Antecedentes

Captulo II Antecedentes

El cido ctrico (2-hidroxi, cido-1,2,3-tricarboxilico) deriva de la palabra latina citrus: rbol del ctrico, una fruta parecida al limn. Fue primeramente aislado del jugo de limn en 1784 por Carl Scheele, tiene un peso molecular es de 210.14 Da, contiene tres grupos carboxilos, por lo tanto tiene tres pKas con valores de pH de 3.1, 4.7 y 6.4, respectivamente. Este cido es un intermediario universal del metabolismo en eucariotes y se encuentran trazas en prcticamente todos los animales y plantas (Papagianni, 2007). El cido ctrico fue producido comercialmente en Inglaterra en 1826 a partir de limones importados de Italia. El jugo de limn fue la base de su produccin hasta que en 1919 se desarrollo un proceso industrial en Blgica con Aspergillus niger y se sintetiz a partir de glicerol por Grimoux y Adams en 1880. Se han reportado diferentes mtodos para su sntesis qumica, utilizando diferentes mtodos, pero estn muy lejos de ser competitivas con los mtodos de fermentacin (Papagianni, 2007). Actualmente solo el 1 % de la produccin total mundial es extrado del jugo del limn en pases como Mxico y Sudamrica donde an es viable econmicamente (Yigitoglu, 1992). Microorganismos productores de cido ctrico

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Para la produccin por fermentacin adems de los hongos, se han empleado levaduras y bacterias que han alcanzado producciones en cantidades importantes, como sustrato se ha usado a hidrocarburos (alcanos) y carbohidratos (Mattey, 1999). Se conocen varias levaduras que producen cido ctrico a partir de diversas fuentes de carbono, tales como: Candida tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii, C. intermedia, Hansenula, Pichia, Debaromyces, Torula, Torulopsis, Kloekera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces y Yarrowia lipolytica Candida sp, Hansenula sp, Debaromyces sp, Torula sp, Turolopis sp, Kloekera sp, Saccharomyces sp, Zygosaccharomyces sp y Yarrowia sp. De

todas ellas, las especies de Candida son las que se han usado industrialmente para su produccin, estas son: C. catenula, C. guilliermondii y C. intermedia. Las levaduras son capaces de producir cido ctrico a partir de varias fuentes de carbono. Por ejemplo, Yarrowia lipolytica se ha estudiado ampliamente, pero produce una gran cantidad de cido isocitrico, lo cual es indeseable. Este problema ha motivado a usar cepas mutantes de Y. lipolytica, estas son capaces de tener baja actividad de la enzima acotinasa la cual es responsable de la sntesis de cido isocitrico. Las mutaciones genticas no han sido bien exploradas, pero ofrecen posibles usos para mejorar los rendimientos y altas velocidades de fermentacin (Rymowicz et al, 2010). En tanto entre las bacterias que se han empleado tenemos a Arthrobacter paraffinens, Bacillus licheniformis, Corynebacterium sp y hongos como:

Aspergillus niger, A. awamori, A. clavatus, A. nidulans, A. fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus, A. wentii, A. saitoi, A. flavus, Absidia sp., Acremonium

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sp., Botrytis sp., Eupenicillium sp., Mucor piriformis, Penicillium citrinum, P. janthinellu, P. luteum, P. restrictum Talaromyces sp, Trichoderma viride y Ustulina vulgaris (Crolla y Kennedy, 2001; Kuforiji et al, 2011).

Aunque muchos microorganismos pueden ser usados para producir cido ctrico, el hongo Aspergillus niger sigue siendo el principal microorganismo productor a nivel industrial. Cepas especficas de A. niger lo sobreproducen y se han desarrollado a partir de diversos procesos de fermentacin. Su rendimiento a veces excede el 70 % de la fuente de carbono. Currie (1917) descubri que algunas cepas de A. niger crecen de forma exitosa en medios con altas concentraciones de azucares y minerales a un pH inicial entre 2.5 y 3.5, los cuales producan altas concentraciones de cido ctrico. Este descubrimiento sent las bases para la produccin industrial por medio de estas cepas. La principal ventaja de Aspergillus niger es su fcil manejo y cultivo, crece en una gran variedad de sustratos, tiene altos rendimientos. Con el desarrollo de la Biotecnologa se han generado varias cepas modificadas genticamente de Aspergillus niger, donde se han reportado mejores rendimientos. Sin embargo, su uso industrial y estabilidad no ha sido del todo aceptado, ya que la industria se ha basado principalmente en el uso de varios sustratos para incrementar los rendimientos de cido ctrico (Singh et al, 2011). La produccin industrial de cido ctrico involucra de manera general una etapa de filtracin de medio de cultivo que contiene el producto, micelio y otras impurezas.

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Primero se precipita como citrato de calcio, posteriormente este es filtrado y lavado con agua. Despus es tratado con cido sulfrico y por ltimo se remueve el CaSO4 formado por filtracin. Este es el nico proceso viable de separacin y purificacin en la industria, el problema es que cada tonelada de cido ctrico producido genera 2.5 toneladas de desecho (Bauer et al, 1988). La extraccin por solventes es otra alternativa al mtodo clsico (Wenneresten, 1983). Sin embargo, la extraccin por este mtodo contiene impurezas que provienen de la melaza o licores de azucares. La ventaja del mtodo de

extraccin por solventes es que evita el uso de calcio y H 2SO4 y el problema de contaminacin. El ciclo del cido ctrico La sntesis del cido ctrico comienza con la glucolisis (Martin y Wilson, 1951; Cleland y Johnson, 1954). Pero tambin una pequea fraccin se sintetiza por la va de las pentosas fosfato, la cual va decreciendo conforme avanza la fermentacin (Legisa y Mattey, 1988); pero no existe evidencia de un bloqueo total de esta va (Roehr et al, 1987). Aspergillus niger tiene una va adicional para el catabolismo de la glucosa y es llevado a cabo por la glucosa oxidasa (Hayashi y Nakamura, 1981). Esta enzima se activa por las altas concentraciones de glucosa y oxgeno en la presencia de bajas concentraciones de otros nutrientes (Mischak et al, 1985; Rogalski et al, 1988; Dronawat et al, 1985). Desafortunadamente la glucosa oxidasa, en la fase lag de crecimiento, transforma una cantidad importante de glucosa en cido

