BIOQUMICA

ESTRUCTURAL Y BIOLGICA
Jos Carlos Rodrguez Rey, Javier Len Serrano, M Dolores Delgado Villar y Jess Navas Mndez

PRCTICA 2 ACTIVIDAD ENZIMTICA Y DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES

Objetivos
- Introducir en la determinacin de la concentracin de protenas en plasma sanguneo. - Entender y practicar los principios de la espectrofotometria. - Aprender a manejar pipetas automticas. - Familiarizarse con el concepto de actividad enzimtica y su utilizacin en clnica. - Calcular velocidades de reaccin. - Utilizar mtodos grficos para el clculo de KM y velocidad mxima de los enzimas.

1. Introduccin a la determinacin de protenas totales

La sangre est formada por una solucin acuosa que contiene molculas de tamao variable y diversos tipos de elementos celulares. Los elementos formes de la sangre se encuentran for- mando una suspensin en agua denominada plasma. Aunque el plasma es el medio natural de las clulas sanguneas, la mayora de las determinaciones qumicas se hacen en suero. Las protenas del plasma pueden clasificarse en dos grupos: las que son sintetizadas por el hgado (albmina) y las inmunoglobulinas (producidas por las clulas plasmticas de la mdula sea). El plasma humano tiene una concentracin en protenas de 60-80 g/L (frecuentemente se expresa en g/dL; 6-8 g/dl). Casi la mitad de esta protena plasmtica es albmina, cuyo rango de concentracin es 35-45 g/L. La albmina es una protena de 62.000 D que acta co- mo protena de reserva, adems de importante transportador (cidos grasos, bilirrubina y fr- macos) y regulador osmtico. Es producida por el hgado. Su concentracin aumenta en casos de deshidratacin y disminuye en casos de ascitis/edema y dao heptico severo. La determinacin de la concentracin de protenas en sangre puede ser llevada a cabo por di- ferentes mtodos. En esta prctica vamos a utilizar uno de los mtodos que se utilizan con ms frecuencia: el mtodo de Biuret. En l la disolucin de protena se mezcla con un reactivo que determina que aparezca o se intensifique un color (azul) que se cuantifica midiendo la ab- sorbancia a una determinada longitud de onda frente a un blanco de reactivo. El color genera- do es poco estable y depende de las condiciones de reaccin, por lo que hay que realizar una curva patrn con soluciones de una protena de concentracin conocida (albmina bovina). La base terica de la aplicacin de la espectrofotometria para medir la concentracin de una sustancia en solucin se explica en la Introduccin de este Manual de Practicas.

Materiales
- Soluciones de suero sanguneo A y B de concentracin desconocida. - Soluciones de protena patrn (albmina de suero bovina) de concentraciones conocidas. - Reactivo de Biuret. - Pipetas. - Tubos. - Agitadores. - Rotulador. - Espectrofotmetros (Colormetros).

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Determinacin por el mtodo de Biuret

La concentracin de protenas se medir utilizando el mtodo del Biuret, que se basa en la for- macin de un complejo coloreado o cromforo, de color azul-prpura, entre el in cobre y los enlaces peptdicos a pH alcalino. Se requiere un mnimo de dos enlaces peptdicos para la for- macin del complejo coloreado, que se mide a 550 nm. Es un mtodo poco sensible pero muy preciso, ya que la abundancia de grupos peptdicos (por unidad de masa de protena) es prc- ticamente la misma en cualquier protena.

Mtodo
1) Numerar 7 tubos. 2) Aadir al tubo " " " " " " " " " " 1 2 3 4 5 6 7 100 l de agua destilada (tubo blanco). 100 l de solucin de protena " l " " " " l " " " " l " " " " l " " " " l " " " 20 g/L. 40 g/L. 60 g/L. 80 g/L. problema A. problema B.

3) Aadir 4 ml de reactivo de Biuret a todos los tubos. 4) Mezclar el contenido de cada tubo. 5) Esperar 5 min. para que se desarrolle el color. Medir la absorbancia a 550 nm ajustando a cero con el tubo 1 ( blanco).

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Resultados
- En una hoja de papel milimetrado construir una grfica de A550 (eje y) frente a concentra- cin de protena (eje x) de las soluciones patrn (tubos 2-5). Marcar el eje de las x en g/l de protena.

- Determinar la concentracin de las soluciones problema A y B interpolando en la grfica patrn los valores de las soluciones problema A y B. Expresarlo en g/L.

