PROBLEMAS DE ENZIMAS 1. Comentar las siguientes cuestiones a) La Km de un enzima para un sustrato vara proporcionalmente con la concentracin de enzima.

b) Si se aade suficiente sustrato, la Vmax de una reaccin enzimtica puede alcanzarse incluso en presencia de un inhibidor no competitivo. c) Cuando un enzima posee varios sustratos, el valor de Km para todos ellos es siempre el mismo. d) En cintica enzimtica michaeliana, la inhibicin reversible competitiva se caracteriza por aumentar la Km de la reaccin. e) Un efector alostrico acta al unirse al enzima en un sitio diferente al centro activo. f) A niveles de saturacin de sustrato, la velocidad de una reaccin enzimtica es proporcional a la concentracin del enzima. g) La constante de Michaelis-Menten equivale a la concentracin de sustrato para la cual v o es de la Vmax. 2. Si a temperatura constante de 298 K una enzima consigue incrementar la velocidad de una reaccin 10 7 veces, cunto habr conseguido disminuir la barrera de energa libre de su estado de transicin. 3. La enzima malato deshidrogenasa (MDH) cataliza la reacin: L-malato + NAD+ ===== oxalacetato + NADH + H+ 10L de una solucin del enzima parcialmente purificada, que contiene 0,4 mg de protena /mL, permite la transformacin de 0.45 moles de L-malato/min. El L-malato se mantiene en exceso durante la reaccin. Calcular en UI/mg de protena la acividad enzimatica especfica de la MDH. 4.- Calcula el nmero de recambio de una enzima pura que tiene una actividad especfica de 30 moles s1 mg-1 de enzima. El enzima es tetramrico con 4 sitios activos idnticos uno en cada monmero y posee una Mr de 100 kD. 5. Un volumen de 0,1 mL de una preparacin homognea de nitrato reductasa (Mr =500 kD), que contiene 0,5 mg de protena/mL, cataliza la produccin de 20moles de nitrito en 5 minutos, utilizando una mezcla de reaccin cuyo volumen final es de 1 mL. Calclese: (a) La actividad de la preparacin en UI/mL (b) La actividad especfica (c) La actividad total, en katales, de 100 mL de preparacin (d) La actividad molar (nmero de recambio) de la preparacin (e) La actividad por centro activo, suponiendo que el enzima dispone de 2 sitios activos para la reduccin del nitrato. (f) El tiempo requerido para que se transforme una molcula de sustrato en producto 6. La hidrlisis del pirofosfato a ortofosfato es importante para impulsar reacciones biosintticas tales como la sntesis de DNA. Esta reacin est catalizada en Escherichia col por una pirofosfatasa que tiene una masa molecular de 120 kD y est constituida por 6 subunidades idnticas. Para este enzima una unidad se define como la cantidad de enzima que hidroliza 10 moles de pirofosfato en 15 minutos a 37 C en condiciones de ensayo estndar. El enzima purificado tiene una Vmax de 2800 unidades por mg de enzima. (a) Cuntos moles de sustrato se hidrolizan por segundo y por mg de enzima cuando la concentracin de sustrato es mucho mayor que que Km? (b) Cuntos moles de centro activo existen en un mg de enzima? Suponer que cada subunidad solo tiene un centro activo. (c) Cul es el nmero de recambio del enzima? 7.- En una reaccin enzimtica: S-----P, se presenta una Km para el sustrato de 1 mM y una Vmax de 0,1 moles/min. (a) Si se ensaya con una concentracin inicial de sutrato de 10 M, se observa que, al cabo de 23 min de reacin, la concentracin de sustrato ha bajado hasta 1 M. Calclese la concentracin de sustrato que permanecer despus de 46 min de reaccin. (b) Si la enzima se ensaya con una concentracin inicial de sustrato de 100 mM, calclese la cantidad de sustrato que habr desaparecido a los 8 min de reaccin.

