Espectroscopa de RMN, aspectos instrumentales

Marta Bruix
Instituto de Qumica-Fsica Rocasolano Serrano 119, 28006 Madrid, mbruix@iqfr.csic.es

1. Introduccin. La resonancia magntica nuclear es la espectroscopa cuya instrumentacin ha sufrido los avances ms espectaculares en los ltimos aos. Los primeros espectrmetros introducidos en los aos 50 trabajaban en la modalidad de onda continua con imanes permanentes, con frecuencias de resonancia para el protn de 30-60 MHz y sin circuitos de estabilizacin de campo. Ms tarde, en los aos 60 se introdujeron los electroimanes equipados con estabilizadores de flujo para la mejora de la estabilidad y circuitos adicionales de estabilizacin de campo, lock, lo que supuso una gran mejora en la estabilidad de los espectrmetros que pronto comenzaron a operar en la modalidad Fourier monodimensional. La introduccin de la espectroscopa de RMN 2D hacia los aos 80, oblig a un rediseo de los espectrmetros existentes, se equiparon con generadores de pulsos y se introdujeron mejoras en los sistemas de procesado de espectros. En la actualidad, la introduccin de las tcnicas multidimensionales ha exigido un esfuerzo mayor obligando al diseo de espectrmetros ms estables y con manejo de radiofrecuencia ms verstil y rpido.

Figura 1- Evolucin de los imanes de RMN. Ao de introduccin en el mercado de los diferentes espectrmetros de RMN con campos magnticos crecientes. Lnea discontinua, imanes permanentes y electroimanes. Lnea gruesa, imanes superconductores.

Todo ello ha ido unido a la construccin de imanes superconductores de campos magnticos cada vez mayores (figura 1). En esta leccin se va a describir el fundamento de la deteccin experimental del fenmeno de la RMN y como est constituido un espectrmetro moderno, comentando el funcionamiento de las partes ms importantes. 2. Deteccin en RMN. Un sistema de spines nucleares situado en un campo magntico intenso (segn el eje z) se puede excitar con variadas secuencias de pulsos para llevar a cabo el experimento de RMN deseado. Al trmino del mismo, la seal que se genera tiene que ser detectada. Esta seal, como es conocido, corresponde a la magnetizacin macroscpica de la muestra que ha evolucionado a lo largo del tiempo t de adquisicin. Esta magnetizacin, que se mide en unidades de campo magntico (gauss), gira alrededor del campo externo con una frecuencia angular coincidente con su frecuencia de resonancia (frecuencia de Larmor). Por el principio de induccin electromagntica sabemos que cuando un campo magntico vara, ya sea en mdulo o en direccin, es capaz de generar una variacin de tensin elctrica en una espira conductora que rodee a dicho campo. As, en RMN, puede obtenerse una determinada tensin elctrica en los extremos de la bobina de recepcin cuando esta se encuentra convenientemente situada. La magnitud de esa tensin es, en cada momento, proporcional al valor de la magnetizacin y su frecuencia coincide con la frecuencia de resonancia del ncleo excitado. En trminos electrnicos se dice que es una radiofrecuencia modulada en amplitud. Por otra parte la f.e.m. () inducida en la bobina es proporcional al nmero de ncleos que haya en la muestra y a cuan rpidamente vara la magnetizacin: = /t (B1 M) vs expresin que desarrollada conduce a : = 0 B1xy Mxy sen (0t + - ) vs y a partir de aqu la f.e.m. total detectada se obtiene integrando la expresin anterior sobre el volumen total de muestra (vs). 0 es la frecuencia de resonancia, B1xy es el campo magntico creado en el interior de la espira por la corriente inducida, Mxy es la componente en el plano xy de la magnetizacin global de la muestra, y es la fase de la magnetizacin. La f.e.m. es pues proporcional al valor absoluto de 0, y al del valor de la magnetizacin instantnea en el plano xy y vara sinusoidalmente con la frecuencia 0. Es decir, es una radiofrecuencia elctrica del orden del MHz. La f.e.m. inducida es muy pequea, unos pocos nanovoltios. Detectar esas radiofrecuencias tan dbiles con relaciones seal/ruido buenas y sobre todo de forma reproducible durante periodo de tiempo largos (das) ha supuesto un gran esfuerzo de ingeniera en el diseo de los nuevos espectrmetros de RMN que pasamos a describir. 3. Espectrmetro de RMN. Un espectrmetro de RMN est compuesto por diferentes partes que se encuentran representadas en el diagrama de bloques de la figura 2. La funciones bsicas del espectrmetro se podran resumir en tres puntos. En primer lugar, la generacin de las radiofrecuencias (rf) adecuadas en amplitud, frecuencia y fase. En segundo lugar, la direccin de estas rf a la muestra en el momento adecuado con un programador de pulsos, y finalmente la deteccin de la respuesta del sistema de una forma eficaz. Para ello, bsicamente es

necesaria la presencia de un imn, una bobina y un sistema de transmisin-recepcin de radiofrecuencias todo ello bajo el control de un ordenador. Estas partes se encuentran representadas en negrita en el diagrama y estn conectadas por lneas gruesas. Lo dems, son accesorios del espectrmetro.

Estacin trabajo

control shims

corrientes shim bobina shims desacop. obs.

imn

control canal lock

transmisor/ receptor lock

preamplif. lock

control gradientes

amplif. gradientes

ordenador del espectrmetro

transmisor lineal control rf sintetizador

amplificador lineal

obs.

filtro digital

ADC

deteccin cuadratura

preamplificador

control temperatura

unidad temperatura

Figura 2. Diagrama de bloques de un espectrmetro de RMN de pulsos de alta resolucin. Las partes esenciales del espectrmetro estn en lneas gruesas. Las flechas indican el camino de la radiofrecuencia desde el ordenador del espectrmetro a la sonda y el regreso de la seal de RMN al ordenador donde se almacena. Desde el preamplificador, tanto la rf del canal de observacin como la seal de RMN detectada van por el mismo cable. Las partes en lnea fina representan funciones auxiliares del espectrmetro. A partir de la deteccin en cuadratura se generan dos seales moduladas en seno y coseno respectivamente y darn lugar a la parte real e imaginaria de la seal.

