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Mara Elisa Drago Serrano, Teresita del R. Sainz Espues Sistemas de expresin para protenas teraputicas recombinantes Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, vol. 37, nm. 1, enero -marzo, 2006, pp. 38-44, Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57937106

Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, ISSN (Versin impresa): 1870-0195 rmcf@afmac.org.mx Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico

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Volumen 37 No. 1 enero - marzo 2006

Revisin Bibliogrca

Sistemas de expresin para protenas teraputicas recombinantes

Expression Systems for Therapeutic Recombinant Proteins
Maria Elisa Drago Serrano, Teresita del R. Sainz Espues Departamento Sistemas Biolgicos, UAM-Xochimilco.
RESUMEN: Diversos biofrmacos basados en protenas recombinantes son producidos en la actualidad por la industria biofarmacutica. Los sistemas de expresin para la obtencin de biofrmacos, se basan en vectores que permiten la clonacin del gen que codica la protena de inters en una clula hospedera como bacterias, levaduras y lneas celulares. Diversos biofrmacos como factores de coagulacin, hormonas, citocinas y enzimas han sido aprobados para su distribucin comercial. La demanda creciente de medicamentos para el tratamiento de enfermedades, est impulsando el desarrollo de biotecnologas para la produccin sustentable de biofrmacos inocuos, efectivos y de costo razonable. Por la importancia de los biofrmacos para la industria biofarmacutica, el presente trabajo de revisin bibliogrca pretende exponer los sistemas de expresin aplicados en el presente para la produccin de protenas teraputicas recombinantes. ABSTRACT: Several biopharmaceutical products based on recombinant proteins are manufactured at present by biopharmaceutical industry. Expression systems to obtain biopharmaceuticals are based on cloning vectors of genes coding for the protein of interest into a suitable host cell such as bacteria, yeast and cellular lines derived from mammals. Several biopharmaceuticals such as clotting factors, hormones, cytokines and enzymes have been approved for their commercial distribution. Growing demand of medicines intended for the treatment of infectious and chronic diseases is impelling the development of new biotechnologies focused on the ecological production of harmless, ecient and fair cost biopharmaceuticals. By the relevance of biopharmaceutical products to biopharmaceutical industry, the aim of this work was to review the expression systems currently applied for the production of therapeutic recombinant proteins.
Palabras clave: biofrmacos, protenas recombinantes, biotecnologa Key words: Biopharmaceuticals, recombinant proteins, biotechnology.

Correspondencia: Maria Elisa Drago Serrano Departamento de Sistemas Biolgicos, UAM-Xochimilco Calzada del Hueso No. 1100. Col. Villa Quietud. CP. 04960. Delegacin Coyoacn, Mxico D.F. Tel. (52) 55 5483-7253 Fax (52) 55 5483-7237 e-mail: mdrago@correo.xoc.uam.mx Fecha de recepcin: 31 de mayo de 2005 Fecha de aceptacin: 12 de octubre de 2005

Introduccin
A mediados de 1970 se inici el desarrollo de la ingeniera gentica basada en la tecnologa de ADN recombinante que marc a su vez, el comienzo de la industria biofarmacutica actual. Mediante la tecnologa de ADN recombinante ha sido posible modicar geneticamente diversos tipos de clulas que actan como reactores biolgicos, capaces de sintetizar biofrmacos con aplicaciones teraputicas basados en protenas recombinantes. Esta breve revisin bibliogrca presenta un panorama general sobre los principales sistemas de expresin aplicados en la industria biofarmacutica para la produccin de diversos tipos

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de biofrmacos derivados de protenas recombinantes aplicados a la bioterapia y se enfoca sobre todo en aquellos sistemas de expresin de biofrmacos que han sido aprobados para su distribucin comercial.

A continuacin se describen las principales caractersticas de los sistemas de expresin aplicados en la industria biofarmacutica para la produccin de protenas recombinantes que han sido aprobadas para su aplicacin teraputica en humanos 6,7.