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glucnico. Pero debido a la localizacin extracelular de la enzima, esta puede ser influenciada por el pH y se inactiva a pHs menores de 3.5 (Mischak et al, 1985; Roukas y Harvey, 1988). La acumulacin de cido ctrico hace disminuir el pH del cultivo inactivando a la glucosa oxidasa (Mischak et al, 1985). En la glucolisis, una molcula de glucosa produce 2 molculas de piruvato, este ltimo se convierte en Acetil CoA y oxalacetato, precursores del citrato. Clealand y Johnson (1954) fueron los primeros en demostrar que Aspergillus niger libera una molcula de CO2 durante la conversin de piruvato a Acetil CoA y que se utiliza una molcula de piruvato ms una de bixido de carbono para formar una molcula de oxalacetato. Esta ltima reaccin incrementa el rendimiento del cido, debido a que el oxalacetato se forma en cada vuelta del ciclo de Krebs. Lo anterior provoca la prdida de 2 moles de CO 2 y solamente dos terceras partes del carbono proveniente de la glucosa se convierte en cido ctrico. El piruvato se convierte en oxalacetato y posteriormente en malato en el citoplasma. Se ha postulado que la concentracin de malato estimula el transporte del cido ctrico fuera de la mitocondria. Pero este fenmeno no parece ocurrir durante las fases tempranas de la fermentacin (Kubicek et al 1979b), esto se correlaciona con el coeficiente respiratorio (CO2/O2) durante las primeras 70 horas de cultivo, este es cercano a uno, pero comienza a decrecer cuando se inicia la acumulacin del cido ctrico (Kristiansen et al, 2002). Aspergillus niger tambin puede acumular otros cidos orgnicos, tal como el cido oxlico, un coproducto txico de la fermentacin. La sntesis de este

compuesto parece depender de la fuente de carbono (Kubicek et al, 1988), de

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acuerdo a Muller (1975) el ciclo del glioxilato ha estado implicado en biosntesis. Cuando se usa glucosa como fuente de carbono por la va del glioxilato, se pierde fuente de carbono en esta va neutral, compitiendo con la sobreproduccin de citrato (Kubicek, 1988). Debido a la toxicidad del oxalato, este fenmeno es de inters para la produccin de cido ctrico y su regulacin biosintetica an est en debate (Strasser et al, 1994). Kubicek-Pranz et al (1990) encontraron que la acumulacin de cido ctrico sucede cuando la concentracin de glucosa-fructosa es de 14 % (p/v), pero cuando eso sucede, Xu et al (1989a) encontraron un incremento en la concentracin intracelular de fructosa 2-6 bifosfato. La concentracin de este

intermediario de la glucolisis correlaciona con la alta produccin de citrato. La bioqumica de los primeros pasos de la glucolisis an no es completamente entendida, sin embargo, Steinbock et al (1994) encontr que la enzima hexocinasa en la cepa ATCC 11414 fue inhibida por citrato. La inhibicin de la sntesis de cido ctrico se debi a la quelacin del magnesio. Las trazas de iones metlicos, particularmente los iones de manganeso, estimulan la acumulacin de cido ctrico (Trumpy y Millis, 1963), pero uno de los defectos causados por la deficiencia de manganeso es la sntesis de macromolculas y provoca un incremento en la degradacin de protenas (Ma et al, 1985). Como consecuencia, el micelio acumula grandes concentraciones de NH 4 (Kubicek et al, 1979a). Pero varios autores han reportado que la adicin extra de amonio (NH 4) durante la fermentacin de cido ctrico estimula la velocidad de su produccin (Choe y Yoo, 1991; Yigitoglu y McNeil, 1992). Estos autores tambin reportan que

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la cantidad de amonio y tiempo son importantes, pero cuando se agrega en tiempos inapropiados disminuye la acumulacin de cido ctrico. Bioqumica de la produccin y acumulacin de cido ctrico por Aspergillus niger Se han propuesto varias teoras para explicar la acumulacin de cido ctrico por A. niger, ya que los altos rendimientos de este metabolito, en procesos de fermentacin, siempre han dependido del conocimiento de su bioqumica. Despus de 50 aos de optimizacin del proceso de su produccin, todava no existe una explicacin coherente de la sntesis bioqumica con los factores observados que influencian su rendimiento en biorreactores (Kristiansen et al, 2002). En un proceso de fermentacin, la acumulacin de cido ctrico se lleva a cabo cuando varios nutrientes se encuentran en exceso: fuente de carbono, iones hidrgeno y oxgeno. Pero tambin se ha demostrado que la limitacin de iones metlicos (Fe, Mn, Mg), nitrgeno y fosfatos estimulan su produccin y acumulacin. En resumen, no existe un evento bioqumico simple responsable de la sobreproduccin ya que se trata de un evento multifactorial. A pesar de que se han llevado a cabo numerosos estudios sobre la sntesis bioqumica de cido ctrico en A. niger, an no se conocen los eventos que estimulan su acumulacin. La comprensin de los eventos anteriores es incompleta y las industrias dedicadas a su produccin y comercializacin mantienen en secreto sus logros alcanzados. Etapas y tipos de produccin de cido ctrico por fermentacin con Aspergillus niger

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Hoy en da, el 99 % de la produccin total mundial de cido ctrico se obtiene por fermentacin (Kuforiji et al, 2010). A. niger es el microorganismo preferido por sus altos rendimientos. La produccin se puede dividir en tres etapas, las cuales son: preparacin e inoculacin de medio de cultivo, fermentacin y recuperacin o purificacin del producto. Adems existen tres posibles mtodos para producir cido ctrico por A. niger: fermentacin sumergida, fermentacin de superficie y fermentacin en medio slido. Se pueden usar varios tipos de sustrato de acuerdo al tipo de fermentacin (Singh et al, 2011). a) Fermentacin de superficie El micelio de A. niger crece y flota en la parte alta del medio de cultivo. Se usa a pequea y mediana escala, se requieren pocos esfuerzos de operacin, poco equipo y bajo costo de energa. El proceso se lleva a cabo en cmaras de fermentacin donde existe un gran nmero de charolas o tinas. Las charolas deben ser de aluminio puro, tipo acero o polietileno. Pero en las charolas de acero se obtienen mejores rendimientos (Soccol y Vandenberghe, 2003). Las cmaras de fermentacin cuentan con circulacin de aire y al pasar por la superficie del cultivo controlan la humedad y temperatura. El aire se filtra por medio de filtros ya que las cmaras se deben de mantener bajo condiciones aspticas y as deben permanecer al menos durante los primeros dos das, perodo durante el cual las esporas germinan. La fermentacin termina entre 8 y 12 das (Yokoya, 1992), para extraer el cido ctrico, se separa el caldo y el micelio, este es lavado para separar el cido ctrico.