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2. Introduccin al estudio de la cintica enzimtica. Fosfatasa Alcalina

Los enzimas son los catalizadores de las reacciones bioqumicas. La medida de la actividad de un enzima y la comprensin de las variables que la afectan es importante no slo para enten- der la biologa de la clula sino tambin para el diagnstico clnico. Cuando se producen lesio- nes celulares como inflamacin o necrosis de los tejidos, ciertas enzimas pasan al plasma y sus niveles en l aumentan. Estos niveles enzimticos en plasma se analizan para detectar la en- fermedad y llegar al diagnstico diferencial. Una concentracin anormalmente alta de una en- zima en sangre (reflejada en una alta actividad enzimtica) puede ser debida a la destruccin de clulas de un tejido rico en dicho enzima o al aumento del nmero de clulas, como ocurre en los tumores. Por el contrario una baja actividad enzimtica puede indicar un trastorno del tejido en cuestin. Los niveles enzimticos tambin son tiles para vigilar el curso del trata- miento. Por tanto, la enzimologa clnica es un aspecto fundamental del laboratorio clnico. En esta prctica, emplearemos el enzima fosfatasa alcalina como modelo. Las fosfatasas alcali- nas son un grupo de enzimas que presentan su mxima actividad a pH 9-10,5 y catalizan la hi- drlisis de steres monofosfato. La reaccin enzimtica general de la fosfatasa alcalina es: H2O + R-PO4H2 R-OH + PO4H2 Las distintas fosfatasas alcalinas son isoenzimas, catalizan la misma reaccin aunque poseen propiedades diferentes. Se encuentran ampliamente distribuidas en los tejidos humanos tales cono hueso, placenta, intestino, bazo y rin y se desconoce su funcin biolgica precisa. Los niveles de fosfatasa alcalina en plasma son la suma de los isoenzimas procedentes de los dis- tintos rganos. Los valores normales de actividad fosfatasa alcalina en plasma son de 30 a 100U/L (moles/min/L de suero). El aumento de actividad fosfatasa alcalina en plasma se ob- serva en diversas afecciones y su significado clnico se relaciona principalmente con la detec- cin de enfermedades seas (tumores seos, osteomalacias) y hepticas (obstruccin biliar, cncer). Adems en esta prctica aprenderemos a calcular los dos principales parmetros cinticos de los enzimas (constante de Michaelis y velocidad mxima) para lo cual se utilizar la represen- tacin de dobles recprocos desarrollada por Lineweaver y Burk.

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Descripcin de la prctica
En la presente prctica se usar suero como fuente de fosfatasa alcalina. La actividad enzim- tica se medir utilizando el p-nitrofenil-fosfato (p-NFF) como sustrato. Por accin del enzima ste se hidroliza a fosfato y p-nitrofenol (pNF) segn la siguiente reaccin:

El p-nitrofenol (pNF) en solucin alcalina es amarillo y su concentracin puede ser determina- da espectrofotomtricamente. La absorbancia de la solucin (intensidad del color amarillo) es una medida de la concentracin del producto. La prctica tiene dos partes: 1. Construccin de la curva patrn del p-nitrofenol. Se determinar la relacin entre absorban- cia y concentracin del p-nitrofenol. 2. Efecto de la concentracin de sustrato. Se calcular la Km y Vmax de la fosfatasa alcalina.

Materiales
- Tubos y pipetas. - Agua destilada. - Tampn Tris 10 mM pH 9,6. - Soluciones de p-nitrofenol (pNF). - Soluciones de p-nitrofenil-fosfato (p-NFF). - NaOH 0,2N. - Suero humano. - Espectrofotmetro. - Bao a 37C. - Calculadora.

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1. Recta patrn de p-nitrofenol

Preparar los siguientes tubos patrn de p-nitrofenol (pNF, producto): TUBO Tris pH 9,6 Agua destilada Soluciones patrn pNF Blanco 2,2 ml 1 ml 1 2,2 ml 1ml (15M ) 2 2,2 ml 1ml (30M) 3 2,2 ml 1ml (60M) 4 2,2 ml 1ml (90M)

- Mezclar bien. - Seleccionar en el espectrofotmetro la longitud de onda de 400 nm (mximo de absorcin del pNF). - Ajustar el "cero" de absorbancia con el tubo del blanco. - Medir la absorbancia de todos los tubos y anotar los valores obtenidos.

Resultados
Representar grficamente la recta patrn: absorbancias (en ordenadas) frente a concentracio- nes de p-nitrofenol (en abscisas). Recta patrn

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2. Efecto de la concentracin de sustrato y clculo de la Km y Vmax

Preparar 6 tubos marcados convenientemente y aadir lo siguiente: TUBO T Tris pH 9,6 Agua destilada PNFF * Suero 2,1 1 --- 0,1 2,1 --- 1(2,5) 0,1 2,1 --- 1(5) 0,1 2,1 --- 1(7) 0,1 2,1 --- 0,1 2,1 --- 0,1 (ml) 1 2 3 4 5 6

1(10) 1(15)

* Volmenes en ml. 1(2,5) significa 1 ml de una solucin 2,5 mM de p-nitrofenol fosfato

- Mantener los tubos en hielo. Mezclar bien e incubar 5 min a 37C. - Aadir 0,3 ml NaOH 0,2N para detener la reaccin. Mezclar. - Ajustar el "cero" del spectronic con el tubo del blanco y medir la A400 nm.

Resultados
9. Calcular la velocidad inicial (V) en cada tubo expresada aen nmoles p-N-fenol/min. 10. Representar 1/V frente a 1/S (representacin de Lineweaver-Burk) en la grfica de la p- gina siguiente. 11. Calcular la Km y Vmax. Cules son sus unidades? [S] A400nm V0 (nmoles pNF/min) 1/[S] 1/V0 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

[pNF] calculada en la recta patrn

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Representacin de 1/V frente a 1/S