La Fluorescencia

Bases de

Alejandra Lozano | Viviana Torres | Luis Baeza

Luminiscencia
Definicin Tipos de Luminiscencia Fluorescencia Fosforescencia

Definicin
Luminiscencia es la emisin de luz por parte de una substancia y ocurre en estados excitados electrnicamente. Para inducir fluorescencia se usa luz y no temperatura porque en este ltimo caso la diferencia de energa es mayor entre S0 y S1.

Tipos de luminiscencia
Fluorescencia y Fosforescencia, dependiendo de la naturaleza del estado excitado.

Fluorescencia
Orbital excitado con spin contrario al electrn en estado basal. Vida media: (Tiempo entre la excitacin y el regresado al estado basal) es corto (10 ns) Fluorforos tpicos: quinina, fluorescena, rodamina, antraceno, perileno.

Fosforescencia
Orbital excitado con spin en la misma direccin que el orbital en estado basal Vida media es ms larga que en fluorescencia, milisegundos o segundos.

Siempre lo uno o lo otro?

No, complejos moleculares grandes, como por ejemplo metal con orgnico, pueden tener ambos tipos de excitacin de orbitales.

Caractersticas

Stokes Shift
Cuando un sistema (molcula o tomo) absorbe un fotn, gana energa y entra en un estado excitado. Una forma de volver al estado basal es emitir un fotn, perdiendo as energa (otro forma sera perder calor). Cuando el fotn emitido tiene menos energa que el fotn absorbido, esta diferencia de energa se llama Stokes Shift. Cuando el fotn emitido tine ms energa que el fotn absorbido, se habla de anti Stokes Shift. La absorcin es instantnea. En contraste con sta, la emisin ocurre sobre un perodo largo de tiempo.

Stokes Shift

Regla de Kasha
Para un mismo sistema se observa usualmente el mismo espectro de emisin, independiente de cul haya sido la longitud de onda de excitacin. Se puede llegar a diferentes niveles de excitacin pero rpidamente se regresa al ms bajo de los niveles de excitacin.

Regla de imagen de espejo

La emisin es la imagen de espejo de la absorcin de S0 a S1, no del espectro total de absorcin. Esto es verdad para la mayora de los fluorforos.

Conversin interna
Es el regreso del mximo estado vibracional alcanzado en la excitacin al nivel S1.

Principio de Franck-Condon
De acuerdo con este principio, todas las transiciones son verticales, es decir, ocurren sin cambio en la posicin del ncleo y mientras ms sobreposicin haya entre el nivel vibracional mximo alcanzado y S1, ms rpido regresar a S1.

Vida media de la fluorescencia

Tiempo promedio que un fluorforo permanece en estado excitado despus de la excitacin.

Rendimiento (Quantum yield)

Es la razn entre el nmero de fotones emitidos partido por el nmero de fotones absorbidos N fotones emitidos/Nfotones absorbidos El quantum yield es proporcional a la vida media del fluoroforo

Extincin (Quenching)
Consiste en la disminucin de la intensidad de emisin. La intensidad de la fluorescencia puede decaer por una amplia variedad de procesos.

Extincin colisional
Occurre cuando el fluorforo en estado excitado es desacticado al entrar en contacto con otra molcula en solucin, la que llamamos quencher. El quencher acta de distinta forma sobre el fluorforo dependiendo de cuan expuesto est ste a la colisin. Mientras ms accesible sea el fluorforo a este fenmeno, con mayor velocidad decaer la intensidad. Un fluorforo incluido en el interior de una macromolcula es usualmente inaccessible a los quenchers hidrosolubles, de manera que el valor de K es bajo. Este conocimiento se puede usar usar cuando necesitamnos prolongar la fluorescencia. Valores mayores de K se encuentran si el fluorforo est libre o en la superficie de una biomolcula.

Formacin de complejos
Adems de la extincin colisional, la disminucin de fluorescencia puede ocurrir por la formacin de complejos moleculares no fluorescentes con quenchers.

Polarizacin o anisotropa
Los fluorforos absorben luz a lo largo de una direccin especfica en relacin con el eje molecular. Ej: DPH slo absorbe luz polarizada a lo largo de su eje mayor. La rapidez con un fluorforo rota durante el estado excitado determina su polarizacin o anisotropa. La polarizacin puede ser usada para medir volumen aparente (o peso molecular) de protenas. Esta medicin es posible porque las protenas ms grandes rotan ms lento. Cuando una protena se une a otra su tasa rotacional decrece y la anisotropa aumenta La polarizacin tambin ha sido usada para determinar la viscosidad aparente de membranas.

Mediciones de anisotropa
Estn basadas en el principio de excitacin fotoselectiva de fluorforos mediante luz polarizada. Los fluorforos preferentemente absorben fotones cuyos vectores elctricos estn alineados con el momento de transicin del fluorforo.

Mediciones con fluorescencia

Continua (Steady state)
Es el ms comn, es aquel que usa luz continua y observacin. La muestra se ilumina con un haz continuo y se registra la intensidad de emission (Escala de tiempo de ns) Es simplemente un promedio de fenmenos resueltos por tiempo sobre el descenso de intensidad de la muestra. Es proporcional a la vida media.