I. Esquema general de produccin de biofrmacos

Los biofrmacos son producidos por organismos genticamente modicados (genetically modied organisms GMOs). A diferencia de las protenas de origen natural, las protenas recombinantes pueden ser producidas en grandes cantidades lo que ha permitido cubrir la creciente demanda actual. En contraste con las protenas no humanas obtenidas de animales como por ejemplo la insulina de cerdo, las protenas recombinantes son idnticas o dieren ligeramente respecto a las protenas nativas de origen humano, por lo que las reacciones inmunolgicas adversas disminuyen signicativamente 1. La fase inicial upstream (cuesta arriba) de produccin de biofrmacos consiste en el diseo del sistema de expresin que implica la elaboracin mediante ingeniera gentica, del vector de clonacin del gen que codifica la protena de inters en la clula hospedera adecuada. La segunda fase downstream (cuesta abajo) se enfoca al proceso de purificacin, evaluacin del control de calidad y validacin de dicho producto. En trminos generales, la produccin de protenas recombinantes sigue el siguiente esquema: 1) tratamiento con enzimas de restriccin de un vector de clonacin y del ADN que contiene el gen que codifica la protena de inters, 2) ligamiento del gen con el vector para obtener el ADN recombinante (ADNr), 3) internalizacin y replicacin (clonacin) del ADNr en una clula hospedera y 4) expresin del gen en la protena 2. Los vectores ms conocidos son plsmidos bacterianos que se caracterizan por replicarse en forma independiente al cromosoma de la bacteria. Los vectores son molculas de ADN bicatenario que actan como vehculos de clonacin cuya funcin es acarrear y expresar el gen en la clula hospedera. Los virus tambin son empleados como vectores de clonacin ya que se aprovecha su capacidad de introducir y replicar su genoma en la clula 3. El diseo del vector basado en tcnicas de ingeniera gentica y la eleccin de la clula hospedera determinan en gran parte, las caractersticas de la protena recombinante, las estrategias de su purificacin, rendimiento y el costo de su produccin 4. En la industria biofarmacutica suelen emplearse como clulas receptoras del ADNr la bacteria Escherichia coli (E. coli), la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) y clulas de mamferos como la lnea celular CHO (Chinese Hamster Ovary) y BHK (Baby Hamster Kidney 5.

II. Sistemas de Expresin

a. Bacterias Para la expresin de protenas no glicosiladas recombinantes suele emplearse a la E. coli como clula hospedera. A escala industrial, el cultivo de E. coli para la produccin de protenas recombinantes suele llevarse a cabo en medios qumicamante denidos 8 . Los medios sintticos facilitan el aislamiento y puricacin del producto y reducen el costo de su produccin. En trminos generales, los vectores de clonacin para E. coli contienen: el gen que codica la protena de inters, un origen de replicacin que determina el nmero de copias del vector, un marcador de seleccin que puede ser un gen de resistencia a antibiticos (como ampicilina, kanamicina y tetraciclina), un promotor que regula la transcripcin del gen insertado (inserto) y un gen de terminacin de transcripcin 8 . A nivel laboratorio, la ampicilina es el marcador frecuentemente empleado en la seleccin de bacterias recombinantes, sin embargo, a escala industrial, la ampicilina no es el antibitico de eleccin en la produccin de bioteraputicos para uso humano debido a su probable efecto alergnico8. Para evitar el uso de antibiticos, se estn desarrollando cepas mutantes de E. coli a las cuales se les elimina un gen que codica una protena esencial, por ejemplo las enzimas que sintetizan la pared celular. Este gen esencial se fusiona con el operador de lac. En ausencia de lactosa este gene no se transcribe debido a que la molcula represora se une al operador de lac, y por lo tanto la clula no sobrevive, sin embargo, si la clula posee un plsmido con el sitio operador habr una competencia del represor y se unir preferentemente al operador del plsmido permitiendo la transcripcin del gen esencial y la proliferacin celular 8,9. En estudios de investigacin, suele emplearse como parte del vector de clonacin en E. coli al promotor lac cuya expresin es regulada por el isopropil-b-D-tiogalactopiransido (IPTG). Debido al costo elevado del IPTG, a escala industrial, dentro del vehculo de clonacin en E. coli se emplea ms frecuentemente el promotor de triptofano (trp operon) el cual puede inducirse en medios de cultivo carentes de dicho aminocido 8. La principal limitante de la aplicacin de E. coli como clula hospedera radica en que esta bacteria al igual que otras, no es capaz de llevar a cabo modicaciones postraduccionales de la protena recombinante que permitan, por ejemplo su glicosilacin, necesaria para su estabilidad y actividad biolgica 10. Los sistemas de expresin en E. coli que favorecen la secrecin del producto hacia el sobrenadante del cultivo suelen con frecuen-