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Desventajas: A pesar de obtener altos rendimientos en la fermentacin por superficie, este proceso no se utiliza mucho en la industria debido a que se requiere mucho espacio, se requiere de mucho tiempo, existe riesgo de contaminacin, generacin de altas cantidades de calor y altos costos de produccin. b) Fermentacin en estado slido ste proceso requiere poca energa y genera pocos desechos. El agua necesaria para el crecimiento de A. niger se encuentra dentro de la matriz slida. El slido de soporte puede ser de material sinttico, residuos agrcolas, entre otros (Pandey, 2003). Este proceso requiere de tecnologa simple, tiene altos rendimientos,

medio de cultivo a bajo costo, mejor circulacin de oxgeno, menos susceptible a la inhibicin por elementos traza, requiere poca energa y bajo costo de mantenimiento, menor riesgo de contaminacin y genera menor cantidad de desechos en su recuperacin. Desventajas: Dificultades al escalar el proceso, difcil controlar a los parmetros de cultivo (pH, humedad, temperatura, nutrientes, etc.) alto contenido de

impurezas, as como altos costos en la purificacin (Susana y Sanroman, 2006; Holker et al, 2004). c) Fermentacin sumergida Se estima que alrededor del 80 % de la produccin mundial de cido ctrico se obtiene por fermentacin sumergida, se hace en medios de cultivo que usan como base a la sacarosa y glucosa con A. niger (Vanderberghe et al, 1999), utilizando

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principalmente productos que utiliza la industria del azcar, as como desechos agroindustriales (Rivas et al, 2008). Los procesos de fermentacin sumergida usan fermentaciones en lote y lote alimentado, Dependiendo de las condiciones de fermentacin, estas concluyen entre 5 a 12 das. Este tipo de procesos tienen mecanismos sofisticados de control, menor riesgo de contaminacin, bajo costo en mano de obra, alta productividad y rendimientos. Desventajas: Medio de cultivo caro, sensible a la inhibicin por trazas de metales (Fe, Mn, Mg), riesgo de contaminarse y grandes cantidades de desecho (Vanderberghe et al, 1999). Morfologa de A. niger durante la fermentacin La morfologa del micelio es crucial durante el proceso de la fermentacin, no solamente en relacin a la forma de la hifa si no tambin a la agregacin o unin de micelio en forma de pellets. En todos los casos, el micelio de Aspergillus niger es corto, con ramificaciones hinchadas, las cuales tienen puntas apicales. Los pellets son pequeos con una superficie dura y lisa (Clark, 1962). Este fenmeno est relacionado con la aireacin y agitacin (Svenska-Sockerfabrik, 1964), pH (Fried y Sandza, 1959), concentracin de manganeso y otros metales (Kisser et al, 1980) y cantidad de inculo (Berry et al, 1977). Para la produccin de cido ctrico en cultivo sumergido, el crecimiento en pellets de Aspergillus niger es altamente recomendable (Berovic et al, 1993). La agitacin es importante para un adecuado mezclado, transferencia de masa y calor. El mezclado determina la aireacin y transferencia de masa a travs del

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reactor y este es crtico para la fermentacin de cido ctrico. Pero el exceso de agitacin provoca esfuerzos de corte que afectan la morfologa del

microorganismo, cambiando su crecimiento y daando a la estructura de las clulas (Papagianni et al, 1994). Aunque A. niger es resistente a los esfuerzos de corte, se ha reportado que el incremento de la agitacin daa a las hifas, liberando el material intracelular, explicando las bajas productividades bajo condiciones de alta agitacin. Por ejemplo, Smith et al (1990) y Makagiansar et al (1993) reportaron bajas velocidades de sntesis de penicilina a altas agitaciones con Penicillium chrysogenum. Papagianni, 1995 reporto cultivos con Aspergillus niger en biorreactores agitados mecnicamente de 100 a 600 rpm, los micelios se comenzaron a agregar a las 24 horas de cultivo en todos los experimentos. Por medio de anlisis de imgenes se demostr que al incrementar la agitacin, se disminua la longitud de los filamentos. La velocidad especfica de la formacin de cido ctrico se incremento con la agitacin, pero la cantidad de producto se mantuvo constante despus de 300 rpm. Asimismo la longitud del micelio se redujo por un factor de tres al incrementar la agitacin. Se ha reportado que cultivos de A. niger deficientes en manganeso (Mn2), se forman pellets (Levente y Christian, 2003). Sin embargo, el manganeso es esencial para el crecimiento del micelio. Un prerrequisito esencial para tener la morfologa deseada y obtener altos rendimientos es optimizar la concentracin inicial de manganeso en el medio de cultivo. Se ha observado que los medios ricos en nutrientes incrementan la velocidad especfica de crecimiento y la morfologa del hongo, reduciendo la formacin de