Un espectrmetro moderno est controlado por un ordenador central (de adquisicin) que tiene una capacidad de respuesta muy corta y que a su vez est recibiendo las ordenes que el usuario o espectroscopista manda a travs de una estacin de trabajo que puede operar en modo multiusuario. La comunicacin electrnica entre esta estacin de trabajo y el ordenador de adquisicin tiene que ser de alta velocidad. El ordenador de adquisicin est dedicado exclusivamente a esta tarea y ejecuta independientemente y sin interrupcin alguna, los programas de adquisicin definidos por el operador a travs de una serie de parmetros como son: nmero de pulsos, potencias, tiempos de espera, intensidad de gradientes de campo,

sonda

bobina

nmero de acumulaciones, etc. Para ello, da las ordenes pertinentes a los distintos componentes electrnicos para realizar operaciones como: cambiar la frecuencia de un pulso, cambiar la potencia del mismo, mandar al receptor iniciar la recepcin de la seal, etc. A partir del esquema presentado anteriormente, los pasos esenciales para obtener un espectro de RMN, y que nos van a servir para entender como funciona el espectrmetro, estn representados por la direccin de las flechas que salen de las partes esenciales. Estas flechas indican el camino de la informacin desde el ordenador central del espectrmetro a la sonda que contiene la bobina que recoge la seal y la vuelta al ordenador donde la seal de RMN se almacena. En primer lugar, el ordenador manda una orden al control de rf para poner las frecuencias requeridas en el sintetizador y mandar los pulsos de rf desde el transmisor a los diferentes amplificadores, de acuerdo a los requerimientos experimentales definidos previamente. A partir de los datos almacenados digitalmente, el transmisor prepara los pulsos con las formas precisas, las fases, la longitud y la potencia antes de mandarlos a los amplificadores lineales. La RMN moderna precisa que todo esto se lleve a cabo en unos pocos microsegundos, lo que dura la ejecucin de una secuencia de pulsos. Todo el sistema en el transmisor y los amplificadores tiene que ser lineal, de lo contrario, los pulsos con formas no rectangulares estarn distorsionados y no actuarn en la forma esperada. A travs de los amplificadores, los pulsos de rf llegan a la bobina de la sonda de manera que la rf se dirige a la muestra colocada en la parte superior de la sonda lo ms cerca posible de la bobina. Dado que, por una serie de motivos que se comentaran ms adelante, es conveniente usar la misma bobina para mandar la rf de observacin que para recibir la dbil respuesta de los ncleos, los pulsos de rf tiene que pasar a travs del preamplificador. En el camino de vuelta, la seal es recogida por la bobina y llega al preamplificador sin atenuar o con mnima atenuacin. Luego esta seal sale del preamplificador con la frecuencia de RMN amplificada lo suficiente para preservar la relacin S/N en las subsiguientes etapas de amplificacin y mezcla. La seal no puede ser digitalizada a la frecuencia de RMN y debe ser transformada a un rango de frecuencias de unas pocas decenas de kHz. Para ello se disponen de digitalizadores con un rango dinmico amplio. Esta reduccin de frecuencia se produce en varias etapas a travs de una frecuencia intermedia y es posteriormente digitalizada en el convertidor analgico digital (CAD) que muestrea la seal en puntos discretos y la convierte en una serie de nmeros. Finalmente, la seal se filtra y se manda al ordenador donde los diferentes barridos se suman y los datos as obtenidos pueden finalmente procesarse. Adicionalmente a la tarea principal de obtener espectros de RMN, el espectrmetro lleva a cabo un montn de funciones auxiliares. Una de ellas es mantener un ajuste muy bueno de la homogeneidad del campo magntico sobre cada muestra concreta. Para ello se dispone de bobinas de homogeneidad o bobinas de shim. Por otra parte, hay que mantener estable la relacin campo/frecuencia permanentemente, por lo que hay que monitorizar una seal de referencia (deuterio). Asimismo, tambin es preciso mantener estable la temperatura del experimento, poder usar conjuntamente con la radiacin rf los gradientes de campo magntico, etc. Todas estas tareas se coordinan tambin a travs del ordenador del espectrmetro.