Mediciones con fluorescencia

Resuelta por tiempo (Time resolved)
La muestra se expone a un pulso de luz, donde el ancho del pulso es tpicamente ms corto que el tiempo de descenso de la muestra. La disminucin de la intensidad es registrada con un sistema de deteccin de alta velocidad que permite medir la intensidad de la anisotropa (Escala de tiempo de ns)

Por qu usar fluorescencia resuelta por tiempo si tcnicamente es ms complejo?

Por la informacin molecular que entrega. La curva especfica del descenso de la anisotropa contiene informacin acerca de la forma de la macromolcula y su flexibilidad. En principio, el valor de r refleja el descenso de la anisotropa y la forma de la molcula. Pero no es suficiente como para revelar la forma de molcula por s solo en forma exacta. El descenso de la intensidad puede revelar dos tiempos, dando a entender la presencia de ms de un estado conformacional. La fluorescencia continua solo revelar una intensidad promedio, dependiente de un promedio ponderado de los dos tiempos de descenso.

Indicadores fluorescentes
Los fluorforos bioqumicos se dividen en intrnsecos y extrnsecos. Los primeros son aquellos que ocurren naturalmente y los extrnsecos son aquellos que se agregan a una muestra para transmitirle propiedades especficas. Son fluorforos cuyas propiedades son sensibles a una sustancia de inters. Al unirse a la molcula de inters aumenta la intensidad de la emisin y se puede medir, de esa manera, la cantidad de esa sustancia. Se pueden usar para sodio, Ca2+, Mg2+, Na+, Cl, y O2, as well as pH.

Transmisin de energa de resonancia (RET)

Tambin llamada transferencia de energa de resonancia de Frster (FRET) Se basa en que la excitacin de un cromforo puede transferirse a otro cercano, generalmente cuando ambos se sitan en la misma molcula. En el caso de que se trate de fluorforos el mecanismo subyacente contina siendo el mismo: la energa se transfiere, lo que desemboca en la aparicin de fluorescencia (pero no es la fluorescencia la transferida) RET provee la posibilidad de medir la distancia entre dos sitios de macromolculas. La extincin del donador puede ser usada para calcular la distancia entre donador y aceptador.

Nuevas tecnologas fluorescentes

Excitacin Multifotn
La estimulacin debe ocurrir en una escala de tiempo de femtosegundos (10-15 segundos) porque el perodo de absorcin es muy corto. La excitacin multifotn permite imgenes de slo un plano focal del microscopio. Esto es una ventaja, porque de otra forma podra haber distorsin por fluorescencia que viniera de otros planos. Ciertas molculas slo son excitadas por una longitud de onda que no se alcanza con un solo fotn y es necesario recurrir a ms de un fotn. La excitacin localizada por dos fotones ha encontrado amplio uso en microscopa de fluorescencia.

Espectroscopa de correlacin de fluorescencia

FCS se basa en las fluctuaciones temporales que ocurren en un volumen pequeo observado. La amplitud y velocidad de las fluctuaciones se miden en una serie temporal y se usan para calcular la funcin de correlacin. Esta funcin permite conocer la dinmica molecular de la solucin: el nmero medio de molculas fluorescentes observadas simultneamente el tiempo de residencia molecular, td, relacionado con la constante difusin los tiempos caractersticos de "encendido/apagado" de la fluorescencia, tf, relacionados con dinmicas intramoleculares ultrarpidas.

Deteccin de molcula nica

Cuando se observa una molcula nica no hay promedio por mezcla, lo que permite estudiar el comportamiento de una molcula individual. La vida media de molculas individuales puede ser medida al mismo tiempo que se van recogiendo las imgenes de intensidad. Esta tcnica se usa para incluir fluorforos que absorben UV, considerado improbable hace poco. DMU muestra que un ribosoma flucta entre conformaciones segn la cantidad de energa transferida, que depende de la emisin de donadores y aceptadores de energa. Y revela la tasa de dichos cambios.

Espectroscopa de fluorescencia
Puede aportar variada informacin, interaccin de solventes con fluorforos, distancias entre sitios de biomolculas, cambios conformacionales, etc. Y se est extendiendo su usogracias a la disminucin de costos y complejidades.

Precauciones al trabajar con microscopa de fluorescencia

Se debe tomar en cuenta los objetivos del trabajo en relacin con la preparacin de la muestra seleccionada, los fluorforos elegidos para trabajar y los equipos seleccionados.

Preparacin de la muestra
Ni el software de deconvolucin ni los microscopios confocales son capaces compensar Fijacin Permeabilizacin Medio en que monta la muestra

Fluorforos elegidos
Absorcion Emision Brillo Fotoestabilidad Espectros sobrepuestos

Equipos seleccionados
Lente objetivo
Medio de inmersin Aberraciones esfricas

Tamao del pinole Correspondencia entre las diferentes piezas de los equipos Correccin de aberraciones cromticas Seteo constante

Muchas gracias