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pellets (Hemmersdorfer et al, 1987). No solo el tipo de fuente de carbono, sino tambin la concentracin es crtico para la fermentacin, influenciando la velocidad de produccin, rendimiento y crecimiento del hongo. Por ejemplo, Papagianni (1995) reportaron cultivos con concentracin inicial de glucosa de 60, 100 y 150 g/L en un reactor agitado mecnicamente, se encontr que la velocidad de crecimiento se incrementa (a las 48 hrs de cultivo) conforme la concentracin de glucosa disminuye. Factores que afectan la produccin de cido ctrico por Aspergillus niger en cultivo sumergido a) Condiciones del cultivo Afectan el crecimiento de A. niger y la produccin de cido ctrico de forma diferente. Por ejemplo, Grewal y Kalra (1995), Couto y Sanroman (2006)

reportaron que se produce alta concentracin de cido ctrico en condiciones donde se genera poca biomasa. Vanderberghe et al (2000) obtuvieron un buen crecimiento de micelio junto a altas productividades de acido ctrico. Sin embargo, Elzbieta (2008) obtuvo altos rendimientos con 150 g/L de azucares en el medio de cultivo. Las trazas de metales influencian notablemente la sntesis de cido ctrico, porque requiere de ciertas trazas para su crecimiento (Mattey, 1999). Los iones metlicos que deben limitarse son el Zinc, Manganeso, Hierro, Cobre, metales pesados y metales alcalinos. Algunos metales inicos (Fe 2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+ y otros) inhiben la produccin de cido ctrico an a muy bajas concentraciones (Kapoor et al, 1987). Pero tambin es sensible a las trazas de metales que vienen

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en las melazas (Majolli y Aguirre, 1999). Por lo tanto, la concentracin de esos metales debe disminuirse para tener un ptimo crecimiento y sntesis del cido ctrico (Mara y Wladyslaw, 1989). La concentracin ptima de Fe 2+ requerida para su produccin vara entre diferentes especies de hongos, pero para A. niger en cultivo sumergido y usando melazas como sustrato, la sntesis de cido ctrico es severamente afectado por la presencia de hierro a concentraciones de 0.2 ppm. Sin embargo, la adicin de cobre entre 0.1 a 500 ppm durante la inoculacin o durante las primeras 50 horas de cultivo contrarresta el efecto nocivo del hierro. Otros autores tambin han reportado el efecto benfico del cobre sobre el hierro (Haq et al, 2002). Suministros de Mn2+ a concentraciones de 3 g/L reducen drsticamente el rendimiento de cido ctrico (Rohr et al, 1996). Estos autores tambin confirmaron el papel del manganeso en la regulacin de las enzimas del cido ctrico, pero tambin es importante en otras funciones celulares, por ejemplo en la sntesis de la pared celular, formacin de esporas y produccin de metabolitos secundarios. La concentracin de las trazas de metales en el medio de cultivo se puede controlar por dos formas: 1) Purificar el medio de cultivo para remover ciertos iones metlicos y despus adicionar la cantidad requerida. 2) Agregar agentes quelantes al medio para disminuir la concentracin de los iones metlicos. La ventaja del ltimo mtodo es que el complejo acta

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como

un buffer metlico, el cual se disocia para iones conforme el

microorganismo los utilice para su crecimiento (Jianlong, 1988). La presencia de trazas de metales en concentraciones toxicas es un problema significativo durante una fermentacin sumergida. Pero en fermentaciones en slido se obtienen altos rendimientos sin que haya inhibicin. Las sales de hierro son esenciales para activar la sntesis de Acetil CoA, por lo tanto importante para producir el metabolito (Milson y Meers, 1985). Pero el exceso en su concentracin activa la sntesis de la enzima aconitasa, la cual es responsable de la produccin de cido isocitrico, Este es un producto no deseable y reduce el rendimiento del cido ctrico. El fosfato de dihidrgeno de Potasio es la fuente ms apropiada de fosforo, y a bajas concentraciones favorece la sntesis del metabolito de nuestro inters. La adicin de acetato de metilo, cobre y zinc favorecen el crecimiento del mecelio y produccin de cido ctrico (Sato y Sudo, 1999). El tipo y la

concentracin de la fuente de carbono es uno de los factores ms importantes que determinan la concentracin final del producto deseado. De acuerdo a Anwar et al (2009), el alto contenido de azucares favorece una produccin alta. b) Fuente de nitrgeno Estimula la formacin de conidios y la produccin del metabolito de inters, es directamente influenciado por la fuente de nitrgeno, la urea, cloruro de amonio y sulfato de amonio son los preferidos (Chundakkadu, 2005). La ventaja de usar sales de amonio es que el pH cae conforme son consumidas, y el pH bajo es esencial para la fermentacin de cido ctrico (Mattey, 1999). Los componentes

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del medio de cultivo juegan un papel importante en el rendimiento final. Es importante considerar la concentracin de las trazas de metales y otros constituyentes presentes en la biomasa, de acuerdo al tipo de fermentacin y requerimientos fisiolgicos del microorganismo. Por ejemplo, la toxicidad causada por los metales pesados debe considerarse, removiendo con una sustancia quelante para optimizar el crecimiento ptimo del microorganismo. La morfologa del hongo es un parmetro importante que afecta la produccin de cido ctrico y a su vez, esta depende de los constituyentes del medio de cultivo (Singh et al, 2011). c) Factores ambientales Varios factores ambientales influencian el bioproceso, entre ellos se encuentran, la temperatura, humedad, pH, minerales, tipo de inoculo, adicin de nutrientes, entre otros. Pero tambin se encuentran parmetros de ingeniera, como lo es la agitacin (Shojaosadati y Babaeipor, 2002) y tamao de sustrato (Roukas, 1999). 1) Humedad Los hongos prefieren ambientes hmedos para su crecimiento. En una fermentacin solida, se requiere la baja humedad para la generacin de biomasa, reducir la difusin de nutrientes, optimo crecimiento, estabilidad de sus enzimas, consumo de sustrato (Chundakkadu, 2005). Por el contrario, una humedad alta causa la aglomeracin del sustrato, limitacin en la transferencia de masa, y competencia con bacterias (Gowthaman et al, 2001). 2) Temperatura