4. Los componentes de las rutas de la radiofrecuencia. 4.1. El camino de la transmisin. Tal como queda representado en la figura 2, este camino empieza en el sintetizador de frecuencias y termina en la bobina de rf de la sonda. El papel del sintetizador es proporcionar la frecuencia base para el transmisor. Por razones obvias de estabilidad, todas las radiofrecuencias del espectrmetro se generan a partir de un oscilador nico mediante multiplicaciones, sumas, o restas de esta frecuencia patrn. El transmisor funciona de forma continua pero el paso posterior de la rf est controlado por el programador de pulsos, controlado a su vez por el ordenador de adquisicin. Del transmisor sale finalmente la frecuencia concreta, la duracin y la fase de la radiacin que se ha programado. La precisin de cada una de estas tareas es muy alta ya que la frecuencia puede ser definida en pasos discretos de al menos 0.1 Hz, la fase en pasos de 1 o menores y la duracin de los pulsos en fracciones de 50 ns o menores. Antes de entrar en la etapa final de amplificacin, el pulso debe atenuarse para conseguir la potencia preestablecida en el experimento. A partir de la potencia mxima, la rf puede ser atenuada en un rango tambin muy amplio, tpicamente del orden de 80 dB o ms, en pasos de 0.1 dB o menores. Normalmente la potencia a la salida del transmisor es cercana a 1 mW y esta rf debe ser atenuada antes de amplificarse hasta 50-1000 W. La funcin del atenuador es controlar exactamente la potencia de salida del canal de radiofrecuencia. Desde el amplificador lineal de potencia, el pulso viaja a la sonda establecindose un campo magntico oscilante linealmente polarizado 2B1 a lo largo de toda la muestra. Normalmente se precisan dos tipos de amplificadores dado que tcnicamente es difcil disear uno que cubra satisfactoriamente todo el rango de frecuencias. Un tipo se utiliza para los ncleos de alto valor de tales como 1H y 19F, mientas que los del otro tipo se utilizan para los ncleos de bajo valor de como 31P, 13C y 15N. Tpicamente las potencias de los amplificadores de protn son de 50-100 W. Para la mayora de los heteroncleos con bajo valor de , es preciso disponer de amplificadores de alta potencia, normalmente en el rango de 300-500 W con el fin de evitar pulsos excesivamente largos que pueden tener perfiles de excitacin no convenientes. Todas las etapas del camino de transmisin debe estar bien linealizadas. La linealizacin tiene la ventaja de que las potencias de todos los pulsos pueden ser calculadas a partir de un pulso rectangular independientemente de la forma, longitud, potencia y fase. Esto evita la determinacin experimental de estos parmetros, que en muchos casos puede no ser sencilla. Un espectrmetro moderno puede tener entre dos y cuatro canales de radiofrecuencia. Cuando se aplican diversas rf en un mismo experimento, cada canal de radiofrecuencia debe ser optimizado y protegido insertando filtros entre el amplificador y la sonda. As se previene que frecuencias muy distintas de la asignada a cada canal puedan llegar a la muestra y afectar severamente la medida. Es interesante recordar aqu algunas definiciones tcnicas y relaciones que son importantes en este contexto. En primer lugar la potencia del transmisor P se expresa habitualmente en relacin a la frecuencia de referencia en escala logartmica, en unidades de dB: P [dB] = 10 log (Pref/P) = 20 log (Vref/V)

donde V es el voltaje aplicado. El campo B1 es proporcional a este voltaje en la bobina. Si suponemos por ejemplo que el usuario quiere doblar la longitud de su pulso de 90, el voltaje en la bobina debera ser la mitad y la potencia debe ser reducida por un factor de cuatro. Cambiar en un factor de 2 un pulso de 90 requiere un cambio de potencia de 6 db. La potencia P del amplificador puede calcularse a partir del voltaje pico-pico Vpp medido a travs de una resistencia de 50 Ohm usando la ecuacin: P = Vpp2/400 El campo B1 se mide en Tesla (T) en el sistema SI, pero puede tambin expresarse en unidades de Gauss (G) y en unidades de kHz, de manera que puede establecerse la relacin: B1 [G] = 0.23334 B1 [kHz] Cada Tesla corresponde a 104 G. Si tenemos en cuenta la relacin B1/2 = 1/360, un campo B1 de 5 G corresponde a 21.42 kHz o a un pulso de 90 de 11.7 us. 4.2. La ruta de la deteccin. El receptor de un espectrmetro de RMN es muy parecido a un receptor de radio domstico en el cual la seal de rf es detectada por una antena y convertida en una seal de audiofrecuencia, utilizando un proceso de conversin de frecuencias y de modulacin. La figura 2 nos muestra como este camino de deteccin empieza en la bobina de la sonda y termina con la digitalizacin de la seal en la memoria del ordenador. As pues, tal como se ha comentado en el apartado 2 (Deteccin en RMN), la seal de RMN se obtiene como un voltaje oscilante. Posteriormente, esta seal se manda al preamplificador para ser amplificada. El voltaje tpico inducido en la bobina por la magnetizacin nuclear es muy pequeo, del orden de los micro-nano (10-6-10-9) voltios. Por ello, las prdidas en la transmisin deben ser minimizadas poniendo el preamplificador lo ms cercano posible a la bobina. La calidad del preamplificador, juntamente con la de la bobina receptora, determina la mxima relacin seal-ruido que puede obtenerse con un espectrmetro concreto. En las criosondas, el preamplificador suele estar incorporado en el cuerpo de la sonda de manera que puede ser enfriado a la vez que la bobina. Desde el preamplificador, la seal se manda a la parte de la consola que se encarga de convertir la rf en una frecuencia menor, de rango intermedio, que es la misma para todo los ncleos. El uso de la frecuencia intermedia permite un tratamiento posterior de la seal que no depende del ncleo en cuestin. Este proceso se aplica en dos etapas hasta conseguir la seal de audiofrecuencia deseada. La bobina de transmisin/recepcin es paralela al eje x, por lo que nicamente detecta la magnetizacin Mxy en este eje. Ello hace que no sea posible saber el signo de la componente Mxy segn y. En la prctica esto equivale a ignorar si las frecuencias detectadas son mayores o menores que la frecuencia del pulso de excitacin lo que obligara a dar el pulso de medida en un extremo del intervalo espectral deseado para poder obtener siempre diferencias de frecuencia del mismo signo. Como consecuencia, sera preciso efectuar un filtrado de ruido adicional, originado por el obligado aumento (al doble) de la anchura espectral, lo que a su vez dara origen a un empeoramiento notable de la relacin seal/ruido. El problema se resolvera si se dispusiese de otra bobina receptora igual situada en el eje y. En