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Volumen 37 No. 1 enero - marzo 2006 cia, ser aplicados a escala industrial debido a que no se requiere el rompimiento de la bacteria para su obtencin 11. La desventaja de este sistema estriba en el efecto de dilucin del producto 8. Por otra parte, se han diseado vectores plasmdicos de clonacin para E. coli que propician la exportacin del producto recombinante hacia el espacio periplsmico 8. Este proceso facilita el aislamiento del producto pero diculta su proceso de puricacin por el exceso de contaminantes provenientes de la clula hospedera como son protenas y ADN 12. Por otra parte, existe el riesgo de la prdida de actividad derivada de la accin enzimtica de proteasas periplsmicas 8. Otra estrategia de obtencin de protenas recombinantes en E. coli incluye su produccin intracitoplsmica. Este mtodo no requiere que la protena sea solubilizada ni renaturalizada para un correcto replegamiento (refolding), sin embargo su puricacin es larga y costosa 8. Otro sistema de expresin en E. coli incluye la produccin de protenas recombinantes insolubles en forma de cuerpos de inclusin citoplsmica12. Este sistema tiene como ventaja un alto rendimiento del producto sin embargo se precisan mtodos costosos para replegar el producto 8 y para eliminar las protenas y ADN de la clula hospedera12 por ello, su aplicacin a escala industrial resulta econmicamente desventajosa. Algunos productos biofarmacuticos recombinantes aprobados para su aplicacin y producidos en E. coli incluyen: insulina (hormona), Ecokinase (anticoagulante), citocinas como interferon alfa 2b (IFN-2b), IFN--1a y al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-) entre muchos otros 13 . b. Levaduras La produccin de protenas recombinantes comerciales se ha basado tambin, en el cultivo en medios qumicamente denidos de levaduras como Pichia pastoris (P. pastoris) y S. cerevisiae 14. Los vehculos de clonacin empleados en levaduras suelen acarrear como promotores al gene PGK (3-phosphoglycerate kinase, 3fosfoglicerato quinasa), ADH1 (alcohol dehydrogenase1, alcohol deshidrogenasa 1), fosfatasa cida y genes del cluster GAL (galactosa)5,15,16. En la industria biofarmacutica, los sistemas de expresin con levaduras son altamente valorados ya que pueden realizarse en medios qumicamente denidos y adems no se requiere remover endotoxinas bacterianas, ambos aspectos reducen el costo de la produccin del producto. Se han logrado obtener cepas recombinantes de S. cerevisiae capaces de llevar a cabo la N-glicosilacin (adicin de carbohidratos al grupo R del aminocido asparagina de la protena) de protenas heterlogas15. A pesar de la habilidad de las levaduras de glicosilar protenas, la composicin de los azcares de estas glicoprotenas diere de la protena nativa de origen animal. Las glicoprotenas provenientes de levaduras pueden tener una vida media baja debido a que al unirse a receptores de manosa expresados en la supercie de macrfagos, son captadas y eliminadas por estas clulas fagocticas14. Lo anterior ha limitado la aplicacin de levaduras en sistemas de expresin de protenas heterlogas humanas que no requieren ser glicosiladas. Esta limitante, ha motivado la bsqueda de sistemas alternativos de expresin en levaduras diferentes a S. cerevisiae que han probado ser ms ecientes para la produccin de glicoprotenas de naturaleza humana como es el caso de la cepa recombinante Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)17. Algunos productos recombinantes generados en S. cerevisiae son hirudina (anticoagulante), hormonas como insulina y glucagon, vacuna cudruple contra difteria, ttanos, tosferina y hepatitis14. c. Lneas celulares Para la produccin de protenas glicosiladas humanas recombinantes se emplean cultivos derivados de lneas celulares de mamferos como la lnea celular BHK (Baby Hamster Kidney)18, HEK293 (Human embryonic kidney)19 y principalmente la lnea celular CHO (Chinese Hamster Ovary)18,20. En trminos generales, los requerimientos bsicos de un vehculo de clonacin para clulas eucariontes21 son: un promotor eucarintico generalmente de origen viral, que regule y promueva la expresin del gen que codica la protena de inters, un sitio de clonacin, una secuencia de poliadenilacin, un origen bacteriano de replicacin y un marcador de seleccin. A escala industrial los genes de seleccin ms populares son el gen que codica la enzima glutamina sintetasa (GS) y el gen que codica la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) implicada en el metabolismo de nucletidos22. Usualmente se adiciona un agente txico como el metotrexato (MTX) frecuentemente empleado para seleccionar las clulas resistentes receptoras del gen de seleccin22. Los vehculos de clonacin en clulas eucarinticas suelen portar promotores derivados del virus SV40, virus del papiloma, virus vaccinia, promotores retrovirales LTR (long terminal repeat)5 y adenovirus 20. En sistemas de expresin de protenas recombinantes que emplean como vector el adenovirus recombiante humano (rhAD), las clulas CHO han mostrado ser ms estables y por tanto ms ecientes que las HEK ya que stas ltimas son ms vulnerables a sufrir efecto citoptico como resultado de la replicacin viral 20. Aun cuando la capacidad de clulas CHO para expresar glicoprotenas es alta, estas clulas carecen de enzimas que permiten la glicosilacin terminal de protenas observada en las protenas humanas18. Por ello, se han diseado lneas celulares CHO transfectadas con genes que codican dichas enzimas y que son capaces de producir protenas con un patrn de glicosilacin de las glicoprotenas humanas18.