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La temperatura es una de las variables que ms afectan el rendimiento de A. niger para la produccin de cido ctrico. El no controlar de forma adecuada a la temperatura se puede afectar a la fisiologa en varios aspectos, tal como desnaturalizacin de protenas, inhibicin enzimtica, aceleracin o supresin en la produccin del metabolito, y lo ms importante, afectar la fisiologa celular (Pandey et al, 2001). 3) Aireacin En cultivos sumergidos, el principal objetivo de la aireacin es suministrar oxgeno suficiente para el crecimiento del microorganismo y para remover el bixido de carbono. La aireacin tambin es crtica para remover el calor y mantener la transferencia de humedad (Raimbault, 1998; Pandey et al, 2000; Shojaosadati y Babaeipour, 2002) regulando de esta forma la temperatura del medio de cultivo, distribucin del vapor de agua y cantidad de compuestos voltiles producidos durante el metabolismo. La acumulacin de cido ctrico se incrementa considerablemente conforme se incrementa la tensin de oxgeno disuelto, pero tambin se incremento su concentracin en un factor de 1.4 por la adicin de ndodecano al 5 % (v/v), el cual fue usado como vector para transportar oxgeno al medio de cultivo con A. niger (Jialong, 2000). Sin embargo, la excesiva aireacin produce esfuerzos de corte, el cual tiene un efecto daino para la morfologa del hongo filamentoso (Lu et al, 1997; Shojaosadati y Babaeipour, 2002). 4) Agitacin

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La agitacin es uno de los parmetros ms importantes en las fermentaciones aerobias, esta permite la homogeneidad del medio de cultivo, con respecto a la temperatura y ambiente gaseoso una mayor interaccin entre el rea interfacial gas-lquido, permitiendo la transferencia de oxgeno en el lquido (Trilli, 1986). La agitacin permite la remocin de la remocin de metabolitos voltiles, evita la formacin de pellets o agregados celulares, incrementa la transferencia de calor, protege al medio de cultivo contra la desecacin o humedad excesiva y mejora las condiciones para el crecimiento microbiano (Mitchell y Berovic, 1998). Durante la produccin de cido ctrico, la agitacin permite la distribucin de esporas, necesidades de agua para el control de la humedad y/o cualquier otro nutriente dentro del medio de cultivo (Suryanarayan, 2003). 5) pH El pH es otro de los aspectos importantes a considerar en cualquier fermentacin, este vara de acuerdo a los requerimientos metablicos del microorganismo. En el caso de la produccin de cidos orgnicos, estos provocan que el pH disminuya. Cada microorganismo tiene un rango de pH para su crecimiento, los hongos filamentosos crecen en un rango amplio de pH (desde 2 hasta 9) con un rango ptimo de 3.8 a 6.0. Esta versatilidad para adaptarse es beneficio para los hongos ya que esto minimiza la contaminacin por bacterias, especialmente a pH bajos. Durante la produccin de cido ctrico, se pueden marcar dos tiempos; el primero donde las esporas requieren un pH mayor a 5 para germinar y segundo, el pH para la produccin de cido ctrico necesita pHs menores a 2. El pH bajo reduce el riesgo de contaminacin e inhibe la sntesis de cidos orgnicos no deseados,

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como el cido gluconico y cido oxlico pero tambin permite que la extraccin y purificacin del cido ctrico se ms simple (Levente y Christian, 2003). El pH cambia tambin de acuerdo de la fuente de nitrgeno seleccionada, as como de las caractersticas de crecimiento del microorganismo (Gowthaman et al, 2001). Para sobreproducir el producto deseado, el microorganismo puede ser crecido bajo condiciones suboptimas para la produccin de biomasa. Se han reportado varias ventajas para usar esporas en el inoculo en lugar de micelio. De acuerdo a Larroche (1996), las esporas funcionan como biocatalizadores, los tiempos son flexibles para preparar el inoculo, se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo y tienen alta resistencia al dao causado por esfuerzos de corte o insuficiente transferencia de masa cuando no se tiene un control perfecto en las fermentaciones sumergidas (Gowthaman et al, 2001; Krishna y Nokes, 2001). Sin embargo, tambin trae algunas desventajas, como la mayor duracin de la fase lag, diferentes condiciones optimas para la germinacin de esporas y crecimiento vegetativo y excesivo tamao del inoculo. Es necesario que la actividad metablica de las esporas sea inducida antes de que el hongo comience a usar el sustrato para crecer (Krishna y Nokes, 2001). El tamao y la forma de los pellets del micelio juegan un papel directo en la biosntesis del cido ctrico durante una fermentacin sumergida (Saha et al, 1999). Los pellets menores a 1 mm de dimetro estn asociados con altas velocidades de produccin y altos rendimientos (Magnuson y Lasure, 2004). 6) Otros factores

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Se ha observado que la adicin de metanol incrementa la produccin de cido ctrico a partir de glucosa y otras fuentes de carbono. Sikander y Haq (2005), utilizaron concentraciones de metanol, etanol, isopropanol, metil acetato, npropanol, el cual incrementa el rendimiento de etanol. Esos estudios demostraron que la adicin de 4 % (v/v). Lo anterior se atribuye a la lenta degradacin del cido ctrico y a la reduccin de la actividad de la enzima acotinasa, pero tambin puede ser debido al incremento de la actividad de otras enzimas del ciclo de Krebs. Pero tambin existe la posibilidad de que el etanol pueda ser convertido a Acetil CoA metabolito intermediario necesario en la sntesis de nuestro metabolito de inters. La adicin de metanol puede incrementar tambin la permeabilidad de la pared celular para transportar citrato, Taketomi (1961) analiz la adicin de metanol a la fermentacin y la sntesis de protenas afecto la sntesis de protenas pero sin afectar el consumo de nitrgeno. Lo anterior provoco el incremento de la sntesis de aminocidos, pptidos y protenas de bajo peso molecular durante las etapas tempranas de la fermentacin. El metanol afecta directamente la morfologa del micelio y promueve la formacin de pellets, pero tambin provoca una alta permeabilidad de la membrana estimulando la excrecin de cido ctrico del micelio. Pandey et al, (2000) reportan que es necesario mantener la forma de pellets en el cultivo en dimetros menores de 3 mm para una mxima produccin; lo anterior se ha demostrado con la adicin de metanol, etanol, isopropanol y acetato de metilo. La adicin de aceites vegetales tambin incrementa la produccin del metabolito (Sikander y Haq, 2005). Las grasas vegetales actan como fuente de carbono y se