la prctica se utiliza otra solucin, que es matemticamente equivalente, pero que no requiere la presencia fsica de la segunda bobina. Es lo que se llama la deteccin en cuadratura. El sistema dispone de dos detectores de manera que, a la frecuencia intermedia, la seal de rf se separa y se enva a los dos canales diferentes donde se mezcla con una frecuencia de referencia rfref (la de transmisin) que est desfasada en 90 en un canal respecto al otro (figura 3). As, la informacin que circula por cada canal corresponde a una modulacin seno y a una modulacin coseno de la seal. Combinando las componentes detectadas en ambos canales y haciendo uso de las propiedades de la transformada de Fourier, pueden obtenerse las dos componentes de Mxy, y determinarse el signo de la frecuencia de resonancia respecto a la frecuencia de referencia o de medida. Este esquema permite reducir la anchura espectral excitada por un factor de dos y a la vez reducir el ruido por 2.

Seal RMN detectada

DSF

Amp

filtro

Seal modulada en seno

DSF Frecuencia referencia Fase +/- 90

Amp

filtro

Seal modulada en coseno

Figura 3. Diagrama de la deteccin en cuadratura. Cada detector sensible a la fase (DSF) tiene dos frecuencias de entrada y una de salida. La salida final son dos seales moduladas en seno y en coseno que permiten diferenciar frecuencias mayores y menores que la del pulso de medida.

Una etapa posterior reduce la frecuencia de la seal en la zona de las radiofrecuencias, del orden de 100 kHz. La seal as detectada es digitalizada y mandada a un filtro digital que elimina parte del ruido y las seales que estn fuera de la ventana de observacin. La seal digitalizada se almacena en el ordenador. En este recorrido, la funcin del convertidor analgico digital es muestrear la seal elctrica de RMN y convertirla en un numero binario. La velocidad de digitalizacin (entre 200 kHz 1 MHz) limita el rango de frecuencias que se puede caracterizar o la anchura espectral que se puede medir. Pero adems de esta limitacin, tambin limita la amplitud de las seales que pueden ser observadas. Dado que el proceso de digitalizacin convierte la seal en un nmero proporcional a la magnitud, el digitalizador debe tener una buena resolucin (2n, medida en bits) para que el rango dinmico sea lo suficientemente grande. Ello permitir digitalizar seales que tengan intensidades muy diferentes. As, el valor digitalizado viene definido por una serie de bits, y el nmero de bits depende de la resolucin del digitalizador. Un digitalizador de 8 bits puede digitalizar intensidad de seales desde 000000000 (0 decimal) hasta 11111111 (255 decimal), lo que en un espectro real equivale a igualar la seal ms intensa a 255 y la ms dbil a 1. Es decir, esta ltima sera el 0.4% de la seal ms intensa y este sera el intervalo dinmico del digitalizador. Como la mayora de los espectros de RMN exceden este rango, es preciso usar digitalizadores mayores de 12 bits. Esto es crtico, por ejemplo, en los espectros de

biomacromolculas donde es preciso detectar de manera simultnea las dbiles seales que provienen del soluto frente a la intensa seal del disolvente. En estos casos la resolucin debe ser de 16 o 18 bits. Algunos elementos de este trazado pueden ser optimizados por el operador. En principio, el circuito de transmisin/recepcin debe ser sintonizado para cada muestra a la frecuencia exacta de excitacin y la impedancia del circuito debe tambin ajustarse. Esto se describir en el apartado de la sonda. 5. Imn superconductor. El imn es la parte ms costosa y uno de los elementos bsicos de un espectrmetro de RMN. El campo magntico B0 generado por el imn es el encargado de eliminar la degeneracin de los niveles de energa del spin nuclear. A mayores campos magnticos mayor dispersin de las seales en el espectro y mayor sensibilidad en los experimentos ya que esta depende de B03/2. Actualmente, la mayora de los imanes son superconductores, es decir su bobina est construida con espiras de diferentes aleaciones (NbTi, Nb3Sn) embebidas en una matriz de cobre que presentan una resistencia casi nula cuando se enfran a temperaturas cercanas al cero absoluto. Esto se consigue sumergiendo la bobina en helio lquido (4.2 K). Este bao de helio lquido est rodeado de una camisa de nitrgeno liquido (77.4 K) que a su vez est rodeada de una camisa de vaco (10-6 mBar) para evitar perdidas del He liquido por evaporacin. Cuando se instala el imn, la bobina debe enfriarse previamente a la temperatura del helio lquido y a continuacin se cargan las espiras con una cantidad de corriente importante (del orden de 100 A para un imn de 14,1 T o 600 MHz) con el fin de crear el campo magntico deseado. Una vez en estas condiciones, la corriente elctrica que circula por las espiras contina circulando sin perdidas aparentes siempre que no aumente la temperatura. La longitud de las espiras superconductoras, en uno de estos imanes, puede llegar a ser de ms de 100 kilmetros. Las aleaciones de niobio permiten la superconduccin a baja temperatura pero el cobre de la matriz no presenta esas propiedades. Sin embrago, la presencia de cobre es esencial para que en el caso de un repentino colapso de la superconductividad (quench), la mayora de la corriente puede fluir por l. Adems, el cobre garantiza la disipacin eficiente del calor producido en el quench ayudando a evitar grandes daos en el alambre superconductor. La estabilidad requerida para los imanes de alta resolucin requieren que estos trabajen de modo continuo sin conexin a la red elctrica una vez instalados. Consecuentemente, las uniones que conectan las diferentes espiras deben presentar una mnima resistencia para evitar una paulatina disminucin del campo magntico inicial. En la actualidad, para conseguir los campos magnticos ms elevados que se utilizan e RMN (a partir de 18,8 T o 800 MHz), la espira superconductora tiene que enfriarse a temperaturas menores de las comentadas anteriormente, alrededor de los 2 K. Todo ello conlleva una mayor complejidad en el mantenimiento de las condiciones de trabajo. 6. Bobinas de homogeneidad de campo. Adicionalmente a la espira principal, el imn superconductor tiene espiras superconductoras adicionales (crio-shims) que producen gradientes especficos de campo magntico que se usan para mejorar la homogeneidad de la bobina principal. Estos crio-shims corrigen grandes inhomogeneidades. Las corrientes de estas bobinas se establecen en el momento de la instalacin del espectrmetro y normalmente no se modifican posteriormente.