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Generalmente las lneas celulares expresan mezclas heterogneas de protenas con patrones diferentes de glicosilacin (glicoformas) 23, por ello, su composicin debe ser estimada24, 25 para cubrir los estndares permitidos para su produccin industrial. Mediante el diseo de estrategias de ingeniera gentica enfocadas a la regulacin de rutas de glicosilacin, se ha modicado el procesamiento postraduccional de protenas recombinantes para mejorar su actividad, tal como fue demostrado en hibridomas generados con clulas CHO que sobreexpresan la enzima UDP-glucoaminoacil transferasa III y producen anticuerpos IgG con mayor capacidad citotxica dependiente de anticuerpos (ADCC) 26 que los anticuerpos no modicados. Aun cuando el sistema ms eciente de expresin de protena glicosiladas humanas se realiza en lneas celulares, es preciso reconocer que muchas lneas derivan de clulas tumorales y pueden ser portadoras de retrovirus. Por otra parte, las lneas celulares son muy vulnerables a la contaminacin viral proveniente de los componentes del medio como el suero fetal 27. Debido a lo anterior, los productos recombinantes producidos en lneas celulares tienen un riesgo potencial de transmitir enfermedades ocasionadas por virus, priones 28 y micoplasmas 29. Hoy en da se disponen de medios de cultivo comerciales libres de suero (Hyclone, Invitrogen) que han permitido disminuir el riesgo de contaminacin exgena de las lneas celulares22. En ciertas condiciones, el costo de produccin de biofrmacos en lneas celulares aumenta debido a las prdidas derivadas del efecto citoptico ocasionado por la replicacin del vector de clonacin o de la apptosis. Esta ltima denominada muerte celular programada, puede surgir debido a que las lneas celulares se ven forzadas a portar un nmero extremo de copias de genes exgenos ocasionando su inestabilidad 30. La identicacin de genes que limitan la apoptosis 31 podr permitir en un futuro, solventar los problemas de estabilidad de las lneas celulares destinadas a la generacin de biofrmacos. En la actualidad, cerca de un 50 a 60% de protenas glicosiladas humanas aprobadas para su distribucin comercial se producen en clulas inmortales de ovario de hamster CHO22. A partir de esta lnea celular se han obtenido una amplia gama de protenas bioteraputicas recombinantes entre las que se incluyen: el factor de coagulacin IX, tirotropina alfa, eritropoyetina, IFN--1a (citocinas) 7,13. Con la lnea BHK se han obtenido el factor de coagulacin VIIa y VIII 7.