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degradan como glicerol y cidos grasos; el glicerol entra directamente al ciclo de Krebs y los cidos grasos ingresan a travs de la glucolisis. Hoy en da la produccin de biodisel tiene como subproducto al glicerol y es un sustrato disponible y acta directamente en la sntesis de cido ctrico (Figenova et al, 2005). La adicin de inhibidores sobre varias enzimas del ciclo de Krebs, tales como el fluoruro de calcio, fluoruro de sodio, arsenato de sodio, malonato de sodio, azida de sodio, fluoruro de potasio, cido yodoacetico y agentes axidantes, tales como perxido de hidrgeno, naftaquinona y azul de metileno adicionados a la fermentacin, tambin incrementan la acumulacin de cido ctrico (Adham et al, 2008). Sin embargo, una alta concentracin de esos inhibidores puede inhibir el crecimiento del micelio y disminuir la produccin del metabolito de inters. Se ha estudiado el efecto de otros inductores del crecimiento del micelio, por ejemplo, Michaelis y Papoutsakis (1990) usaron a el polietilenglicol, suero sustancias que protegen al micelio de los esfuerzos de corte causados por la hidrodinmica e impulsores del reactor, estimulando su crecimiento. La naturaleza de la fuente de carbono afecta a la produccin de cido ctrico, sobre todo en la actividad de las enzimas del ciclo del cido ctrico (Xu et al, 1989). En trminos generales, solo los azucares que son metabolizados rpidamente por el hongo permiten altos rendimientos, as que los polisacridos no son recomendables. Recuperacin y purificacin del cido ctrico

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La obtencin del cido ctrico producido en fermentaciones sumergidas se obtiene por mtodos clsicos como precipitacin, extraccin y absorcin (Figura 1)

Figura 1. Esquema de la recuperacin de cido ctrico por los mtodos convencionales

Mtodos de extraccin a) Precipitacin Es uno de los mtodos convencionales para extraer el cido ctrico de una fermentacin sumergida. En este caso, el caldo de fermentacin se calienta a 50 C por 20 minutos y es precipitado como citrato de calcio, usando carbonato de

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calcio y cido sulfrico (Pazouki y Panda, 2008). El precipitado (citrato de calcio) es entonces filtrado y lavado con agua varias veces, despus es llevado a un acidulador y tratado con cido sulfrico. La solucin es nuevamente filtrada para remover el CaSO4 (Kiousdetidis et al, 1979). Kunzl y Cechurova (1977) lograron separar el 88 % de citrato de calcio de caldo de cultivo que contena cido ctrico, mlico, oxlico y gluconico y otros contaminantes orgnicos adicionando cal a pH de 6 agitando constantemente y calentando de forma gradual a ms de 80 C. El filtrado de la suspensin se calent a 60 C y lavada con agua a la misma temperatura. Karklin et al (1984) separo el cido ctrico de caldos de fermentacin usando pHs entre 6.1 y 7.5. La clarificacin fue hecha con carbn activado y kieselgur y despus mezclado con CaCl2, acetato de sodio o Ca(OH)2 para precipitar el cido ctrico. Luego el citrato de calcio fue separado por filtracin al vacio, lavado con agua caliente y secado entre 90-105 C. El pH optimo y temperatura fue entre 7.07.2 y 80 C, respectivamente. El cido ctrico producido por fermentacin, usando como fuente de carbono a alcanos, fue separado del caldo de cultivo como citrato de calcio. Este ltimo fue convertido a cido ctrico por medio de la adicin de H 2SO4 a 80-90 C, seguido de una evaporacin y cristalizacin. El rendimiento de cido ctrico fue entre 64.8 a 92.9 %. El citrato de calcio tambin fue convertido a cido ctrico por cromatografa de intercambio inico, en este caso el rendimiento fue entre 83.9 a 100 %. El cido ctrico tambin aislado del caldo de fermentacin a travs de citrato trisdico y

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citrato de tripotasio por medio de cromatografa de intercambio inico (Ramina y Brigmane, 1984). El caldo de cultivo que contiene cido ctrico es decolorado por medio de carbn activado y pasado a travs de cromatografa de columnas de resina de intercambio inico. El lquido fue concentrado al vacio y finalmente se cristaliz a baja temperatura, donde el cido ctrico cristaliza como cido ctrico

monohidratado. El cido ctrico cristaliza con dificultad y produce bajos rendimientos (Kertes y King, 1986). Pendl et al (1986) trato el caldo de fermentacin con cal hasta alcanzar un pH de 4.3, seguido de un calentamiento a vapor a 60 C. Posteriormente se le agreg ms cal hasta alcanzar un pH de 6.2. La suspensin resultante fue filtrada y lavada con agua a 60 C. Su descomposicin fue tratada con H 2SO4 a pH de 1.86 para obtener cido ctrico y cido oxlico. Posteriormente, la solucin fue des ionizada y cristalizada. El mtodo de precipitacin, a pesar de ser simple y extenso, genera problemas alternos, como la formacin de productos indeseables. Pero tambin existe prioridad por acortar el mtodo e incrementar su eficiencia de recuperacin utilizando tcnicas avanzadas. Para eliminar la generacin de yeso y CO como coproductos se han utilizado otras tcnicas de separacin, por ejemplo, extraccin por solventes (Pazouki y Panda, 1998), extraccin supercritica de CO 2 (Shishikura et al, 1992), electrodilisis (Pinto et al, 1992) y separacin por membranas (Friesen et al, 1991).