Sin embargo, la homogeneidad de un espectrmetro de RMN de alta resolucin slo puede alcanzarse con la ayuda de otras bobinas de shim que se encuentran a temperatura ambiente. Estas ltimas estn situadas en un tubo cilndrico que rodea a la sonda (figura 2) y cada una de ellas produce correcciones del campo en determinadas direcciones del espacio. Estn diseadas para crear pequeos campos magnticos que se oponen y cancelan las inhomegenidades del campo principal. Dado que estas variaciones existen en una gran variedad de formas funcionales (lineales, parablicas, etc) las bobinas de shim deben ser capaces de crear una gran variedad de campos de oposicin. Tpicamente hay de 20 a30 shims de temperatura ambiente que en la mayora de los espectrmetros estn controlados por el ordenador. Estos shims deben optimizarse para cada muestra concreta. Los espectrmetros ms modernos estn equipados con mecanismos de homogenizacin por gradientes de campo magntico. Estos procesos son ms efectivos en soluciones acuosas. 7. Sonda. La sonda es, probablemente, la parte ms importante del espectrmetro. Podemos decir que la versatilidad de un equipo de RMN depende de la diversidad de sondas disponibles, que se diferencian entre ellas en el tamao del tubo de muestra que aceptan, el rango de frecuencias en el que pueden trabajar, el nmero de canales y la situacin de las bobinas. En la sonda es donde queda colocado el tubo de muestra y es la parte del espectrmetro encargada de mandar la rf y detectar la seal que proviene de la solucin. Contiene la bobina de rf para transmisin/recepcin, las bobinas del canal de estabilizacin (lock) y las bobinas de los gradientes. Adems, contiene la unidad para el giro de la muestra y el circuito para el control de la temperatura. El giro de la muestra alrededor del eje del tubo se lleva a cabo con la ayuda de un rotor. En las condiciones de giro, cada molcula de la disolucin situada en una posicin concreta y a un radio r respecto al eje z, experimentar un campo magntico promedio correspondiente al del circulo de ese radio. Eso se traduce en una menor anchura de lnea en el espectro puesto que se promedian determinadas imperfecciones. Las sondas se construyen para albergar tubos de RMN de diferentes dimetros. El dimetro ms comn es el de 5 mm. Sin embargo existen tambin sondas de 2.5, 3, 8 y 10 mm, adems de un sinfn de sondas especiales: de flujo, microsondas, etc, e incluso sondas para trabajar a muy altas o muy bajas temperaturas. En este apartado vamos a describir con ms detalle las bobinas de la sonda. 7.1. Bobina de radiofrecuencia. La bobina de radiofrecuencia acta como una antena. Por una parte, transmite los pulsos de radiofrecuencia de la secuencias de pulsos (el campo magntico B1 que rota la magnetizacin neta). Adems, detecta la respuesta de los spines via la magnetizacin transversal que precesiona en el plano xy, la cual induce un voltaje en la bobina. La utilizacin de dos bobinas diferentes para la transmisin y la recepcin tiene conceptualmente algunas ventajas. Sin embargo, el diseo de dos bobinas sintonizadas a la misma frecuencia que deben situarse en un espacio muy pequeo es una tarea difcil debido a las interferencias que pueden producirse y el resultado no es ptimo. Por ello, en los espectrmetros de RMN se utiliza una nica bobina de recepcin/transmisin. La bobina de rf produce un campo magntico oscilante linealmente polarizado (B1) perpendicular a la direccin z del campo magntico esttico que se toma como x por convencin. La mayora de las bobinas de rf en los espectrmetros de RMN lquidos son de tipo Helmholtz. Estas bobinas son capaces de

producir un campo B1 bastante homogneo en todo el volumen de la muestra que es cilndrico. Una bobina puede sintonizarse adicionalmente para 3 frecuencias diferentes o puede ser diseada para ser sintonizada para un rango amplio de frecuencias con una frecuencia fija adicional. Los mejores resultados se obtienen para bobinas optimizadas para una sola frecuencia. Por eso, cada sonda cuenta con una o ms bobinas con diferentes rangos de frecuencias. La bobina necesita estar situada lo ms cerca posible de la muestra y acostumbra a estar optimizada para una frecuencia de recepcin y adicionalmente para la frecuencia del lock. Si la sonda est capacitada para trabajar con otras frecuencias, contendr una bobina adicional ms externa que la anterior. Esta bobina externa se utiliza para los desacoplamientos y transferencias de polarizacin.
Tubo de muestra

bobina

Figura 4. Dibujo del interior de una sonda donde puede apreciarse la bobina de recepcin/transmisin que rodea al lugar donde se sita el tubo de muestra.