macos antes de ser lanzados para su distribucin comercial32. Dichas normas son acordadas por organismos como EMEA (The European Medicines Evaluation Agency) (http://pharmacos.eudra.org) el CDER (Center for Drug Evaluation and Research del U.S. Food and Drug Administration, FDA (http://www.fda.gov). que legislan entre otros aspectos, la produccin y aplicacin de bioterapeticos recombinantes as como el impacto ambiental de su produccin32. En Mxico las GMP para la fabricacin de frmacos sean o no recombinantes estn reguladas por la norma ocial mexicana NOM-164-SSA1-1998. Estas instancias regulan la utilizacin de productos potencialmente dainos que son empleados a nivel laboratorio para la produccin de biofrmacos pero que son totalmente inaceptables para su aplicacin a nivel industrial 9. En la industria farmacutica para la produccin de biofrmacos de uso humano, es inaceptable el empleo de ampicilina, para la seleccin de clonas por sus posibles efectos alergnicos8 tampoco es aceptable la aplicacin de lisozima, ARNasa pancretica, fenol, cloroformo, agentes mutgenos como bromuro de etidio y cloruro de cesio entre muchos otros 9. En trminos generales, las pruebas clave de evaluacin que se aplican en etapas intermedias y en la fase nal de produccin de biofrmacos son: esterilidad, pureza, homogeneidad, identidad, estabilidad, rendimiento, potencia, protena celular, evaluacin de endotoxinas e inocuidad9, 33. La seleccin y aplicacin de dichas pruebas depende de las caractersticas del producto. La evaluacin de la calidad de biofrmacos es un proceso complejo que involucra mtodos de control de tipo analtico, bioqumico, microbiolgico, biolgico, inmunolgico y molecular. En relacin a estos mtodos de control se incluyen entre muchos otros, a la espectrometra de masas de ionizacin por desercin por lser asistida por matriz (MALDI-MS) 23, cromatografa liquida de alta resolucin en fase inversa (RPHPLC), cromatografa de intercambio inico12, cromatografa de afinidad 34, bioluminiscencia y quimioluminiscencia35, ensayo inmunoenzimtico (ELISA) 12, reaccin en cadena de polimerasa (PCR) 29, 37 y bioensayos en cultivos celulares y en animales de prueba 36. Adems del control obtenido con estos mtodos, se lleva a cabo un proceso de validacin en el cual se aplican pruebas de control para evaluar la eliminacin de molculas y agentes biolgicos potencialmente dainos 27. Por otra parte, la evaluacin preclnica del producto en humanos es una etapa crucial previa al lanzamiento comercial del producto 33. Debido a que el aspecto del control est fuera del alcance de la presente revisin, se sugiere consultar el sitio web de la FDA que provee una excelente fuente de informacin sobre este rubro (http://www.fda.gov/cber/gene.htm). En el Cuadro 1 se muestran algunos biofrmacos que han sido aprobados para su aplicacin clnica.

III. Control de biofrmacos aprobados para su distribucin comercial

A lo largo del proceso de produccin de biofrmacos se aplican obligatoriamente rigurosas pruebas de control de calidad que cumplan las normas basadas en las buenas prcticas de manufactura (Good Manufacturing Practice, GMP) de biofr-