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b) Extraccin por solventes Aunque el mtodo clsico por precipitacin es la tcnica ms utilizada en procesos industriales, la separacin por solventes tambin ha sido usada para separar cido ctrico. La extraccin por medio de aminas parece ser un mtodo prometedor par cidos carboxlicos disueltos en soluciones acuosas. El cido ctrico es fcilmente extrado por un gran nmero de solventes orgnicos, tales como las aminas alifticas de alto peso molecular (Pazouki y Panda, 1998). Baniel y Gonen (1990) reportaron un 90 % de recuperacin de cido ctrico con el mtodo de extraccin antes mencionado. Wenneresten (1983) demostraron que las aminas terciarias son muy efectivas para la extraccin de cido ctrico. El mtodo de extraccin por aminas es muy favorecido a pHs muy bajos (abajo del pKa ms pequeo) y se favorece su reactividad con aminas terciarias bsicas. Las ventajas de este mtodo son: consumo mnimo de cidos y bases minerales, y menor generacin de co-productos, no se evaporan grandes cantidades de agua. c) Adsorcin Es difcil lograr altos radios de recuperacin usando tcnicas de separacin convencionales. Se ha reportado el uso de resinas de intercambio inico para cidos orgnicos, por ejemplo, Juang y Chou (1996), analizaron la adsorcin de cido ctrico de soluciones acuosas en resinas de macroporos (Amberlita XAD-4 y

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XAD-16) impregnados con tri-n-octilaminas. Gluszcz et al (2004) midieron las propiedades de absorcin de 18 tipos de resinas de intercambio inico para recuperar cido ctrico y lctico, encontraron que las resinas con pH bsico poseen altas capacidades de adsorcin. Takatsuji y Yoshida (1998) tambin reportaron los mecanismos de adsorcin para el cido ctrico, mlico y actico en resinas comerciales (Diaion WA30) con pH bsico. Las isotermas de absorcin de los cidos orgnicos fueron altamente favorables y la capacidad de adsorcin depende del valor del pH en la solucin. La extraccin en lnea de cido ctrico del fermentador con resinas dbilmente bsicas ayudara a evitar la inhibicin por producto e incrementar la velocidad de produccin y viabilidad celular. Estructura y propiedades del cido ctrico El cido ctrico (2-hidroxy-cido-1,2,3-tricarboxilico( Figura 2)), es un metabolito comn en las plantas y animales. Este es uno de los cidos orgnicos ms utilizados en la industria de alimentos, bebidas e industria farmacutica (KirkOthmer, 2002).

Figura 2. Estructura qumica del cido ctrico

Debido a su funcionalidad y aceptabilidad ambiental, el cido ctrico y las sales que produce (con potasio y sodio) se utilizan en diversas aplicaciones industriales, entre ellas como material quelante, buffer y como sustancia amortiguadora. Esos

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usos incluyen la elaboracin de detergentes, champs, cosmticos, limpieza de qumicos y extraccin de petrleo (Kirk-Othmer, 2002).

a) Propiedades fsicas El cido ctrico anhidro cristaliza en agua a temperaturas de 130 C, es incoloro y forma cristales traslucidos o polvo blanco cristalino. Su cristal es de forma monoclnica holohedrica. El cido ctrico es deliquiscente en aire hmedo y es pticamente inactivo. Algunas otras propiedades son: frmula molecular (C 6H8O7), peso molecular 192.13 g/mol; punto de fusin 153 C; descomposicin trmica 175 C; densidad 1.665 g/mL (Kirk-Othmer, 2002). El cido ctrico experimenta algunas reacciones que son comunes en cualquier cido orgnico. Entre ellas se incluyen las reacciones de esterificacin, formacin de sales y reacciones anhdridas. Sin embargo, los grupos hidroxilo (OH) terciarios no sufren todas esas reacciones: 1) Reacciones de descomposicin Esto ocurre cuando el cido ctrico se calienta a 175 C, el cido ctrico se descompone y forma cido acontico, cido itaconico, cido acetonedicarboxilico, dixido de carbono y agua (Patentes: 499-12-7; 498-23-7; 97-65-4; 542-05-2). 2) Reacciones de esterificacin El cido ctrico es esterificado fcilmente con alcoholes en condiciones azotroficas en la presencia de un catalizador, tal como el cido sulfrico. Los alcoholes unidos

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al cido ctrico alcanzan su punto de ebullicin a temperaturas superiores de 150 C (Seidell, 1941).

3) Reacciones de oxidacin El cido ctrico es fcilmente oxidado por una variedad de agentes oxidantes, tales como los perxidos, hipoclorito, persulfato, permanganato, periodato, hipobromito, cromato, dixido de manganeso y cido ntrico. El producto de la oxidacin son cidos acetodicarboxilicos, cidos oxlicos, bixido de carbono y agua (Blair y Zienty, 1979). 4) Reduccin La hidrogenacin del cido ctrico produce cido 1,2,3 propanocarboxilico (Seidell, 1941).La hidrogenacin produce dixido de carbono, agua, metano, cido frmico y pequeas cantidades de cido metil succnico. 5) Formacin de sales El cido ctrico forma sales mono, di y tribsicas con muchos cationes, tales como los lcalis, amonio y aminas. Las sales pueden ser preparadas por neutralizacin directa de una solucin de cido ctrico en agua usando una base apropiada. El citrato trisdico es el ms ampliamente utilizado en comparacin con otro tipo de sal de cido ctrico. 6) Formacin de quelantes

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El cido ctrico forma complejos multivalentes con iones metlicos y forma quelatos (Staal, 1989). Esta propiedad es importante en el proceso del cido ctrico, la contaminacin por metales afecta el color, estabilidad, apariencia del producto o eficiencia del proceso. 7) Corrosin En soluciones acuosas, el cido ctrico corroe el acero a temperaturas elevadas, exceptuando el acero 316 es resistente a la corrosin. Otros metales como el aluminio, cobre y niquel son medianamente corrodos por el cido ctrico. Por otra parte, el vidrio y plsticos (polister, polietileno, polipropileno, polivinil) no son corrodos por el cido ctrico (Kirk-Othmer, 2002). Aplicaciones del cido ctrico El cido ctrico es utilizado en la industria de alimentos, medicina, agricultura e industria qumica, debido a sus propiedades nicas. El cido ctrico se utiliza para ajustar el pH, como sustancia quelante o para formar complejos estables con iones metlicos multivalentes, tambin es usado para estabilizar emulsiones y otros sistemas multifsicos. En resumen, el cido ctrico es dulce, limpio, tiene sabor agradable y es utilizado como acidulante en alimentos diversos Othmer, 2002). El cido ctrico, citrato de sodio y el citrato de potasio se utilizan para la elaboracin de bebidas carbonatadas y no carbonatadas (National Soft Drink Association, 1982). Las bebidas bajas en caloras, isotnicas, utilizan solo cido ctrico en combinacin con sales de citrato para otorgar sabor y propiedades de (Kirk-

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buffer y para incrementar la actividad antimicrobiana. La alta solubilidad del cido ctrico es importante para la elaboracin de jarabes. Se puede combinar con cido mlico para obtener perfiles nicos de sabor. Tambin se utiliza para estabilizar el pH en bebidas dietticas. La concentracin presente en muchas bebidas carbonatadas y de sabores estn alrededor del 0.10-0.25 % (p/p). Existe toda una gama de aplicaciones en la industria de alimentos (Tabla 1).
USO
Fabricacin de mermeladas y jaleas. Elaboracin de dulces. Ensaladas. Alimentos congelados. Frutas y vegetales congelados. Grasas y aceites. Elaboracin de postres y confitera. Elaboracin de quesos Lcteos. Alimentos del mar. Productos crnicos.