Uno de los parmetros que caracterizan una bobina es el factor de calidad Q. Este factor mide el amortiguamiento (damping) en el circuito, es decir la relacin entre la energa almacenada y la energa perdida en cada periodo de operacin. El factor Q vale: Q= L/ R donde es la frecuencia, L la inductancia y R la resistencia. As, para una bobina, un valor alto de Q significa una resistencia pequea, o lo que es lo mismo una perdida tambin pequea y por tanto un comportamiento ms parecido a la bobina ideal. En general, cuanto mayor es Q, mayor es la sensibilidad y mayor el campo de rf que puede obtenerse para una potencia dada. Q determina a su vez el lapso de tiempo o demora necesario para cualquier cambio de potencia o fase en la rf. El valor de esta demora en nanosegundos es aproximadamente igual al valor de Q. Los valores tpicos de Q estn en el rango de 300 a 400. La homogeneidad del campo B1 creado por la bobina es un factor determinante de la calidad de la misma. Si el campo no es homogneo no todos los ncleos de la muestra experimentarn

el mismo pulso. Esto se hace ms importante en secuencias largas con numerosos pulsos de rf en las que se perder gran parte de la seal e incrementaran el nmero de artefactos. Por razones de sensibilidad, la bobina debe encontrarse muy cerca de la muestra (figura 4). Esta proximidad espacial puede causar problemas cuando la bobina y el medio circundante, normalmente aire o nitrgeno usado para la estabilizacin de la temperatura, no tienen la misma susceptibilidad magntica. En estas condiciones la presencia de la bobina puede distorsionar el campo magntico esttico en la muestra y dificultar mucho el proceso de homogeneizacin. Para solventar estos problemas, las sondas pueden ser construidas especficamente para diferentes susceptibilidades magnticas del aire o del nitrgeno y deben usarse con el gas correspondiente para obtener buenos resultados. Las bobinas deben ser sintonizadas especficamente para la muestra que vaya a ser estudiada. Cada bobina tiene una banda o rango de frecuencias a las que puede resonar. Cuando ponemos una muestra en la bobina, la conductividad y la constante dielctrica de la muestra afecta a la frecuencia de resonancia. Si esta frecuencia es diferente a la frecuencia seleccionada, la bobina no mandar de forma eficiente el campo B1, ni detectar eficientemente la seal que viene de la muestra. Esto finalmente conlleva una perdida de sensibilidad en el experimento. La mejor sensibilidad se consigue despus de sintonizar la sonda exactamente a la frecuencia de resonancia de cada ncleo en cada muestra concreta. Pero adems, la bobina tiene que ajustarse a la impedancia de los circuitos del transmisor y del receptor (normalmente 50 Ohms). Este valor es el requerido para la ptima transmisin de los pulso de rf a la muestra y de la seal inducida de RMN al receptor a travs de los cables coaxiales. Todo ello se hace gracias a la presencia de pequeos capacitadores variables colocados en la sonda. Cuando la sonda est bien sintonizada y con la impedancia ajustada, no hay rf reflejada y toda la potencia es absorbida.
Frecuencia del transmisor

error de sintona (tunning) error de matching Sonda bien sintonizada

Figura 5. Representacin de la potencia reflejada frente a la frecuencia. Izquierda, bobina mal sintonizada (error de tunning) y con mal ajuste de la impedancia (error de matching). Derecha, bobina bien ajustada.

Los ltimos avances en la tecnologa de sondas han conducido al desarrollo de las sondas criognicas. Estas sondas utilizan el helio gas para enfriar la bobina de excitacin/recepcin y el preamplificador de seal a 20-70 K, mientras la muestra se mantiene a la temperatura del experimento. Como consecuencia de ello se optimiza la eficiencia de la bobina y se reduce el ruido trmico, logrndose mejoras en la relacin seal/ruido en un factor de 3 a 4. Eso permite reducir el tiempo de los experimentos o, alternativamente, la concentracin de la muestra a estudiar.

7.2. Bobina de gradientes. Las sondas modernas no slo contienen bobinas de rf si no que, adicionalmente, tienen bobinas apantalladas para aplicar gradientes de campo magntico en una o en las tres dimensiones espaciales. Estas bobinas estn colocadas dentro de la sonda y producen gradientes de campo magntico B0 que son necesarios para aplicar la espectroscopa de gradientes, experimentos de difusin y microscopa de RMN. No todas las sondas tienen gradientes y no todos los espectrmetros de RMN tiene el equipamiento necesario para poder utilizarlos. Son bobinas de temperatura ambiente. Para crear los gradientes en la direccin z (paralelo a B0) la bobina es del tipo anti-Helmholtz, para los gradientes en x e y las bobinas tienen otros diseos (figura 6).

Figura 6. Diferentes tipos y formas de las bobinas de gradientes utilizadas en los ejes x, y, z.

Los gradientes de campo que se obtienen son del orden de 0,5 T/m (50 G/cm). Para ello estas bobinas estn cargadas con corrientes elctricas en el rango de los 10 A. Cuando se enciende o apaga una corriente de esta intensidad, la bobina de gradientes tiende a vibrar. Esto es algo que hay que minimizar para poder obtener espectros de alta resolucin ya que estas perturbaciones interfieren con el requisito bsico de la recuperacin rpida de la homogeneidad del campo magntico despus de la aplicacin del gradiente. Las sondas de gradientes tienen que estar diseadas para recobrar inmediatamente la homogeneidad. Unos valores tpicos seran: un tiempo de recuperacin de unos 100 s despus de un pulso de gradiente rectangular en el eje z de 2 ms a un valor de 0.5 T/m. En el caso de gradientes en los tres ejes, las interferencias entre las distintas bobinas, incrementan los tiempos de recuperacin individuales. Como ya se ha comentado, el uso de gradientes de campo posibilita un mtodo eficaz para conseguir la homogeneidad de campo de una forma sencilla y semiautomtica. 8. Sistemas de estabilizacin de campo y frecuencia. Los modernos espectrmetros de RMN precisan de una elevada estabilidad (mayor de 10-9) del campo magntico y de la frecuencia. Podra pensarse que la estabilidad de ambos, la radiofrecuencia y el campo magntico, debe de ser al menos del mismo orden de magnitud lo cual es imposible de alcanzar con las herramientas actuales. El campo magntico tiene una