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Volumen 37 No. 1 enero - marzo 2006 Cuadro 1. Biofrmacos aprobados para su aplicacin clnica. Basado de 13 y 41.
Producto Kogenate (rh-Factor VIII producido en cl. BHK). Nutropin (rh GH producido en E. coli) Norditropin (rh Gh) Puregon (rh FSH producido en cl. CHO) Benex (rh-Factor IX producido en cl. CHO ) Regranex (rh-PDGF producido en S. cerevisiae) Follistim (rh-FSH producido en cl. CHO) Insuman (rh-Insulin producido en E. coli) Glucagen (rh-Glucagon producido en S. cerevisiae) Thyrogen (Thyrotrophin-, rh-TSH producido en cl. CHO) Beromun (rh TNFa producido en E. coli) Virtron (rh-IFN-a-2b producido en E. coli) Viraferon (rIFN-a-2b producido en E. coli) Nutropin AQ (rh-GH producido en E coli) Infuse (rh proteina 2 sea morfognica producida en CHO) Advate Factor VIII producido en clulas CHO Apidra (insulina Glulisina) Dukoral toxina colrica oral) Compaa Bayer Genetech Novo Nordisk N.V. Organon Genetics Institute Ortho-McNeil Organon Hoechst AG Novo Nordisk Genzyme Boehringer-Ingel Schering Plough Schering Plough Schwartz Pharma Medtronic Baxter AG Aventis SBL vaccine AB Indicacin tereputica Hemolia A Deciencia de GH en nios Deciencia de GH en nios Anovulacin y superovulacin Hemolia B Diabetes, lceras neuropticas Algunas formas de infertilidad Diabetes mellitus Hipoglicemia Deteccin/tratamiento de cncer tiroideo Tratamiento post-remocin de tumores Hepatitis crnica B y C Hepatitis crnica B y C Falla crecimiento, sndrome Turner Promueve fusin de vrtebras Hemolia A Diabetes mellitus Inmunizacin contra V. cholerae Ao* 1993 1994 1995 1996 1997 1997 1997 1997 1998 1998 1999 2000 2000 2001 2002 2004 2004 2004

r, recombinant (recombinante); rh, recombinant human (humana recombinante); E. coli (Escherichia coli); CHO, Chinese hamster ovary; BHK, baby hamster kidney; hGH, human growth hormone (hormona humana de crecimiento); FSH, follicle stimulating hormone (hormona foliculo estimulante); TSH, thyroid stimulating hormone (hormona estimulante de tiroides); IFN, interferon; PDGF, platelet derived growth factor (factor de crecimiento derivado de plaquetas). (*) ao de aprobacin

V. Conclusin y perspectivas
Mediante los sistemas de expresin aplicados en la industria de biofrmacos ha sido posible generar estos productos en cantidades que anteriormente resultaba difcil por no decir imposible de lograr. Otra ventaja adicional de biofrmacos radica en que se ha incrementado el nivel de su bioseguridad a diferencia de

lo que ocurre con los productos teraputicos de origen natural como hormonas proticas como la insulina obtenida del pncreas porcino cuya aplicacin ha sido asociada a reacciones inmunolgicas adversas o como la hormona de crecimiento y factores de coagulacin sanguneos provenientes de cadveres humanos, que han sido sealados como fuentes potenciales de transmisin de enfermedades infecciosas como hepatitis C y de la enferme-

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dad de Creutzfeldt-Jakob respectivamente2. La produccin de biofrmacos a escala industrial est siendo optimizada por la aplicacin de tecnologas de vanguardia como son los sistemas de clonacin que no requieren del uso de enzimas de restriccin 38, la sntesis de cromosomas articiales 39 y los microarreglos40, mtodo mediante el cual es posible analizar simultneamente los niveles de expresin de miles de genes. La aplicacin de bioensayos en cultivos de tejidos36 y mtodos moleculares como la PCR37 para la deteccin de retrovirus y la aplicacin de transposones42 en lugar de plsmidos para abatir el riesgo de la transmisin horizontal de genes de resistencia hacia antibiticos, son algunas herramientas que sern fundamentales para asegurar la inocuidad y bioseguridad requeridos en el control de calidad que representa el principal reto a enfrentar para la produccin de protenas recombinantes teraputicas. La demanda creciente de biofrmacos para el tratamiento o prevencin de enfermedades infecciosas y crnicas, esta estimulando el desarrollo de biotecnologas capaces de la produccin sustentable de biomedicamentos inocuos, altamente efectivos y de costo razonable.

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