PROPIEDADES
Proveen de sabor y se ajustan al pH del producto para su ptima gelatinizacin. Se adiciona al dulce para dar sabor. Evita la inversin del azcar. Se combinan con el cido ascrbico para evitar el ataque enzimtico a vegetales preparados. Quela y acidifica para conservar a los alimentos congelados e incrementa la actividad antioxidante. Inhibe el deterioro del sabor y olor Atrapa metales y evita la oxidacin enzimtica. Mantiene el color e incrementa el sabor de las frutas enlatadas Evita la oxidacin de grasas y aceites, adems, atrapa trazas de metales Junto al citrato de sodio, se utilizan en la industria de la confitera para optimizar las caractersticas de gelatinas e incrementan su sabor Se utiliza citrato de sodio en el proceso de elaboracin de queso, se utiliza para estabilizar las emulsiones de aceite y agua. Tambin le da cuerpo y textura al queso Estabilizador de cremas batidas y estabiliza lcteos que contienen vegetales. Se le adiciona a malteadas, y postres congelados antes de su pasteurizacin. Reduce su viscosidad Se adiciona junto a otros antioxidantes para bajar el pH y retardar el crecimiento bacteriano, evitando el deterioro, evita sabores desagradables y color de pescados y otros alimentos de origen marino Se utiliza para curar a la carne e incrementa la efectividad antioxidante y ayuda a modificar la textura. Contiene propiedades antimicrobianas Tabla 1. Usos del cido ctrico en los alimentos

En la medicina, el cido ctrico y las sales de citrato son usados como buffer para mantener la efectividad y estabilidad de una gran cantidad de frmacos. Tambin se utilizan para formular medicamentos efervescentes junto al bicarbonato; en este caso les confiere una rpida disolucin de los ingredientes activos y mejora la palatabilidad. Se usan para quelar trazas de metales inicos y evita la degradacin de los ingredientes de una formulacin farmacutica. Evita la coagulacin de sangre y es usado para separar los componentes celulares (fraccionamiento) y

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plasma. Los citratos de calcio y amonio se utilizan como suplementos minerales o en gomas de mascar para el cuidado dental. En el sector agrcola, el cido ctrico y sus sales de amonio se usan para atrapar iones solubles como el hierro, cobre, magnesio, manganeso y zinc, los cuales son micronutrientes utilizados para formular fertilizantes lquidos. Tambin se utiliza en los forrajes para el ganado, en la formacin de quelatos fcilmente digeribles de nutrientes metlicos esenciales. Tambin se usa para mantener un sabor

agradable logrando incrementar el consumo de alimentos por parte de los animales, controla el pH gstrico y mejora la eficiencia de absorcin de nutrientes en el intestino delgado. El uso industrial del cido ctrico es muy amplio, este va desde elaboracin de detergentes hasta la fabricacin de cemento para la construccin (Tabla 2).
USO
Fabricacin de detergentes

PROPIEDADES
Se usa para fabricar detergentes en polvo y lquidos. El cido ctrico reemplaza a los fosfatos y es menos contaminante. Atrapa iones de aguas duras y dispersa aceites. El cido ctrico funciona adecuadamente a altos y bajos pHs, y su efectividad no es afectada por la temperatura del agua; lo anterior hace al cido ctrico idneo Es un limpiador de superficies duras. Acidifica y quela disolventes y depsitos de agua dura. Se utiliza en la construccin para incrementar la eficacia de surfactantes. Remueve colorantes que son dficiles de eliminar en la ropa El cido ctrico ajustado a un pH de 3.5 junto al amonio y trietanolamina, se usan para limpiar metales oxidados. Es til en la limpieza de reactores nucleares y boilers de vapor, con el fin de restaurar la eficiencia en la transferencia de calor. Limpia equipo de acero de la industria y para reas de difcil acceso, tales como los cascos de barcos. Las soluciones de citrato de aluminio ajustadas a un pH de 7.0 en usada para gelificar polmeros, estimulando la recuperacin de petrleo. Se usa para remover sulfuro de hidrgeno del gas natural y formando azufre elemental. Absorbe dixido de azufre del gas producido por las plantas elctricas. El dixido de azufre es el principal causante de la lluvia cida. Es usado como aditivo y formulaciones plsticas para retardar el tiempo de secado y reduce la cantidad de agua requerida para hacer una mezcla. Mejora su resistencia y fuerza de construcciones. Acta como Buffer de resinas de glioxilato, las cuales son usadas para dar alta durabilidad y ajusta el pH durante el teido de telas

Limpiador

Limpieza de metales

Petrleo Desulfacin de gas Formulacin de concretos y morteros Fabricacin de textiles

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Plsticos

Junto con el bicarbonato, el cido ctrico es usado como agente efervescente de espuma de poliestireno. Ha reemplazado a los fluoroclorocarbonos de los recipientes de plstico. Es un agente quelante en la fabricacin de resinas y los esteres de citrato se usan como plastificante de pelculas de PVC, usadas para empacar alimentos. Se adiciona a la pulpa lquida para blanquear y atrapar iones metlicos y evita la decoloracin. Se adiciona a cosmticos para ajustar el pH, quelar metales y evitar la decoloracin y descomposicin Le confiere volumen, estabilidad y fuerza a materiales cermicos usados como condensadores elctricos y fundicin. Tabla 2. Aplicaciones del cido ctrico en la industria

Fabricacin de papel Cosmticos Cermica