tendencia natural a derivar paulatinamente con el tiempo, vara con las fluctuaciones de temperatura y presin, se afecta con la presencia de material magntico en movimiento, etc. Estas modificaciones externas son del orden de 10-20 miligauss (10-7) y son excesivas si deseamos medir por ejemplo una seal de protn con una anchura a mitad de la altura de 0.3 Hz a 800 MHz en experimentos que duran das. Afortunadamente, es suficiente con que la relacin campo-frecuencia sea estable en el orden de 10-9. Estas condiciones pueden obtenerse midiendo la seal de RMN de un ncleo determinado de forma permanente y compensando el campo magntico para cualquier desviacin que se produzca en la posicin de resonancia de esta seal. Este acoplamiento del campo magntico a una frecuencia de resonancia se conoce como lock (bloqueo campo-frecuencia) y para ello se utiliza habitualmente la resonancia de deuterio incluida en la mayora de los solventes que se utilizan en RMN. El circuito de lock se llama tambin circuito de estabilizacin, y puede imaginarse como un espectrmetro adicional dentro de nuestro espectrmetro. Su misin es detectar la seal de deuterio en dispersin (al revs de lo que es habitual en la espectroscopa de RMN que detecta la seal e absorcin) (figura 7). Dado que la posicin de resonancia de cualquier ncleo depende del campo magntico, cuando se produce alguna inestabilidad en el campo magntico principal (B0), la seal de deuterio se desva de su posicin. El circuito de lock lo detecta como un incremento de tensin elctrica (V) que es amplificada y enviada como una seal de error a unas bobinas capaces de generar un campo magntico adicional que corrige al principal.
Frecuencia de referencia

B0

Figura 7: Seal de dispersin del deuterio en el canal de estabilizacin (lock), eje de ordenadas V (voltaje), eje de abcisas B0 (campo magntico).

La estabilidad absoluta de la frecuencia del oscilador maestro de los sintetizadores utilizados actualmente es del orden de 10-8 Hz/da, claramente insuficiente para experimentos largos. Sin embrago lo que debe ser estable no es la frecuencia absoluta, sino la diferencia de frecuencias entre las radiofrecuencias de transmisin y de recepcin que al ser obtenidas del mismo oscilador varan de la misma forma con el tiempo. Lo mismo ocurre con las estabilidades de las fases.

La existencia de un canal de estabilizacin y el origen comn de todas las radiofrecuencias de un espectrmetro, posibilitan realizar espectros de RMN reproducibles. Las variaciones muy rpidas del campo magntico externo (arranque de trenes o mquina) no son bien corregidas con los mecanismos disponibles descritos. 9. Control de Temperatura. La temperatura de la muestra debe ser controlada de forma precisa para evitar desviaciones. En primer lugar la temperatura debe ser muy estable y no desviarse ms de 0.05 K de la temperatura deseada. Esto es especialmente importante cuando se trabaja en disoluciones acuosas ya que la seal de resonancia del agua presenta una dependencia muy grande con la temperatura (0.01 ppm/K). Si la temperatura es inestable, el sistema de lock trata de compensar la desviacin de la seal de D2O. Ello conduce, consecuentemente, al desplazamiento de las dems seales del espectro que tienen una dependencia con la temperatura probablemente menor que la del agua pero en cualquier caso distinta a la de ella. En experimentos multidimensionales largos, si la temperatura no es estable, las resonancias individuales no estn siempre completamente alineadas a lo largo de todos los incrementos del periodo de evolucin. Ello da lugar a bandas de ruido (ruido t1) perpendiculares al eje de la dimensin directa de medida. Adems, las inestabilidades de temperatura incrementan los artefactos en la espectroscopia de diferencia. Los problemas derivados de una mala regulacin de la temperatura son tanto ms importantes cuanto ms finas sean las seales en el espectro. Para regular la temperatura, se hace fluir una corriente de gas (aire o nitrgeno) alrededor de la muestra. Este gas ha pasado previamente por una resistencia elctrica. Un termopar introducido en la sonda, en una zona muy prxima a la muestra, mide la temperatura y un circuito electrnico se encarga de regular la potencia de la resistencia para conseguir la temperatura deseada. Para que la regulacin sea correcta, la temperatura de entrada del aire debe de ser al menos 10 K por debajo de la temperatura a la que se quiere regular en la muestra. Por eso, es necesario disponer de un accesorio que permita enfriar el aire o el nitrgeno previamente a su introduccin en la sonda para que luego pueda ser calentado. Adems, el flujo debe ser suficientemente alto para disipar eficientemente el calentamiento que se pueda producir por radiaciones intensas, como por ejemplo en el desacoplamiento heteronuclear o durante el tiempo de mezcla de un experimento TOCSY. El flujo de aire es especialmente crtico en le caso de las sondas criognicas ya que debe ser lo suficientemente elevado como para homogeneizar el posible gradiente de temperatura entre la sonda (que se encuentra a 20-40 K) y la muestra. Sin embargo, en ningn caso, el flujo de aire debe ser excesivamente alto puesto que puede producir vibraciones o movimientos del tubo de muestra que rebajaran la calidad de los espectros obtenidos. Es importante tener en cuenta que las variaciones de temperatura en la habitacin pueden afectar el correcto control de la temperatura en la muestra. Adems, fallos en la correcta regulacin de la temperatura del experimento pueden daar la muestra y, ms importante, pueden daar la sonda. Por ejemplo, un fallo o una mala adecuacin de los parmetros que controlan la resistencia del circuito podra congelar o sobrecalentar la muestra dependiendo de la temperatura del gas de entrada y del defecto o exceso de la potencia permitida de calentamiento. Los posibles fallos en el suministro del flujo de aire es algo tambin a considerar para evitar daos, especialmente en el caso de las sondas criognicas.

