empleo de micelio inmovilizado por adsorcin en materiales slidos o por encapsulacin en geles (21,22) y el empleo de biodiscos (23). En particular, el uso de levaduras y bacterias, aprovechando sus altas tasas de crecimiento y su facilidad para crecer en una gran variedad de sustratos, resulta promisorio. Finalmente, otro campo de sumo inters reside en el uso de las tcnicas de ingeniera gentica para mejorar los procesos existentes. Por citar uno de muchos posibles ejemplos, la fermentacin resultara ms econmica si se consumieran fuentes de carbono ms baratos que la melaza, tales como desperdicios celulsicos. Esto podra lograrse transfiriendo a A. niger los genes que codifican celulasas de alta actividad o aumentando la dosis de las ya presentes. OTROS CIDOS CARBOXUCOS DE INTERS

Componente
.....

Tabla 3 Costos de produccin de cido ctrico. Requerimientos Costo Costo

por tonelada de ctrico unitario (fi citrico)

Porcentaje del predo de venta

En principio, los fundamentos bioqumicos en que se basa la produccin de cido ctrico pueden extenderse a otros cidos carboxilicos presentes en el ciclo de Krebs. Tal es el caso de los cidos fumrico y mlico que pueden sintetizarse por mtodos microbiolgicos. Sin embargo, en estos casos os mecanismos presentes no son tan conocidos. Muy probablemente su formacin resulta de la reversibilidad del cido ctrico operando en sentido contrario a partir de oxalacetato (17). Fumrico

Costos variables Melazas cido sulfrico Carbn Electricidad activado Nutrientes Cal Agua Vapor

3000 kg

$80/t

240 72 12.5 190 2 18 380 915 280

15 4.6 12.1

800 kg 590/t 25 kg $500/t 3 800 kw-h 5C/kw-h 5-15 kg $200/t 450 kg $40/t 25 m3 2Cm5 191 S20/t Costos variables totales al 20% Costo anual por intereses y depreciacin

CH,COOH OH,-COOH Este cido tiene una produccin estimada mundial superior a las 60 000 toneladas anuales (24). Presenta una baja solubilidad en agua (vase Tabla 2) y es usado como acidulante en alimentos, as como en la produccin de resinas y materiales plsticos. Recientemente se ha empleado como materia prima en la produccin de cido asprfjco a travs de la enzima aspartasa (6) y de cido mlico con la enzima fumarasa. Actualmente se produce por va qumica sustituyendo al mtodo fermentativo empleado en la dcada de los 60. Varios hongos filamentosos acumulan cido fumrico, principalmente especies de Rhizopus. Mlico HO CH ------ COOH CH,COOH

_ _

24.3 58.6 18

Datos para una planta con capacidad de 2 5001 de ctrico anuales. Costo de capital 3.5 millones. No i se incluyen costos de mano de obra. Los costos son en dlares.
Tornado de: AJ. Hacking, Economic A Specis of Biotechnology. 1986, Cambridge University Press, Cambridge, Inglalerra.