8. Una enzima de Km= 3 x 10-4 M se ensaya con una concentracin inicial de sustrato de 10 -8M. Al cabo de un minuto se ha utilizado el 0,5% del sustrato: (a) Qu porcentaje del sustrato se habr utilizado al cabo de 5 minutos? (b) Si la concentracin inicial de sustrato fuera 8 x 10-7 M qu porcentaje del sustrato se habr utilizado al cabo de 5 minutos? (c) Calcular la Vmax (d) Para una concentracin de sustrato de 8 x 10-7 M qu timpo se requiere para que se utilice el 50% del sustrato?,y (e) Para una concentracin de sustrato 3 x 10-6 M qu tiempo se requiere para que se utilice el 75%? 9. En una preparacin enzimtica conteniendo 58 g de enzima/mL, se determin la actividad enimtica midiendo la variacin en la absorbancia del sustrato empleado con el tiempo. La mezcla de reaccin contena 0.1 mL de extracto enzimtico al que se aadieron diferentes concentraciones del sustrato disuelto en el mismo tampn, hasta un volumen final de 2 mL. Las reacciones enzimticas se llevaron a cabo en condiciones ptimas de pH, temperatura y fuerza inica. Los valores de las velocidades iniciales de la reaccin para diferentes concentraciones de sustrato figuran en la siguiente tabla: (S) (M) Velocidad inicial( M/min) 1,0 x 10-8 5,0 x 10-8 1,0 x 10-7 2,5 x 10-7 7,5 x 10-7 1,0 x 10-6 6,818 x 10-6 25,00 x 10-6 37,50 x 10-6 53,571 x 10-6 62,50 x 10-6 68,182 x 10-6

Determinar: (a) el valor de Km y Vmax (b) Sabiendo que la masa molecular del enzima es 125kD y que contiene dos subunidades idnticas de 62.5 kD, teniendo cada una de ellas un centro cataltico para el sustrato, determinar: la actividad especfica, la actividad molecular, la constante cataltica de la reaccin y la actividad por centro activo. 10.- Para determinar la energa de activacin del proceso de reduccin de nitrgeno hasta amonio por la deshidrogenasa de una cianobacteria se estudi la velocidad de reduccin de nitrgeno a diferentes temperaturas, obtenindose los siguientes resultados: Temperatura (C) 10 20 30 35 40 45 Vmax( mol N2/mg . h) 6.98 15,99 38,44 46,82 46,84 46,12 (a) Determnese grficamente el valor de Ea (b) Calcula el Q10 entre 20C y 30 C (c) Explique por qu a partir de una determinada temperatura no se cumple la ecuacin de Arrhenius 11.- La tabla siguiente muestra los valores de la concentracin de producto p (en mM) a varios tiempos (en min), para 5 concentraciones de sustrato diferentes (en mM). Sigue ensta enzima una cintica de Michaelis-Menten? Si es as calcule su Km para el sustrato y la Vmax. t (S)= 1 (S)= 2 (S)= 5 (S)= 10 (S)= 20 1 0,095 0,18 0,37 0,56 0,76 2 0.185 0.34 0,71 1,08 1,50 3 0,260 0,49 1,01 1,57 2,20 4 0,330 0,62 1,29 2,04 2,88 5 0,395 0,74 1,56 2,47 3,50 6 0,450 0,85 1,80 2,87 4,12 7 0,505 0,95 2,02 3,23 4,66 8 0.555 1,04 2,220 3,59 5,24 9 0,595 1,12 2,40 3,92 5,74 10 0,630 1,20 2,58 4,22 6,24

12.- Se aaden 25 l de una preparacin de un enzima monosustrato a 1ml de mezcla de reaccin para el ensayo de la actividad enzimtica, utilizando diferentes concentraciones de sustrato. Las v o obtenidas en cada caso fueron las siguientes: [ S] (M) 10-2 10-3 10-4 7,5x10-5 4x10-5 2x10-5 6x10-6 A partir de estos datos: a) b) c) d) e) Hacer la representacin grfica segn Michaelis-Menten y Lineawever Burk. Determinar el valor de las constantes cinticas (Km, y Vmax). Calcular la velocidad de la reaccin para una [S] = 1,5x10-5M y [S] = 0,02M. Si [S] = 0,04M, Cul sera la cantidad de producto formado una vez transcurridos 3 minutos?. Cul sera la vo obtenida si el ensayo se hace con 50 l de la preparacin enzimtica y a concentracin saturante de sustrato?. vo(nmoles/min) 75,00 74,90 62,00 58,25 46,15 33,00 15,00

13. Se midi la cintica de un enzima en funcin de la concentracin de sustrato en presencia u ausencia del inhibidor (I) a una concentracin de 2 mM. (S) (M) Velocidad (mol/min) -I +I 3 10.4 2.1 5 14.5 2.9 10 22.5 11.3 30 33.8 22.6 90 40.5 33.8 (a) Cules son los valores de Km y Vmax en ausencia y en presencia del inhinidor? (b) De qu inhibicin se trata? (c) Cul es su Ki? (d) Cuando la concentracin del sustrato es 10 M y la del inhibidor 2 mM,qu fraccin de las molculas de enzima estn unidas al sustrato?y al inhibidor?