Por todo ello es necesario buscar los parmetros apropiados y prever un mnimo nivel seguridad en el control de la temperatura. 10. Especificaciones de un espectrmetro de RMN. La calidad de un espectrmetro se mide obteniendo espectros de RMN, normalmente monodimensionales, de muestras comnmente aceptadas como patrones y comparando determinados parmetros espectrales con unos valores de referencia. Aunque son muchas las especificaciones que se pueden medir, hay unas pocas que definen muy bien el comportamiento de un espectrmetro: forma de lnea, sensibilidad, resolucin, supresin de la seal de H2O y estabilidad. Cada una de ellas es independiente, pero indirectamente estn relacionadas unas con otras ya que finalmente siempre dependen de dos factores: la homogeneidad del campo magntico que pueda alcanzarse con el imn en cuestin y la calidad de la electrnica de que se disponga. Para la forma de lnea se evala principalmente la de 1H por ser la ms sensible. Se mide la anchura que muestra la resonancia del cloroformo en una muestra estndar a la altura de sus satlites de 13C (0,55 %) y a 1/5 de dicha altura (0,11 %). Esta especificacin es muy importante porque de ella depende de que se puedan observar lneas de poca intensidad que estn prximas a seales intensas. En el caso de existir inestabilidades mecnicas en el imn, estas se manifiestan como seales de modulacin, simtricas respecto a la seal intensa del cloroformo. Esta especificacin es muy til para detectar cualquier inestabilidad del campo de baja frecuencia. Si la forma de lnea es mala, con toda probabilidad la sensibilidad tambin lo ser. La sensibilidad, se mide tambin para el 1 H observando la relacin seal/ruido de la lnea ms intensa del cuartete del CH2 en una muestra de etilbenceno al 0.1% con un pulso de 90. La sensibilidad est determinada por la intensidad del campo magntico, el dimetro del tubo de muestra y la calidad de la bobina de deteccin. La resolucin, que depende fundamentalmente de la homogeneidad del campo magntico, se determina tambin en la muestra de cloroformo midiendo la anchura a mitad de la altura de la seal. La obtencin de buenos valores para esta especificacin era muy importante cuando nicamente se dispona de espectroscopa en una dimensin. Con la introduccin de las tcnicas multidimensionales, esta especificacin es cada vez menos relevante. Todas estas pruebas pueden tambin hacerse para los heteroncleos. Mencin aparte merece la prueba de la eliminacin de la seal del agua. Este es un parmetro muy importante para experimentos que deban realizarse en solucin acuosa donde la seal del disolvente es mucho mayor que las seales del soluto. Una buena eliminacin de la seal del agua es esencial para obtener espectros de calidad. Se lleva a cabo con una muestra de sacarosa disuelta en H2O (2 mM) y con una secuencia de pulsos que contenga un pulso de presaturacin de potencia establecida. Se mide la anchura de la seal residual del agua despus de la saturacin al 50 y 10% de la altura de otra sustancia patrn de concentracin conocida (0,5 mM, DSS). Finalmente, aunque no est establecida una especificacin concreta para medir la estabilidad total a largo plazo, es conveniente tener una referencia de ella sobre todo cuando se tengan que llevar a cabo experimentos multidimensionales de implican largos tiempos de adquisicin. En estos caos, las inestabilidades se manifiestan en un fenmeno conocido como ruido t1, en forma de tiras de ruido perpendiculares a la dimensin directa, coincidentes con seales intensas. Una posibilidad que da muy buenos resultados, pues es muy sensible a muchas inestabilidades tanto magnticas como vibracionales, est basada en la realizacin de espectros diferencia en funcin del tiempo. Como ya se ha comentado, la espectroscopa de

diferencia es muy sensible a cualquier desestabilizacin, bien sea del propio espectrmetro como atribuibles a causas externas, por lo que es apropiada para este tipo de controles. As, observando como se anula la seal del cloroformo unida a 12C (despus de sustraer dos espectros) frente a las seales seleccionadas de los satlites de 13C, podremos tener una estimacin de la estabilidad en funcin del tiempo. 11. Bibliografa El mejor tratado de instrumentacin de RMN que puede consultarse en castellano corresponde al captulo de Dr. Jos Luis Nieto Espectroscopa de RMN. Aspectos instrumentales, del Curso Avanzado de RMN, Escuela de verano, Universidad de Zaragoza 51-71 (1993). Ed. Sociedad Espaola de ptica. Captulos de libros: A.E. Derome Modern NMR techniques for Chemuistry Research Pergamon Press (1989), captulos 3 y 4. T.A. Frenkiel Instrumentation and pulse sequences, captulo 3 en NMR of Macromolecules: A Practical Approach Oxford University Press (1993). Otros tratados especficos: Gerhard Wider, Technical aspects of NMR spectroscopy with biological macromolecules and studies of hydration in solution en Progress in NMR Spectroscopy 32, 193275 (1998). Contiene un nmero elevado de citas bibliogrficas al respecto. Joseph P. Hornak, NMR hardware en The basics of NMR, captulo 7, accessible en la webb: http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/ (1999). Perry J. Pellechia, NMR: Instrumentation and Acquisition parameters, captulo 5, accessible en la webb: http://homer.chem.sc.edu/perry/chem729/ La mayor fuente de la informacin respecto a la instrumentacin de RMN, deriva de las publicaciones internas de los fabricantes de los espectrmetros que existen en el mercado.