14.- Se representaron en un diagrama de Lineweaver-Burk los datos obtenidos midiendo las velocidades inciales, expresadas en moles min-1, obtenidas con varias concentraciones de sustrato (mM), en ausencia y en presencia de una concentracin 2 M de un inhibidor. Se obtuvieron dos rectas que cortan a los ejes de abscisas y ordenadas en los siguientes puntos ------------------------------------(I) = 0 (I) = 2 mM ------------------------------------y 0,5 0,5 x -2,0 -0,5 ------------------------------------(a) calular Vmax y Km en ausencia y en presencia del inhibidor, as como el tipo de inhibicin y los valores de la constante de inhibicin (b) Si se representasen los datos en un diagrama de Hanes-Wolf, cules sera los puntos de corte? (c) y en Eadie-Hofstee?

(d) Calcular la cantidad de sustrato consumida en 4 min de reaccin, en ausencia de inhibidor, si la concentracin inicial de sustrato es 0,1 M.

15.- La subtilisina (Mr = 27,6 kK) es una proteasa bacteriana que hidroliza especficamente steres aromticos y amidas. Los valores de Km y kcat para la hidrlisis de un ster derivado de tirosina son 0,146 M y 548 s-1, respectivamente. (a) Cul es la Vmax para esta reacin? (b) El indol es un inhibidor competitivo de la subtilisina, con una Ki de 0,05 M. Calcule la velocidad mxima de la hidrlisis del sustrato anterior en presencia de 6,25 M de indol (c) Cul es la velocidad inicial de la reaccin en presencia de 6,25 mM de indol?

16.- Se estudi la cintica de un enzima en ausencia de inhibidor y en presencia de dos inhibidores A y B, este ltimo a dos concentraciones distintas. La siguiente tabla muestra los valores de la velocidad inicial de la reaccin en los cuatro casos y en funcin de la concentracin de sustrato. vo (mmol/ L x min) [ S] mmol/L 1,25 1,67 2,50 5,00 10,00 Sin inhibidor 1,72 2,04 2,63 3,33 4,17 Inhibidor A 3mM 0,98 1,17 1,47 1,96 2,38 Inhibidor B Inhibidor B 3 mM 5 mM 1,25 1,54 2,00 2,86 3,70 1,01 1,26 1,72 2,56 3,49

(a) Qu tipo de inhibicin realizan los inhibidores A y B? (b) Determinar el valor de Km y Vmax en ausencia y presencia de cada inhibidor. (c) Calcular el valor de la constante de disociacin, KI, del complejo enzima- . inhibidor B. 17. El enzima succinato deshidrogenasa de corazn de buey es capaz de liberar dos tomos de hidrgeno del cido succnico para transferirlos al FAD. El cido malnico [CH 2(COOH)2] interfiere esta accin, de acuerdo con las cifras de la siguienta tabla: Velocidad de reaccin (nmoles de FADH2 formados por minuto) En ausencia de malnico En presencia de malnico10-4M 3,6 1,1 11,4 4,1 20 9,1 32 21,3 36,4 29,6

Succinato(mM) 0,1 0,4 1 4 10

a) Trazar las grficas con y sin inhibidor, utilizando la representacin de Lineweaver-Burk. b) Calcular en ambos casos (utilizando la representacin), los valores de las constantes cinticas Km y Vmax c) Deducir el tipo de inhibicin que se produce, calcular KI y razonar la posible accin del cido malnico, a la vista de su estructura qumica.

18.- Se determin la velocidad inicial de una reacin catalizada por una enzima reguladora con la siguiente gama de concentraciones de sustrato:

(S)0 (mmol L-1) 0,1 0,3 0,5 1,0 3,0 5,0 10,0 100,0 500,0 1000,0 Determnese el indice de Hill y el valor de S0,5.

Vo (mmol L-1) 1.6 x 10-4 1,4 x 10-3 4,0 x 10-3 1,6 x 10-2 0,14 0,39 1,45 14,6 15,9 16,0

19.- La aspartato transcarbamilasa, que cataliza la siguiente reaccin: carbamil-P + L-asp ======== N-carbamil-L-asp + Pi presenta, a saturacin de carbamil-P, los siguientes datos de velocidad en presencia o ausencia de los moduladores, ATP o CTP: (Asp) (mM) Control +ATP 2 mM +CTP 0,5 mM 1 0,30 0,75 0,15 2 0,94 1,78 0,53 3 1,63 2,53 0,84 4 2,53 3,32 1,16 5 3,05 3,79 1,79 6 3,58 4,05 2,21 8 4,63 4,89 3,05 10 5,05 5,21 4,11 12 5,42 5,63 4,95 15 5,74 5,95 5,47 17 5,89 6,11 5,68 20 6,00 6,11 5,89 A partir de estos datos determnense: (a) Los parmetros cinticos del enzima en ausencia de moduladores (b) El efecto del ATP y CTP en la modulacin de la actividad enzimtica (c) Se trata de un enzima tipo K o tipo V?